一株豬流行性腹瀉病毒及其分離培養方法與流程
2023-09-18 08:50:25 2
本發明涉及微生物領域，具體涉及一株新的豬流行性腹瀉病毒及其分離培養方法。
背景技術：
豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）系冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，可引起以嘔吐、腹瀉和脫水為特徵的豬腸道傳染性疾病。各種年齡的豬均易感，但哺乳仔豬受害最嚴重 ，死亡率可高達100%。近幾年我國多省爆發PED，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。
豬流行性腹瀉病的防控以疫苗預防接種為主，目前尚無特效藥物治療此病，並且國內使用的疫苗主要為PEDV CV777毒株，該毒株分離年代較早，與新變異株相比缺乏廣泛的免疫原性，因此分離PEDV新毒株，培養免疫原性更強的毒株用於預防豬流行性腹瀉是十分必要的。
PEDV很難在體外培養的細胞系中進行增殖，使得PEDV的分離較困難。自1971年首次在英國和比利時報導PED後，日本、韓國、加拿大、中國等多個國家相繼報導了該病的發生，許多學者先後以PK-15細胞（豬腎細胞）、BHK細胞（倉鼠腎細胞）、牛睪丸細胞、豬睪丸細胞等體外分離培養PEDV，但多年嘗試未成功。1988年瑞士Hoffman等首次在添加胰酶培養的Vero細胞上成功培養出PEDV，盲傳5代出現細胞病變（Hoffman，M et al，1988）。日本和韓國也相繼報導了PEDV在Vero細胞上盲傳90代病變特徵仍不顯著，必須藉助PCR檢測的方法才能確定病毒的存在。
技術實現要素：
本發明的目的在於針對現有技術中的上述問題，提供一株豬流行性腹瀉病毒。
本發明的另一目的是提供上述豬流行性腹瀉病毒株的培養方法。
本發明通過以下技術方案實現上述目的：
本發明公開了一株豬流行性腹瀉病毒，名稱為PEDV/CH/BJ/2014，於2014年12月4日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.10111。保藏地址：中國.北京.中國科學院微生物研究所。
上述豬流行性腹瀉病毒，其編碼病毒纖突蛋白S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；ORF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；囊膜蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；核衣殼蛋白N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
上述豬流性腹瀉病毒的培養方法為：
1）用細胞培養液（含10%FBS，1%青鏈黴素的DMEM）培養Vero細胞長至單層；
2）用無菌1×PBS洗滌細胞2次，加入適量無血清DMEM；
3）取PEDV病毒液接種於Vero細胞上，並在DMEM中添加胰酶至終濃度3~5μg/mL形成吸附液；
4）於37℃和5%濃度CO2的條件下吸附1.5h，吸附完成後棄掉吸附液，加入含有濃度為5~10μg/mL胰蛋白酶的無血清DMEM作為維持液，於37℃，5%濃度CO2的細胞培養箱中培養。
5）連續培養48~72h或細胞病變達80%後，收穫細胞培養物置於-80℃冰箱，反覆凍融3次，取適量細胞培養物進行接毒傳代，重複步驟1)、2)、3)、4)。
與現有技術相比，本發明具備以下優勢：
PEDV/CH/BJ/2014毒株與CV777毒株S基因同源性僅有94%，而S基因編碼的蛋白是介導產生中和抗體的主要抗原，因此PEDV/CH/BJ/2014毒株的成功分離及其穩定傳代對新疫苗的開發具有重要意義。本發明不僅僅是對我國PEDV毒種的補充，對PEDV的診斷、防控及深入研究都有重大價值。
附圖說明
圖1：病料的RT-PCR檢測結果電泳照片，其中M：DL2000Marker；1-5：陽性病料；6：陰性病料；7：陽性對照；8：陰性對照。
圖2：Vero細胞感染PEDV後的病變照片（20×倍數），其中2-1:正常細胞對照；2-2:病料傳至第6代時，Vero細胞感染病毒36h後的病變照片，細胞融合成合胞體。
圖3：RT-PCR檢測不同代次的PEDV/CH/BJ/2014病毒培養物，1-6：第5、10、15、20、25、30代細胞培養上清，7：陰性對照。
圖4：PEDV/CH/BJ/2014毒株感染Vero細胞的透射電鏡照片，箭頭指示為病毒顆粒。
圖5：間接免疫螢光鑑定照片，其中5-1：陰性對照；5-2：PEDV/CH/BJ/2014感染Vero細胞的結果。
圖6：PEDV/CH/BJ/2014分離株S基因系統進化分析結果。
具體實施方式
以下結合說明書附圖和實施例對本發明做詳細說明，但不是限制本發明。
實施例1 ：PEDV/CH/BJ/2014毒株的獲得
1.病料的採集與處理
採集北京某豬場的疑似病毒性腹瀉仔豬的糞便及腸組織6份，樣品編號後，分別按質量體積比1:5加入生理鹽水，腸組織進行勻漿，糞便樣品振蕩混勻，反覆凍融3次，8000 rpm/min(轉/分鐘)離心10 min，取上清液，先用孔徑0.48μm的濾器過濾，再用0.22μm的濾器過濾除菌，所得病料處理液分裝並於-80℃冰箱儲存備用。
2.病料的RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈式反應)檢測
編號1-6的上述處理液各取250 μL，使用OMEGA公司生產的Total RNA Kit II試劑盒提取RNA。提取後的RNA進行反轉錄：6 μL的RNA與1μL Oligo(dT)混合均勻，70℃ 10 min，迅速冰浴2min。向該混合液中加入2 μL 5×Buffer，0.5 μL 10 mM的dNTP mix，0.25μL MLV反轉錄酶及0.25 μL RNase Inhibitor。混勻後按如下條件反應：42℃，60 min；70℃，15 min。
反轉錄後的cDNA用以下引物進行PCR，擴增N基因，上遊引物NF：5』 CGGTTCTCACAGATAGTGAG 3』，SEQ ID NO：17；下遊引物NR：5』 CGCTAGAAAAACACTCAGTAAT 3』，SEQ ID NO：18。 反應體系為：cDNA 1μL，2×Taq Mix 12.5μL，10 μM/mL的上下遊引物各0.5μL，補加去離子水至25μL，混合均勻。同時設水陰性對照和CV777毒株陽性對照。PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30 s，56℃退火30s，72℃延伸2min，反應30個循環；72℃延伸10 min。
取5μL PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果見圖1，可見編號1-5的病料樣品均檢測到陽性條帶，編號6的樣品未檢測到陽性條帶。選取可擴增到陽性條帶的病料上清液作為分離病毒的樣品備用。
3.豬流行性腹瀉病毒的分離傳代
選取RT-PCR檢測陽性病料上清液進行病毒的分離培養。
於底面積25cm2的細胞培養瓶中培養Vero細胞（購自中檢所），約培養48h長滿單層，棄去培養液，用PBS洗滌細胞3次，每瓶加入500μL病料上清，於37℃、5% CO2的培養箱中吸附1.5h，期間每隔20 min輕搖一次。吸附完成後棄掉吸附液，加入5 mL含10 μg/mL胰蛋白酶的DMEM，置培養箱中繼續培養，同時設置相同培養條件的陰性對照，逐日觀察，72h為一個傳代周期（前3代培養周期為7天）。傳代前將上一代細胞培養物反覆凍融3次，重複以上步驟進行傳代。連續傳至5代，將培養物按步驟2所述方法進行RT-PCR檢測，結果為陽性的繼續傳代，若為陰性則丟棄。
經過反覆傳代篩選，最終在編號3的病料上清中分離到一株可穩定傳代的毒株，命名為PEDV/CH/BJ/2014，該毒株在第2代即可觀察到明顯的細胞病變，在第5代就可使病變穩定存在，主要表現為細胞大量融合，呈合胞體狀，見圖2-2。待病變80%以上即可收穫病毒於-80℃冰箱，凍融3次後8000 rpm/min離心10 min，取上清分裝並置-80℃冰箱保存。
4.細胞培養物的RT-PCR檢測
操作方法同步驟2中病料的RT-PCR檢測方法，檢測樣品採用PEDV/CH/BJ/2014第5、10、15、20、25、30代的細胞培養物上清液，檢測結果見圖3，結果顯示不同代次的病毒培養物均能檢測到明亮的目的條帶。
5.電鏡鑑定
將病毒感染Vero細胞單層後，分別於24、36和48 h用細胞刮收取細胞，800 r/min離心後，收集細胞並用2.5%戊二醛電鏡固定液固定，製作超薄切片並用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，電子顯微鏡觀察病毒形態，見圖4，結果顯示感染PEDV的vero細胞中能檢測到典型PEDV病毒粒子，表明病毒在vero細胞中穩定增殖。
6.間接免疫螢光檢測
於24孔板培養Vero細胞，長至單層後接種PEDV/CH/BJ/2014 第6代病毒培養物，同時設立不接毒的Vero細胞作陰性對照，以及接種CV777毒株的陽性對照。培養24h後在顯微鏡下觀察細胞病變情況，輕輕吸棄培養液，用4℃預冷的PBS洗滌細胞3次。每孔加入500μL -20℃預冷的丙酮，將培養板置4℃冰箱固定15min。PBS洗滌3次，每次5min。每孔加入500μL 5%的脫脂奶粉封閉30min。棄掉脫脂奶粉，用PBS輕輕洗滌2次，每次3min。向孔內滴加適當稀釋後的一抗（鼠抗PEDV 6C8單克隆抗體（BioNote，Seoul，Korea））各200μL，於37℃作用1h。PBS洗滌3次，每次5min；滴加FITC（異硫氰酸螢光素）標記的山羊抗鼠IgG二抗（1：20000），37℃作用30min，PBS洗滌3次，每次5min。每孔加入500μLPBS，於倒置螢光顯微鏡下觀察並拍照。實驗過程中需設置只加一抗不加二抗和只加二抗不加一抗的陰性對照。結果顯示，陰性對照孔均無螢光；陽性對照孔及接種PEDV/CH/BJ/2014的孔均在細胞漿中呈現綠色螢光；只加一抗和只加二抗的陰性對照孔沒有綠色螢光背景。說明所分離到的病毒是豬流行性腹瀉病毒，結果見圖5，表明分離株PEDV/CH/BJ/2014具有良好的抗原性。
7.S、ORF3、M、N基因序列測定
取250 μL PEDV/CH/BJ/2014第6代Vero細胞培養物提取RNA，並進行反轉錄及PCR擴增(RNA提取和反轉錄體系及反應條件同上述步驟2)。反轉錄後的cDNA用下述引物進行PCR：分段擴增S基因，引物S1F 5』 TAGTGATGTTGTGTTAG 3』,見SEQ ID No:2；S1R 5』 CGCTGCACAGCAGCTC 3』, SEQ ID No:3；S2F 5』 CATACCAGAAGGTTTTAG 3』 ,見SEQ ID No:4； S2R 5』 GTAATCAACTCACCCTT 3』,見SEQ ID No:5； S3F 5』TTACCCTGAGTTTGGTAGTG 3』,見SEQ ID No:6； S3R 5』 TCCGTCTGTAGAGCAAGAT 3』,見SEQ ID No:7；S4F 5』CTTCACATGTATAGTGCGTCT 3』,見SEQ ID No:8； S4R 5』 CAGACTTTGAGACATCTTTGAC 3』,見SEQ ID No:9。擴增ORF3基因，引物ORF3F 5』CTAGACTTCAACCTTACGAA 3』,見SEQ ID No:11；ORF3R 5』TACTAGACCATTATCATTCACT 3』,見SEQ ID No:12。擴增M基因，引物 MF 5』 ACTGTTATTGACGTATAAACG 3』,見SEQ ID No:14；MR 5』 ATGAAGCACTTTCTCACTATC 3』,見SEQ ID No:15。擴增N基因，引物NF 5』 CGGTTCTCACAGATAGTGAGA 3』,見SEQ ID No:17；NR 5』 CGCTAGAAAAACACTCAGTAAT 3』,見SEQ ID No:18。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，56℃退火40s，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸7min。將PCR產物送諾塞基因公司進行測序。測序結果：S基因拼接後全長為4161bp，見SEQ ID No:1；ORF3基因全長675bp，見SEQ ID No:10；M基因661bp（非全長），見SEQ ID No:13 ；N基因全長1326bp，見SEQ ID No:16。
8.S基因進化分析
利用DNAStar軟體對測序結果進行分析，結果表明，PEDV（PEDV/CH/BJ/2014）株與我國分離株 2011-BJ-1構成一新的分支，與美國報導株MEX/104/2013、USA/Colorado/2013及KUIDL-PED-2014-007同源性較高；與經典參考株如比利時CV777、韓國毒株DR13等相比，不在同一進化分支上，已經發生了明顯的變異，表明我國當前新流行的PEDV野毒株發生了明顯的變異，結果見圖6。
SEQUENCE LISTING
北京偉嘉人生物技術有限公司
一株豬流行性腹瀉病毒及其分離培養方法
1
18
PatentIn version 3.3
1
4161
DNA
PEDV/CH/BJ/2014
1
atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60
caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120
gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180
gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240
tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300
gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360
gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420
gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480
catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540
tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600
ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acctattaca tgcttaatgt tactagtgct 660
ggtgaggatg gtatttctta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta ttctgccaat 720
gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780
cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840
gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900
caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960
tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020
ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcag atcctcactt agccaccttc 1080
gccatacctc tgggtgctat ccaagtaccc tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140
aactccactg tttataaatt cttgtctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200
accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggctact tgcatctcgg tttgttggat 1260
gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg acgtttctgg tttttggacc 1320
atagcatcga ctaattttgt tgatgcactt atcgaagttc aaggaactgc cattcagcgt 1380
attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440
gacgatggtt tctaccctat ttcttctaga aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct 1500
tttgttgctt tgccatcatt taatgatcat tcttttgtta acattactgt ctctgcgtcc 1560
tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt 1620
tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680
tatggttatg tgtctaaatc acaggacagt aattgccctt tcaccttgca atctgttaat 1740
gattacctgt cttttagtaa attttgtgtt tccaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800
atagatcttt ttggttaccc tgagtttggt agtggtgtta agtttacgtc cctttacttt 1860
caattcacaa agggtgagtt gattactggc acgtctaaac cacttgaagg tgtcacggac 1920
gtttctttta tgactctgga tgtgtgtacc aagtatacta tctatggctt taaaggtgag 1980
ggtatcatta cccttacaaa ttctagcttt ttggcaggtg tttattacac atctgattct 2040
ggacagttgt tagcctttaa gaatgtcact agtggtgctg tttattctgt tacgccatgt 2100
tctttttcag agcaggctgc atatgttgat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160
tctagctcca cttttaacag tactagggag ttgcctggtt tcttctacca ttctaatgat 2220
ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc 2280
agtattggct acgtcccatc tcagtctggc caagtcaaga ttgcacccac ggttactggg 2340
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aacacgcctg ttagtgttga ttgtgccaca tatgtttgta atggtaactc tcgttgtaaa 2460
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tctgtgtatg atcctgcaag tggcagggtg gtacaaaaaa ggtcttttat tgaagacctg 2700
ctttttaata aggtggttac taatggcctt ggtactgttg atgaagacta taagcgctgt 2760
tctaatggtc gctctgtggc agatctagtc tgtgcacagt attactctgg tgtcatggta 2820
ctacctggtg ttgttgacgc tgagaagctt cacatgtata gtgcgtctct catcggtggt 2880
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gttgttaact cgcagggtgc agctttgact caacttaccg tacagctgca acacaacttc 3180
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gttcaggttg accgtctcat caccggcaga ttatcagcac ttaatgcttt tgttgctcaa 3300
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ttctctctgg tacaggcagc acctcagggc ctgctgtttt tacatacagt acttgtaccg 3480
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gaatattttg tttcatcgcg acgtatgttt gaacctagaa aacctaccgt tagtgatttt 3660
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ggtgaaattg cagatttaga gcagcgttca gagtctctcc gtaatactac agaggagctc 3900
caaagtctta tatataatat caacaacaca ctagttgacc ttgaatggct caaccgagtt 3960
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人工序列
2
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人工序列
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人工序列
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人工序列
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DNA
人工序列
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10
675
DNA
PEDV/CH/BJ/2014
10
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gctaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa 120
gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttttta tctacttctt tgcactgttt 180
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11
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actacttctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc ttggagcacc aactggtgta 420
acgctaacac tccttagtgg tacattgctt gtagagggct ataaggttgc tactggcgta 480
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人工序列
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DNA
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tggaggagaa ttcccaaggg cgaaaatagc gtagcagctt gcttcggacc caggggaggc 900
ttcaaaaatt ttggagatgc ggaatttgtc gaaaaaggtg ttgatgcctc aggctatgct 960
cagatcgcca gtttagcacc aaatgttgca gcattgctct ttggtggtaa tgtggctgtt 1020
cgtgagctag cggactctta cgagattaca tataattata aaatgactgt gccaaagtct 1080
gatccaaatg tagagcttct tgtttcacag gtggatgcat ttaaaactgg gaatgcaaaa 1140
ccccagagaa agaaggaaaa gaagaacaag cgtgaaacca cgcagcagct gaatgaagag 1200
gccatctacg atgatgtggg tgtgccatct gattcgactc atgccaattt ggaatgggac 1260
acagctgtag acggtggtga cacggccgtt gaaattatca acgagatctt cgacacagga 1320
aattaa 1326
17
21
DNA
人工序列
17
cggttctcac agatagtgag a 21
18
22
DNA
人工序列
18
cgctagaaaa acactcagta at 22