轉化水稻的方法
2023-09-18 01:02:25
轉化水稻的方法
【專利摘要】本發明涉及一種轉化水稻的方法，包括：採用所述誘導水稻愈傷組織的方法或所述大量擴增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織；農桿菌侵染所述愈傷組織。本發明轉化水稻的方法能夠使一些不易於遺傳轉化的秈稻品種獲得胚性愈傷，並採用固體培養基誘導初生愈傷後再通過液體培養基懸浮培養，可大量擴增出質量好、生長快的水稻胚性愈傷以提供農桿菌進行侵染轉化，轉化頻率可達10%以上，顯著降低了對秈稻外植體供應的壓力，大大減小了秈稻組織培養的時間和人力消耗。
【專利說明】轉化水稻的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物轉化的方法，特別是涉及一種轉化水稻組織的方法。
【背景技術】
[0002]水稻(Oryza sativa)是世界主要的糧食作物之一，也是我國的第一大糧食作物。然而，伴隨著人口增加和社會發展，可耕作的土地面積卻越來越小，並且水稻產量的年增長率已下降至不足1%，作物品種的產量已經快達到了生產極限，依靠傳統的育種技術已經很難有較大的突破，作物基因工程技術的進步是選育高產作物品種的希望所在。
[0003]水稻的遺傳轉化方法主要有農桿菌介導法、基因槍轟擊法、電擊法、PEG法和花粉管通道法等，其中農桿菌介導法為目前水稻常用的轉基因方法。近年來粳稻轉基因技術已經相當的成熟和穩定，而秈稻作為我國稻區的主栽品種(特別是長江中下遊和南方稻區)，在農桿菌介導的遺傳轉化過程中存在難以逾越的技術瓶頸:
[0004](I)基因型依賴性強:一些大面積推廣應用的優良品種和一些超級雜交稻的親本材料都不能進行遺傳轉化。
[0005](2)受體材料有限:在農桿菌介導的秈稻遺傳轉化過程中，農桿菌侵染所依賴的受體材料-愈傷，都是經過固體培養基誘導出來的初生愈傷，然後再通過固體培養基繼代培養所獲得的；這一傳統的方法固然能得到適於轉化的胚性愈傷，但是獲得的胚性愈傷數量有限。
[0006](3)外植體需求量大:如果為研究基因組學而導入大量的外源基因或是對一些優良品種進行遺傳轉化，需要大量供應水稻外植體以便大規模起始的水稻愈傷誘導和繼代工作。
[0007](4)轉化頻率低:農桿菌介導的秈稻遺傳轉化，其轉化效率很大程度上取決於胚性愈傷的感受狀態；常規的秈稻遺傳轉化方法由於轉化頻率低，需要大量的外植體和人力才能獲得足夠數量的可供轉化的愈傷，並且轉化過程也需要花費大量的時間。
[0008](5)轉化周期長、精細度高:農桿菌介導的秈稻遺傳轉化過程需要大量的手工操作，這就大大增加了培養基汙染的概率；同時對實驗員操作的精細度、操作時間和強度要求較高，而操作時間跨度越長對整個研發周期會產生不良的影響。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一種轉化水稻的方法，有效克服現有技術基因型依賴性強、受體材料有限、外植體需求量大、轉化效率低和轉化周期長、精細度高等技術缺陷。
[0010]為實現上述目的，本發明提供了一種誘導水稻愈傷組織的方法，包括:
[0011]將水稻種子接種於固體的誘導培養基以誘導初生愈傷；
[0012]將所述初生愈傷通過液體的懸浮培養以獲得愈傷組織。
[0013]為實現上述目的， 本發明還提供了一種大量擴增水稻愈傷組織的方法，包括:
[0014]將水稻種子接種於固體的誘導培養基以誘導初生愈傷；[0015]將所述初生愈傷接種於液體的懸浮培養基以獲得胚性愈傷；
[0016]所述胚性愈傷通過懸浮培養繼代以獲得愈傷組織。
[0017]為實現上述目的，本發明還提供了一種節省水稻外植體的方法，包括:
[0018]將水稻種子接種於固體的誘導培養基以誘導初生愈傷；
[0019]將所述初生愈傷接種於液體的懸浮培養基以獲得胚性愈傷；
[0020]所述胚性愈傷通過懸浮培養繼代以獲得愈傷組織。
[0021]為實現上述目的，本發明還提供了一種轉化水稻的方法，包括:
[0022]採用所述誘導水 稻愈傷組織的方法或所述大量擴增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織；
[0023]農桿菌侵染所述愈傷組織。
[0024]進一步地，所述侵染步驟之前的步驟為將所述愈傷組織進行預培養。
[0025]為實現上述目的，本發明還提供了一種生產穩定轉化的水稻植物的方法，包括:
[0026]採用所述誘導水稻愈傷組織的方法或所述大量擴增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織；
[0027]農桿菌侵染所述愈傷組織；
[0028]侵染後的愈傷組織與所述農桿菌共培養；
[0029]在含有選擇劑的培養基上培養並選擇轉化的抗性愈傷組織；
[0030]轉化的抗性愈傷組織再生為水稻植物。
[0031]進一步地，所述侵染步驟之前的步驟為將所述愈傷組織進行預培養。
[0032]更進一步地，所述共培養步驟之前的步驟為將侵染後的愈傷組織進行乾燥處理。所述選擇步驟之前的步驟為將共培養後的愈傷組織進行恢復培養。
[0033]優選地，所述選擇劑是潮黴素、甘露糖或草丁膦。
[0034]本發明中的克隆基因、表達盒、載體(例如質粒)、蛋白和蛋白片段、以及轉化的細胞核植物均可使用標準方法生產。
[0035]本發明可用於在水稻植物中表達任何目的基因。目的基因可以是耐除草劑基因、抗病基因或抗蟲基因，或者是選擇或評價標記，並含有植物可操作的啟動子、編碼區和終止子區。耐除草劑基因包括對咪唑啉酮或磺醯脲除草劑耐受的AHAS基因、對草丁膦除草劑耐受的PAT或bar基因、對草甘膦除草劑耐受的EPSPS基因等。抗病基因包括抗生素合成酶基因，例如硝吡咯菌素合成酶基因，植物來源的抗性基因等。抗蟲基因包括蘇雲金芽孢桿菌殺蟲基因。目的基因也可以編碼與生物化學途徑有關的酶，該酶的表達可改變食物、飼料、營養藥和/或藥物生產中重要的性狀。目的基因可以位於質粒上。適合本發明使用的質粒可以含有一個以上目的基因和/或農桿菌可含有帶有不同目的基因的不同質粒。
[0036]本發明中所述「水稻」是指Oryza sativa，所述方法是以農桿菌介導的目的基因傳輸到水稻細胞，之後再生為轉化的水稻植物為基礎的。本發明的方法獨立於栽培品種。
[0037]在選擇劑存在的情況下培養轉化的水稻細胞。優選地，用潮黴素磷酸異構酶(HPT)基因轉化，並且轉化的基因在潮黴素存在的情況下培養。在含有潮黴素為選擇劑的培養基中，HPT基因轉化的水稻細胞選擇性生長。
[0038]含有異源核酸(即含有按照本發明的方法轉化的細胞或組織)的轉基因植物以及通過該轉基因植物產生的種子和後代是本發明所涉及的。將轉化的細胞培養成有用栽培品種的方法是本領域技術人員公知的。植物組織體外培養技術和整個植株再生技術也是公知的。相應的，所述「種子」包括這些轉化植物的種子以及轉化植物後代產生的種子。所述「植物」不僅包括轉化和再生的植物，還包括通過本發明的方法產生的轉化和再生植物的後代。
[0039]可以從本發明的方法產生的植物中篩選成功的轉化植物。為了開發改良的植物和種子品系，可以持續地篩選和選擇本發明再生植物的種子和子代植物以使轉基因和整合的核酸序列持續存在。因此，可以將所需要的轉基因核酸序列移入(即漸滲或交配)其它的遺傳品系如某些原種或商業上有用的品系或品種中。漸滲目的基因進入遺傳植物品系的方法可通過本領域公知的多種技術來實現，包括通過傳統的育種、原生質體融合、細胞核轉移以及染色體轉移。 育種方法和技術也是本領域公知的。根據本發明獲得的轉基因植物和自交系可用於生產商業上有價值的雜交植物和農作物。
[0040]本發明提供了一種轉化水稻的方法，具有以下優點:
[0041]1、減小基因型的依賴性。本發明轉化水稻的方法能夠使一些不易於遺傳轉化的秈稻品種獲得胚性愈傷。
[0042]2、提供大量愈傷組織。本發明轉化水稻的方法採用固體培養基誘導初生愈傷後再通過液體培養基懸浮培養， 能夠大量擴增出質量好、生長快的水稻胚性愈傷以提供農桿菌進行侵染轉化。
[0043]3、降低外植體供應壓力。由於本發明轉化水稻的方法可以提供大量優良的水稻胚性愈傷，所以顯著降低了對秈稻外植體供應的壓力。
[0044]4、轉化效率高。本發明轉化水稻的方法的轉化頻率可達10%以上。
[0045]5、轉化成本低。由於本發明轉化水稻的方法可以提供大量優良的水稻胚性愈傷，所以大大減小了秈稻組織培養的時間和人力消耗。
[0046]下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0047]圖1為本發明轉化水稻的方法的重組克隆載體DBNOl-T構建流程圖；
[0048]圖2為本發明轉化水稻的方法的重組表達載體DBN100001構建流程圖；
[0049]圖3為本發明轉化水稻的方法的轉化水稻組織的效果圖。
【具體實施方式】
[0050]下面通過具體實施例進一步說明本發明轉化水稻的方法的技術方案。
[0051]第一實施例、重組表達載體的構建及重組表達載體轉化農桿菌
[0052]1、構建含有目的基因的重組克隆載體
[0053]將HPT 核苷酸序列連入克隆載體 pGEM-T (Promega，Madison，USA，CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產品pGEM_T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨苄青黴素抗性基因；fl表示噬菌體fl的複製起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；ΗΡΤ為潮黴素磷酸轉移酶基因核苷酸序列(SEQ ID N0:1) ;MCS為多克隆位點)。
[0054]然後將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501)，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態細胞、10μ I質粒DNA (重組克隆載體DBN01Ab-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養I小時(200rpm轉速下搖床搖動)，在表面塗有IPTG (異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X_gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨苄青黴素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,瓊脂15g/L，用NaOH調pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青黴素100mg/L，用NaOH調pH至7.5)中於溫度37°C條件下培養過夜。鹼法提取其質粒:將菌液在12000rpm轉速下離心lmin，去上清液，沉澱菌體用100 μ I冰預冷的溶液I (25mMTris-HCl, IOmM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸浮；加入200 μ I新配製的溶液II (0.2Μ NaOH, 1%SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3_5min ;加Λ 150 μ I冰冷的溶液III (3Μ醋酸鉀，5Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5_10min ;於溫度4°C、轉速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻後室溫放置5min ;於溫度4°C、轉速12000rpm條件下離心5min,棄上清液,沉澱用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌後晾乾；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA,PH8.0)溶解沉澱；於溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;於溫度_20°C保存備用。
[0055]提取的質粒經ApaI和EcoRV酶切鑑定後，對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的HPT基因序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0056]2、構建含有目的基因的重組表達載體
[0057]用限制性內切酶HindIII和KasI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達載體DBNBC-01 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構可以提供))，將切下的HPT基因序列插到表達載體DBNBC-01的HindIII和KasI位點之間，利用常規的酶切方法構建載體是本領域技術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN100001，其構建流程如圖2所示(Kan:卡那黴素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin(泛素)基因啟動子(SEQ ID N0:2)；HPT:潮黴素磷酸轉移酶基因核苷酸序列(SEQ ID NO: l)；Nos:胭脂鹼合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:3)；LB:左邊界)。
[0058]將重組表達載體DBN100001用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態細胞、10 μ I質粒DNA (重組表達載體DBN100001 )，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養I小時(200rpm轉速下搖床搖動)；然後在含50mg/L卡那黴素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白腖10g/L,酵母提取物5g/L, NaCl 10g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調pH至7.5)上於溫度37°C條件下培養12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,卡那黴素50mg/L，用NaOH調pH至7.5 )中於溫度37°C條件下培養過夜。鹼法提取其質粒。將提取的質粒用限制性內切酶HindIII和KasI酶切後鑑定，並將陽性克隆進行測序鑑定，結果表明重組表達載體DBN100001在HindIII和KasI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即HPT核苷酸序列。
[0059]3、重組表達載體轉化農桿菌
[0060]對己經構建正確的重組表達載體DBN100001用液氮法轉化到農桿菌ΕΗΑ105α中，其轉化條件為:100 μ L農桿菌ΕΗΑ105 α、3 μ L質粒DNA (重組表達載體);置於液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉化後的農桿菌EHA105 α接種於LB試管中於溫度28°C、轉速為200rpm條件下培養2小時，塗於含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那黴素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養並提取其質粒，用限制性內切酶ApaLI和EcoRV酶切後進行酶切驗證，結果表明重組表達載體DBN100001結構完
全正確。
[0061]第二實施例、轉基因水稻植株的獲得
[0062]成熟種子滅菌:取成熟的水稻種子(明恢63)若干，脫殼後挑選顆粒飽滿、胚完好的糙米置於三角瓶中，用75% (v/v)的酒精滅菌lmin,以除去糙米表面的米糠等雜質,將液體濾去，再加入質量分數50%的次氯酸鈉(含吐溫20 (I滴/30mL))，並不斷地搖晃振蕩20-40分鐘，用無菌水衝洗4-5次以去除殘留的次氯酸鈉。
[0063]愈傷誘導:將上述處理後的糙米略微乾燥後接種於愈傷誘導培養基(N6培養基大量鹽、B5培養基微量鹽、 B5培養基有機質、蔗糖30g/L、乾酪素500mg/L、穀氨醯胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2-嗎啉乙磺酸(MES) 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L、植物凝膠2.5-3.5g/L，pH5.8)上，每皿10-14粒胚，28_30°C暗培養I周左右，直至成熟胚的盾片處誘導產生直徑大約2-4mm的初生愈傷(顏色鮮黃、質地堅硬、胚性狀態好)。
[0064]初生愈傷懸浮培養:從上述成熟胚的盾片處小心地剝離所述初生愈傷，並將其轉移到裝有愈傷擴增懸浮培養基(N6培養基大量鹽、B5培養基微量鹽、B5培養基有機質、蔗糖30g/L、乾酪素500mg/L、穀氨醯胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2_嗎啉乙磺酸(MES)500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) l-3mg/L，pH5.8)的三角瓶中，每個三角瓶中接種4_5粒初生愈傷，在28-30°C暗培養條件下，將三角瓶置於轉速100-150r/min機械搖床上震蕩培養，直至擴增出大量水稻愈傷組織顆粒。
[0065]愈傷懸浮培養繼代:所述初生愈傷懸浮培養10-25天後，挑選所述懸浮培養基中生長旺盛、質地堅硬、色澤鮮黃的所述愈傷組織顆粒(胚性愈傷)(6粒)，轉移至另一裝有所述懸浮培養基的三角瓶中進行繼代懸浮培養，每個三角瓶接種5-15粒所述愈傷組織顆粒，在28-30°C暗培養條件下，將三角瓶置於轉速100-150r/min機械搖床上震蕩培養，以便獲得大量的愈傷組織(35粒)留存備用。每隔10-20天可繼代一次，胚性狀態好的愈傷組織能無限繼代下去。
[0066]預培養:愈傷組織的在轉化前3-10天，將活力旺盛、生長良好的所述愈傷組織轉移到預培養培養基(N6培養基大量鹽、B5培養基微量鹽、B5培養基有機質、蔗糖30g/L、乾酪素500mg/L、穀氨醯胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2_嗎啉乙磺酸(MES)500mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) l_3mg/L、植物凝膠2.5-3.5g/L，pH5.8)上，繼續在28-30°C條件下暗培養。
[0067]農桿菌菌液的製備:用槍頭挑取含有DBN100001的農桿菌單菌落，接入到含有25mg/L利福平(Rifampicin)和50mg/L卡那黴素(Kanamycin)的LB液體培養基(胰蛋白腖 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，卡那黴素 50mg/L，用 NaOH 調 pH 至 7.5)中，28°C黑暗條件下振蕩(200rpm)培養16_18h。再取200ml的新鮮菌液，加入到20ml所述LB液體培養基中，並於上述相同條件下再培養12h。菌液在4000rpm條件下離心lOmin，之後棄去LB培養基上清液；加入0.1M MgS04溶液20ml重新懸浮農桿菌；菌液於4000rpm條件下離心lOmin，隨後棄去含有抗生素的MgS04上清液；用5ml侵染培養液(N6培養基大量鹽、B5培養基微量鹽、B5培養基有機質、乾酪素500mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙醯丁香酮(AS) 100-200uM、穀氨醯胺 500mg/L、脯氨酸 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L，pH5.4);中重新懸浮(用移液槍輕輕吹打)農桿菌，再加入適量的侵染培養液，將其濃度調整為 OD600=0.1-0.6。[0068]農桿菌侵染水稻愈傷:將農桿菌菌液(20_30ml)與預培養後的水稻愈傷組織(200個，浸沒在菌液中)一起放置5-20分鐘；侵染結束後將農桿菌菌液吸出，並用濾紙將附著在水稻愈傷組織上的農桿菌菌液徹底吸乾。
[0069]農桿菌與水稻愈傷組織共培養:將吸乾農桿菌菌液的愈傷組織轉移到共培養培養基(N6培養基大量鹽、B5培養基微量鹽、B5培養基有機質、乾酪素500mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙醯丁香酮(AS) 100-200uM、穀氨醯胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2_嗎啉乙磺酸(MES) 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L、植物凝膠 3_6g/L，pH5.8)上，愈傷組織與農桿菌在20-28°C條件下暗培養至少48小時。
[0070]水稻愈傷組織的恢復:將共培養後的愈傷組織轉移到恢復培養基(N6培養基大量鹽、B5培養基微量鹽、B5培養基有機質、乾酪素500mg/L、蔗糖30g/L、穀氨醯胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2-嗎啉乙磺酸(MES) 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L、植物凝膠2.5-3.5g/L、頭孢黴素500mg/L，pH5.8)上，在28_30°C條件下暗培養2_7天，以消除農桿菌並為侵染細胞提供恢復期。
[0071]水稻愈傷組織的篩選:恢復期結束後，將愈傷組織轉移到篩選培養基(N6培養基大量鹽、B5培養基微量鹽、B5培養基有機質、乾酪素500mg/L、蔗糖30g/L、穀氨醯胺500mg/L、脯氨酸 500mg/L、2-嗎啉乙磺酸(MES) 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L、植物凝膠 2.5-3.5g/L、頭孢黴素 500mg/L、潮黴素(Hygromycine)50mg/L，pH5.8)上，導致轉化的細胞選擇性生長，在28-30°C條件下暗培養3-6周，獲得抗性愈傷組織(50個)。
[0072]水稻抗性愈傷組織再生成植物:將抗性愈傷組織轉移到再生培養基(N6培養基大量鹽、B5培養基微量鹽、B5培養基有機質、乾酪素500mg/L、蔗糖30g/L、2_嗎啉乙磺酸(MES)500mg/L、激動素(KT)l-3mg/L、6-苄氨基腺嘌呤 0-2mg/L、奈乙酸(NAA)0.2-lmg/L、植物凝膠 2-4g/L、頭孢黴素 0-200mg/L、潮黴素(Hygromycine) 20mg/L，pH5.8)上，在 25_30°C的光照培養室中培養分化3-5周；分化出來的小苗轉移到生根培養基(1/2MS培養基大量鹽、MS培養基微量鹽、N6培養基有機質、乾酪素500mg/L、蔗糖15g/L、奈乙酸(NAA)O-0.5mg/L、植物凝膠2.5-3.5g/L，pH5.8)上，25_30°C下光照培養至約IOcm高，移至30°C條件下的溫室培養可以獲得轉基因植株。
[0073]第三實施例、用TaqMan驗證轉基因的水稻植株
[0074]取轉基因水稻植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant MaxiKit提取其基因組DNA，通過Taqman探針螢光定量PCR方法檢測HPT基因的拷貝數。同時以野生型水稻植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重複，取平均值。
[0075]檢測HPT基因拷貝數的具體方法如下:
[0076]步驟11、取轉基因水稻植株和野生型水稻植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重複；
[0077]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產品說明書；
[0078]步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0079]步驟14、 調整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的範圍為80_100ng/μ I ；[0080]步驟15、採用Taqman探針螢光定量PCR方法鑑定樣品的拷貝數，以經過鑑定已知拷貝數的樣品作為標準品，以野生型水稻植株的樣品作為對照，每個樣品3個重複，取其平均值；螢光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0081]以下引物和探針用來檢測HPT基因:
[0082]引物I (PFl):GCATAACAGCGGTCATTGACTG 如序列表中 SEQ ID N0:4 所示；
[0083]引物2 (PRl):AGAAGATGTTGGCGACCTCG 如序列表中 SEQ ID N0:5 所示；
[0084]探針I (PPl):AGCGAGGCGATGTTCGGGGATTC 如序列表中 SEQ ID NO:6 所示；
[0085]PCR反應體系為:
[0086]JumpStart?Taq ReadyMix? (Sigma)10 μ I
[0087]50 X弓丨物/探針混合物I μ I
[0088]基因組DNA3μ I
[0089]水(ddH20)6μ I
[0090]所述50Χ引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45 μ 1，100 μ M濃度的探針50μ I和860 μ IlXTE緩衝液，並且在4°C，貯藏在琥珀試管中。
[0091]PCR反應條件為:
[0092]
步驟溫度時間
2195 0C5 分鐘
2295 0C30 秒
2360'OI 分鐘
24回到步驟22，重複40次
[0093]利用SDS2.3 軟體(Applied Biosystems)分析數據。
[0094]上述實驗結果表明，愈傷組織顆粒經過懸浮培養繼代後獲得了大量的愈傷組織，擴增效率可達5倍以上；HPT基因均已整合到所檢測的水稻植株的染色體組中的陽性植株為30株,轉化效率可達10%以上,如表1、表2和圖3所示。
[0095]表1、水稻愈傷懸浮培養的實驗結果
[0096]
【權利要求】
1.一種誘導水稻愈傷組織的方法，其特徵在於，包括: 將水稻種子接種於固體的誘導培養基以誘導初生愈傷； 將所述初生愈傷通過液體的懸浮培養以獲得愈傷組織。
2.一種大量擴增水稻愈傷組織的方法，其特徵在於，包括: 將水稻種子接種於固體的誘導培養基以誘導初生愈傷； 將所述初生愈傷接種於液體的懸浮培養基以獲得胚性愈傷； 所述胚性愈傷通過懸浮培養繼代以獲得愈傷組織。
3.一種節省水稻外植體的方法，其特徵在於，包括: 將水稻種子接種於固體的誘導培養基以誘導初生愈傷； 將所述初生愈傷接種於液體的懸浮培養基以獲得胚性愈傷； 所述胚性愈傷通過懸浮培養繼代以獲得愈傷組織。
4.一種轉化水稻的方法，其特徵在於，包括: 採用權利要求1所述誘導水稻愈傷組織的方法或權利要求2所述大量擴增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織； 農桿菌侵染所述愈傷組織。
5.根據權利要求4所述轉化水稻的方法，其特徵在於，所述侵染步驟之前的步驟為將所述愈傷組織進行預培養。
6.一種生產穩定轉化的水稻植物的方法，其特徵在於，包括: 採用權利要求1所述誘導水稻愈傷組織的方法或權利要求2所述大量擴增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織； 農桿菌侵染所述愈傷組織； 侵染後的愈傷組織與所述農桿菌共培養； 在含有選擇劑的培養基上培養並選擇轉化的抗性愈傷組織； 轉化的抗性愈傷組織再生為水稻植物。
7.根據權利要求6所述生產穩定轉化的水稻植物的方法，其特徵在於，所述侵染步驟之前的步驟為將所述愈傷組織進行預培養。
8.根據權利要求6或7所述生產穩定轉化的水稻植物的方法，其特徵在於，所述共培養步驟之前的步驟為將侵染後的愈傷組織進行乾燥處理。
9.根據權利要求6-8任一項所述生產穩定轉化的水稻植物的方法，其特徵在於，所述選擇步驟之前的步驟為將共培養後的愈傷組織進行恢復培養。
10.根據權利要求9所述生產穩定轉化的水稻植物的方法，其特徵在於，所述選擇劑是潮黴素、甘露糖或草丁膦。
【文檔編號】A01H4/00GK103740635SQ201310722080
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】金許成 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心