一株拮抗枸杞根腐病的解澱粉芽孢桿菌及其應用的製作方法
2023-12-01 17:28:06
本發明涉及一株拮抗枸杞根腐病的解澱粉芽孢桿菌及其應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
枸杞是一種名貴的中藥，枸杞果實有較高的營養保健和藥用價值，與瓊珍靈芝、長白山人參，東阿阿膠並稱為「中藥四寶」。隨著經濟的發展和社會的進步，人們也越來越認識到枸杞的價值，促使人們對枸杞進行了廣泛的產品開發，並取得了重要成果。寧夏枸杞在中國栽培面積最大，主要分布在中國西北地區。近年來，隨著枸杞種植面積不斷擴大，老產區與新產區枸杞根腐病發病率連年上升，日益嚴重，已經嚴重影響到了當地農民經濟收入，對整個產業鏈有一定的破壞作用。枸杞根腐病是一種系統感染病害，病株根和根頸部發生腐爛，莖杆維管束變褐色。潮溼時病部偶爾長出白色或粉紅色黴層(病原菌)。由於根腐，葉片變小，缺少光澤，枝條矮化，果實瘦小；或葉片變黃萎蔫，嚴重時植株逐漸枯死。有的病株根頸與枝幹的皮層變褐色腐爛，葉尖變黃向上捲縮，逐漸焦枯，當腐爛皮層環繞樹幹時，病部以上樹幹枯死。有的枝葉突然萎蔫乾枯，枯葉仍掛在樹上。上述症狀在一棵樹上有的表現為部分主枝發病，有的樹幹病死後可在根頸部又長出新枝條。目前人們防治枸杞根腐病主要是噴灑農藥，配方施肥，增施磷鉀肥的方式。但這些方法費時費力，而且很難從根源上有效防治病害的發生，而且對環境汙染大，對人體健康也有一定的傷害。因此，利用生物學方法來防治枸杞根腐病的發生已經逐漸成為人們關注的熱點，而找到拮抗枸杞根腐病的菌種資源是關鍵，其中拮抗菌株的篩選和應用是目前微生物學工作者的研究熱點之一。
解澱粉芽孢桿菌是芽孢桿菌的一個種，在酶工業、食品工業和農業中具有廣泛的應用。其中，在農業應用中，儘管已有解澱粉芽孢桿菌對多種病原真菌具有活性的報導，但目前為止，解澱粉芽孢桿菌製成生防製劑用於防治植物病害的報導較少。中國專利CN1952116A公開了一種從土壤中分離的解澱粉芽孢桿菌I7及其在桃炭疽病菌、梨黑斑病菌、蘋果褐腐病菌、銳頂鐮刀菌、辣椒黑腐病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、茄子早疫病菌、立枯絲核菌、小麥根腐病菌、馬鈴薯絲核菌、馬鈴薯早疫病菌、馬鈴薯晚疫病菌、西瓜霜黴病等病害防治中的應用。中國專利CN1792167A公開了一種解澱粉芽孢桿菌及其在防治魔芋細菌性軟腐病中的應用。美國專利US 6960342中公開了一種從臺灣百合地土壤中分離得到的解澱粉芽孢桿菌，其製成的生物製劑可用於橢圓葡萄孢引起的葡萄灰黴病的防治。但目前還未有防治枸杞根腐病的解澱粉芽孢桿菌的報導。
生防微生物與土壤環境中的微生物群落之間往往存在相互作用，外源拮抗菌的引入可以引起作物根際土壤微生物群落的組成發生變化，不同植物根際同種細菌的定植和功能具有較大差異性；而且，生防微生物在土壤環境中能否存活並且快速生長也是實現防治作用的關鍵，因此，篩選能夠對枸杞根腐病具有防治作用的生防菌株具有十分重要的實際應用價值。
技術實現要素：
針對上述現有技術，本發明的目的是提供一株拮抗枸杞根腐病的解澱粉芽孢桿菌及其應用。
為實現上述目的，本發明採用下述技術方案：
根據本發明的第一方面，提供一株拮抗枸杞根腐病的解澱粉芽孢桿菌，其分類命名為解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49，已於2016年11月10日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCC NO.13255。
該菌株是從枸杞根際土壤中分離得到，該菌株的菌落及菌體特徵為：在LB平板上培養24h後菌落呈圓形，乳黃色，稍隆起，邊緣整齊，表面光滑，菌落直徑為2.10mm。菌體呈長杆狀，產芽孢，革蘭氏陽性。
該菌株的生理生化特徵為：氧化酶實驗陰性，接觸酶實驗陽性，檸檬酸鹽利用實驗陽性，硝酸鹽利用實驗陰性，澱粉水解實驗陰性，M-R實驗陰性，V-P實驗陽性，葡萄糖發酵實驗陽性，蔗糖發酵實驗陽性，麥芽糖發酵實驗陽性，阿拉伯糖發酵實驗陽性，木糖發酵實驗陽性，纖維二糖發酵實驗陰性，乳糖發酵實驗陰性，山梨醇發酵實驗陽性，甘露醇發酵實驗陽性。
根據本發明的第二方面，提供一種生防製劑，其活性成分為上述解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49的發酵產物。
優選的，所述生防製劑為液態菌劑。
進一步的，所述生防製劑中解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49的含量大於或等於3×108cfu/mL。
本發明還提供上述生防製劑的製備方法，包括如下步驟：發酵上述的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49，得到發酵產物。
上述製備方法中，發酵採用的培養基為液體豆芽汁培養基，其原料組成：黃豆芽100g，蔗糖50g，水1000mL，pH自然。
所述液體豆芽汁培養基的製備方法為：黃豆芽沸水蒸煮30min，用四層紗布過濾，加入蔗糖定容到1000mL。
上述製備方法中，發酵的條件為：35-40℃，恆溫搖床培養20-30h；優選為，37℃，恆溫搖床培養24h。
根據本發明的第三方面，提供上述解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49和/或生防製劑在防治枸杞根腐病中的應用。
上述應用中，所述防治枸杞根腐病體現在抑制枸杞根腐病的發作，降低發病率。
根據本發明的第四方面，提供上述解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49和/或生防製劑在促進枸杞生長或者促進枸杞增產中的應用。
本發明還提供一種能防治枸杞根腐病，同時促進枸杞生長和增產的產品，其活性成分為上述的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49或上述生防製劑。
本發明的有益效果：
(1)本發明分離得到的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49，該菌株對枸杞根腐病具有較強拮抗作用，為枸杞根腐病的生物防治提供了新的生防菌，增加了生防製劑的種類。
(2)研究表明，在大田條件下，採用本發明的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49的菌懸液對枸杞根腐病發病嚴重的地塊的枸杞樹進行灌根處理後，能明顯抑制枸杞根腐病的發作，降低發病率；同時，本發明的解澱粉芽孢桿菌還能改善植株的生長狀況，顯著提高枸杞的產量，對枸杞樹平均增產可達434％以上。以上研究結果表明，本發明的拮抗枸杞根腐病的芽孢桿菌對寧夏枸杞根腐病具有一定的防治效果。
(3)不同植物的根腐病，其病原菌不同，發病機理也會存在差異。對其他植物的根腐病有防治效果的解澱粉芽孢桿菌，並不能直接推知其對枸杞根腐病有防治效果。我們在實驗過程中發現，在平板對峙實驗中對植物病原菌有拮抗效果的菌株，但並不能保證其在大田實驗中的效果。大田實驗的結果也證明，擁有較好的平板對峙實驗結果的菌株，在大田實驗中，對枸杞根腐病病原菌也未必擁有明顯的抑制效果。因此，對其他植物的根腐病有防治效果的解澱粉芽孢桿菌而言，由於寧夏地區惡劣的生存環境，菌株能否存活並且快速生長成為關鍵問題，因此未必對枸杞根腐病有防治效果。
另外，需要說明的是：解澱粉芽孢桿菌對不同植物根腐病病原菌的抑制效果，是沒有可比性的。首先，解澱粉芽孢桿菌同種不同菌株會存在一定的差異，同是作為拮抗植物根腐病病原菌的菌株，由於其篩選環境的不同，其功能會存在很大的差異。其次，在平板對峙試驗中，也會受拮抗菌的生長狀況、菌株接種時間、菌株培養環境、培養基的成分以及不同實驗人員的操作等相關因素的影響。因此，在不同文獻報導中，解澱粉芽孢桿菌對不同植物根腐病病原菌的抑制效果沒有可比性。
附圖說明
圖1：菌株GQJK49的菌落形態圖；
圖2：菌株GQJK49的系統進化樹圖。
具體實施方式
下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。
實施例1：菌株的分離和鑑定
1.菌株的分離與篩選：
(1)菌種的分離
從寧夏省中寧縣石啦叭村採集枸杞樹根際土壤樣品。稱取10.0克枸杞根際土，按每10克土加90mL無菌水的比例放入事先準備好的裝有玻璃珠的三角瓶中，置於37℃恆溫搖床上180r/min震蕩20-30min。梯度稀釋法，將土壤懸液稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同梯度。吸取合適稀釋度的土壤溶液0.1mL置於LB平板培養基中，塗布均勻(本實驗選取10-4、10-5、10-6三個梯度進行塗布)。37℃恆溫培養箱培養24h，挑取單菌落。將獲取的菌株用三區劃線的方法進行純化，直至獲得單一菌落，並對菌株進行編號，保存於4℃冰箱備用。
(2)拮抗菌的篩選
利用平板對峙法對拮抗菌進行初選。將步驟(1)保存的菌株活化，做平板對峙實驗。將保存在斜面上的枸杞根際病原菌採用劃線方法活化於PDA平板，28℃培養至長滿平板。用滅菌的藍槍頭或打孔器將枸杞根腐病的病原菌腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)做成圓形菌塊，用鑷子轉接到PDA平板的中間部位，置於28℃培養箱培養一天。用牙籤挑取活化好的拮抗菌接種到距病原菌邊緣2cm處，置於28℃培養箱繼續培養2-5天，待病原菌長滿平板，觀察是否有抑菌帶出現，測量抑菌帶的寬度。同時測量抑菌直徑，計算抑菌率。
抑菌率(％)＝(菌落直徑D-抑菌直徑d)/菌落直徑D×100％
2.試驗結果：
選擇一株抑菌效果最好的菌株GQJK49，其平板對峙試驗的結果見表1。
表1：平板對峙試驗結果
由表1可以看出：菌株GQJK49對枸杞根腐病的病原菌具有較好的抑菌作用。
2.菌株GQJK49的形態及生物學特性測定
(1)菌落特徵及菌體形態
該菌株的菌落及菌體特徵為：在LB平板上培養24h後菌落呈圓形，乳黃色，稍隆起，邊緣整齊，表面光滑，菌落直徑為2.10mm。菌體呈長杆狀，產芽孢，革蘭氏陽性。
(2)生理生化特徵
該菌株的生理生化特徵為：氧化酶實驗陰性，接觸酶實驗陽性，檸檬酸鹽利用實驗陽性，硝酸鹽利用實驗陰性，澱粉水解實驗陰性，M-R實驗陰性，V-P實驗陽性，葡萄糖發酵實驗陽性，蔗糖發酵實驗陽性，麥芽糖發酵實驗陽性，阿拉伯糖發酵實驗陽性，木糖發酵實驗陰性，纖維二糖發酵實驗陰性，乳糖發酵實驗陰性，山梨醇發酵實驗陽性，甘露醇發酵實驗陽性。
3.菌株GQJK49的分子生物學鑑定
菌株GQJK4的16S rDNA基因序列，如核苷酸序列表中SEQ ID NO.1所示。將所測16S rDNA序列與GenBank資料庫中的序列比對，結果表明：GQJK49與Bacillus siamensis(KCTC 13613)同處於一個最小分支上，其16S rDNA基因序列與Bacillus amyloliquefaciens(NBRC 15535)的菌株序列相似度為99％，結合上述生理生化特徵結果，鑑定GQJK49為解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
該菌株GQJK49，分類命名為解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49，已於2016年11月10日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCC NO.13255。
實施例2：菌株GQJK49生防製劑的製備
具體製備方法如下：
將斜面保存的拮抗枸杞根腐病的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49轉接到裝有5mL豆芽汁液體培養基的試管中，放於37℃、180rpm恆溫搖床中培養12h。然後按1％的接種量接種到100mL/250mL的液體豆芽汁培養基中，放於37℃、180rpm恆溫搖床中培養24h，製成濃度為3×108cfu/mL的菌懸液。
實施例3：田間試驗
1.試驗方法：
選擇枸杞根腐病發病嚴重的地塊，設計兩個處理，分別為處理1：GQJK49菌液(實施例2製備)，每棵枸杞樹用量為25mL；處理2：用等量的清水作對照。每個處理設置3個重複，每個重複選擇20棵枸杞樹。
具體試驗方法：用清水將菌液稀釋200倍後對枸杞樹進行灌根。對照用等量的清水灌根。
2.試驗結果：
(1)菌株GQJK49對枸杞根腐病的防治效果
結果如表2所示。
表2：大田實驗中枸杞樹發病統計結果
由表2可以看出：
①發病率：在大田試驗中，對照的發病率為90％，用解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49菌液處理的枸杞樹發病率為46.67％，與對照相比，用GQJK49處理的枸杞樹的發病率降低了43.33個百分點。
②相對防效：解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49對枸杞根腐病的相對防效達55％。
(2)菌株GQJK49對枸杞樹的增產效果
結果見表3。
表3：大田實驗中枸杞產量統計結果
由表3可以看出：對照處理的枸杞樹平均產量為0.5kg/棵，用解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)GQJK49菌液處理的產量為2.67kg/棵，與對照相比，用GQJK49處理的枸杞樹平均增產434％。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術的技術人員在本發明披露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
SEQUENCE LISTING
山東農業大學
一株拮抗枸杞根腐病的解澱粉芽孢桿菌及其應用
2016
1
PatentIn version 3.5
1
1421
DNA
菌株GQJK49
1
tcggcggctg gctcctaaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga 180
tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga 480
cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540
ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat 600
gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg 660
cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag 720
ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc 780
gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc 840
tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac 900
gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960
tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt 1020
cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080
gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200
tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga 1260
agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt 1320
cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380
aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgacttgc a 1421