鑑定蛋白質摺疊抑制劑的方法

2023-12-01 07:16:31 2

專利名稱：：鑑定蛋白質摺疊抑制劑的方法鑑定蛋白質摺疊抑制劑的方法本發明涉及用於鑑定抑制蛋白質的摺疊，從而抑制其生物學功能的抑制劑的方法，尤其是用於鑑定蛋白質摺疊、具有高度選擇性並且不產生抗性的肽類抑制劑的方法。發明背景蛋白質起主要生理學作用的事實是本領域公知的。人們已經在用蛋白質作為治療劑，催化劑和具有特定性能的適宜材料方面作出了許多努力。許多疾病起源於導致蛋白質喪失功能性的蛋白質突變。在某些情況下，例如，由蛋白質發揮的催化活性可能受損，從而導致代謝途徑發生改變(例如，苯fe酮尿症)。在其它一些情況下，蛋白質本身的結構特性可能受到影響，以致於導致物理功能性的喪失(例如，肌營養不良症)。Creutzfeld-Jakob病和其它傳染性腦病可能由蛋白質的改變其形狀和形成聚合物的結構修飾引起[l]。類似地，疾病還可能由蛋白質逐漸轉化為聚合性/3-摺疊的長鏈，並沉澱，形成原纖維的澱粉樣變引起P]。已知有許多癌症的發生是由於蛋白質的突變。在這個意義上，已知有約50%的人類癌症由主要降低其穩定性的腫瘤抑制因子P53的突變導致[3]。酶和受體是恢復功能，或者破壞傳染原或癌症的藥物的常見靶點。蛋白質科學的終極目標是能根據蛋白質的胺基酸序列預測其結構和活性(所謂的"摺疊問題")，及抑制該活性[4,5]。有了這樣的成果，設計和合成新的催化劑，材料及藥理活性劑，尤其是適於抑制酶活性的藥物將成為可能。這些藥物可能顯示的主要特性是特異性(即，無毒)和有效性。通常，這可以通過將酶的活性位點加帽(競爭性抑制)，或者通過結合到該蛋白質的某些其它區域/部分上，從而引起使該酶不適於與底物結合的結構變化(變構抑制)來實現。為了實現這些目標中的任何一個，必須優化配體和蛋白質之間的結合。由於不僅需要計算酶和底物或其它配體間的能，而且還需要計算它們與水的相互作用能和反應期間熵的變化這樣一個事實，因此這是個相當艱巨費時的問題。淨結合能是兩個大數之間的小差異。在靶點為顯示高突變率的病毒蛋白質的情況下，出現的更複雜的問題是常常伴隨著眾所周知的抗性的發展。因此，策劃新的策略，使設計比已知的以活性位點為中心的設計更有效更經濟的蛋白質抑制劑成為可能，以及產生以阻斷酶與其底物間的相互作用為目的，不產生抗性的策略是至關重要的。許多實驗性[6-8，38，41]和理論性[9,10]的研究顯示球狀單結構域蛋白質(即，長度為N，包括60-150個胺基酸的蛋白質[28])通過分級機制(hierarchicalmechanism)摺疊，所述分級機制即，由少數連續胺基酸組成小單元，由小單元構成大單元，大單元再依次構成更大的單元，最後形成完整蛋白質。對天然態形成前胺基酸鏈段的摺疊和締合的實驗性研究鑑定了初期摺疊事件中的部分類天然結構[39]。這些結構要素通常被稱為摺疊結構域或摺疊子[9]。這些單元的操作定義是"蛋白質從變性態開始摺疊形成的最初可觀察的類天然結構的三維結構"。這些結構域內的突變可以嚴重限制正確摺疊蛋白質的形成[IO]。模型計算[11，12]顯示，小的單體單結構域蛋白質的摺疊從未摺疊構象開始，在依次發生下列分級事件後進行1)形成少數(2-4個)總體上含有所述蛋白質的約20%至約30%的胺基酸(因此各含有該蛋白質的5%至15%的胺基酸)的局部基本結構(通常稱為LES)，所述LES通過少數沿所述多肽連結近的高度保守的強相互作用("熱")疏水胺基酸(小於所述蛋白質胺基酸的10%)而得到穩定；2)LES在(後臨界)摺疊核對接(docking)[13],即形成使系統處於整個摺疊過程的主要自由能障之上的天然接觸的最小集合；3)在摺疊核形成後將剩餘的胺基酸立刻鬆弛在天然結構上。人們發現，穩定LES的"熱"點對(非保守性)點突變非常敏感。由於大多數蛋白質穩定能集中在這些位點，因此其中一個或兩個發生突變的可能性具有較高的使摺疊構象失穩的概率。用模型計算的LES鑑定前段的摺疊結構域是正常的。同樣的模型表明，利用其序列與蛋白質的LES的序列相同的肽(稱為p-LES)可能使該蛋白質的天然構象失穩[14]。這些摺疊抑制劑相對於常規摺疊抑制劑而言，具有兩個重要優勢。第一，其分子結構直接由靶蛋白質提示。人們不必設計或優化任何事物，只需找到靶蛋白質的LES即可。由於LES的設計已經由無數次病毒(或表達該蛋白質的有機體)的增殖，以識別並彼此劇烈地相互作用，使該蛋白質快速摺疊並避免與其它蛋白質發生聚集的演化而完成，所得抑制劑有望顯示較小的毒性。第二，其不太可能由於逃逸突變而無效。實際上，p-LES遵循使摺疊核穩定的相同範例與該靶蛋白質的互補性LES結合，穩定化由蛋白質的"熱"胺基酸控制[15，16]。因此，逃逸突變必須包括那些為LES的穩定和對接所必需的"熱"胺基酸上的突變。這些突變通常導致蛋白質變性。換言之，不妨礙蛋白質摺疊成其天然生物活性狀態的結構突變不能阻止局部基本結構向摺疊核的對接或p-LES的抑制作用。通過LES失穩或其對接而阻礙摺疊核形成的突變原則上避免了p-LES的作用，但其將由於突變蛋白質不能摺疊而不被表達。發明概述總而言之，本發明涉及使球狀單域蛋白質(這些蛋白質的典型長度為60-150)的LES個體化的簡單，經濟且(基本)無誤差的方法。因此，本發明涉及不太可能產生抗性的這些蛋白質的摺疊的高度特異性強效抑制劑(p-LES肽)的個體化。由於球狀多結構域蛋白質通常被構建成序列單元(結構域，區組[17-24]或模塊[25，26])的組合，對於真核生物，所述序列單元的特徵長度為約125個胺基酸，對於原核生物，特徵長度為約150個胺基酸，序列單元如單結構域蛋白質那樣摺疊，因此本發明還涉及用於鑑定蛋白質摺疊的肽抑制劑而不管蛋白質的大小或模塊性的方法及三態多聚體的各個單體[29,30]。在下文中，我們在球狀蛋白質或屬於三態多聚體的單體的序列單元的框架下對本發明進行了解釋。發明目的本發明因此涉及用於鑑定在不誘導逃逸突變的條件下抑制蛋白質摺疊，從而抑制其特定生物活性的肽類抑制劑的方法。因此，本發明的第一個目的是用於鑑定含N個胺基酸的蛋白質的摺疊的肽抑制劑的方法，該方法包括a)設計M個長度為L的肽，其各自顯示與靶蛋白質的某區段同一的序列，以覆蓋全部蛋白質，不同肽之間允許有一些重疊。L通常包含約IO個胺基酸，優選在約4至約20之間變動。因此，M的範圍為約5至約50，通常為約20。b)單個或集群製備M個所設計的肽。C)製備M份各自含有適當摩爾比的所考慮的蛋白質和一種肽的溶液，並在37"C孵育各溶液。d)利用標準技術評價上述溶液中肽的抑制效力或未摺疊度或兩者，以鑑定對所述蛋白質賦予抑制活性的肽。本發明的方法特別有優勢，因為其使得人們可以用可靠且非常簡單的方法從M個特意設計和製備的肽中鑑定出所考慮的蛋白質具有抑制活性，甚至最高抑制活性的肽。發明詳述根據本發明，除非另有說明，術語"肽"表示通常包括大約10個胺基酸的短肽鏈。優選該肽包括L個胺基酸，其中L在約4至約20之間變動。該"肽"的序列除非另有說明，與所述蛋白質的同等長度的區段相同。此外，"肽類抑制劑"是指阻斷靶蛋白質的摺疊，從而阻斷其特定生物學功能的肽。g卩，該抑制劑具有與所述蛋白質的LES基本同一的序列，因此也可以被稱為p-LES[14]。"LES"(局部基本結構)是指在摺疊過程中形成得非常早的第一天然結構[11,12](在文獻[9，10,38]中也被稱為摺疊子或摺疊結構域)。這些結構通過強相互作用，通常疏水的高度保守("熱")胺基酸得到穩定。人們可以區別結構良好的所謂的閉合LES和低結構化的所謂的開放LES[15]。當在溶劑中分離時，後一種類型的LES不顯示任何(重要)天然接觸。相反地，當分離時，閉合LES卻顯示出了同樣在(後臨界)摺疊核中起重要作用的天然接觸[13]。(後臨界)摺疊核"FN"是指為克服整個摺疊過程中蛋白所遇到的最高自由能障所需要的天然接觸的最小集合[13]。這些接觸大部分由LES的對接引起。該事件基本上由閉合LES控制。"熱"胺基酸是指在蛋白質的摺疊中起主要作用的胺基酸。這些胺基酸的非保守性突變通常導致蛋白質變性[16]。根據本發明的方法的步驟(a)及其任何變體，M個長度為L的肽可以這樣設計，即顯示與所考慮的蛋白質的某區段同一的序列。M和L的值的選擇應能覆蓋所述蛋白質的全部胺基酸序列，並且允許有一些重疊。通常L是IO個胺基酸(對於長度為N的單結構域蛋白質，相當於胺基酸總數N的約十分之一，即，L=N/10)，優選在約4至約20之間變動。因此，M的範圍為約5至約50，通常為約20。僅作為非限制性的解釋性的例子，本發明的方法可以通過設計19個胺基酸鏈長均為12個胺基酸的肽(g卩，M等於19)，用於對蛋白質，例如，包括120個胺基酸的蛋白質具有抑制活性的肽的鑑定。由上所述，當19個長度均為12個胺基酸的肽顯示與所述蛋白質的指定區段相同的序列，並且必須覆蓋全部蛋白質序列時，對本領域技術人員而言顯而易見的是將存在著具有重疊區段的肽(各相鄰肽之間的重疊在該特定例子中約為50%)。通常，本發明的方法的步驟(a)可以提供用於系統地設計指定的M個肽，通過從胺基酸1和下一個胺基酸開始，逐漸覆蓋全部蛋白質(因此不同肽之間允許有約50%至約70%的重疊；常見下述實施例4)。或者，所述M個肽可以通過從與接近氮和碳末端的蛋白質區段及蛋白質中心相應的區域開始進行設計，並且允許不同肽之間的再次重疊。步驟(b)包括根據本領域公知的方法製備M個肽。所述方法可以包括，例如，任何已知的用於合成肽的合成方法，或者，可能按照已知方法通過在適當的位點切割蛋白質而直接由蛋白質獲得它們。通過將步驟(b)中所製備的任何一種肽與靶蛋白質一起溶解在任何適宜的溶劑中而執行步驟(c)。肽與蛋白質的摩爾比可以在1:1-10:1(肽/蛋白質)的範圍內適當地變動；優選相對濃度是3:1(肽/蛋白質)。這樣獲得的溶液在約37。C孵育數分鐘，例如，一直到10分鐘。或者，步驟b)和c)可以由計算機模擬取代，其利用蛋白質的簡化模型(例如，全原子G5模型，CaG5-模型等[33]),加上熱力學取樣或模擬動力學(例如，MonteCarlo算法，Newton動力學等)，模擬蛋白質在各個類型肽存在下的演變(從該蛋白質的未摺疊或摺疊構象開始)，從而確定蛋白質本身在這些肽存在下的未摺疊度。這些模擬實驗可以提供有關與蛋白質的區段相同的抑制劑的序列及其在溶液中的天然構象的信息。與顯示小結構和/或大波動的抑制劑相比，顯示高度結構和穩定性的抑制劑是優選的。這與高度結構化抑制劑(與所謂的"閉合"局部基本結構(LES)，艮卩，顯示對蛋白質穩定性重要的天然接觸的動機區段相對應)有望比其它低結構化的所謂的"開放"LES特異性更強，從而毒性更小的事實是一致的[11,12，15]。在這方面，值得注意的是，僅考慮殘基的CV原子的模型計算重視了存在於這兩種類型LES之間的差異。當存在的系統實驗信息涉及與大量蛋白質位點相關的0值[4]時，為了確定蛋白質的"溫"和"熱"位點(即，在蛋白質的摺疊中起主要作用的部位[16]，相應的佔據它們的胺基酸是高度保守的)，可以最後對長度和蛋白質上的初始和最終胺基酸數稍微進行調整，以保證肽抑制劑包括所有熱胺基酸，並且，即使不是全部，也包括大多數溫胺基酸。迭代(iteration)過程可以常常通過利用適當的軟體(參見下述實施例1)計算與靶蛋白質的不同胺基酸相關的0值來進行。一旦設計了新的抑制劑，還可能通過按照上述步驟(d)的分析測試其效力。根據本發明的方法的步驟(d)，上述溶液中肽的抑制效力或未摺疊度或兩者可以根據常規方法進行測定。作為非限制性例子，分光光度檢測，沉降平衡試驗，圓二色譜和核磁共振技術都可以用來測定上述抑制作用。同樣地，吸收實驗是本領域[4]已知的當蛋白質是酶時用來測定抑制效力[4,31]的方法。如之前報導的那樣，一旦發現有效阻斷蛋白質摺疊的肽，就不必要繼續進行檢査其餘肽的抑制特性的過程，搜索和鑑定可以終止於該點。換言之，本發明的方法可以用來從所製備並如此測試的所有M個肽中鑑定出被賦予最高抑制活性的最佳肽。或者，如上文所述，步驟(c)的不同溶液可以按任何順序進行測試，一旦發現具有預期抑制活性的肽便停止全部方法，而無需測試和製備所有溶液。這樣，根據本發明的其它實施方案，步驟(a)可以包括設計長度為4-20的單個肽；步驟(b)可以包括製備所述肽；步驟(c)可以包括製備蛋白質與所述相同肽的溶液；步驟(d)可以包括評價所述肽的抑制活性。如果發現所述肽的抑制效力令人滿意，則可以終止該方法，因為其能容易地鑑定適當的肽抑制劑。反之，如果抑制效力不佳，或者無論如何該肽缺乏任何顯著抑制效力，則用另一個肽重複步驟(a)至(d)，直到鑑定出最佳抑制劑。少數(1-4)抑制蛋白質摺疊，並被我們稱之為p-LES的肽鑑定了在摺疊過程中導致LES的蛋白質的胺基酸區段。由於蛋白質為了實現其生物活性必須為天然(摺疊)構象，因此p-LES也有望成為蛋白質功能的有效的且永久有效的特異性抑制劑。應該測定p-LES在培養基中的溶解度，並且如果需要，可以對其進行修飾，以降低其疏水性。例如，修飾可以通過以下方法進行1)加入極性和/或帶電荷的胺基酸；2)縮短鏈長，即釋放C端或N端或此兩端的一個或兩個疏水胺基酸；3)保守突變，即用另一個疏水性稍小的胺基酸置換疏水性胺基酸。此外，由於p-LES是肽，因此其也可以被細胞消化和/或產生過敏反應。在這種情況下，p-LES可以用作對應於其模擬分子的摺疊抑制劑，或者按照已知方法，利用D-胺基酸合成的最終具有相同胺基酸序列的肽的先導物。下面將通過實施例，同時參考肽模擬物和p-LES的溶解度更加詳細地描述本發明的各個方面和實施方案。所述實施例不希望限制本發明，因為人們將認識到，可以在不超出本發明的範圍的條件下對本發明的方法的細節進行修改。附圖圖l:srcSH3的晶體結構的圖。(5個)反向平行的/3-摺疊被描畫為帶箭頭的(淺灰色)帶狀物，而a螺旋則以深灰色表示。圖2:在三種不同溫度下計算的單獨的SH3蛋白質的序參數q的平衡分布概率，所述q的定義為天然接觸的相對數。qX).7時，該蛋白質為天然構象，q0.5時，該蛋白質為變性態。天然和變性態的峰具有相同面積時的溫度T=0.843是摺疊溫度。圖3:由Src-SH3蛋白質結構域和三種與插圖中所示由第一個和最後一個胺基酸表徵的蛋白質區段之一具有相同序列的肽組成的系統的序參數q在T^.825時的平衡分布概率。圖4:T=0.825時計算的由Src-SH3蛋白質結構域和三種與插圖中所示由第一個和最後一個胺基酸表徵的蛋白質區段之一具有相同序列的肽組成的系統的序參數q的平衡分布概率。圖5:T=0.825時由Src-SH3蛋白質結構域和三個其序列與長度為6的起始於橫坐標所示部位的蛋白質片段同一的肽組成的系統的天然態群，其已相對於蛋白質本身的天然態群(pN"-"S)進行標準化。肽以區段l-6開始，以區段55-60結束，不同肽之間的重疊為67%。線引導目光。空心圓點提供了由輕微修飾兩種初始肽，即肽p-S2(=21-27)和p-S3(=35-40)而獲得的肽p-S'2(=18-28)禾Bp-S'3(=36-42)的抑制劑特性的信息(參見正文)。圖6:SrcSH3蛋白質結構域在T=0.825時的天然態群(空心圓點)。所示橫坐標值為0的結果與野生型序列相對應。其它結果與在位點9，30(冷，C)，5，49和55(溫，W)及18，26(熱，H)處具有突變的蛋白質相對應。T-0.825時，SrcSH3蛋白質結構域在三種p-S3(35-40)存在下的天然態的相對群以實心三角形的方式顯示。圖線引導目光。不同突變位點的值與具有橫坐標中所指突變的蛋白質的野生型序列相對應。圖7:利用改良G5模型計算的Src-SH3突變的自由能的變化AAG。並且還顯示了[AAG]和[AAG]+2d的值。AAG>[AAG]+2(7的位點(#18，26，27和40)被稱為熱胺基酸，而[AAG]<AAG<[AAG]+2ff的位點(#4，5，6，28，39，41，48，49，50和55)是溫胺基酸。系統計算和實驗信息表明，單結構域單球狀蛋白質的"熱"和"溫"點以上述比例存在(參照[40]及其中的參考文獻)。圖8:與圖7相同，但是是通過蛋白質工程[32]經實驗確定的AAGu.N值。在這種情況下，位點IO，20，24和26是熱點，而位點5，7，18，23，38，41，44，48，49和50則是溫點。圖9:HIV-1-PR同二聚體的天然構象的圖。各單體含有99個胺基酸。兩種單體用不同灰度級表示。在向右顯示的單體中，與該單體有關的LES的可能候選者以暗灰色表明[37]。圖10:利用廣義C。GG模型[37]計算的HIV-1-PR單體的許多位點(x軸)上的突變對該蛋白質的天然態的穩定性pw(y軸)的影響。實心十字與單獨的單體的天然構象的穩定性相對應(生物學溫度T=2.5kJ/mol)，而實心圓點則顯示了該單體在三種p-S8(=83-93)型p-LES存在下的pw值。在突變位點=0處所畫十字和閉合圓點表示與野生型序列相關的結果。圖線引導目光。圖11:在肽83-93(1)，非抑制劑肽(2)，肽61-70(3)和肽9-19(4)(來自參考文獻[36])存在下HIV-1-PR活性基準的吸光度作為時間的函數。實施例實施例1(Sre-SH3)該結構域顯示5個反向平行的/3-摺疊和a螺旋，由60個殘基組成(參見圖1)。對於本發明的方法，這是有趣的基準，因為其已通過熱力學和動力學實驗被廣泛表徵[32]。利用廣義G5模型[33]模擬SH3結構域的摺疊，並計算該結構域為其天然構象的概率(參見圖2)。對SH3結構域與肽同時存在的每一種情況，我們重複該計算過程，所述肽顯示與28種長度為N/10(=6)的蛋白質區段，即1-6，3-8，5-10，……，55-60之一同一的序列，並且肽-結構域比例為3:1。結果見圖3，4和5。從這些結果可以清楚地指出肽p-S屍3-8，p-S2=21-27，p-S3=35-40和p-S4=45-50抑制了摺疊，而p-S3肽是最有效的。因此，區段S,(卜l，2，3和4)是srcSH3結構域的LES。圖6中所示結果證明了肽S,(i二l，2，3和4)不僅是有效抑制劑，而且還永久有效的事實。圖6中顯示了點突變對蛋白質本身及在三種p-S3肽存在下的穩定性的影響。不影響蛋白質的穩定性或摺疊能力的突變(例如，在位點#9和#30處的突變)未改變p-S3肽的抑制能力。另一方面，逃逸突變(例如，在位點#(5，18，26，49和55)處的突變)不能摺疊。這些結果與位點#(9，30)，#(5，49，55)和#(18，26)分別為冷，溫和熱點的事實一致。結合圖5和圖7中所示結果，為了確保4種抑制劑p-S,(i=l，2，3和4)包括所有熱點(位點#18，26，27和40)和大多數溫點(4，5，6，28，39,41，48，49，50，55)，可以稍微調整這4種抑制劑的長度和初始及最終胺基酸數。沿這些圖線進行的第一次迭代的合理成果產生了P-S屍P-S—3-8(包括溫胺基酸4，5和6)，p-S'2=18-28(熱胺基酸18，26，27;溫胺基酸28)，p-S'3=36-42(熱胺基酸40;溫胺基酸39，41)，p-S'4=p-S4=45-50(溫胺基酸48，49，50)。注意該抑制劑肽的集合不包括單個(溫)胺基酸(#55)。這與不是所有參與(後臨界)FN的溫點必定屬於LES(例如，S36-模型蛋白質的溫胺基酸弁16是後臨界FN的一部分，但不屬於任何LES[16])的事實是一致的。圖5中所示P-S2'和P"S3'的結果(空心圓點)例證了迭代肽的改良的效力。值得注意的是，到現在為止報導的所有結果均來自於模型計算。由於在目前的情況(Src-SH3蛋白質結構域)下，存在的詳細實驗信息涉及在摺疊過程中起重要作用的胺基酸(即從蛋白質工程中了解AAG值[32]，參見圖8)，因此可能利用該信息去進行迭代過程。從圖8所示結果可以指出分別與胺基酸#10，20,24,26和胺基酸#5，7，18,23，38,41,48,50相應的"熱"和"溫"點。利用這些結果及圖5和6中所示結果，我們發現合理的第一次迭代產生了p-S—5-10(含有熱胺基酸10和溫胺基酸#5，7)，p-S2'=20-26(熱胺基酸#20，24，26;溫胺基酸#23)，p-S3'=38-44(溫胺基酸#38,41，44)和p-S4'=p-S4=45-50(溫胺基酸#48，50)。由上述方法確定的這些肽的抑制特性應該通過本發明的方法的步驟(d)中所引用的分析法進行測試。實施例2(HIV-PR，計算的)HIV-1-PR是由各自含有99個胺基酸的鏈構成的同二聚體(圖9)。該酶的穩定性已通過冗長的時間達數百納秒(ns)的全原子模擬進行了研究。利用相應的結果建立了廣義CsG5模型。然後其被用來模擬該酶摺疊的全部動力學演化，並將所得結果與可在文獻中獲得的全原子標準G5模型模擬實驗的結果進行比較。結合獲自這些模擬實驗的認知和來自突變的信息(表l)，確定該蛋白質的"熱"和"溫"點，並選出LES的可能候選者。尤其是，區域S^(83-93)(詳情參照[37]和其中的參考文獻)。在3種p-Ss肽存在下模擬HIV-1-PR單體的摺疊。將天然態的群Pw定義為鏈顯示出低於IO人的RMSD，並形成大於70%的天然接觸的標準化概率，一個結果顯示P^^0.28。該數值必須與相同生物學條件下單獨的蛋白質的PN=0.87及該蛋白質在具有與片段61-71和4-14相同的序列的對照肽存在下的數值PN=0.72和0.66進行比較[37]。該抑制劑不產生抗性這一事實的證據見圖10。不影響蛋白質的穩定性或摺疊能力的突變基本上未改變p-Ss肽的抑制特性(例如，在位點#19處的突變)。逃逸突變(例如，在位點#33處的突變)基本上不能摺疊。實施例3(HIV-PR，實驗性的)通過固相合成得到顯示與野生型HIV-1-PR單體的區段83-93(S8)和區段9-19及61-70具有同一的序列的肽。向20mM磷酸鹽緩衝液(pH6)中加入0.8mMNaCl，lnMEDTA和lmM二硫蘇糖醇，再加入2.78MgHIV-l蛋白酶和5.4pM肽(即，各不同肽的濃度為蛋白酶濃度的3倍)，製成各溶液。利用顯色底物[34]進行光譜分析，測量其在310nm處的吸光度相對時間的變化[36]。圖11中報導了部分相應結果。可以看到，肽83-93始終降低蛋白酶的活性，因此可以用作抑制劑。該序列因此可以被理解為產生了HIV-1-PR的L^S。如從圖9觀察到的那樣，該LES結構良好，包含許多內部天然接觸(其穩定a螺旋轉角)。其因此是特異性尤其強的肽抑制劑。值得注意的是，不管是否由商品化藥物(目標為抑制該蛋白酶的活性部位)誘導，在該片段[35]或其互補片段(即，片段24-34)中觀察到的突變都被發現是保守突變(參照表l)。tableseeoriginaldocumentpage18表l:參考文獻[35]中報導的觀察到的HIV-l-PR的突變。對於野生型序列的各殘基(wt)，列出了在治療和/或未治療患者中觀察到的突變(mut)和與這些突變中的最少保守性突變相關的PAM250分值(PAM250是由分析相關蛋白質之間發生的胺基酸置換而得到的分值。其為通常發生在相關蛋白質之間的置換(保守突變)規定各種正值，為不可靠置換(unlikelyreplacements)(非保守突變)規定零或負分值)。用粗體字報告了發生非保守性突變的位點。實施例4如果是含有N個胺基酸的蛋白質，可以製備長度為L=(N/10)±2，各顯示與該蛋白質的某區段相同的序列的肽。肽#1與開始於胺基酸1和結束於胺基酸L的區段一致，肽#2與區段(L/z+l)—[(l+z)L/z]—致，…，而ith肽與區段(iL/z+l)—[(i+z)L/z]—致，其中i-l，2，…，im，其中i:n-zN/L-Z。因此，將產生的肽的最大數量是im+l。數量Z控制兩個相鄰肽之間允許的重疊。z的推薦值為導致50%和67%重疊的2和3。為了(現實)例證的目的，我們選擇值N400，L=10，z=3。然後獲得im=27和67%的重疊。與28種可能肽各自的第一個和最後一個胺基酸相對應的數集中在表2中。以HIV-1-PR二聚體的單體為例，我們關聯這些結果，並假定在抑制摺疊的肽的搜索中所遵循的三種不同方案a)從胺基酸(aa)1開始有序搜索，並繼續進行至aal00(即，從N端開始向C端進行)，b)有序搜索，但以相反的順序進行(由100至1，g卩，從C端到N端)，c)從蛋白質的N端，C端和中間開始隨機搜索，然後從這些區域離開，以覆蓋全部蛋白質。為找到p-LES抑制劑(表2的肽#26)，在第一種情況下，研究者需要進行26次嘗試，在第二種情況下，需要3次嘗試，而在第三種情況下則需要12次嘗試(見表2)。tableseeoriginaldocumentpage20表2:將HIV-1-PR的序列分割為肽的例子。各列分別顯示了肽的標識號，指標i(參見正文)，HIV-1-PR序列中的相應片段和基本上同時從蛋白質的中心及C和N末端開始進行的非連續抑制試驗的例子(以羅馬數字表示)。在這種情況下，當測試肽#26時，搜索工作在12個步驟後結束。參考文獻1.A.L.HorwichandJ.S.Weissman，DeadlyConformations-ProteinMisfoldinginPrionDisease,Cell89(1997)4992.D.R.Boothetal.，Instability,unfoldingandaggregationofhumanlysozymevariantsunderlyingamyloidfibrillogenesis,Nature385(1997)7873.D.SidranskyandM.Hollstein,Clinicalimplicationsofthep53gene.AnnualReviewofMedicine,47(1996)2854.A.Fersht，StructureandMechanisminProteinScience,Freeman,NewYork(1999)5.C.BrandenandJ.Tooze，IntroductiontoProteinStructure,Garland,NewYork(1999)6.H.J.DysonandP.E.Write,Peptideconformationandproteinfolding,Curr.Opin.Struct.Biol.3(1993)60-657.L.C.Wu，R.GrandorriandJ.Carey,AutonomousSubdomainsinProteinFolding,Prot.Sci.3(1994)396-3718.Y.Bai,J.S.Mulue，L.MayneandS.W.Englander,Primarystructureeffectsonpeptidegrouphydrogenexchange,Proteins17(1993)75-869.R.Jaenicke，Proteinfolding:localstructures,domains,subimits,andassembliesBiochem.30(1991)3147-6110.A.Wallqvist,G.W.SmithersandD.G.Covell，AcooperativefoldingunitinHIV-1protease.Implicationsforproteinstabilityandoccurrenceofdrug-inducedmutations,Prot.Engin.11(1998)999-100511.R.A.BrogliaandG.Tiana,HierarchyofEventsinthefoldingofmodelproteins,J.Chem.Phys.114(2001)7267-727312.G.TianaandR.A.Broglia，StatisticalAnalysisofNativeContactFormationintheFoldingofDesignedModelProteins,J.Chem.Phys.114(2001)2503-250713.V.I.Abkevich,A.M.GutinandE.I.Shakhnovich,Specificnucleusasthetransitionstateforproteinfolding,Biochem.33(1994)10026-1003214.R.A.Broglia,G.TianaandR.Berera,Resistanceproof,folding-inhibitordrugs,J.Chem.Phys.118(2003)4754-475815.R.A.BrogliaandG.Tiana，Readingthethree-dimensionalstructureofaproteinfromitsaminoacidsequence,Proteins45(2001),421-42716.G.Tiana,R.A.Broglia,H.E.Roman,E.VigezziandE.I.Shakhnovich,FoldingandMisfoldingofDesignedProtein-likeFoldingandMisfoldingofDesignedProtein-likeChainswithMutations,J.Chem.Phys.108(1998)757-76117.D.B.Wetlaufer,Nucleation,RapidFolding,andGlobularIntrachainRegionsinProteins,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70(1973)697-70118.D.B.Wetlaufer,Foldingofproteinfragments,Adv.Prot.Chem.34(1981)61-9219.G.E.SchulyandR.H.Schirmer，PrinciplesofProteinStructure,Springer,Heidelberg(1979)20.G.E.Schulz，Domainmotionsinproteins,Curr.Opin.Struct.Biol.1(1991)883-88821.K.A.Dill,Theoryforthefoldingandstabilityofglobularproteins,Biochem.24(1985)1501-150922.J.S.Richardson,TheAnatomyandTaxonomyofProteinStructure,Adv.Prot.Chem.34(1981)167-33923.J.JaninandS.J.Wodak，Structuraldomainsinproteinsandtheirroleinthedynamicsofproteinfunction,Prog.Biophys.Mol.Biol.42(1983)21-7824.D.S.GoodsellandA.J.Olson,Solubleproteins:size,shapeandfunction,TrendsBiochem.Sci.18(1993)65-6825.R.F.Doolittle，ReconstructinghistorywithaminoacidsequencesProt.Sci.1(1992)191-20026.P.Bork，Mobilemodulesandmotifs,Curr.Opin.Struct.Biol.2(1992)413-42127.A.L.Berman，E.KolkerandE.N.Trifonov,Underlyingorderinproteinsequenceorganization,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(1994)4044-404728.D.XuandR.Nussinov,Favorabledomainsizeinproteins,Fold.Design.3C1998)1129.E.Shakhnovich，Proteinswithselectedsequencesfoldintouniquenativeconformation,Phys.Rev.Lett.72(1994)390730.G.TianaandR.A.Broglia，Foldinganddesignofdimericproteins,Proteins49(2002)82-9431.C.CantorandC.Schimmel，BiophysicalChemistry,W.H.FreemanandCo.(1994)32.V.P.Grantcharova,D.S.Riddle,J.V.SantiagoandD.Baker,ImportantroleofhydrogenbondsinthestructurallypolarizedtransitionstateforfoldingofthesrcSH3domain,NatureStruct.Biol"5714(1998)33.N.G5，Theoreticalstudiesofproteinfolding.AnnuRevBiophysBioeng，12183-21(1983)34.T.A.Tomaszeketal.ChromophoricpeptidesubstratesforthespectrophotometricassayofHIV-1protease,Biochem.Biophys.Res.Comm168，274-280(1990)35.R.W.Shafer,P.Hu，A.K.Patick，C.CraigandV.Brendel,Identificationofbiasedaminoacidsubstitutionpatternsinhumanimmunodeficiencyvirustype1isolatesfrompatientstreatedwithproteaseinhibitors,J.Virol.73(1999)6197-620236.R.A.Broglia，G.Tiana，D.Provasi，F.Simona,L.Sutto，F.VasileandM.Zanotti,tobepublished,DesignofafoldinginhibitoroftheHIV-1Protease,q-bio/040801337.R.A.Broglia,G.Tiana,L.Sutto，D.ProvasiandF.Simona,DesignofHIV-1-PRinhibitorswhichdonotcreateresistance:blockingthefoldingofsinglemonomers,q-bio/050401138.H.Maity，M.Maity,M.M.G.Krishna,L.MayneandS.W.Englander，NMRcharacterizationofresidualstructureinthedentauredstateofprotenL,Proc.Natl.Ac.Sci.USA,102(2005)4741-474639.Q.Yi,M.L.Salley-Kim,E.J.AimandD.Baker,NMRCharacterizationofresidualstructureinthedenaturedstateofproteinL,J.Mol.Biol.299(2000)1341-1351.40.R.A.Broglia,G.TianaandD.Provasi,Simplemodelsofproteinfolding,J.Phys.Cond.Mat.16(2004)R111-R11441.A.M.LeskandG.D.Rose,Foldingunitsinglobularproteins,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)4304-4308權利要求1.用於鑑定N個胺基酸的蛋白質的摺疊的長度為L的肽抑制劑的方法，該方法包括a)設計M個長度為L的肽，其各自顯示與所考慮的蛋白質的某區段的同一的序列，以在有某些程度重疊的情況下覆蓋全部蛋白質長度，其中L通常為10，一般在約4至約20的範圍內，其中M是通常在5至50之間變動的整數；b)單個或集群製備M個所設計的肽；c)製備M份各自含有適當摩爾比的所考慮的蛋白質和一種所述肽的溶液，並在37℃孵育各溶液；d)通過標準技術評價上述溶液中肽的抑制效力或未摺疊度或兩者，以鑑定對所述蛋白質賦予抑制活性的肽。2.權利要求1的方法，其中N為60-150。3.權利要求l的方法，其中肽的長度L為4-20。4.權利要求l的方法，其中肽的長度對應於L-N/10。5.權利要求1的方法，其中步驟(b)通過根據標準方法合成M個肽或者適當切割靶蛋白質而進行。6.權利要求1的方法，其中肽/蛋白質的摩爾比在1:1-10:1之間變動。7.權利要求5的方法，其中肽/蛋白質的摩爾比是3:l。8.權利要求1的方法，其中步驟(b)和(c)可以由電腦程式模擬取代。9.權利要求1的方法，其中步驟(b)和(C)通過分光光度檢測，沉降平衡試驗，圓二色譜或核磁共振技術來進行。10.通過權利要求l-8任一項中所定義的方法鑑定的肽抑制劑。11.權利要求9中所定義的肽抑制劑，其用作藥劑。12.權利要求l的方法，其用於多結構域蛋白質的各個結構域。全文摘要本發明涉及用於鑑定抑制蛋白質的摺疊，從而抑制其生物學功能的不產生抗性的肽抑制劑的方法。尤其是，本發明涉及具有高突變率的病毒酶的抑制劑。文檔編號G01N33/68GK101228443SQ200680026560公開日2008年7月23日申請日期2006年7月17日優先權日2005年7月19日發明者圭多·蒂亞納,裡卡多·布羅利亞申請人:米蘭大學