抗gpiib/iiia重組抗體的製作方法

2023-09-17 16:01:00

專利名稱：：抗gpiib/iiia重組抗體的製作方法描述本發明涉及新的核酸序列，該序列編碼針對血小板膜蛋白的人自身抗體並編碼抗獨特型抗體，本發明還涉及人抗體新的胺基酸序列，以及上述核酸序列和胺基酸序列在診斷和治療疾病中的用途。自身免疫性血小板減少性紫癜(AITP)是免疫病，其特徵在於與正常或升高的巨核細胞生成相關的血小板數目降低。因抗血小板自身抗體的存在使得網狀內皮系統(脾，肝臟和骨髓)中的血小板破壞增加。可在約75％AITP患者中檢測到的這些自身抗體絕大多數針對的是血小板膜糖蛋白(GP)IIb/IIIa和Ib/IX。在一個和相同的患者中可發現幾種不同的自身抗體特異性(參見Berchtold和Wenger，血液81(1993)，1246-1250；Kiefel等，英國血液學雜誌，79(1991)，256-262；McMillan等，血液70(1987)，1040和Fujisawa等，血液79(1991)；1441)。然而，由於從AITP患者得到的自身抗體的量有限，目前仍難以鑑定結合表位並確定自身抗體的致病重要性。使用雜交瘤技術(Kunicki等，人抗體雜交瘤1(1990)83-95)僅能從AITP患者的淋巴細胞中得到一些可與GPIIb/IIIaAIPT反應的人單克隆抗體。據報導，健康個體中也存在抗多種自身抗原的天然自身抗體，例如抗人血小板的細胞內和細胞骨架成分的自身抗體(Guilbert等，免疫學雜誌，128(1982)，2779-2787；Hurez等，歐洲免疫學雜誌，23(1993)，783-789和Pfueller等，臨床實驗免疫學，79(1990)，367-373)。健康個體血清中存在的一些自身抗體也可抗血小板膜蛋白(Souberbielle，歐洲血液學雜誌，56(1996)，178-180)。然而，這些天然自身抗體的作用及其與疾病相關性自身抗體的關係仍是未知的。皮質類固醇可用於治療AITP，約一半患者在4周內對服用強的松產生反應；然而，長期減輕症狀很少見。靜脈內施用高劑量的免疫球蛋白(IVIgG)被推薦用於緊急治療表現出嚴重出血或血小板數目極低的患者。大多數患者在接受這一治療之後，血小板數目快速地，但通常為瞬時地增加。皮質類固醇和IVIgG在治療AITP中的作用機理仍是未知的。Berchtold等(血液74(1989)，2414-2417和Berchtold和Wenger，血液81(1993)，1246-1250)進行的研究揭示出IVIgG中存在的抗獨特型抗體可抑制自身抗體與血小板糖蛋白的結合。本申請需解決的問題是鑑定新的DNA序列，該序列負責自身抗體與GPIIb/IIIa的結合。可使用此方法製備可用的新型藥物製品，該製品可用於改善AITP的診斷和治療。令人驚奇地是使用健康人供體的外周循環B細胞製備人抗體重鏈和輕鏈的組合噬粒展示文庫之後，可以鑑定自身抗體的結合序列。人抗體重鏈和輕鏈Fab片斷展示於絲狀噬菌體M13的表面之後，可以鑑定出對GPIIb/IIIa表現出特異性結合的噬菌體克隆。為此，將噬粒文庫連續地與缺乏GPIIb/IIIa的血小板機能不全的血小板(負選擇)和正常的血小板(正選擇)接觸。幾輪選擇和通過感染大腸桿菌進行擴增之後，得到23個克隆，它們能與GPIIb/IIIa複合物結合。使用針對GPIIb/IIIa的單克隆抗體庫進行抑制研究，產生兩組克隆兩組都被特異於GPIIb/IIIa複合物的單克隆抗體抑制，一組還被GPIIb特異性的單克隆抗體抑制。對克隆進行DNA分析，顯示出2種不同的抗GPIIb/IIIa噬菌體克隆的存在，這進一步證實了上述發現。這些結果表明可從健康個體的基因組克隆2種GPIIb/IIIa特異性的噬菌體克隆，即自身抗體，這些克隆能識別屬於GPIIb/IIIa複合物的構象表位。抑制研究還確定了兩種噬菌體克隆都能抑制AITP患者的血小板相關性自身抗體與純化的GPIIb/IIIa的結合，因此可能識別與AITP相關的GPIIb/IIIa表位。由於噬菌體克隆含有得自健康個體基因組之天然自身抗體的抗原結合序列，因此，此發現可導致對AITP中血小板相關性自身抗體的新認識。另外，將抗GPIIb/IIIa噬菌體克隆用作抗原，可以使用這些新的噬菌體克隆產生針對抗GPIIb/IIIa自身抗體的重組型抗獨特型抗體。以此方法得到的重組型抗獨特型抗體構成了令人感興趣的臨床方法，可以替代IVIgG的使用。序列表SEQIDNO1-8(自身抗體)和SEQIDNO9-18(抗獨特型抗體)中顯示了所鑑定的噬菌體克隆的核苷酸序列和由這些核苷酸序列推定的胺基酸序列。I.自身抗體本發明的第一方面涉及編碼自身抗體的核酸，因此，本發明的部分主題是編碼人抗體重鏈或其功能衍生物或其片斷，包含選自下組的CDR3區域的核酸(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列VLPFDPISMDV(I)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列ALGSWGGWDHYMDV(II)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列，和(d)編碼具有同等的與GPIIb/IIIa結合之能力的胺基酸序列的核苷酸序列。另外，優選該新的核酸含有選自下組的CDR1區域(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列GYSWR(III)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列SYAMH(IV)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。另外，優選該新的核酸含有選自下組的CDR2區域(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列DISYSGSTKYKPSLRS(V)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(VI)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。本發明的第二方面是編碼人抗體輕鏈或其功能衍生物或其片斷，包含選自下組的CDR3區域的核酸(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列ATWDDGLNGPV(VII)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列AAWDDSLNGWV(VIII)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列，和(d)編碼具有同等的與GPIIb/IIIa結合之能力的胺基酸序列的核苷酸序列。另外，優選該新的核酸含有選自下組的CDR1區域(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列SGSSSNIRSNPVS(IX)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列SGSSSNIGSNTVN(X)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。另外，優選該新的核酸含有選自下組的CDR2區域(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列GSHQRPS(XI)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列SNNQRPS(XII)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。II.抗獨特型抗體本發明的第二方面涉及編碼抗獨特型抗體的核酸，因此，本發明的部分主題是編碼人抗體重鏈或其功能衍生物或其片斷、包含選自下組的CDR3區域的核酸(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列VRDLGYRVLSTFTFDI(XIII)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列DGRSGSYARFDGMDV(XIV)(c)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列MGSSVVATYNAFDI(XV)(d)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列DADGDGFSPYYFPY(XVI)(e)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列LRNDGWNDGFDI(XVII)(f)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列DSETAIAAAGRFDI(XVIII)(g)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列EDGTTVPSQPLEF(XIX)(h)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列GSGSYLGYYFDY(XX)(i)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列GLRSYNYGRNLDY(XXI)(j)編碼與(a)，(b)，(c)或(d)中的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列，(k)編碼具有同等的與抗GPIIb/IIIa的自身抗體結合之能力的胺基酸序列的核苷酸序列。該新的核酸還優選含有CDR1區域，其選自編碼表7a所示胺基酸序列NFAMS，SYTMH，DYALH或SHYWS的核苷酸序列，編碼胺基酸序列TYYWS的核苷酸序列，編碼表7b所示胺基酸序列DYGMH，SHTIS，KYAIH或ELSMH的核苷酸序列和編碼與上述胺基酸序列之一具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。該新的核酸還優選含有選自下組的CDR2區域編碼表7a所示下述胺基酸序列GISGGGLLTHYA(D/N)SVKG，LISYDGSNKYYADSVKG，GISWDSTSIGYADSVKG或FIYDGARTRFNPSLRS的核苷酸序列；編碼胺基酸序列YIYYSGNTNYNPSLKS的核苷酸序列；編碼表7b所示下述胺基酸序列AISYDGSNKYYADSVKG，GITPIFGTVNYAQKFQG，AISSNGGNTYYADSVKG或GFDPEDGETIYAQKFQG的核苷酸序列；和編碼與上述胺基酸序列之一具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。本發明的另一部分主題是編碼人抗體輕鏈或其功能衍生物或其片斷、包含選自下組的CDR3區域的核酸(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列CSYVHSSTN(XXII)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列QVWDNTNDQ(XXIII)(c)編碼與(a)或(b)的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列，和(d)編碼具有同等的與抗GPIIb/IIIa的自身抗體結合之能力的胺基酸序列的核苷酸序列。優選該新的核酸還含有選自下述的CDR1區域編碼表7a所示胺基酸序列TGTSSAIGNYNFVP的核苷酸序列，編碼表7b所示胺基酸序列GGYKIGSKSVH的核苷酸序列和編碼與上述胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。另外，優選該新的核酸還含有選自下述的CDR2區域編碼表7a所示胺基酸序列EGSKRPS的核苷酸序列，編碼表7b所示胺基酸序列EDSYRPS的核苷酸序列和編碼與上述胺基酸序列具有至少80％，優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。在本發明的意義上，術語「人抗體鏈的功能性衍生物」指的是至少包括上文所定義的重鏈和/或輕鏈CDR3區域的多肽，適當時，該多肽與人抗體的相關互補鏈(或該鏈的衍生物)一起能形成抗體衍生物，該衍生物對抗原具有等同於非衍生化抗體所具有的識別特異性。優選這種抗體衍生物對相關抗原的結合常數至少為10-6l/mol，優選為至少10-8l/mol。通過例如使用重組DNA技術缺失，取代和/或插入編碼相關多肽的基因區段可製備人抗體鏈的功能衍生物。單鏈抗體可由例如H和L鏈的可變區或者一個或兩個H鏈結構域組成，適當時還可具有恆定區，這是特別優選的抗體鏈或抗體功能衍生物。這種構建體的製備描述於Hoogenboom等，免疫學評論，130(1992)，41-68；BarbasIII，MethodsCompanionMethodsEnzymol，2(1991)，119和Pluckthun，免疫化學(1994)，MarcelDekkerInc.，第9章，210-235。在本發明的意義上，術語「同等的結合能力」指的是結合親和性和/或特異性(即表位識別)與具體公開序列所具有的相同。本發明的另一部分主題是含有至少1拷貝新核酸的載體，此載體可以是原核載體或真核載體。質粒，粘粒和噬菌體是原核載體的例子，這種載體詳細描述於例如Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版(1989)，冷泉港實驗室出版社的第1-4章中。優選原核載體為質粒或噬菌體。另一方面，載體也可以是真核載體，例如酵母載體，昆蟲載體(杆狀病毒)或哺乳動物載體(質粒載體或病毒載體)。真核載體的例子描述於Sambrook等，文獻同上，第16章和Winnacker，基因和克隆，EineEinfuhrungfurdieGentechnologie[基因和克隆，基因工程導言](1985)，VCHVerlagsgesellschaft，尤其是第5，8和10章。本發明的另一部分主題是表達新核酸的細胞，或被新核酸或新載體轉化的細胞。細胞可以是原核細胞(如革蘭氏陰性細菌細胞，尤其是大腸桿菌)或真核細胞(如酵母，植物或哺乳動物細胞)。適當細胞和將新核酸導入這種細胞的方法的例子見於上述參考文獻中。本發明的另一部分主題是由新核酸編碼的多肽，尤其是重組多肽。特別優選多肽含有人抗體H鏈和/或L鏈的可變區。特別優選的是表現出抗體特性，其亞單位成分是重鏈或其功能衍生物和輕鏈或其功能衍生物的多肽。該多肽可由兩個獨立的鏈組成或以單鏈多肽的形式存在。本發明的另一部分主題是抗新多肽的抗體，所述抗體針對的是負責識別抗原的多肽區域。此抗體可以是多克隆的抗血清，單克隆抗體或者多克隆或單克隆抗體的片斷(如Fab，F(ab)2，Fab』或F(ab』)2片斷)。優選此抗體針對的是新多肽抗體之重鏈和/或輕鏈CDR3區域，或其部分區域。通過用含有新CDR3區域的肽或多肽免疫實驗動物，並從實驗動物中分離所得的多克隆抗體，即可使用已知方法得到這種抗體。另外，根據Kohler和Milstein的方法或其改良方法，通過將實驗動物中產生抗體的B細胞與白血病細胞融合可得到單克隆抗體。另外，通過以新多肽為抗原，篩選適當的噬粒文庫，例如健康人供體的噬粒文庫，也可得到針對新多肽CDR3區域的重組抗體。本發明還涉及藥物組合物，其含有上述核酸、載體、多肽、抗體或細胞作為有效成分，適當時還添加有其它活性成分和藥學上常用的佐劑、添加劑或賦形劑。該藥物組合物可用於製備診斷或治療劑。診斷用途的例子是診斷AITP或AITP誘因。另一個優選的診斷用途是監測AITP疾病的進程。該藥物組合物作為診斷劑的用途包括例如檢測將新多肽表達為抗體的B細胞亞群。通過核酸雜交試驗(適當時需先進行擴增)可在核酸水平上檢測此抗體。另一方面，通過使用抗原或與多肽特異性反應的抗體進行的免疫測定法可在蛋白質水平上檢測此抗體。另外，該新的藥物組合物也可用於治療領域，尤其是預防或治療AITP。此治療用途可基於例如刺激抗自身抗體之抗體的產生。為此，可給患者施用新的自身抗體多肽，從而引發和/或刺激抗獨特型抗體的形成。在此方面，根據常規的免疫方法即可進行給藥(Fox等，J.Pharmacol.Exp.Ther.279(1996)，1000-1008；Whittum-Hudson等，天然藥物2(1996)，1116-1121；Jardieu，免疫學最新觀點，7(1995)，779-782)。另一方面，通過施用適當的反義核酸可特異性地抑制抗體基因的表達。可給患者施用該新的抗獨特型抗體多肽以直接抑制自身抗體的活性。對新的自身抗體多肽的研究表明這些多肽令人驚奇地可抑制血纖蛋白原與血小板的結合，因此，新的自身抗體多肽和抗獨特型抗體多肽(適當時可聯合使用這兩種多肽)可在心肌梗塞或中風，或靜脈形成血栓並發肺栓塞或局部缺血等之後用作調節血液凝結，尤其是預防血栓的藥劑。鼠單克隆抗體，如單克隆抗體7E3(參見美國專利5440020)或其片斷(如可商購的Fab片斷ReoPro)，或短的合成肽已被用作血纖蛋白原的拮抗劑以用於治療的目的。然而，鼠單克隆抗體和抗體片斷的缺點在於具有免疫原性，當用於治療人患者時會產生不必要的副反應，而短肽一般會很快地降解。與已知的藥劑相比，該新多肽的優點在於它們由來源於人的胺基酸序列組成，因此表現出的不必要的副作用比相應的鼠抗體或抗體片斷的小，而由於其大小比肽大，因此它不會象肽那樣快速地降解。因此，本發明涉及新的核酸、尤其是編碼自身抗體多肽的核酸、含有此核酸的載體、被上述核酸或載體轉化的細胞，由核酸編碼的多肽、含有一種或多種上述物質的藥物組合物用於製備影響尤其是抑制血纖蛋白原與血小板之結合的藥劑的用途。優選使用藥劑調節血液凝結，尤其是溶解血栓和/或防止血栓形成。根據已建立的鼠抗體或抗體片斷的施用方法可施用該新的藥物組合物。本發明的另一部分主題是分離表達核酸的噬粒克隆的方法，所述核酸編碼抗GPIIb/IIIa之自身抗體或編碼針對這些自身抗體的抗獨特型抗體，所述方法的特徵在於由人供體的淋巴細胞製備噬粒文庫，通過親和選擇，包括負和正選擇步驟分離所需的噬粒克隆。優選此方法還包括從克隆中分離編碼抗體的核酸和/或使用編碼抗體的核酸表達重組的抗體鏈或其衍生物或其片斷。下列實施例、圖和序列表也對本發明作出解釋，其中SEQIDNO.1表示新抗體(噬粒克隆PDG7)H鏈的核苷酸序列，其中H鏈構架區(FR)1從bp1延伸至90，互補決定區(CDR)1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至195，FR3為bp196至291，CDR3為bp292至324，FR4為bp325至357。SEQIDNO.2表示對應於SEQIDNO.1所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至65，FR3為AA66至97，CDR3為AA98至108，FR4為AA109至119。SEQIDNO.3表示新多肽(噬粒克隆PDG7)L鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至60，CDR1為bp61至99，FR2為bp100至144，CDR2為bp145至165，FR3為bp166至261，CDR3為bp262至294，FR4為bp295至333。SEQIDNO.4表示對應於SEQIDNO.3所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至20，CDR1為AA21至33，FR2為AA34至48，CDR2為AA49至55，FR3為AA56至87，CDR3為AA88至98，FR4為AA99至111。SEQIDNO.5表示新多肽(噬粒克隆PDG13)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至109，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至198，FR3為bp199至294，CDR3為bp295至336，FR4為bp337至369。SEQIDNO.6表示對應於SEQIDNO.5所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至66，FR3為AA67至98，CDR3為AA99至112，FR4為AA113至123。SEQIDNO.7表示新多肽(噬粒克隆PDG13)L鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至60，CDR1為bp61至99，FR2為bp100至144，CDR2為bp145至165，FR3為bp166至261，CDR3為bp262至294，FR4為bp295至333。SEQIDNO.8表示對應於SEQIDNO.7所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至20，CDR1為AA21至33，FR2為AA34至48，CDR2為AA49至55，FR3為AA56至87，CDR3為AA88至98，FR4為AA99至111。SEQIDNO.9表示新多肽(噬粒克隆AI-X16)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至198，FR3為bp199至288，CDR3為bp289至336，FR4為bp337至369。SEQIDNO.10表示對應於SEQIDNO.9所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至66，FR3為AA67至96，CDR3為AA97至112，FR4為AA113至123。SEQIDNO.11表示新多肽(噬粒克隆AI-X16)L鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至60，CDR1為bp61至102，FR2為bp103至147，CDR2為bp148至168，FR3為bp169至264，CDR3為bp265至291，FR4為bp292至375。SEQIDNO.12表示對應於SEQIDNO.11所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至20，CDR1為AA21至34，FR2為AA35至49，CDR2為AA50至56，FR3為AA57至88，CDR3為AA89至97，FR4為AA98至125。SEQIDNO.13表示新多肽(噬粒克隆AI-X20)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至195，FR3為bp196至291，CDR3為bp292至333，FR4為bp334至366。SEQIDNO.14表示對應於SEQIDNO.13所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至65，FR3為AA66至97，CDR3為AA98至111，FR4為AA112至122。SEQIDNO.15表示新多肽(噬粒克隆AI-X39)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至198，FR3為bp199至294，CDR3為bp295至339，FR4為bp340至372。SEQIDNO.16表示對應於SEQIDNO.15所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至66，FR3為AA67至98，CDR3為AA99至113，FR4為AA114至124。SEQIDNO.17表示新多肽(噬粒克隆AI-X40)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至198，FR3為bp199至297，CDR3為bp298至339，FR4為bp340至372。SEQIDNO.18表示對應於SEQIDNO.17所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至66，FR3為AA67至99，CDR3為AA100至113，FR4為AA114至124。SEQIDNO.19表示新多肽(噬粒克隆AI-X2)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至195，FR3為bp196至291，CDR3為bp292至327，FR4為bp328至360。SEQIDNO.20表示對應於SEQIDNO.19所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至65，FR3為AA66至97，CDR3為AA98至109，FR4為AA110至120。SEQIDNO.21表示新多肽(噬粒克隆AI-B14)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至198，FR3為bp199至294，CDR3為bp295至336，FR4為bp337至369；該序列中可見下列變異第7位可以是C，而第9位可以是G，第13位為G，15位為G，91位為A，92位為G，98位為C，149位為T，205位為A，228位為A，251位為A，253位為T和/或284位為A。變異的結果是相應胺基酸序列(參見SEQIDNO.22)中第3位可以為Q，而第5位為V，31位為S，33位為A，50位為V，69位為T，76位為K，84位為N，85位為S和/或95位為Y。SEQIDNO.22表示對應於SEQIDNO.21所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至66，FR3為AA67至98，CDR3為AA99至112，FR4為AA113至123。SEQIDNO.23表示新多肽(噬粒克隆AI-B18)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至198，FR3為bp199至294，CDR3為bp295至333，FR4為bp334至366；該核苷酸序列中可見下列變異第7位可以是C，而第13位可以是G，第16位為C，56位為A，94位為T，97位為G，155位為T，173位為C，223位為T，252位為T或C，261位為G，267位為G，271位為A，275位為C和/或277位為G。變異的結果是相應胺基酸序列(參見SEQIDNO.24)中第3位可以為Q，而第5位為V，6位為Q，19位為K，32位為Y，33位為A，52位為I，58位為A，75位為S，84位為S，87位為R，89位為E，91位為T，92位為A和/或93位為V。SEQIDNO.24表示對應於SEQIDNO.23所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至66，FR3為AA67至98，CDR3為AA99至111，FR4為AA112至122。SEQIDNO.25表示新多肽(噬粒克隆AI-B24)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至198，FR3為bp199至294，CDR3為bp295至330，FR4為bp331至363；該核苷酸序列中可見下列變異第7位可以是C，而第9位可以是G，第13位為G，15位為G，31位為G，46位為A，67位為G，89位為G，92位為G，93位為C，98位為G，102位為G，140位為G，141位為G，145位為G，149位為T，157位為T，158位為A，160位為G，166位為A，173位為A，235位為T，251位為A，290位為C和/或293位為A。變異的結果是相應胺基酸序列(參見SEQIDNO.26)中第3位為Q，而第5位為V，11位為V，16位為R，23位為A，30位為S，31位為S，33位為G，34位為M，47位為W，49位為A，50位為V，53位為Y，54位為D，56位為S，58位為K，79位為L，84位為N，97位為A和/或98位為K。SEQIDNO.26表示對應於SEQIDNO.25所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至66，FR3為AA67至98，CDR3為AA99至110，FR4為AA111至121。SEQIDNO.27表示新多肽(噬粒克隆AI-B24)L鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至60，CDR1為bp61至96，FR2為bp97至138，CDR2為bp139至159，FR3為bp160至255，CDR3為bp256至282，FR4為bp283至366；該核苷酸序列中可見下列變異第4位可以是C或T，而第37位可以是G，第40位為A，50位為G，67位為A，72位為T，133位為A，136位為T，138位為T或C，148位為G，160位為T，161位為T，162位為T或C，200位為C，217位為T，218位為G，220位為A或C，269位為G，271位為T，272位為G，275位為G和/或282位為T或C。變異的結果是相應胺基酸序列(參見SEQIDNO.28)中第2位為L，而第13位為G，14位為K，17位為R，23位為N，24位為N，45位為I，47位為Y，50位為D，54位為F，67位為T，73位為S，74位為R，90位為S，91位為S，92位為S和/或94位為H。SEQIDNO.28表示對應於SEQIDNO.27所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至20，CDR1為AA21至32，FR2為AA33至46，CDR2為AA47至53，FR3為AA54至85，CDR3為AA86至94，FR4為AA95至122。SEQIDNO.29表示新多肽(噬粒克隆AI-B38)H鏈的核苷酸序列，其中FR1從bp1延伸至90，CDR1為bp91至105，FR2為bp106至147，CDR2為bp148至198，FR3為bp199至294，CDR3為bp295至333，FR4為bp334至366；該核苷酸序列中可見下列變異第7位可以是C，而第9位可以是G，第13位為G，15位為A和/或16位為C。變異的結果是相應的胺基酸序列中第3位為Q，而第5位為V和/或第6位為Q。SEQIDNO.30表示對應於SEQIDNO.29所示核苷酸序列的胺基酸序列，其中FR1從AA1延伸至30，CDR1為AA31至35，FR2為AA36至49，CDR2為AA50至66，FR3為AA67至98，CDR3為AA99至111，FR4為AA112至122。圖1顯示出因加入抗獨特型抗體phabAI-X17而使自身抗體phab(PDG-X)與GPIIb/IIIa的結合受到抑制。圖2顯示出因加入抗獨特型抗體phabAI-B而使自身抗體phab(PDG-B)與血小板的結合受到抑制。圖3顯示出自身抗體phab與未經處理的和經EDTA處理的血小板的結合。圖4顯示出由自身抗體phab引起的對血纖蛋白原與GPIIb/IIIa結合的抑制作用。圖5-7顯示出由抗體7E3和抗體片斷ReoPro引起的對自身抗體phab與GPIIb/IIIa結合的抑制作用。實施例1.鑑定自身抗體序列1.1.分離自身抗體自身抗體得自12個AITP患者(8個患原發性AITP，3個患與SLE相關的AITP，1個患與斯耶格倫症候群相關的AITP)，製備方法如下4℃下將患者血漿與純化的GPIIb/IIIa保溫過夜，隨後於室溫下用0.2mol/l甘氨酸和0.15mol/lNaCl，pH2.5洗脫15分鐘。100,000g離心30分鐘之後，用1mol/lTris-HCl中和上清液，對Tris緩衝的鹽溶液(TBS)透析過夜。提取血漿時，所有患者皆為血小板減少症(血小板數目＜150×109/l)，其骨髓中的巨核細胞正常或增大，沒有其它可測形式的免疫性血小板減少症。1.2.分離純化的抗原所用抗原為純化的GPIIb/IIIa，它是GPIIIa的胞質片斷(胺基酸721-744)和GPIIIa的細胞外片斷(胺基酸468-690)(Beardsley，Blut59(1989)，47-51和Phillips等，酶學方法，215(1992)，244-263)。1.3.分離血小板以用於淘選和免疫印跡通過差速離心取自健康人供體的經EDTA抗凝結的血樣來製備富含血小板的血漿。通過2000g離心15分鐘分離出血小板，然後用含有50mmol/l檸檬酸鈉，100mmol/lNaCl和125mmol/l葡萄糖的檸檬酸緩衝液(pH6.2)洗滌6次，最後重新懸浮於相同緩衝液中。使用相同的富集方法從患有格蘭茨曼I型血小板功能不全病的14歲男孩體內得到功能不全的血小板。1.4.單克隆抗體使用了識別複合形式的GPIIb/IIIa的鼠單克隆抗體和選擇性識別GPIIb或GPIIIa的抗體。這些抗體是使用相應的抗原，通過常規的免疫方法分離得到的，它們與AITP不相關。所述抗體的分離描述於Kouns等(生物化學雜誌267(1992)，18844-18851)，Steiner等(Biochim.Biophys.Acta1119(1992)，12-21)和Haring等(美國國家科學院院報82(1985)，4837-4841)。1.5.噬粒文庫使用得自健康、預先免疫過的人供體的外周血淋巴細胞，根據Vogel等(歐洲免疫學雜誌，24(1994)，1200-1207)所述的方法製備組合Fab文庫。除了Taq聚合酶(PerkinElmer，NJ，USA)外，所有酶和寡核苷酸都得自BoehringerMannheimGmbH(Mannheim，德國)。通過PCR擴增Fab分子H和L鏈的引物，VCSM13輔助噬菌體和大腸桿菌菌株XL-Blue都得自Stratacyte(LaJolla，CA，美國)。噬粒pComb3得自ScrippsResearchInstitute(LaJolla，CA，美國)。按BarbasIII和Lerner(MethodsCompanionMethodsEnzymol，2(1991)，119)所述進行克隆，轉化至XL-Blue細胞和製備phab。用4％(w/v)聚乙二醇8000和3％(w/v)NaCl沉澱phab，重新懸浮於PBS，pH7.4中。所得表達文庫含有1×107特異性。1.6.分離GPIIb/IIIa特異性phab利用總共5輪親和選擇(「淘選」)製備GPIIb/IIIa特異性phab。用5×107個功能不全的血小板預吸附(負選擇)之後，將phab與108個正常的血小板一起保溫45分鐘(正選擇)。然後用0.05mol/l檸檬酸鈉，pH2.5洗脫結合的phab，並用1mol/lTris緩衝液中和。每一輪淘選之後，通過滴定噬菌體集落形成單位監測GPIIb/IIIa特異性phab的富集。5輪選擇之後，發現洗脫的phab被富集了100倍以上。更仔細地分析第4輪選擇之後所得phab庫的GPIIb/IIIa特異性。為此，隨機選擇40個phab克隆，在免疫斑點試驗中確定其結合特異性。將1微升正常的和功能不全的血小板(109個/ml)，以及純化的GPIIb/IIIa(500μg/ml)滴加至硝酸纖維素條上(Millipor公司，Bedford，MA，美國)。將條置於含0.15％酪蛋白的TBS(TBS-酪蛋白)中封閉，然後與用TBS-酪蛋白稀釋的phab一起保溫過夜。用TBS-0.1％吐溫20(TBS-吐溫)洗滌3次後，與用TBS-酪蛋白稀釋1000倍的辣根過氧化物酶綴合的多克隆兔抗噬菌體抗體(Vogel等，文獻同上)保溫之後，用4-氯-1-α-萘酚(Merck，Darmstadt，德國)檢測結合的phab。還檢測了滴加前通過加熱(70℃)或酸處理(0.5NHCl，pH2)變性蛋白質之後phab與血小板和純化的GPIIb/IIIa的結合。在40個隨機選擇的克隆中，23個(57.5％)與GPIIb/IIIa反應，而17個未表現出任何結合。保溫前通過加熱或pH2處理變性抗原之後，未觀察到抗GPIIb/IIIa與phab的結合，從而闡明phab的結合需要完整的GPIIb/IIIa。在陰性phab中檢測Fab的存在情況揭示出15個克隆(88％)不含任何Fab分子。2個不與GPIIb/IIIa結合的Fab陽性克隆對GPIIb/IIIa可能有低結合親和性。1.7.Fab分析為了檢測陽性phab的κ，λ和Fd鏈，將抗GPIIb/IIIaphab滴加至硝酸纖維素上，將濾膜與已用TBS-酪蛋白稀釋1000倍的經過氧化物酶標記的小鼠抗人λ，κ(TheBindingSiteLimited，Birmingham，英國)和Fd抗體(得自HP6045雜交瘤細胞系，ATCC1757，Rockville，MD，美國)保溫4小時，然後通過化學發光法(ECL，Amersham，Switzerland，Zurich，Switzerland)顯色。檢測15個隨機選擇的抗GPIIb/IIIaFab克隆的κ，λ和Fd鏈，結果表明Fd鏈存在於12個克隆(80％)中，而λ鏈存在於所有克隆中。通過將集中的phab與多種濃度的血小板一起預保溫以定量測定Fab與血小板上GPIIb/IIIa的結合。然後通過免疫斑點法分析上清液。在此方面，確定每個血小板結合1-3×104個phab。這表明每個血小板上約10-50％GPIIb/IIIa分子可以被phab佔據。1.8.鑑定phab結合表位通過使用多種單克隆抗體(見1.4.)進行抑制試驗來測定phab的表位特異性。在雙份重複試驗中，各將1微升融化的正常和功能不全的血小板(109個/ml)，純化的GPIIb/IIIa(500μg/ml)，GPIIIa的肽片斷(胺基酸468-690，500μg/ml)和GPIIb/IIIa的胞質區段(500μg/ml)滴加至硝酸纖維素條上。封閉後，將phab克隆(0.4μg/mlFab)在加或不加單克隆抗體(1μg/ml)的情況下保溫過夜。使用經過氧化物酶標記的抗噬菌體抗體和4-氯-1-α-萘酚檢測結合的phab。在這些研究中鑑定出兩組phab克隆，A組(5個克隆)被所有抗體的匯集物中度抑制，但被GPIIb/IIIa複合物特異性抗體強烈抑制。抗GPIIb抗體沒有反應。B組(10個克隆)被所有抗體的匯集物完全抑制，但被複合物特異性抗體和IIb特異性抗體抑制的程度較低。兩組與GPIIIa特異性的抗體都未表現出反應。使用血小板或純化的GPIIb/IIIa作為抗原也得到相同的結果。未發現phab與胞質肽或GPIIIa的胞外片斷結合。這些結果概述於表1。表11.9.抑制試驗通過抑制試驗測定抗GPIIb/IIIaphab對患者自身抗體與GPIIb/IIIa結合的封閉作用。為此，使用兩個按上文所述鑑定的phab克隆(PDG16和PDG31)。從1∶3至1∶1000連續稀釋洗脫的患者自身抗體，分析其與純化的GPIIb/IIIa的結合。通過免疫斑點試驗可以實現此目的。在3份重複試驗中，各將100ng純化的GPIIb/IIIa滴加至硝酸纖維素條上，然後用TBS-酪蛋白封閉濾膜。為了用phab封閉AITP自身抗體與GPIIb/IIIa的結合，將濾膜條與1011個phab保溫1小時，然後與不同稀釋度的AITP自身抗體保溫4小時。使用經過氧化物酶標記的抗人IgG-Fc抗體和ECL檢測結合的自身抗體。抗GPIIb/IIIaphab抑制得自8個AITP患者的自身抗體的結合。對PTG16，PTG31和兩種phab的匯集物的抑制範圍分別為10至46％，32至60％和20至67％。這些phab對得自4個AITP患者的自身抗體的結合沒有影響。兩組都含有得自原發性AITP患者和與疾病相關之AITP患者的自身抗體。所得結果概述於表2。表21.10.DNA序列分析使用NukleobondAXPC20純化試劑盒(Macherey-NagelAG，Oensingen，Switzerland)從4個A組phab克隆和4個B組phab克隆中純化質粒DNA。使用PRISMReadyReactionDyeDeoxyTerminatorCycleSequencing試劑盒，在ABI373A測序系統上進行核酸測序。引物得自Microsynth，Balgach，Switzerland。使用下列引物測定H鏈的序列Chγ1(5』-CGCTGTGCCCCCAGAGGT-3』)和PCH(5』-GGCCGCAAATTCTATTTCAAGG-3』)。使用下列引物測定L鏈的序列cλ(5』-GAGACACACCAGTGTGGC-3』)，Ck(5』-CACAACAGAGGCAGTTCC-3』)和PCL(5』-CTAAACTAGCTAGTCTCC-3』)。將由DNA序列推定的胺基酸序列與GenEMBL-Genbank相比較，株系被定為VH和Vλ家族。通過自動測序分析各組中的4個phab克隆(A組PDG7，PDG8，PDG10和PDG16；B組PDG13，PDG17，PDG31和PDG37)的VH和Vλ核苷酸序列，並與已知株系的基因序列相比較(表3和4)。各組中H和L鏈推定的胺基酸序列之間有100％的同源性。與之形成對照的是，A組和B組H鏈胺基酸序列之間的同源性僅為36.9％，L鏈胺基酸序列之間的同源性為81.9％。就H鏈而言，A組克隆與VH4家族株系基因VH4.11(Sanz等，EMBOJ.8(1989)，3741-3748)的序列同一性程度最高。構架區(FR)有7個胺基酸差異，互補決定區(CDR)有8個胺基酸的差異。B組克隆與VH3家族最同源的1.9III株系序列(Berman等，EMBOJ.7(1988)，727-738)在FR內有4個胺基酸不同，在CDR內有1個胺基酸不同。就L鏈而言，A組和B組克隆與Vλ1家族DPL2株系基因序列(Williams和Winter，歐洲免疫學雜誌，323(1993)，1456)同源性最高。A組克隆在FR內有9個胺基酸差異，在CDR內有10個胺基酸的差異，B組克隆在FR內有1個胺基酸差異，在CDR內有2個胺基酸的差異，所得結果簡述於表3和4。表3A.重鏈克隆FR1CDR1FR2CDR2_____FR3CDR3FR4VH4.11QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPDG7--K-L---------------N-----R---G-S-R----S---------D-S-----K-K---R----L-------------N--------------VLPFDPISMDVWGKGTTVTVSSPDG8-------------------------------------------------------------------------------------------------VLPFDPISMDVWGKGTTVTVSSPDG10-------------------------------------------------------------------------------------------------VLPFDPISMDVWGKGTTVTVSSPDG16-------------------------------------------------------------------------------------------------VLPFDPISMDVWGKGTTVTVSS1.9IIIQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPDG13--K-L---------------------------A-----------------------------------A----------------------------RALGSWGGWDHYMDVWGKGTTVTVSSPDG17--------------------------------------------------------------------------------------------------ALGSWGGWDHYMDVWGKGTTVTVSSPDG31--------------------------------------------------------------------------------------------------ALGSWGGWDHYMDVWGKGTTVTVSSPDG37--------------------------------------------------------------------------------------------------ALGSWGGWDHYMDVWGKGTTVTVSSHB5255--Q-V---------------------------------------------------------------T-----------------------------DRPIARWTYGGMDVWGQGTTVTVSSB.輕鏈克隆FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4DPL2VLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPDG7-V------------W------------R--P-S--H-V---------FGSH-----------------------R----G-AG-----T---G---PVFGGGTKLTVLSQPPDG8--------------------------------------------------------------------------------------------------FGGGTKLTVLSQPPDG10--------------------------------------------------------------------------------------------------FGGGTKLTVLSQPPDG16--------------------------------------------------------------------------------------------------FGGGTKLTVLSQPDPL2VLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPDG13-V----------------------------------------------------------------------------------------------WVFGGGTKLTVLGQPPDG17--------------------------------------------------------------------------------------------------FGGGTKLTVLGQPPDG31--------------------------------------------------------------------------------------------------FGGGTKLTVLGQPPDG37--------------------------------------------------------------------------------------------------FGGGTKLTVLGQPFR構架區；CDR互補決定區。給出頂端序列(VH4.11；1.9III；DPL2)是為了進行比較，它們各代表最密切相關的已知株系基因序列的推定的胺基酸序列。虛線表示相同。M85255指的是EMPL/GenBank參照號，表示人抗GPIIb自身抗體2E7推定的胺基酸序列(Kunicki等，自身免疫學雜誌，4(1991)，433-446)。對重鏈而言，前3個胺基酸(QVK)由pComb3載體序列確定。表4顯示出A組和B組克隆與已知的株系V基因序列之間胺基酸同源性的排布。2.鑑定抗獨特型抗體序列2.1phab克隆AI-X根據實施例1所述的方法，使用噬粒技術鑑定抗獨特型抗體的序列。將實施例1中選定的克隆PDG16用作抗原，沒有陰性的預先選擇。使用組合phab文庫的匯集物測定外周血B淋巴細胞的非免疫文庫和已被紅細胞固定化的外周血淋巴細胞文庫，和得自扁桃體的B淋巴細胞非免疫文庫的特異性。分析4輪淘選之後所得的phab庫，為此，隨機選擇40個phab克隆，測定它們的結合特異性，選定克隆中有25個能與抗GPIIb/IIIaphab反應。這些抗獨特型phab克隆屬於兩組I組(3個克隆)僅與A組自身抗體phab克隆(PDG7，8，10和16)反應，而II組phab克隆(共22個克隆)與A組和B組phab克隆、鼠抗GPIIb/IIIa單克隆抗體、純化的血清免疫球蛋白(IVIgG)或其F(ab』)2片斷以及抗IgEFab都能反應。14個phab克隆(III組)不與上述任何物質反應。1個IV組phab克隆僅與抗GPIIb/IIIa抗體反應。這些特異性試驗的結果簡述於表5a中。對I組phab克隆(AI-X16，17和24)進行的DNA序列分析表明除了CDR2區域的1個胺基酸外，重鏈編碼序列完全相同，而輕鏈編碼序列完全相同。與已知株系基因序列的比較結果表明與VH3H鏈序列約有85％的同源性，與V-λIIL鏈家族序列約有90％同源性。在II，III和IV組phab克隆中各取1個代表，對其進行H鏈基因的DNA序列分析，序列分析的結果和與已知株系基因序列的比較結果簡述於表6和7a。抑制試驗的結果示於圖1，利用免疫斑點試驗測定純化的GPIIb/IIIa對AI-X17與PDG-A結合的抑制作用。將660和220ngPDG-Aphab分別滴加至硝酸纖維素濾膜上，將抗原與濃度範圍為50μg/ml至50ng/ml的GPIIb/IIIa保溫2小時，與緩衝溶液保溫2小時作為對照，然後再與噬菌體克隆AI-X17(終濃度為1012/ml)保溫2小時。使用過氧化物酶綴合的多克隆兔抗噬菌體抗體，通過電化學發光法檢測結合的噬菌體。發現AI-X17phab(I組)能抑制A組抗體phab(PDG-X)與IIb/IIIa糖蛋白的結合，這證明AI-X17能識別PDG-A上的抗原結合位點。測定結合PDG-A的另一個克隆AI-X2的序列，與克隆AI-X20，39和40類似，此克隆僅具有重鏈而無輕鏈。重鏈自身(可能是作為二聚體)能以足夠的特異性和親和性與抗原(即PDG-A)結合。2.2phab克隆AI-B根據實施例2.1所述的方法，使用噬粒技術鑑定其它抗獨特型抗體的序列，將實施例1中選擇的克隆PDG-B用作抗原。共選擇40個phab克隆，測定其結合特異性。選定克隆中的34個與抗GPIIb/IIIaphab反應，這些抗獨特型phab克隆屬於3組I組(14個克隆)僅與B組抗體phab克隆反應，而II組phab克隆(共8個克隆)與A組和B組phab克隆均反應，III組phab克隆(共12個克隆)還與鼠單克隆抗GPIIb/IIIa抗體、純化的血清免疫球蛋白(IVIgG)或其F(ab』)2片斷以及抗IgEFab反應。6個phab克隆(IV組)不與上述任何物質反應。這些特異性試驗的結果簡述於表5b中。對I組phab克隆(AI-14，18，24和38)進行DNA序列分析的結果簡述於表6和7b。克隆AI-B14，18和38僅具有重鏈。AI-B14和17是相同的，AI-B34和40也與AI-B18相同。AI-Bphab對PDG-B與血小板之結合的抑制作用示於圖2。利用流式細胞計數分析測定這種抑制作用。為此，使用輔助噬菌體作為對照，在存在或缺乏AI-Bphab時，將富含血小板的血漿(共107個血小板)與生物素化的PDG-B保溫。用低聚甲醛固定血小板，用R-藻紅蛋白(RPE)標記的鏈黴親和素檢測結合的PDG-B。FACScan儀器中的計數為10,000，記錄螢光的平均值(±SD)。克隆AI-B18，24和38獲得最強的抑制作用(＞60％)。結合抑制作用表明AI-B克隆能與PDG-B上的抗原結合位點相互作用。表5a結合於AIXphab克隆PDGAPDGB抗-IgEFab抗-GPIIb/IIIaSGF(ab』)2mAbI組16，17，243+-----II組22++++++1，2，3，4，5，6，7，9，11，13，14，23，26，27，28，29，33，35，36，37，38，40III組14------8，10，12，15，18，19，21，22，25，30，31，32，34，39IV組201---+--表5bAI-B結合於phab克隆nPDG-XPDG-B抗-IgE抗-GPIIb/IIIaIvIgGIvIgGFabmAbF(ab』)214(AI-B5，7，8，14，17，18，23，24，-+----30，31，33，34，38，40)8++----12++++++6------表6抗Id噬菌體克隆H鏈L鏈抗獨特型Phab-克隆VH家族株系基因同源性Vλ家族株系基因同源性(AI-X和AI-B)(％)*(％)*AI-X16，AI-X24VH3DP4788Vλ2DPL1088AI-X17VH3DP4787VΛ2DPL1088AI-X39VH3DP4994---AI-X40VH3DP3195---AI-X20VH4DP7178---AI-B14，AI-B17VH3DP4691---AI-B18VH1DP1085---AI-B24VH3DP4981VΛ33h82AI-B38VH1DP598---*各個phab克隆的胺基酸序列與已知株系V基因序列的最高同源性(以％表示)。表7aA.重鏈克隆FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4DP47EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAIX16Q-K---------H----------------DNF-----------------G---G-LL-H-------------N--R--V-------------------VRDLGYRVLSTFTFDIWGQGTKVTVSSAIX24-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AIX17-------------------------------------------------------------N---------------------------------------------------------------DP49QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAIX39--K-L-------H-------------------T----------------L------------------A-----------------K-----------DGRSGSYARFDGMDVWGQGTTVTVSSDP31EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDAIX40Q-K-L----------------------------L-------------------D-T----------------------------------------V--MGSSVVATYNAFDIWGQGTMVTVSSDP71QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAIX20--K-L--------------------DV--R-H----L------------F--DGAR-RF----R---SL-M-P-K-------G------S-------DADGDGFSPYYFPYWGQGIPVSVSSB.輕鏈克隆FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4DPL10QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQNPGKAPKLMIYEVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSSTFAIX16VV-----------------------AI-N--F-P----------------G---------------------------------E------VH---NWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSAIX24-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AIX17-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------25FR構架區；CDR互補決定區。給出頂端序列(DP47；DP49；DP31；DP71和DPL10)是為了進行比較，它們各代表最密切相關的已知株系序列。虛線表示相同。對重鏈而言，前3個胺基酸(QVK)由pComb3載體序列確定。表7bA.重鏈克隆FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4DP-46QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAI-B14--K-L-------------------------D-G----------------A------------------S------N-------ST---------F---DSETAIAAAGRFDIWGQGTMVTVSSAI-B17-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------DP-10QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAI-B18--K-LE------------M------------HT------------------T-----V-----------P-------------R--T-DDSGI-----EDGTTVPSQPLEFWGQGTRVTVSSDP-49QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAI-B24--K-L-----L----G------S------NK-AI------------Y-SA--SN-G-T--------------------V----S------------VRGSGSYLGYYFDYWGQGTLVTVSSDP-5QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATAI-B38Q-K-LE-------------------------------------------------------------------------------------------GLRSYNYGRNLDYWGQGTLVTVSSB.輕鏈克隆FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4VL3hSYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSFIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVHDSSSDHAI-B24-V----------RQ--T-----YK--------------------V-E--Y---E------------M-----TG---------------NTN-QTIFGGGTKLTVLRQPKAAPSVTLFPPSSFR構架區；CDR互補決定區。給出頂端序列(DP46；DP10；DP49；DP5扣VL3h)是為了進行比較，它們各代表最密切相關的已知株系序列。虛線表示相同。對重鏈而言，前3個胺基酸(QVK)由pComb3載體序列確定。3.自身抗體多肽對血纖蛋白原與血小板之結合的影響3.1方法分析Fab與經EDTA預處理的血小板的結合將富含血小板的血漿與10mMEDTA保溫30分鐘，加入生物素化的PDG-B和PDG-A多肽，室溫下將混合物保溫1小時，使用藻紅蛋白標記的鏈黴親和素通過流式細胞計數分析測定PDG-A和PDG-B與血小板的結合。聚集實驗新鮮製備富含血小板的血漿(250×109/l)，將其保存於5％CO2中。在缺乏或存在PDG-A或PDG-B的情況下(最大量為10微克Fab)，通過不同稀釋度的ADP(最大濃度為410μM)激活血漿。在Rodell300BD-5aggregometer(BaxterAG，Dudingen，Switzerland)中測定聚集作用。在隨後的實驗中，加入PDG-A或PDG-B之後再將多克隆的抗Fab抗血清加入激活的血小板中。血纖蛋白原結合試驗用0.5μg/mlGPIIb/IIIa包被ELISA板的孔，並用溶於Tris-緩衝鹽溶液的3.5％牛血清白蛋白封閉之。在缺乏或存在PDG-A，PDG-B或作為對照的抗IgEFab(最大濃度為23μg/ml)的情況下，以不同的濃度(最大為0.08μg/ml)加入血纖蛋白原(KabiDiagnostics，Stockholm，Sweden)。用大鼠抗人血纖蛋白原抗體、生物素化的小鼠抗大鼠抗體和由鏈黴親和素和生物素化的辣根過氧化物酶組成的綴合物(AmershamPharmaciaBiotechEuropeGmbH，Dubendorf，Switzerland)，使用ELISAEasyReader(EAR340AT，SLTInstruments，Austria)，在405nm下測定結合的血纖蛋白原。使用單克隆抗體7E3和抗體片斷ReoPro的競爭試驗在存在或缺乏鼠單克隆抗體7E3或其Fab片斷ReoPro(Fab總量範圍為1014至1010)的情況下，將富含血小板的血漿(230×109/l)與PDG-B或PDG-A(分別為200和400μg/ml)一起保溫1.5小時。用等體積的1％低聚甲醛固定之後，使用藻紅蛋白標記的鏈黴親和素通過流式細胞計數分析測定PDG-B和PDG-A與血小板的結合。3.2結果檢測的重組型抗GPIIb/IIIaFab自身抗體片斷未表現出與經10mMEDTA預處理的血小板的結合，這表明自身抗體片斷僅識別構象完整的抗原(圖3)。在使用富含血小板之血漿的聚集實驗中，PDG-A和PDG-B都不能抑制聚集。在血纖蛋白原的濃度比血清中的低104至106倍的血纖蛋白原結合試驗中，PDG-A和PDG-B完全抑制血纖蛋白原的結合(圖4)。當將使用類似的富集方法得到的抗IgEFab用作對照時，沒有抑制作用出現。這些結果表明PDG-A和PDG-B均與GPIIb/IIIa上的血纖蛋白原結合位點強有力地相互作用。在用鼠單克隆抗GPIIb/IIIa抗體7E3或其可商購的Fab片斷ReoPro進行的研究中，它們都能抑制血纖蛋白原與激活的GPIIb/IIIa結合，PDG-B與血小板的結合被選擇性地和完全地抑制(圖5和7)。與之形成對照的是，7E3或ReoPro都未顯著抑制PDG-A與血小板的結合。序列表1)一般資料(i)申請人(A)姓名ASATAGAppliedScienceTechnology(B)街道Baarerstrasse77(C)城市Zug(E)國家瑞士(F)郵政編碼6302(ii)發明題目重組抗體(iii)序列數30(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)原始申請資料(A)申請號DE19723904.8(B)申請日06-JUN-1997(vi)原始申請資料(A)申請號DE19755227.7(B)申請日12-DEC-1997(vi)原始申請資料(A)申請號DE19820663.1(B)申請日08-MAY-1998(2)SEQIDNO1的資料(i)序列特徵(A)長度357個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..357(xi)序列描述SEQIDNO1CAGGTGAAACTGCTCGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu151015ACCCTGTCCCTCAACTGCACTGTCTCTGGTCGCTCCATCAGTGGTTAC96ThrLeuSerLeuAsnCysThrValSerGlyArgSerIleSerGlyTyr202530TCTTGGAGATGGATCCGGCAGTCTCCAGGGAAGGGACTAGAGTGGATT144SerTrpArgTrpIleArgGlnSerProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GGGGATATCTCTTATAGTGGGAGTACCAAGTACAAACCCTCCCTCAGG192GlyAspIleSerTyrSerGlySerThrLysTyrLysProSerLeuArg505560AGTCGAGTCACCCTGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTG240SerArgValThrLeuSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580AAGCTGAATTCGGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCG288LysLeuAsnSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095CGAGTCTTGCCCTTTGACCCGATCTCGATGGACGTCTGGGGCAAAGGG336ArgValLeuProPheAspProIleSerMetAspValTrpGlyLysGly100105110ACCACGGTCACCGTCTCCTCA357ThrThrValThrValSerSer115(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特徵(A)長度119個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO2GlnValLysLeuLeuGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuAsnCysThrValSerGlyArgSerIleSerGlyTyr202530SerTrpArgTrpIleArgGlnSerProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyAspIleSerTyrSerGlySerThrLysTyrLysProSerLeuArg505560SerArgValThrLeuSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuAsnSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgValLeuProPheAspProIleSerMetAspValTrpGlyLysGly100105110ThrThrValThrValSerSer115(2)SEQIDNO3的資料(i)序列特徵(A)長度333個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..333(xi)序列描述SEQIDNO3GTGGTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGTGGGTC48ValValThrGlnProProSerAlaSerGlyThrProGlyGlnTrpVal120125130135ACCATCTCTTGTTCTGGGAGCAGCTCCAACATCAGAAGTAATCCTGTT96ThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleArgSerAsnProVal140145150AGCTGGTATCACCAGGTCCCAGGCACGGCCCCCAAACTCCTCATCTTT144SerTrpTyrHisGlnValProGlyThrAlaProLysLeuLeuIlePhe155160165GGTAGTCATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCC192GlySerHisGlnArgProSerGlyValProAspArgPheSerGlySer170175180AAGTCGGGCACCTCCGCCTCCCTGGCCATCCGTGGGCTCCAATCTGGG240LysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlaIleArgGlyLeuGlnSerGly185190195GATGCTGGTGACTATTACTGTGCAACATGGGATGACGGCCTCAATGGT288AspAlaGlyAspTyrTyrCysAlaThrTrpAspAspGlyLeuAsnGly200205210215CCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGTCAGCCC333ProValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuSerGlnPro220225230(2)SEQIDNO4的資料(i)序列特徵(A)長度111個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO4ValValThrGlnProProSerAlaSerGlyThrProGlyGlnTrpVal151015ThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleArgSerAsnProVal202530SerTrpTyrHisGlnValProGlyThrAlaProLysLeuLeuIlePhe354045GlySerHisGlnArgProSerGlyValProAspArgPheSerGlySer505560LysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlaIleArgGlyLeuGlnSerGly65707580AspAlaGlyAspTyrTyrCysAlaThrTrpAspAspGlyLeuAsnGly859095ProValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuSerGlnPro100105110(2)SEQIDNO5的資料(i)序列特徵(A)長度369個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..369(xi)序列描述SEQIDNO5CAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg115120125TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTAT96SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSarGlyPheThrPheSerSerTyr130135140GCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTG144AlaMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal145150155GCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTG192AlaValIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal160165170175AAGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT240LysGlyArgPheAlaIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr180185190CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT288LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys195200205GCGAGAGCGCTGGGGAGCTGGGGGGGTTGGGACCACTACATGGACGTC336AlaArgAlaLeuGlySerTrpGlyGlyTrpAspHisTyrMetAspVal210215220TGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA369TrpGlyLysGlyThrThrValThrValSerSer225230(2)SEQIDNO6的資料(i)序列特徵(A)長度123個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO6GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaValIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheAlaIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAlaLeuGlySerTrpGlyGlyTrpAspHisTyrMetAspVal100105110TrpGlyLysGlyThrThrValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO7的資料(i)序列特徵(A)長度333個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..333(xi)序列描述SEQIDNO7GTGGTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTC48ValValThrGlnProProSerAlaSerGlyThrProGlyGlnArgVal125130135ACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATACTGTA96ThrIleSerCysSerGlySarSerSerAsnIleGlySerAsnThrVal140145150155AACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTAT144AsnTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeuIleTyr160165170AGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCC192SerAsnAsnGlnArgProSerGlyValProAspArgPheSerGlySer175180185AAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAG240LysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlaIleSerGlyLeuGlnSerGlu190195200GATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGT288AspGluAlaAspTyrTyrCysAlaAlaTrpAspAspSerLeuAsnGly205210215TGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCC333TrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGlnPro220225230(2)SEQIDNO8的資料(i)序列特徵(A)長度111個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO8ValValThrGlnProProSerAlaSerGlyThrProGlyGlnArgVal151015ThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlySerAsnThrVal202530AsnTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeuIleTyr354045SerAsnAsnGlnArgProSerGlyValProAspArgPheSerGlySer505560LysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlaIleSerGlyLeuGlnSerGlu65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysAlaAlaTrpAspAspSerLeuAsnGly859095TrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGlnPro100105110(2)SEQIDNO9的資料(i)序列特徵(A)長度369個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..369(xi)序列描述SEQIDNO9CAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTTCACCCCGGGGGG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValHisProGlyGly115120125TCCCTGAGACTCTCTTGTGCAGCCTCTGGATTTACGTTTGACAACTTT96SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAspAsnPhe130135140GCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC144AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal145150155TCAGGCATTAGTGGTGGTGGTCTTTTGACACACTACGCAGACTCCGTG192SerGlyIleSerGlyGlyGlyLeuLeuThrHisTyrAlaAspSerVal160165170175AAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAAACAATTCCAGGAACACTGTATAC240LysGlyArgPheThrIleSerArgAsnAsnSerArgAsnThrValTyr180185190CTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTGTATTATTGT288LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys195200205GTGAGAGATCTGGGCTATAGAGTACTTTCGACTTTTACTTTTGATATC336ValArgAspLeuGlyTyrArgValLeuSerThrPheThrPheAspIle210215220TGGGGCCAGGGGACAAAGGTCACCGTCTCTTCA369TrpGlyGlnGlyThrLysValThrValSerSer225230(2)SEQIDNO10的資料(i)序列特徵(A)長度123個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO10GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValHisProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAspAsnPhe202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerGlyIleSerGlyGlyGlyLeuLeuThrHisTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAsnAsnSerArgAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095ValArgAspLeuGlyTyrArgValLeuSerThrPheThrPheAspIle100105110TrpGlyGlnGlyThrLysValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO11的資料(i)序列特徵(A)長度375個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..375(xi)序列描述SEQIDNO11GTGGTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATC48ValValThrGlnProAlaSerValSerGlySerProGlyGlnSerIle125130135ACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGCTATTGGGAATTATAACTTT96ThrIleSerCysThrGlyThrSerSerAlaIleGlyAsnTyrAsnPhe140145150155GTCCCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATT144ValProTrpTyrGlnGlnHisProGlyLysAlaProLysLeuMetIle160165170TATGAGGGCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGC192TyrGluGlySerLysArgProSerGlyValSerAsnArgPheSerGly175180185TCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCT240SerLysSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrIleSerGlyLeuGlnAla190195200GAGGACGAGGCTGAGTATTACTGCTGCTCATATGTTCATAGTAGCACT288GluAspGluAlaGluTyrTyrCysCysSerTyrValHisSerSerThr205210215AATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCC336AsnTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGlnPro220225230235AAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCT375LysAlaAlaProSerValThrLeuPheProProSerSer240245(2)SEQIDNO12的資料(i)序列特徵(A)長度125個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO12ValValThrGlnProAlaSerValSerGlySerProGlyGlnSerIle151015ThrIleSerCysThrGlyThrSerSerAlaIleGlyAsnTyrAsnPhe202530ValProTrpTyrGlnGlnHisProGlyLysAlaProLysLeuMetIle354045TyrGluGlySerLysArgProSerGlyValSerAsnArgPheSerGly505560SerLysSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrIleSerGlyLeuGlnAla65707580GluAspGluAlaGluTyrTyrCysCysSerTyrValHisSerSerThr859095AsnTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGlnPro100105110LysAlaAlaProSerValThrLeuPheProProSerSer115120125(2)SEQIDNO13的資料(i)序列特徵(A)長度366個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..366(xi)序列描述SEQIDNO13CAGGTGAAACTGCTCGAGTCAGGACCAGGACTGGTGAAGCCCTCGGAG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu130135140ACCCTGTCTCTCACCTGCACTGTCTCTGATGTCTCCATCAGAAGTCAT96ThrLeuSerLeuThrCysThrValSerAspValSerIleArgSerHis145150155TACTGGAGTTGGCTCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATT144TyrTrpSerTrpLeuArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle160165170GGGTTTATCTATGACGGTGCGAGAACCAGGTTCAACCCCTCCCTCAGG192GlyPheIleTyrAspGlyAlaArgThrArgPheAsnProSerLeuArg175180185AGTCGAGTCTCCCTTTCAATGGACCCATCCAAGAAGCAGTTTTCCCTG240SerArgValSerLeuSerMetAspProSerLysLysGlnPheSerLeu190195200205AAACTGGGGTCTGTGACCGCTGCGGACTCGGCCGTCTACTACTGTGCG288LysLeuGlySerValThrAlaAlaAspSerAlaValTyrTyrCysAla210215220AGAGACGCGGATGGAGATGGCTTCAGCCCATACTACTTTCCCTACTGG336ArgAspAlaAspGlyAspGlyPheSerProTyrTyrPheProTyrTrp225230235GGCCAGGGAATCCCGGTCTCCGTCTCCTCG366GlyGlnGlyIleProValSerValSerSer240245(2)SEQIDNO14的資料(i)序列特徵(A)長度122個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO14GlnValLysLeuLeuGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysThrValSerAspValSerIleArgSerHis202530TyrTrpSerTrpLeuArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyPheIleTyrAspGlyAlaArgThrArgPheAsnProSerLeuArg505560SerArgValSerLeuSerMetAspProSerLysLysGlnPheSerLeu65707580LysLeuGlySerValThrAlaAlaAspSerAlaValTyrTyrCysAla859095ArgAspAlaAspGlyAspGlyPheSerProTyrTyrPheProTyrTrp100105110GlyGlnGlyIleProValSerValSerSer115120(2)SEQIDNO15的資料(i)序列特徵(A)長度372個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..372(xi)序列描述SEQIDNO15CAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCACCCTGGGAGG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyValValHisProGlyArg125130135TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTAT96SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr140145150ACTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTG144ThrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal155160165170GCACTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTG192AlaLeuIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal175180185AAGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTATAT240LysGlyArgPheAlaIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr190195200CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT288LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys205210215GCGAAAGATGGCCGGAGTGGGAGCTACGCCAGGTTCGACGGTATGGAC336AlaLysAspGlyArgSerGlySerTyrAlaArgPheAspGlyMetAsp220225230GTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA372ValTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSer235240245(2)SEQIDNO16的資料(i)序列特徵(A)長度124個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO16GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyValValHisProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530ThrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaLeuIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheAlaIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysAspGlyArgSerGlySerTyrAlaArgPheAspGlyMetAsp100105110ValTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO17的資料(i)序列特徵(A)長度372個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..372(xi)序列描述SEQIDNO17CAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyArg125130135140TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTAT96SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAspAspTyr145150155GCCCTGCACTGGGTCCGTCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTC144AlaLeuHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal160165170TCAGGTATTAGTTGGGATAGTGGTACCATAGGCTATGCGGACTCTGTG192SerGlyIleSerTrpAspSerGlyThrIleGlyTyrAlaAspSerVal175180185AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT240LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr190195200CTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGT288LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaLeuTyrTyrCys205210215220GTAAAAGATATGGGGTCTTCGGTAGTGGCTACGTACAATGCTTTTGAT336ValLysAspMetGlySerSerValValAlaThrTyrAsnAlaPheAsp225230235ATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA372IleTrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSer240245(2)SEQIDNO18的資料(i)序列特徵(A)長度124個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO18GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAspAspTyr202530AlaLeuHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerGlyIleSerTrpAspSerGlyThrIleGlyTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaLeuTyrTyrCys859095ValLysAspMetGlySerSerValValAlaThrTyrAsnAlaPheAsp100105110IleTrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO19的資料(i)序列特徵(A)長度360個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型mRNA的cDNA(vii)直接來源(B)克隆AI-X2(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..360(xi)序列描述SEQIDNO19CAGGTGAAACTGCTCGAGTCAGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu125130135140ACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCTTCAGTACTTAC96ThrLeuSerLeuThrCysThrValSerGlyGlySerPheSerThrTyr145150155TATTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATT144TyrTrpSerTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle160165170GGGTATATCTATTACAGTGGGAACACCAACTACAACCCCTCCCTCAAG192GlyTyrIleTyrTyrSerGlyAsnThrAsnTyrAsnProSerLeuLys175180185AGTCGAGCCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTG240SerArgAlaThrIleSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu190195200AAGCTGAGCTCTGTTACCGCCGCAGACACGGCCGTATATTACTGTGCG288LysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla205210215220AGACTGCGTAACGATGGCTGGAATGATGGCTTTGATATCTGGGGCCAA336ArgLeuArgAsnAspGlyTrpAsnAspGlyPheAspIleTrpGlyGln225230235GGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA360GlyThrMetValThrValSerSer240(2)SEQIDNO20的資料(i)序列特徵(A)長度120個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO20GlnValLysLeuLeuGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysThrValSerGlyGlySerPheSerThrTyr202530TyrTrpSerTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyTyrIleTyrTyrSerGlyAsnThrAsnTyrAsnProSerLeuLys505560SerArgAlaThrIleSerValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgLeuArgAsnAspGlyTrpAsnAspGlyPheAspIleTrpGlyGln100105110GlyThrMetValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO21的資料(i)序列特徵(A)長度369個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型mRNA的cDNA(vi)原始來源(A)生物體人(vii)直接來源(B)克隆AI-B14(viii)基因組中的位置(A)染色體/區段14(B)作圖位置q32.3(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..369(xi)序列描述SEQIDNO21CAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg125130135TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTAT96SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAspTyr140145150GGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTG144GlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal155160165GCAGCTATATCATATGATGGAAGTAACAAATACTATGCAGACTCCGTG192AlaAlaIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal170175180AAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAATTCCAACAATACGCTATAT240LysGlyArgPheSerIleSerArgAspAsnSerAsnAsnThrLeuTyr185190195200CTGCAAATGAGCACCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTTCTGT288LeuGlnMetSerThrLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrPheCys205210215GCGAGAGATTCGGAAACGGCAATAGCGGCAGCTGGACGGTTTGATATC336AlaArgAspSerGluThrAlaIleAlaAlaAlaGlyArgPheAspIle220225230TGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA369TrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSer235240(2)SEQIDNO22的資料(i)序列特徵(A)長度123個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO22GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAspTyr202530GlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaAlaIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheSerIleSerArgAspAsnSerAsnAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetSerThrLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrPheCys859095AlaArgAspSerGluThrAlaIleAlaAlaAlaGlyArgPheAspIle100105110TrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO23的資料(i)序列特徵(A)長度366個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型mRNA的cDNA(vi)原始來源(A)生物體人(vii)直接來源(B)克隆AI-B18(viii)基因組中的位置(A)染色體/區段14(B)作圖位置q32.3(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..366(xi)序列描述SEQIDNO23CAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCC48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer125130135TCGGTGATGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCCAT96SerValMetValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerHis140145150155ACTATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATG144ThrIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet160165170GGAGGGATCACCCCTATCTTTGGTACAGTGAACTACGCACAGAAGTTC192GlyGlyIleThrProIlePheGlyThrValAsnTyrAlaGlnLysPhe175180185CAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAACCCACGAGCACAGCCTAC240GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspGluProThrSerThrAlaTyr190195200ATGGAACTGAGGAGCCTGACATCTGACGACTCGGGCATCTATTACTGT288MetGluLeuArgSerLeuThrSerAspAspSerGlyIleTyrTyrCys205210215GCGAGAGAAGATGGCACTACAGTACCAAGTCAACCCCTTGAGTTCTGG336AlaArgGluAspGlyThrThrValProSerGlnProLeuGluPheTrp220225230235GGCCAGGGAACCCGGGTCACCGTCTCCTCT366GlyGlnGlyThrArgValThrValSerSer240245(2)SEQIDNO24的資料(i)序列特徵(A)長度122個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO24GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValMetValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerHis202530ThrIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleThrProIlePheGlyThrValAsnTyrAlaGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspGluProThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuThrSerAspAspSerGlyIleTyrTyrCys859095AlaArgGluAspGlyThrThrValProSerGlnProLeuGluPheTrp100105110GlyGlnGlyThrArgValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO25的資料(i)序列特徵(A)長度363個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型mRNA的cDNA(vi)原始來源(A)生物體人(vii)直接來源(B)克隆AI-B24(viii)基因組中的位置(A)染色體/區段14(B)作圖位置q32.3(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..363(xi)序列描述SEQIDNO25CAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGG48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly125130135TCCCTGAGACTCTCCTGTTCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAAATAT96SerLeuArgLeuSerCysSerAlaSerGlyPheThrPheAsnLysTyr140145150GCAATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAATATGTT144AlaIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTyrVal155160165170TCAGCTATTAGTAGTAATGGGGGTAACACATACTACGCAGACTCCGTG192SerAlaIleSerSerAsnGlyGlyAsnThrTyrTyrAlaAspSerVal175180185AAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGGTGTAT240LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrValTyr190195200CTTCAAATGAGCAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT288LeuGlnMetSerSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys205210215GTTAGAGGAAGTGGGAGCTACTTAGGATACTACTTTGACTACTGGGGC336ValArgGlySerGlySerTyrLeuGlyTyrTyrPheAspTyrTrpGly220225230CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA363GlnGlyThrLeuValThrValSerSer235240(2)SEQIDNO26的資料(i)序列特徵(A)長度121個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO26GlnValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysSerAlaSerGlyPheThrPheAsnLysTyr202530AlaIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTyrVal354045SerAlaIleSerSerAsnGlyGlyAsnThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetSerSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095ValArgGlySerGlySerTyrLeuGlyTyrTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO27的資料(i)序列特徵(A)長度366個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型mRNA的cDNA(vi)原始來源(A)生物體人(vii)直接來源(B)克隆AI-B24(viii)基因組中的位置(A)染色體/區段22(B)作圖位置q11(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..366(xi)序列描述SEQIDNO27GTGGTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCTCCAAGACAGACGGCC48ValValThrGlnProProSerValSerValAlaProArgGlnThrAla125130135ACGATTACCTGTGGGGGATACAAGATTGGAAGTAAAAGTGTCCACTGG96ThrIleThrCysGlyGlyTyrLysIleGlySerLysSerValHisTrp140145150TACCAACAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTATTGGTCGTCTATGAGGAT144TyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValValTyrGluAsp155160165TCCTACCGGCCCTCAGAGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCT192SerTyrArgProSerGluIleProGluArgPheSerGlySerAsnSer170175180185GGGAACATGGCCACCCTGACCATCACCGGGGTCGAAGCCGGGGATGAG240GlyAsnMetAlaThrLeuThrIleThrGlyValGluAlaGlyAspGlu190195200GCCGACTACTACTGTCAGGTGTGGGATAATACTAATGATCAGACGATA288AlaAspTyrTyrCysGlnValTrpAspAsnThrAsnAspGlnThrIle205210215TTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTACGTCAGCCCAAGGCTGCC336PheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuArgGlnProLysAlaAla220225230CCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCT366ProSerValThrLeuPheProProSerSer235240(2)SEQIDNO28的資料(i)序列特徵(A)長度122個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO28ValValThrGlnProProSerValSerValAlaProArgGlnThrAla151015ThrIleThrCysGlyGlyTyrLysIleGlySerLysSerValHisTrp202530TyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValValTyrGluAsp354045SerTyrArgProSerGluIleProGluArgPheSerGlySerAsnSer505560GlyAsnMetAlaThrLeuThrIleThrGlyValGluAlaGlyAspGlu65707580AlaAspTyrTyrCysGlnValTrpAspAsnThrAsnAspGlnThrIle859095PheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuArgGlnProLysAlaAla100105110ProSerValThrLeuPheProProSerSer115120(2)SEQIDNO29的資料(i)序列特徵(A)長度366個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型mRNA的cDNA(vi)原始來源(A)生物體人(vii)直接來源(B)克隆AI-B38(viii)基因組中的位置(A)染色體/區段14(B)作圖位置q32.3(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..366(xi)序列描述SEQIDNO29CAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCC48GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla125130135TCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATACACCCTCACTGAATTA96SerValLysValSerCysLysValSerGlyTyrThrLeuThrGluLeu140145150TCCATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATG144SerMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpMet155160165170GGAGGTTTTGATCCTGAAGATGGTGAAACAATCTACGCACAGAAATTC192GlyGlyPheAspProGluAspGlyGluThrIleTyrAlaGlnLysPhe175180185CAGGGCAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACGGCCTAC240GlnGlyArgValThrMetThrGluAspThrSerThrAspThrAlaTyr190195200ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT288MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys205210215GAGACAGGTCTGAGGTCGTACAACTATGGTCGTAACCTTGACTATTGG336GluThrGlyLeuArgSerTyrAsnTyrGlyArgAsnLeuAspTyrTrp220225230GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA366GlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer235240(2)SEQIDNO30的資料(i)序列特徵(A)長度122個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO30GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysValSerGlyTyrThrLeuThrGluLeu202530SerMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyPheAspProGluAspGlyGluThrIleTyrAlaGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrMetThrGluAspThrSerThrAspThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095GluThrGlyLeuArgSerTyrAsnTyrGlyArgAsnLeuAspTyrTrp100105110GlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120權利要求1.編碼人抗體重鏈或者其功能衍生物或其片斷、並包含選自下組的CDR3區域的核酸(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列VLPFDPISMDV(I)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列ALGSWGGWDHYMDV(II)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列，和(d)編碼具有同等的與GPIIb/IIIa結合之能力的胺基酸序列的核苷酸序列。2.根據權利要求1的核酸，其進一步含有選自下組的CDR1區域(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列GYSWR(III)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列SYAMH(IV)和(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。3.根據權利要求1或2的核酸，其進一步含有選自下組的CDR2區域(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列DISYSGSTKYKPSLRS(V)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(VI)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。4.編碼人抗體輕鏈或者其功能衍生物或其片斷、包含選自下組的CDR3區域的核酸(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列ATWDDGLNGPV(VII)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列AAWDDSLNGWV(VIII)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列，和(d)編碼具有同等的與GPIIb/IIIa結合之能力的胺基酸序列的核苷酸序列。5.根據權利要求4的核酸，其進一步含有選自下組的CDR1區域(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列SGSSSNIRSNPVS(IX)(c)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列SGSSSNIGSNTVN(X)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。6.根據權利要求4或5的核酸，其進一步含有選自下組的CDR2區域(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列GSHQRPS(XI)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列SNNQRPS(XII)(c)編碼與(a)或(b)中的胺基酸序列具有至少80％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列。7.編碼人抗體重鏈或者其功能衍生物或其片斷、包含選自下組的CDR3區域的核酸(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列VRDLGYRVLSTFTFDI(XIII)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列DGRSGSYARFDGMDV(XIV)(c)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列MGSSVVATYNAFDI(XV)(d)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列DADGDGFSPYYFPY(XVI)(e)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列LRNDGWNDGFDI(XVII)(f)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列DSETAIAAAGRFDI(XVIII)(g)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列EDGTTVPSQPLEF(XIX)(h)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列GSGSYLGYYFDY(XX)(i)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列GLRSYNYGRNLDY(XXI)(j)編碼與(a)、(b)、(c)或(d)中的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列，和(k)編碼具有同等的與針對GPIIb/IIIa之自身抗體結合的能力的胺基酸序列的核苷酸序列。8.根據權利要求7的核酸，其進一步含有CDR1和/或CDR2區域，所述區域選自編碼表7a或b所示胺基酸序列或與其至少80％同源的胺基酸序列的核苷酸序列。9.編碼人抗體輕鏈或者其功能衍生物或其片斷，包含選自下組的CDR3區域的核酸(a)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列CSYVHSSTN(XXII)(b)編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列QVWDNTNDQ(XXIII)(c)編碼與(a)的胺基酸序列具有至少80％、優選至少90％同源性的胺基酸序列的核苷酸序列，和(d)編碼具有同等的與抗GPIIb/IIIa之自身抗體結合之能力的胺基酸序列的核苷酸序列。10.根據權利要求9的核酸，其進一步含有CDR1和/或CDR2區域，所述區域選自編碼表7a或b所示胺基酸序列或與其至少80％同源的胺基酸序列的核苷酸序列。11.一種載體，其特徵在於(a)含有至少1拷貝根據權利要求1至3中任一項的核酸和/或至少1拷貝根據權利要求4至6中任一項的核酸或者(b)含有至少1拷貝根據權利要求7或8的核酸和/或至少1拷貝根據權利要求9或10的核酸。12.一種細胞，其特徵在於(a)表達根據權利要求1至3中任一項的核酸和/或根據權利要求4至6中任一項的核酸或者(b)根據權利要求7或8的核酸和/或根據權利要求9或10的核酸。13.一種多肽，其特徵在於(a)由根據權利要求1至3中任一項的核酸和/或根據權利要求4至8中任一項的核酸或者(b)根據權利要求7或8的核酸和/或根據權利要求9或10的核酸編碼。14.根據權利要求13的多肽，其特徵在於含有人抗體H鏈的可變區和/或L鏈的可變區。15.根據權利要求14的多肽，其特徵在於同時含有H鏈的可變區和L鏈的可變區。16.根據權利要求13至15中任一項的多肽，其特徵在於偶聯了標記基團或毒素。17.針對根據權利要求13至16中任一項之多肽的抗體。18.根據權利要求17的抗體，其特徵在於該抗體針對的是多肽抗體重鏈和/或輕鏈的CDR3區域。19.一種藥物組合物，其含有根據權利要求1至10中任一項的核酸、根據權利要求11的載體、根據權利要求12的細胞、根據權利要求13至16中任一項的多肽或者根據權利要求17或18的抗體作為活性成分，適當時還含有其它活性成分和常規的藥用佐劑、添加劑或賦形劑。20.根據權利要求1至10中任一項的核酸、根據權利要求11的載體、根據權利要求12的細胞、根據權利要求13至16中任一項的多肽、根據權利要求17或18的抗體或者根據權利要求19的藥物組合物用於製備診斷或者治療或預防AITP之藥劑的用途。21.根據權利要求1至10中任一項的核酸、根據權利要求11的載體、根據權利要求12的細胞、根據權利要求13至16中任一項的多肽或者根據權利要求19的藥物組合物用於製備能對血纖蛋白原與血小板的結合產生影響之藥劑的用途。22.根據權利要求21的用途，其用於製備調節血液凝結、尤其是溶解血栓和/或預防血栓形成之藥劑。23.表達編碼抗GPIIb/IIIa之自身抗體或編碼針對這些自身抗體的抗獨特型抗體的核酸的噬粒克隆的分離方法，所述方法的特徵在於由得自人供體的淋巴細胞製備噬粒文庫，通過親和選擇，包括負和正選擇步驟分離所需的噬粒克隆。24.根據權利要求23的方法，其特徵在於編碼抗體的核酸分離自所述克隆。25.根據權利要求23或24的方法，其特徵在於編碼抗體的核酸被用於表達重組抗體鏈或者其衍生物或其片斷。全文摘要本發明涉及編碼針對血小板膜蛋白的人自身抗體和抗獨特型抗體的新型核酸序列,本發明還涉及人抗體新的胺基酸序列,以及上述核酸序列和胺基酸序列診斷和治療疾病的用途。文檔編號C12P21/08GK1263556SQ98807163公開日2000年8月16日申請日期1998年6月5日優先權日1997年6月6日發明者P·伯克託爾德,R·F·A·艾舍爾申請人:Asat應用科學技術股份公司