粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球及其製備方法與流程
2023-09-18 00:14:50 1
本發明涉及單分散微球的製備方法，具體來說是粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球及其製備方法。
背景技術：
治療胰島素依賴型糖尿病的首選藥物胰島素，臨床上主要以針劑形式給藥，多數患者終身需要頻繁注射胰島素(通常每天1～4次)，伴有多種不良反應：例如低血糖反應、胰島素浮腫、皮下脂肪萎縮、肥大性脂肪營養不良、注射部位炎症、硬結及耐藥性等，給患者帶來諸多不便和巨大痛苦。
Mickel C等報導，胰島素活性分子能透過腸壁吸收入血，小腸的吸收率最高，結腸與直腸也有較高的吸收率。Bendayan M證實胰島素分子是通過小腸上皮細胞的轉運進入腸內環境，再滲透入毛細血管內皮細胞質膜並進入血液循環而發揮作用。
載藥緩釋微球是一種應用較為廣泛的新型給藥體系，其以適宜的高分子材料為載體，將藥物分散或包埋在其中形成球形載體給藥系統，粒徑為一到幾百微米，可通過口服、注射、吸入等方式進入體內。使用載藥緩釋微球後，可在較長時間內維持體內有效藥物濃度，提高藥效並降低藥物的不良反應，可以提高用藥的有效性、安全性、順從性，具有重要的臨床應用價值。
殼聚糖是一種生物相容性好、低毒的輔料，廣泛應用於藥物的各種劑型。Valerie D等研究證明，殼聚糖能夠打開消化道上皮細胞間的緊密連接，從而促進蛋白多肽類藥物在消化道的吸收。將胰島素製成緩釋微球進行腸溶包衣或裝入腸溶膠囊口服給藥，可以克服胰島素作為蛋白質在胃腸道內的吸收難以克服酸催化分解、蛋白酶降解以及黏膜穿透性差等屏障、生物利用度低下等缺點，同時又可以克服患者終身需要頻繁注射胰島素帶來的不便及產生的多種不良反應。
傳統的微球製備技術一般都需要先通過機械攪拌或者超聲振蕩得到分散的乳滴。這樣引入的機械外力是不穩定、不均勻的(如距離攪拌中心或超聲發生源遠近不同部位受力不同)，從而導致得到的乳滴大小、乳滴內部物質含量和濃度不均勻，最終製備的藥物載體尺寸不均一，結構差異性大，分散性差。而藥物載體的粒徑分散性和結構是決定藥物體外釋放行為的最重要因素。藥物載體的尺寸不均一將導致無法精確考察載藥微球量與裝載藥物量、載體粒徑與藥物釋放的關係，且靶向性差，難以安全用於臨床疾病的治療。
由於機械攪拌或震蕩有很強的劇烈性，往往還會導致產生的乳滴碰撞、破碎，使其中的藥物擴散出去造成損失，因而製備的載體的藥物裝載率低，還會造成生物活性藥物失活。而且傳統的攪拌製備乳滴過程耗時較長，乳滴無法及時迅速地被處理為固化的載體，會使乳滴中的藥物沉降或積聚到乳滴表面，造成載體對藥物的包封率低，在後續的藥物釋放中表現為突釋現象明顯和藥物釋放過快，甚至達不到臨床治療所需的藥物緩釋的要求。另外，傳統的製備過程常常使用乳化劑，還會引入較多的外部不可控因素，使得製備的藥物載體質量參差不齊，製備方法重現性差。
微流控液滴技術是在微流控裝置上操縱微小體積液體—液滴，液滴體積小，易於操控，可精確控制液體流速，確保製備的液滴大小均一、組成均勻、性質穩定。由於微流控中液滴溫和的產生方式，減少或避免了液滴間的碰撞破碎，且每個液滴都被不相容的另一相包圍，液滴相互間不接觸，避免了樣品間的交叉感染。而且在微流控裝置上調控流體的流速，可以調控生成液滴的大小。因此利用微流控裝置可以調控制備所需大小、粒徑均一的單分散液滴，再固化成目標大小、粒徑均一的單分散的微球。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發明的目的在於提供一種粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球的製備方法。
本發明的另一目的在於提供一種粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球。
為了實現本發明的目的，本發明提供了一種粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球的製備方法，其步驟如下：配製凝膠浴溶液、分散相溶液和連續相溶液，在微流控裝置中控制分散相溶液和連續相溶液的流速和粘度，當分散相溶液與連續相溶液匯合後，獲得尺寸均一的胰島素/殼聚糖溶液液滴，所述液滴通過固化獲得粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球。
更具體地，該方法包括以下步驟：
(1)凝膠浴溶液的配製：按比例將胺或氨基醇加入醇中混合均勻，配製成胺或氨基醇體積百分比為20％～55％的凝膠浴溶液；
(2)分散相溶液和連續相溶液的配製：將殼聚糖加入含重量百分比為0.5％～2％的醋酸水溶液中，再加入pH為1.5～3.0的重量百分比為10％～30％的胰島素溶液，混合均勻，作為分散相溶液；將低極性化合物與醇混合，配製低極性化合物與醇體積比為100:(0～250)的連續相溶液；
(3)調整分散相和連續相的流速與粘度：調整分散相流速為4～30μL·min-1，連續相流速為50～300μL·min-1，分散相粘度為1～500mPa·s，連續相粘度為50～2500mPa·s；
(4)胰島素/殼聚糖液滴的形成：步驟(2)所得分散相溶液和連續相溶液在微流控裝置中匯合後，可獲得粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖溶液液滴；
(5)液滴固化成微球：收集步驟(4)所得的液滴於步驟(1)配好的凝膠浴溶液中，液滴可固化或半固化，再加入醛類，於25～60℃進一步固化成粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球。
其中，步驟(1)所述的醇為異戊醇、異辛醇或己醇；胺為三乙胺或三辛胺；氨基醇為三乙醇胺或二乙醇胺。
步驟(2)中所述的低極性化合物為矽油、大豆油或色拉油；所述的醇為異戊醇、異辛醇或己醇中的一種或兩種。
步驟(5)所述的醛類是低毒或無毒的戊二醛或香草醛，優選無毒的香草醛，因為使用香草醛製得的胰島素/殼聚糖凝膠微球降解出的香草醛是無毒的，對人體無害。
所述製備方法還包括步驟(6)胰島素/殼聚糖水凝膠微球的後處理：將步驟(5)所得的胰島素/殼聚糖凝膠微球經過過濾或潷析後，殘留的有機溶液用有機溶劑洗滌，濾去溶劑，真空乾燥6～9h，即得單分散性胰島素/殼聚糖凝膠微球；所述有機溶劑為烴、滷代烴、醇及酮的一種或幾種；所述的烴為戊烷、己烷、石油醚；滷代烴為二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳；醇為甲醇、乙醇、異丙醇；酮為丙酮或丁酮。
本發明進一步提供了上述製備方法製備的粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球，所述單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球的粒徑範圍為50～600μm，分散係數CV小於6％；載藥率5％～30％，包埋率75％～85％，且具有胰島素緩釋性能，在pH為6.5～7.6的緩衝溶液中37℃下14h累積釋藥率小於60％。
本發明利用微流控液滴技術製備的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球表面形態較好，粒徑範圍為50～600μm，特別是使用香草醛製得的微球降解出的香草醛對人體無害；通過調整毛細管直徑及分散相溶液和連續相溶液的流速與粘度，可以方便地對所製備的胰島素/殼聚糖凝膠微球的尺寸進行調控。
附圖說明
圖1是實施例1製備的單分散胰島素/殼聚糖微球的緩釋曲線圖。
圖2是實施例2製備的單分散胰島素/殼聚糖微球的緩釋曲線圖。
圖3是實施例3製備的單分散胰島素/殼聚糖微球的緩釋曲線圖。
圖4是實施例4製備的單分散胰島素/殼聚糖微球的緩釋曲線圖。
圖5為本發明使用的微流控裝置的示意圖。
圖6為圖5的A部放大圖。
圖中各部件的標記如下：1-1、分散相注射泵；1-2、連續相注射泵；2-1、分散相注射器；2-2、連續相注射器；3、毛細管。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明相關內容。需要指出的是，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，而且，在閱讀了本發明的內容之後，本領域相關技術人員可以對本發明做出各種改動或修改，這些等價形式同樣落入本申請所附權利要求書所限定的範圍。
實施例1
粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球的製備方法，具體為：
將5mL三乙醇胺加入到16mL異辛醇中，磁力攪拌混勻，配製成凝膠浴溶液。
將殼聚糖加入含重量百分比為1％的醋酸水溶液中，配成重量百分比為2.5％的殼聚糖溶液；再按重量比為5:1向殼聚糖溶液中加入pH為2.0的重量百分比20％胰島素鹽酸溶液，混合均勻，作為分散相溶液；將異辛醇與矽油按體積比1:1混合均勻，獲得連續相溶液。
將上述分散相溶液和連續相溶液分別裝入10mL和60mL的注射器2-1、2-2中，置於兩臺注射泵1-1、1-2上，連接到圖5和圖6所示的微流控裝置中，設置分散相流速為10μL·min-1，粘度200mPa·s，連續相流速為100μL·min-1，粘度560mPa·s，微流控裝置中毛細管3的外徑/內徑為165/98μm，開啟微流控裝置，製備粒徑可控的單分散胰島素/殼聚糖溶液液滴；收集生成的胰島素/殼聚糖溶液液滴於裝有上述凝膠浴溶液的培養皿中，緩緩攪拌室溫下形成凝膠後，加入0.2mL戊二醛(25％)於37℃下固化反應3.0h，液滴即可固化成胰島素/殼聚糖凝膠微球。經過簡單的潷析後，殘留的有機溶液用石油醚、氯仿各洗滌2次，再用乙醇洗滌2次後，濾去乙醇，真空乾燥，即得單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球。
本實施例製備的胰島素/殼聚糖凝膠微球呈近圓球形，表面有輕度皺褶，粒徑均一，具有單分散性，粒徑為85μm，載藥率11％，包埋率76％，微球在pH為6.86的混合磷酸鹽緩衝溶液中37℃下緩釋性能見圖1。由圖1可見，微球突釋程度小，具有緩釋特性，37℃下14h累積釋藥率小於50％。
實施例2
將18mL三乙胺加入到20mL異辛醇中，磁力攪拌混勻，配製成凝膠浴溶液。
將殼聚糖加入含重量百分比為1％的醋酸水溶液中，配成重量百分比為2.5％的殼聚糖溶液；再按重量比為5:1向殼聚糖溶液中加入pH為2.0的重量百分比20％胰島素鹽酸溶液，混合均勻，作為分散相溶液；將異辛醇與矽油按體積比1:1混合均勻，獲得連續相溶液。
將上述分散相溶液和連續相溶液分別裝入10mL和60mL的注射器2-1、2-2中，置於兩臺注射泵1-1、1-2上，連接到圖5和圖6所示的微流控裝置中，設置分散相溶液流速為5μL·min-1，粘度200mPa·s，連續相溶液流速為70μL·min-1，粘度560mPa·s，微流控裝置中毛細管3的外徑/內徑為165/98μm，開啟微流控裝置，製備單分散胰島素/殼聚糖溶液液滴；收集生成的液滴於裝有上述凝膠浴溶液的培養皿中，緩緩攪拌室溫下形成凝膠後，加入0.01g香草醛於60℃下固化反應1.5h，液滴即可固化成胰島素/殼聚糖凝膠微球。經過簡單的潷析後，殘留的有機溶液用石油醚、氯仿各洗滌2次，再用乙醇洗滌2次後，濾去乙醇，真空乾燥，即得單分散胰島素/殼聚糖凝膠微球。
本實施例製備的單分散胰島素/殼聚糖凝膠緩釋微球呈近圓球形，表面有一定程度皺褶，粒徑均一，具有單分散性，粒徑為55μm，載藥率10％，包埋率75％，微球在pH為7.2的混合磷酸鹽緩衝溶液中37℃下緩釋性能見圖2。由圖2可見，微球突釋現象不明顯，具有緩釋特性，37℃下14h累積釋藥率小於60％。
實施例3
將15mL三乙胺加入到20mL異辛醇中，磁力攪拌混勻，配製成凝膠浴溶液。
將殼聚糖加入含重量百分比為1％的醋酸水溶液中，配成重量百分比為2.5％的殼聚糖溶液；再按重量比為5:1向殼聚糖溶液中加入pH＝2.0的重量百分比30％胰島素鹽酸溶液，混合均勻，作為分散相溶液；將異辛醇與矽油按體積比2:1混合均勻，獲得連續相溶液。
將上述分散相溶液和連續相溶液分別裝入10mL和60mL的注射器2-1、2-2中，置於兩臺注射泵1-1、1-2上，連接到圖5和圖6所示的微流控裝置中，設置分散相流速為12μL·min-1，粘度270mPa·s，連續相流速為100μL·min-1，粘度420mPa·s，微流控裝置中毛細管3的外徑/內徑為360/225μm，開啟微流控裝置，製備單分散胰島素/殼聚糖溶液液滴；收集生成的液滴於裝有上述凝膠浴溶液的培養皿中，緩緩攪拌室溫下形成凝膠後，加入0.01g香草醛於50℃下固化反應2.0h，液滴即可固化成胰島素/殼聚糖水凝膠微珠。經過簡單的潷析後，殘留的有機溶液用石油醚、氯仿各洗滌2次，再用乙醇洗滌2次後，濾去乙醇，真空乾燥，即得單分散胰島素/殼聚糖凝膠緩釋微球。
本實施例製備的單分散胰島素/殼聚糖凝膠緩釋微球呈橢球形，粒徑為250μm，表面有一定程度皺褶，粒徑均一，具有單分散性。微球載藥率16％，包埋率82％，微球在pH為6.5的混合磷酸鹽緩衝溶液中37℃下緩釋性能見圖3。由圖3可見，微球突釋程度較輕，具有緩釋特性，37℃下14h累積釋藥率小於50％。
實施例4
將15mL三乙胺、20mL無水乙醇加入到20mL異辛醇中，磁力攪拌混勻，配製成凝膠浴溶液。
將殼聚糖加入含重量百分比為1％的醋酸水溶液中，配成重量百分比為2.5％的殼聚糖溶液；再按重量比為5:1向殼聚糖溶液中加入pH＝2.0的重量百分比20％胰島素鹽酸溶液，混合均勻，作為分散相溶液；將異辛醇與矽油按體積比1:1混合均勻，獲得連續相溶液。
將上述分散相溶液和連續相溶液分別裝入10mL和60mL的注射器2-1、2-2中，置於兩臺注射泵1-1、1-2上，連接到圖5和圖6所示的微流控裝置中，設置分散相流速為10μL·min-1，粘度250mPa·s，連續相流速為100μL·min-1，粘度560mPa·s，微流控裝置中毛細管3的外徑/內徑245/98μm，開啟微流控裝置，製備單分散胰島素/殼聚糖溶液液滴；收集生成的液滴於裝有上述凝膠浴溶液的培養皿中，緩緩攪拌室溫下形成凝膠後，加入0.01g香草醛於60℃下固化反應1.5h，液滴即可固化成胰島素/殼聚糖水凝膠微珠。經過簡單的潷析後，殘留的有機溶液用石油醚、氯仿各洗滌2次，再用乙醇洗滌2次後，濾去乙醇，真空乾燥，即得單分散胰島素/殼聚糖凝膠緩釋微球。
本實施例製備的單分散胰島素/殼聚糖凝膠緩釋微球呈橢球形，粒徑為95μm，表面有一定程度皺褶，粒徑均一，具有單分散性。微球載藥率11％，包埋率78％，微球在pH為7.6的混合磷酸鹽緩衝溶液中37℃下緩釋性能見圖4。由圖4可見，微球突釋現象不明顯，具有緩釋特性，37℃下14h累積釋藥率小於45％。