大熊貓白介素18基因以及真核表達質粒構建與免疫效應的製作方法

2023-09-18 04:26:10

大熊貓白介素18基因以及真核表達質粒構建與免疫效應的製作方法
【專利摘要】本發明是一種大熊貓白介素18(IL-18)基因及其真核表達質粒構建與免疫效應。本發明採集大熊貓血液，提取RNA，RT-PCR擴增大熊貓的白介素18基因，將擴增的大熊貓IL-18編碼區克隆到pMD18-T載體，挑選陽性重組子送公司測序，測序正確的重組子命名為pMD-AmIL-18。根據大熊貓白介素18基因序列重新設計引物，以pMD-AmIL-18為模板，用PCR擴增大熊貓白介素18基因，定向插入真核表達載體pcDNA3.1(+)中，成功構建了大熊貓白介素18成熟蛋白真核表達質粒，研製出分子佐劑pAmIL-18。該佐劑可以作為疫苗的免疫增強劑。通過檢測小鼠血清中CDV特異性抗體，IFN-γ和IL-2含量、脾細胞增殖指數(SI)、脾細胞中的CD3+CD4+％、CD3+CD8+％T淋巴的含量，結果發現pAmIL-18對犬瘟熱弱毒疫苗有一定的免疫增強作用。
【專利說明】大熊貓白介素18基因以及真核表達質粒構建與免疫效應

【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物醫藥生物工程領域，是一種大熊貓白介素18基因真核表達質粒 構建及免疫效應。

【背景技術】
[0002] 細胞因子是一組由多種細胞所分泌的可溶性蛋白與多肽的總稱，在nmo 1 /L或 pmol/L水平即顯示生物學作用，可廣泛調控機體免疫應答和造血功能，並參與炎症損傷等 病理過程。白細胞介素是由淋巴細胞、單核巨噬細胞及其它細胞產生的細胞因子，在免疫調 節、造血及炎症過程中起重要作用，細胞因子作為疫苗增強劑有其他佐劑無法比擬的優點。
[0003] 1995年Dkamura從中毒性休克小鼠的肝臟中純化得到一種新的蛋白質，由於其對 IFN-γ的產生具有誘導作用，故稱之為IFN-γ誘導因子（IGIF)。1996年將IGIF命名為白 細胞介素-18(IL-18)。1995年Okamura等從中毒性休克小鼠的肝中純化得到一種可誘導 產生IFN-γ的新型細胞因子，稱之為IFN-γ誘導因子（IGIF)。1996年將IGIF命名為白 細胞介素-18 (IL-18)。隨後的研究發現，IL-18在非⑶14+外周血單核細胞、休眠 T細胞和 NK細胞中IL-18的調節活性類似於TNF-a UL-Ιβ和IL-8。其可以誘導T細胞增殖、增強 NK細胞活性、刺激Thl型細胞分泌M-CSF、增強FasL介導的Thl細胞和NK細胞的細胞毒活 性，在細胞介導的免疫應答方面具有重要作用。IFN-γ是一種抗病毒因子，能干擾病毒的復 制，在治療病毒性疾病中有著十分重要的作用。但它的使用劑量大，半衰期短，在實際應用 中受到很大的限制。而IL-18正是IFN-γ的一種良好的誘導物，可以通過IL-18不斷刺激 機體產生IFN-γ，達到預防治療病毒性疾病的目的。所以，在臨床上IL-18可能作為一種重 要的抗微生物感染和抗腫瘤的重要製劑。
[0004] 自從成功擴增小鼠 IL-18基因以來，人、犬、鼠和豬等哺乳動物的IL-18基因相繼 被克隆並在分子水平上開展了深入研究。早期的研究表明，對小鼠皮內注射IL-18引起淋 巴結的樹突狀細胞數量顯著增加。共同注射IL-18的質粒作為佐劑可以顯著提高免疫小鼠 的⑶4+和⑶8+的T細胞反應。IL-18作為疫苗的佐劑已經應用與很多種動物，包括小鼠、 貓、恆河猴、雞、豬。IL-18已經用於多種疫苗的免疫增強劑，比如經典的豬瘟病毒、偽狂犬病 毒、豬繁殖和呼吸道綜合症病毒以及手足口病毒疫苗等。這些結果都表明，IL-18不僅可以 縮短細胞毒性誘導的時間，同時也可以增加抗原引起的特異性淋巴增殖反應和IFN-γ釋 放，因此，IL-18是一種有效的、能夠增強抗原引起特異性反應的分子佐劑。


【發明內容】

[0005] 本發明主要解決的技術問題包括大熊貓白介素18基因的克隆、大熊貓白介素18 基因真核表達質粒的構建及其增強動物免疫反應的作用。主要包括以下步驟：
[0006] 1.大熊貓白介素18基因的克隆
[0007] 根據大熊貓基因組測序中預測的大熊貓白介素18基因序列以及Genebank中註冊 的其他動物的大熊貓白介素18基因保守序列為參考設計引物，採集大熊貓血液，提取RNA， RT-PCR擴增大熊貓的白介素18基因，將擴增的大熊貓IL-18編碼區克隆到pMD18-T載體，， 轉化到E. coli JM109,並對重組子進行EcoR I和Pst I雙酶切鑑定，並送公司測序，測序正 確的重組子命名為pMD-AmIL-18。
[0008] 2.大熊貓白介素18基因真核表達質粒的構建
[0009] 根據大熊貓白介素18基因序列重新設計引物，以pMD-AmIL-18為模板，用PCR擴 增大熊貓白介素18基因，並將PCR產物經Hindlll和EcoR I雙酶切定向插入以Hindlll 和EcoR I雙酶切處理的真核表達載體pcDNA3. 1 (+)中，成功構建了大熊貓白介素18成熟 蛋白真核表達質粒，研製出分子佐劑pAmIL-18。
[0010] 3.分子佐劑pAmIL-18的免疫增強作用
[0011] BALB/c小鼠95隻，隨機實驗分為3個組，每組30隻，5隻為陰性對照組。其中第 一組為空白對照組（⑶V)，即只注射犬瘟熱病毒（⑶V)弱毒苗（英特威），每隻小鼠接種疫 苗0· lmL ;第二組為犬瘟熱病毒（CDV)弱毒苗+PCDNA3. 1質粒組（CDV+pcDNA3. 1)，每隻小 鼠接種疫苗〇. lmL+100ug pcDNA3. 1質粒；第三組為犬瘟熱病毒（⑶V)弱毒苗+pAmIL18組 (⑶V+pAmIL18)，每隻小鼠接種疫苗0. lmL+100ug pAmIL18質粒。陰性對照組，只注射生理 鹽水。其中疫苗皮下注射，質粒多點肌肉注射。免疫後3周加強免疫一次。加強免疫後1 周、2周、3周、4周、5周和6周摘眼球取血，製備脾細胞懸液。通過檢測小鼠血清中⑶V特 異性抗體，脾細胞增殖、IFN-γ、IL-2、⑶4+、⑶8+含量，研究了該分子佐劑對犬瘟熱（⑶V) 疫苗的免疫增強作用。結果發現PAmIL-18對犬瘟熱疫苗有一定的免疫增強作用。

【具體實施方式】
[0012] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發 明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常 規條件如Sambrook等人所著的分子克隆：實驗室手冊（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述條件，或按照製造廠商所建議的方法。
[0013] 實施例1
[0014] 本實施例描述了本發明提供的大熊貓白介素18(IL_18)基因的獲得方法，包括以 下步驟：
[0015] (1)大熊貓IL-18基因的體外擴增
[0016] 經脂多糖（LPS)刺激後，利用TRIzol法，獲得大熊貓外周血淋巴細胞RNA。
[0017] 根據大熊貓基因組和貓、狗、牛等哺乳動物的IL-18基因進行同源對比，在序 列保守區設計引物，從大熊貓的外周血淋巴細胞RNA中擴增IL-18基因的編碼區片 段。PCR 反應體系：10XPCR 1311打6。.5 4 1^，（1階13(2.5臟〇1/1)1.(^1^，六11111^18上遊引 物（10 μ mol/L) 0· 5 μ L，AmIL18 下遊引物（10 μ mol/L) 0· 5 μ L，cDNA 模板 1. 0 μ L，rTaq DNApolymerase(5U/y L)0. 2μ L，補水至 25μ L。PCR 的反應條件為：94°C 預變性，5min ;30 次循環（94°C變性30s;55°C退火45s;72°C延伸50s)，最後72°C延伸10min。PCR產物經 1. 2%瓊脂糖凝膠電泳後，在580bp處有一條特異的DNA帶，大小與預測的IL-18基因相符， 推斷為大熊貓IL-18基因。
[0018] (2)重組子的鑑定
[0019] 將擴增的大熊貓IL-18編碼區克隆到pMD18-T載體，轉化到E. coli JM109,利用 載體的氨苄青黴素抗性和藍白斑篩選克隆。挑取具有氨苄青黴素抗性的白色單菌落接種培 養，提取質粒DNA並進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，並與pMDIS-T載體進行大小比較，比pMDIS-T 載體大的可能為重組子。將其中一些質粒分別用PstI單酶切、EcoR I和Pst I雙酶切後， 進行瓊脂糖凝膠電泳分析，依次得到約3300bp和2700bp、580bp的片段，同預期的結果相一 致。
[0020] 以重組子菌液為模板，用PCR方法可擴增得約580bp的核酸片段，與預期的一 致。從而初步證實克隆的DNA插入片段為IL-18基因，命名為AmIL-18,重組質粒命名為 pMD-AmIL-18。
[0021] (3)大熊貓IL-18基因序列
[0022] 將鑑定為重組子的質粒進行測序，測序結果表明，與從基因組預測大熊貓IL-18 基因核苷酸序列基本一致。大熊貓IL-18基因的開放閱讀框由579個核苷酸組成，編碼產 物由192個胺基酸殘基組成。
[0023] ATGGCTGCTAACACAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGAAATGAAACTTATTGACAACACACTTTAC TTTATAGCTGAAAATGATGACAGCCTGGAATCAGATTACTTTGGCAAGCTCGAACCTAAACTCTCAATCATACGAAA TTTGAACGACCAAGTTCTCTTCGTTAACCAGGGAAATCAACCCGTGTTTGAGGATATGCCCGATTCTGACTGTACAG ATAACGCACCCCATA CTGTATTTATCATATATATGTATAAAGACAGCCTCACTAGAGGTCTGGCGGTAACCATCTC TGTGAAGTGTAAGAAAATGTCTACTCTCTCCTGTAAGAACAAAACTATTTCCTTTAAGGAAATGTGTCCTCCCAATA GTATCAATGATGAAGGAAATGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTTCCAGGACATGACGATAAGATACAATTTGAG TCTTCATTGTACCAAGGATACTTTCTAGCTTGTCAAAAAGAGAAAGATCTTTTCAAACTCATTTTGAAAAAAAAGGA TGAAAGTGGGGATAAGTCCATTATGTTCACTGTTCAAAACAAAAGCTAGG
[0024] 實施例2
[0025] 本實施例描述了大熊貓白介素18的真核表達質粒pAmIL18獲得方法，其步驟包 括：
[0026] (1)表達引物的設計
[0027] 根據大熊貓IL-18蛋白基因序列及表達載體的多克隆位點序列特徵設計以下引 物：
[0028] 上遊引物：5，-CGCCCAAGCTTGCCATGGCTGCTAACACAG-3，
[0029] 下遊引物：5，-CCGGAATTCCTAGCTTTTGTTTTGAACAG-3，
[0030] 其中斜體分別為Hindlll和EcoR I酶切位點。GCCATGG為pcDNA3. 1 (+)表達的必 須Kozak序列。
[0031] (2)表達質粒的構建策略
[0032] 以陽性pMD18T-AmIL18質粒DNA為模板，用PCR方法擴增大熊貓白細胞介素18基 因的完整的編碼序列。PCR 反應體系：10XPCR buffer2.5yL，dNTP(2.5mmol/L)1.0yL， pAmIL18 上遊引物（10ymol/L)0· 5μ L，pAmIL18 下遊引物（10ymol/L)0· 5μ L，cDNA 模板 1· 0μ L，rTaqDNApolymerase(5U/y L)0. 2μ L，補水至 25μ L。PCR 的反應條件為：94。。預變 性，5min ;30 次循環（94°C 變性 30s ;55°C 退火 45s ;72°C 延伸 50s)，最後 72°C 延伸 lOmin。 用Hindlll和EcoR I雙酶切處理，同時將pcDNA3. 1 (+)質粒載體用Hindlll和EcoR I雙 酶切處理。分別取7 μ LAmIL18雙酶切片段與2 μ LpcDNA3. 1 (+)質粒的雙酶切片段連接，力口 入 10XT4 DNA Ligase buffer lyL，T4 DNA Ligase lyL，16°C連接過夜，將此連接產物 轉化DH5 α感受態細胞，在含有氨苄青黴素的LB平板上37°C培養。
[0033] (3)大熊貓IL-18真核表達質粒的鑑定
[0034] 利用Hindlll和EcoR I雙酶切法對上述獲得的重組表達質粒進行酶切鑑定以及 PCR鑑定，鑑定正確的質粒進行測序以確定具有正確閱讀框、未發生突變的重組子。以上 重組子均與預期結果一致，即具有正確的閱讀框、未發生突變。鑑定的重組子分別命名為 ： pAmIL18〇
[0035] 實施例3
[0036] 本發明提供了大熊貓真核表達質粒pAmIL18對犬瘟熱疫苗免疫增強作用，具體包 括以下步驟：
[0037] (l)pAmIL18分子佐劑的獲得
[0038] 從LB固體培養基中挑取單菌落，接種於盛有100ml液體培養基的三角瓶中，37°C 震蕩培養過夜。在l〇〇〇ml的三角瓶中加入100ml發酵培養基，接入5ml的菌種，37°C， 200rpm/min，培養20h。利用Omega公司的去內毒素質粒大量提取時間盒提取pAmIL18質 粒，操作方法按照試劑盒的說明書進行，即可以獲得pAmIL18分子佐劑。
[0039] (2)動物實驗設計
[0040] BALB/c小鼠95隻，隨機實驗分為3個組，每組30隻，5隻為陰性對照組。其中 第一組為空白對照組，即只注射犬瘟熱病毒（⑶V)弱毒苗（英特威），每隻小鼠接種疫苗 0. lmL ;第二組為犬瘟熱病毒（CDV)弱毒苗+PCDNA3. 1質粒組（CDV+pcDNA3. 1)，每隻小鼠 接種疫苗〇. lmL+100ug pcDNA3. 1質粒；第三組為犬瘟熱病毒（CDV)弱毒苗+pAmIL18組 (⑶V+pAmIL18)，每隻小鼠接種疫苗0. lmL+100ug pAmIL18質粒。陰性對照組，只注射生理 鹽水。其中疫苗皮下注射，質粒多點肌肉注射。免疫後3周加強免疫一次。加強免疫後7d、 14d、21d、28d、35d和42d摘眼球取血，製備脾細胞懸液。
[0041] (3)pAmIL18免疫小鼠的抗體特異性反應
[0042] 在加強免疫3周後，分別於7d、14d、21d、28d、35d和42d摘眼球取血，分離血清， 於-20°C保存。用間接ELISA法測定小鼠血清中的特異性⑶V抗體。
[0043] 結果表明，每組小鼠注射了犬瘟熱（CDV)弱毒苗後，都能有效的刺激CDV特異性抗 體的產生。但是同時pAmIL18,能顯著提高⑶V特異性抗體水平（P < 0. 05)。而同時注射 pcDNA3. 1對⑶V特異性抗體水平影響不大，其中⑶V+pAmIL18組的抗體水平在21d天時達 到最高值，然後逐漸降低。
[0044] ⑷小鼠脾細胞增殖
[0045] 在加強免疫3周後，分別於7d、14d、21d、28d、35d和42d無菌取小鼠脾細胞，具體 製備步驟如下：小鼠頸椎脫白處死，75%乙醇浸泡3分鐘，取出小鼠置於無菌紙上，左腹側 朝上；在小鼠左腹側中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長條狀脾臟；在脾臟下 側提起腹膜，剪開後上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離脾臟下面的結締組織，取 出脾臟。放入盛有5ml RPMI-1640培養液培養基的培養皿中；在40目鋼絲網上剪碎，用滅 菌玻璃注射芯輕磨、過濾，分別製成脾細胞懸液，紅細胞裂解液（Sigma)破壞紅細胞，冰浴 靜置2min，2, 000r/min離心10min，用RPMI-1640培養液洗滌細胞2次，經臺盼藍染色測定 細胞存活率大於95 %。再以含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養液製成2 X 106/mL脾淋巴細 胞懸液。將製備好的免疫小鼠的脾細胞100 μ L接種到96孔板，加入Con A至終濃度5 μ g/ mL，同時做不加 ConA的陰性對照孔。.在培養箱中孵化48h後，每孔加入ΙΟμ L WST-8(10mg/ mL)，37°C孵化2h，測定450nm 0D值。脾細胞的增殖結果用刺激指數（SI)來表示，即實驗組 的〇D45Q/對照組0D45Q。
[0046] 實驗結果表明，同時注射pAmIL18能顯著提高脾細胞增殖指數（P < 0. 05)，並在 35d時達到最高值。而同時pcDNA3. 1組的小鼠脾細胞增殖指數與注射單獨注射CDV弱毒苗 差異不大。
[0047] (5) IFN- γ 和 IL-2 含量
[0048] 用ELISA法測定小鼠血清中的IFN-Y和IL-2含量。實驗結果表明，同時注射 pAmIL18能顯著增加小鼠血清中的IFN- γ和IL-2含量（P < 0. 05)，並在35d時達到最高 值。而同時pcDNA3. 1組的小鼠血清中的IFN- γ和IL-2含量與注射單獨注射⑶V弱毒苗 差異不大。
[0049] (6)⑶3+⑶4+%和⑶3+⑶8+% T淋巴細胞亞群的動態變化
[0050] 製備每隻小鼠的脾細胞，取1X106個/mL濃度的小鼠脾細胞懸液100yL於BD專 用的流式細胞管中，離心，去上清，加 stain bufferlOO μ L，然後再分別加入抗體。1管分別 加入抗鼠⑶3-FTTC單克隆抗體1 μ L、⑶4-ΡΕ單克隆抗體1. 25 μ L，用於測定⑶3+⑶4+% ; 另1管分別加入抗鼠⑶3單克隆抗體1 μ L，ΡΕ標記的⑶8單克隆抗體1. 25 μ L，用於測定 CD3+CD8+%，相應對照管加入抗鼠 IgG-FITC、IgG-PE單克隆抗體各1 μ L。振蕩混勻，4°C下 避光放置30min，用stain buffer洗滌2次。棄上清液，，加固定液（4%多聚甲醛）200 μ L。 BD流式細胞儀檢測CD3+CD4+%、CD3+CD8+%含量。
[0051] 流式細胞結果表明，同時注射pAmIL18能顯著增加小鼠脾淋巴細胞中的 ⑶3+⑶4+%、⑶3+⑶8+%含量（P < 0. 05)，並在35d時達到最高值。而同時pcDNA3. 1組的 小鼠脾淋巴細胞中的⑶3+⑶4+%、⑶3+⑶8+%含量與注射單獨注射⑶V弱毒苗差異不大。
[0001] 序列表 (1) SEQ ID N0:1 的信息 (1) 序列特徵： (A) 長度：579鹼基 (B) 類型：核酸 (C) 鏈性：單鏈 (D) 拓補結構：線性 (E) PCR引物 (ii) 分子類型：寡核苷酸 (iii) 序列描述：SEQ ID N0:1 ATGGCTGCTAACACAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGAAATGAAACTTATTGACAA CACACTTTACTTTATAGCTGAAAATGATGACAGCCTGGAATCAGATTACTTTGGCAAGCT CGAACCTAAACTCTCAATCATACGAAATTTGAACGACCAAGTTCTCTTCGTTAACCAGG GAAATCAACCCGTGTTTGAGGATATGCCCGATTCTGACTGTACAGATAACGCACCCCATA CTGTATTTATCATATATATGTATAAAGACAGCCTCACTAGAGGTCTGGCGGTAACCATCTC TGTGAAGTGTAAGAAAATGTCTACTCTCTCCTGTAAGAACAAAACTATTTCCTTTAAGGA AATGTGTCCTCCCAATAGTATCAATGATGAAGGAAATGACATCATATTCTTTCAGAGAAG TGTTCCAGGACATGACGATAAGATACAATTTGAGTCTTCATTGTACCAAGGATACTTTCTA GCTTGTGAAAAAGAGAAAGATCTTTTCAAACTCATTTTGAAAAAAAAGGATGAAAGTG GGGATAAGTCCATTATGTTCACTGTTCAAAACAAAAGCTAGG (2) SEQ ID N0:2的信息 (i) 序列特徵： (A) 長度：30鹼基 (B) 類型：核酸 (C) 鏈性：單鏈 (D) 拓補結構：線性 (E) PCR引物 (ii) 分子類型：寡核苷酸 (iii) 序列描述：SEQ ID N0:2 CGCC€^GC7TGCCATGGCTGCTAACACAG (3) SEQ ID Ν0·.3的信息 (i)序列特徵： (A)長度：28鹼基
[0002]
【權利要求】
1. 大熊貓白介素18基因及其真核表達質粒與應用，利用淋巴細胞分離液分離大熊貓 血液淋巴細胞，然後用ConA刺激淋巴細胞，擴增出IL-18基因，該基因的開放閱讀框由579 個核苷酸組成，編碼192個胺基酸殘基。
2. 權利要求1所述的大熊貓貓白介素18(IL-18)基因及其真核表達質粒，其特徵在於 將大熊貓白介素18(IL-18)基因插入真核表達載體pcDNA3. 1 (+)，構建能表達大熊貓IL-18 基因的真核表達質粒，研製出分子佐劑pAmIL18。含有編碼序列的白介素18基因的重組載 體。
3. 免疫效應，免疫增強作用。
【文檔編號】A61K39/39GK104099341SQ201310127640
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月15日 優先權日:2013年4月15日
【發明者】王強, 譚雪梅, 鄧家波, 牛李麗, 餘建秋, 嚴悅, 張義正, 嚴慧娟 申請人:成都動物園