作為新的局部用抗出血劑的活化的因子X(FXa)的刺激劑的製作方法

2023-11-01 16:18:47 5

專利名稱：：作為新的局部用抗出血劑的活化的因子X(FXa)的刺激劑的製作方法作為新的局部用抗出血劑的活化的因子X(FXa)的刺激劑發明領域本發明涉及通過使用FXa刺激劑來局部治療個體的出血。本發明是基於脂化的組織因子(TF)表現出新的調節作用的發現，該調節作用刺激兩種形式的FXa，即可溶性FXa及與凝血酶原酶複合物結合的FXa的所有蛋白水解活性(醯胺水解活性及凝血酶原水解活性)。
背景技術：
：1.凝血生理學止血是生物體對出血作出應答的機制，其涉及兩種在損傷後立即起作用且長時間保持活性的過程的參與。第一個過程被稱為原發性止血，其特徵在於在血管損傷部位發生血管收縮並形成血小板聚集。第二個過程稱為繼發性止血，在此階段由於不同凝血級聯(coagulationcascade)蛋白水解酶的作用，形成纖維蛋白凝塊。血小板聚集在毛細血管止血中起關鍵作用，這對黏膜皮膚出血特別重要。相反的，纖維蛋白凝塊形成對大血管止血更重要，尤其對內出血(胃腸道、腦出血等)更重。在血小板聚集形成過程中，可區分為下列階段(i)血小板黏附至由損傷暴露的內皮下層表面；(ii)釋放血小板的顆粒內容物作為對血小板活化的應答；(iii)血小板聚集造成隨後更多的血小板在損傷部位螯合(sequestering)併集中；以及(iv)纖維蛋白原及其它凝血蛋白與血小板表面結合，以產生凝血酶並形成纖維蛋白凝塊，該纖維蛋白凝塊允許血小板融合併固化，從而使止血凝塊穩固。另外，公知血小板計數對纖維蛋白凝塊形成起關鍵作用；血小板計數低於20,000每微升會伴隨嚴重的出血事件。多種輔因子及蛋白水解酶參與凝血過程的第二階段，它們皆稱為凝血因子，以及這個階段由多個階l史組成，以由於凝血酶的作用由纖維蛋白原水解形成纖維蛋白作為結束。另外，凝血酶的產生通過增加更多的血小板被活化及聚集來增強血小板聚集。凝血酶最先由脫輔基酶，凝血酶原進行蛋白水解形成。此蛋白水解作用是由與活化的血小板的表面結合的絲氨酸蛋白酶FXa進行，且只有當其輔因子，活化的凝血因子V(FVa)及鉤離子存在時，此絲氨酸蛋白酶才能夠水解凝血酶原。FXa可由兩種單獨的途徑產生，即內源途徑及外源途徑。內源途徑由一系列的主要涉及凝血因子VIII(FVIII)、凝血因子IX(FIX)及凝血因子XI(FXI)的反應組成，其中各個酶原被水解，產生其活性蛋白酶形式(FVIIIa、FIXa及FXIa)。在各步驟中，新形成的蛋白水解酶將下一酶原催化活化以相繼產生活性形式。在內源途徑中所涉及的不同凝血因子被活化；因此，內源途徑中任何蛋白質的缺乏將以級聯方式阻斷下一步驟的活化，阻止凝塊形成並增加出血趨勢。不同凝血因子的缺乏將造成嚴重的出血症候群，例如FVIII、FIX或FXI的缺乏分別造成血友病A、B和C。在血液凝固的外源途徑中，在損傷部位的外膜細胞上暴露的TF結合循環凝血因子VII/活化的凝血因子VII(FVII/FVIIa)，以形成TF::FVIIa複合物，以及當鈣離子存在時以用作使FX活化的底物。夕卜源途徑目前被認為在血液凝固中是最相關的途徑，公認如果發生由血管損傷導致的出血，則由於外源途徑活化涉及TF與其配體-FVII/FVila的相互作用，將啟動凝血。TF::FVIIa複合物在凝血中的另一項作用是用作底物，使得因FVIIa而發生FX活化。結果，最初不足以使纖維蛋白凝塊形成的基礎FXa水平(〈150pM)增加。在其輔因子，FVa及細胞的促凝表面的存在下，這種基礎FXa濃度的增加將能夠產生纖維蛋白凝塊形成所需要的凝血酶。目前公認的是一旦血小板被活化，它們在凝血過程起關4囊作用。它們提供了富含陰離子磷脂的促凝表面，另一方面它們使儲存其內的FVa及FXa暴露。所有這些都使參與凝血的不同物質在其質膜表面正確組合，形成公知的凝血酶原酶複合物(其包括FXa、FVa、凝血酶原及陰離子促凝血性血小板磷脂表面)。外源途徑活化的理論能夠解釋凝血反應是如何通過TF::FVIIa複合物開始的。說明TF::FVIIa複合物在凝血過程中的生物相關性的一個例子，就是彌散性血管內凝血(DIC)症候群。此臨床疾病狀態與TF的血管內釋放有關，並可出現在嚴重的臨床疾病狀態的病程中(休克、膿毒病、心臟停搏、嚴重創傷、肝病、大外科、燒傷等)。顯然在FVIIa缺乏的情況下，例如先天性缺乏此因子時，理論上不發生凝血，因為無法活化足夠水平的FX，因而出血現象將是致命的。鼠模型證實這一理論，FVII缺乏是威脅生命的並伴隨著嚴重的致命性出血。然而，到目前為止在人類中描述的先天性FVII缺乏症並非總是伴隨著出血。曾經4艮道了無任何臨床症狀並發生在無任何出血併發症的健康人身上的FVII完全缺乏的病例。這些均顯示，人體內一定存在不依賴於FVII的其它引發凝血的機制。TF是屬於特異性結合FVII/FVIIa的II類細胞因子受體超家族的完整的膜糖蛋白，以及在外源性凝血途徑中起重要作用。TF的生理作用是公知的；一方面它是對FVIIa有特異性的受體，並且一旦形成TF::FVIIa複合物，其便起底物的作用，從而發生FX活化。事實上，在血管損傷後，通常被隔離在血管外圍的外膜細胞表面上的TF與其配體，存在於血液中的FVII接觸並相互作用，形成TF::FVII複合物。一旦形成該複合物，便發生FVII自體活化，產生其活化形式FVIIa。目前關於TF::FVII複合物的結構有了廣泛的信息。參與FVII與TF的相互作用的主要的FVII結合部位位於與表皮生長因子(EGF)的第一結構域類似的第一結構域內及蛋白酶結構域中。另一方面，還報導了參與其中的其它較次相關的結合部位(富含4-羧基穀氨酸酯的結構域(Gla結構域)及第二EGF結構域)。TF中存在的結合部位位於兩個類型III纖連蛋白結構域及這兩個結構域之間的中間區。最近的研究已經發現，TF的賴氨酸165和賴氨酸166殘基與活化形式及非活化形式的FX的Gla結構域相互作用。然而與關於TF::FVIIa複合物的信息不同的是，我們對TF與FX及FXa的相互作用所知甚少。首先，數據表明賴氨酸(165和166)殘基作為FX活化的底物起作用。另一方面，最近的研究描述TF可用作FXa輔因子以活化FVII。也就是說，FVII與TF的結合刺激FVIIa自體活化及FX活化。之後，結合TF的FXa刺激FVII活化，進而增加FX活化，並致使凝血酶原水解及纖維蛋白凝塊形成。發明人發現，TF作為FXa的輔因子的假設角色更為重要，對止血至關重要。雖然TF公認的角色是FVII的膜受體，發明人證實TF也是有效的FXa刺激劑。作為FXa刺激劑，TF顯著提高其蛋白水解活性。本說明書中使用的"FXa刺激劑"是指所有形式的FXa,諸如可溶性FXa及結合凝血酶原酶複合物的FXa。公知，皮摩爾濃度的FXa對凝血不能夠產生任何作用，即使其公知的輔因子FVa的存在時也亦然(見表9)。因此在這種情況下，凝血酶原酶複合物是無活性的。令人意外的是，當TF存在時(即，受傷或外源性給藥)，皮摩爾濃度的FXa(即，生理基礎濃度或外源性給藥)仍能引起凝血酶原水解，導致纖維蛋白凝塊形成，即使沒有FVII/FVIIa存在下也亦然(表7)。在本專利申請中，發明人描述了TF::FXa相互作用是不依賴於TF::FVIIa複合物及外源性凝血途徑的新的引發凝血才幾制。最後，公知存在著一些血小板疾病，其伴隨著血小板聚集異常及具有較高的發生出血事件的趨勢，其中格蘭茨曼病(Glanzmann，sdisease)及貝-蘇綜合4i(Bernard-Souliersyndrome)尤為突出，^>開了在這些疾病中先天性缺陷分別影響纖維蛋白原受體及Gplb受體。另一方面，當血小板計數下降在20,000/jliI以下時，在先天性及後天性血小板減少症中將存在嚴重的出血事件。在本專利申請中，發明人證實脂化的TF也有效治療存在於先天性、後天性血小板疾病或嚴重的血小板減少症中(低於9,000//11)的出血。2.凝血病理學先天性缺乏各種凝血因子可以與出血的發生相關，以及它們通常涉及單一蛋白；因此，例如血友病A是缺乏FVIII的遺傳性出血性疾病。後天性凝血疾病發生在先前無出血史的個體，並可能有多種來源；舉例來說，在接受多次輸血的個體中可能存在對凝血因子有特異性的抑制劑。雖然後天性凝血因子缺乏在病因學上未知，其也引起嚴重的止血問題，但是它們也是患有先天性凝血病的患者在接受多次輸血時會發生的最嚴重的問題之一。後天性凝血障礙的其它重要來源是抗凝血劑治療，例如肝素及華法林藥物。顯著比例(5至10%)的用抗凝血藥物治療的患者存在出血事件，這些事件大多數都不易治療。如前所述，先天性及後天性血小板疾病還可以與出血相關。血小板計數降低(低於20,000//xl)可能引起經常與嚴重出血事件一同發生的纖維蛋白凝塊形成障礙(fibrinclotimpairment),目前用於輕度/中度或嚴重/致命出血(由手術或外部創傷造成)的可利用的治療方法非常有限。存在能夠加速凝血及防止出血的不同止血劑，例如(l)人來源的血液製品，如凝血因子濃縮物，及局部止血劑，如纖維膠原、纖維蛋白膠及凝血酶原複合物濃縮物；(2)人重組蛋白；(3)抗纖維蛋白溶解的藥物，例如氨基己酸、氨甲環酸；及(4)無機局部止血劑，i口石圭石及陶土表面)。下列重要的局限性曾被報導(1)靜脈給藥(2)給藥需要特殊裝置(3)治療目標狹窄(4)對特定的出血事件無法給予適當或簡便的治療(5)缺乏急性作用(6)纖維蛋白凝塊不穩定(7)副作用非常危險(8)治療昂貴人來源的血液製品(凝血因子及血小板濃縮物)這是一種非常昂貴的且可利用性低的治療，其必須一直靜脈給藥藥。該治療具有非常狹窄的治療目標，及只能用於治療特定的因子缺乏症。該治療不適用於局部治療任何種類的出血事件。其也無法用於急性治療出血，因為其需要長期的給藥方案才能有效，並且最重要的是這是非常危險的治療20。/。的血友病患者感染肝炎、5%的患者感染HIV、高達15%的患者出現抗FVIII或IX的血漿抗體(後天性血友病)，這需要使用特殊且非常昂貴的替代治療(免疫抑制劑、高劑量的凝血因子、血漿去除術等)。因為這些原因，z^共衛生組織(WHO、FDA、EMEA等)極欲發展優於凝血因子濃縮物的新的止血劑。局部止血劑這是一種昂貴的治療，其不適合在某些出血事件(即，鼻出血)中給藥，對於牙科治療也是麻煩的，形成不穩定的纖維蛋白凝塊，並和凝血因子濃縮物一樣具有潛在的危險副作用。它們不應被用於從未接受人來源的血液製品的患者中，以及不應被用於由於潛在的人類病毒傳4番風險而4妄受用重組FVIII或IX進4亍治療的患者。人重組蛋白這是最昂貴的治療(平均費用為6,000歐元)，只在發達國家使用。與凝血因子濃縮物一樣，其必須一直要靜脈給藥，因為只能用於治療特定的因子缺乏症，因此治療目標非常狹窄，不適合局部治療出血，因為其也需要長期給藥方案才有效，因此不能用於急性治療出血，以及雖然不曾有人類病毒傳播的報導，但是有相同比例的後天性血友病(高達15。/。出現抗FVin或IX的抗體)。與凝血因子濃縮物一樣，政府當局非常限制它的應用。抗纖維蛋白溶解的藥物抗纖維蛋白溶解的藥物最主要的限制在於其具有狹窄的治療目標。這些藥物需要預先形成纖維蛋白凝塊才有效。因此，其只能用於健康個體，但是，當不適當地形成纖維蛋白凝塊時(即，先天性凝血病，如血友病、FVII缺乏症)，其療效顯著降低。另外它們無法用於急性治療出血，因為其也需要長期給藥方案才有效。無才幾局部止血劑這些止血劑的最重要的使用限制在於其不適於在多種類型的出血中進行給藥，例如鼻出血、牙科及外科手術。另外，曾報導有疼痛放熱反應，因此明顯減少了它的應用，將其用途僅限於危急狀況(如戰爭)下的勦膜皮膚出血。總而言之，令人意外的是目前沒有可利用的藥物來適於局部治療筒單的鼻出血，刷牙後牙齦出血，或單純因為刮鬍子、抽血時靜脈穿刺或在街上意外跌倒所導致的日常傷口。這個問題在如下患者中更為嚴重具有出血素質的患者，例如患有血友病類型的或血管性血友病(vonWillebranddisease)的先天性凝血病的患者，患有格蘭茨曼病類型的或貝-蘇症候群的先天性血小板疾病的患者，或患有後天性凝血病的患者。這些患者在日常生活中就會遇到嚴重的問題，並且對於簡單的拔牙或任何導致出血傷口的小創傷，他們都沒有可利用的醫藥治療來改善他們的生活質量。當這些患者受到外傷或嚴重的出血意外時，這個問題顯然變得更加嚴重，因為他們的生命受到嚴重的威脅。在所有這些情況中，唯一可以使用的醫藥工具是給予含有所缺乏的因子的人類血漿，或給予對每一凝血因子特異的的人重組因子。但是這些療法都意味著使用非腸胃外途徑給藥，因此無法象例如在日常輕微或中度出血的情況下那樣被頻繁使用。最後，廣泛認為無上述限制的新的局部止血劑將顯著改善目前的療法，其既可降低成本又能減少副作用的高發生率。3.
背景技術：
：直到目前為止，公認TF是引發凝血的主要要素。要開始凝血，絕對需要將FX活化為FXa,以啟動凝血酶原水解。FXa的來源主要來自FVIIa與其受體(TF)的相互作用。雖然有報告指出FXa存在於血小板顆粒中，當它開始活化時可能被暴露於表面，但是血液中存在的FXa的生理濃度(<150pM)不足以啟動凝血酶形成，即使其輔因子FVa及血小板促凝表面存在時也亦然(圖1)。因此，目前公認只有當FXa基礎濃度顯著上升時才會開始凝血。FXa基礎濃度上升的來源一向被歸因於兩點，TF::FVIIa複合物及FIXa的蛋白水解活性(圖2)。脂化的TF重組蛋白只能夠體外條件下促進健康和血友病血液樣品的凝血，此作用歸因於TF作為FVIIa受體的典型作用。但是在相同的實驗條件下，非脂化的TF表現出完全缺乏這種作用，這表示脂化對於實現TF的功能性是必需的(見結果的6.1部分)。脂化的TF作為局部止血劑的用途從未被描述其能單獨用於輕微、嚴重或致命性出血(外傷或手術性動脈及靜脈出血)的治療。歐洲專利EP266993公開了非脂化的TF作為腸胃外治療出血症候群的止血劑的用途。然而，這個相同的專利公開了EP266993所請求保護的非脂化的TF與本專利申請的脂化的TF之間有重要的活性差異。事實上，公知脂化的TF在體外條件下具有活性，並且其腸胃外給藥立即引起具有致命性後果的彌散性血管內凝血。相反，非脂化的TF在體外條件下不具有活性，但是其已被要求保護通過腸胃外給藥來治療凝血病(EP266993)。到目前為止，沒有關於脂化和非脂化的TF單獨局部治療出血事件的作用的數據。在本專利申請中，發明人利用大鼠斷尾模型證實非脂化的TF不能夠使出血停止。相反，發明人首次證實，脂化的TF是局部治療所有類型的出血的有用的止血劑，該出血包括病理狀況下(用肝素及華法林處理的動物)及健康狀況下(沒有改變凝血的對照大鼠)的出血。整體來說，這表示脂化的TF與非脂化的TF是明顯不同的化合物。因此，脂化的TF作為單獨局部治療出血的試劑的用途對於本領域所屬技術人員來說是非顯而易見的。另一方面，EP266993是根據現有技術來實施的，該技術假設只有當絲氨酸蛋白酶FVII與其受體TF結合時，其才能被活化。因此，根據EP266993及現有技術，當FVII/FVIIa不存在時，TF—定不具有活性。本領域任何技術人員不能顯而易見地想到，TF(脂化及非脂化的)可以有效地治療FVII缺乏的患者。發明人發現，即使FVIIa不存在，TF也可作為FXa的輔因子。這項發現對於了解非脂化的TF也可用作腸胃外止血劑來治療FVII缺乏的患者的出血是非常重要的。國際專利申請WO94/02172教導，通過全身給予天然抗凝血劑的抑制劑(抗體)來暫時抑制一種或多種天然抗凝血劑，能夠抑制微血管出血。該抑制劑可任選地與凝血酶或脂化的TF的局部給藥相組合來進行給藥。需要指出的是，這兩種化合物的用途一直是作為任選的輔助治療，從未作為單獨治療。另外，WO94/02172主張這些協同治療的用途僅用於治療毛細血管出血(微血管出血，即燒傷、發炎的內臟表面、出血的肝臟表面...)，並且從未用於因外科手術或涉及動脈及靜脈損傷的外傷造成的嚴重或致命性出血。然而，WO94/02172的發明人承認，雖然他們觀察到當局部給予凝血酶與全身性治療相結合時有協同作用，但是當局部給予TF時並未發現這類協同作用(WO94/02172,圖3及第22頁，第14至15行)。另外，WO94/02172中所主張的劑量範圍非常高，從0.1mg至10mg。和WO94/02172相反，本專利申請主張單獨使用脂化的TF，以單一治療輕微/中度至嚴重/致命的動脈或靜脈出血，實施例顯示這種治療在1.2/ig/ml的活性蛋白劑量下對於創傷性出血是有效的(見表24及25中的嚴重模型)。這種令人驚訝且格外有效的治療迄今為止未曾被描述，因為脂化的TF用作FXa蛋白水解活性的刺激劑對於本領域所屬技術人員而言是非顯而易見的。發明人發現當FVIIa不存在時，TF作為FXa的輔因子，甚至在其公知的輔因子FVa不存在下也亦然。這項發現對於了解脂化的TF能夠單獨用作止血劑以治療健康及病理狀況下的嚴重出血是非常重要的。美國專利第4,721,618號教導靜脈給予磷脂(PCPS)與高濃度的FXa(0.2至0.5U/Kg)的協同混合物，可以越過血友病哺乳動物的因子vm:c缺乏，使得凝血級聯過程可以繼續進行。所述建議的高濃度的FXa不需要PCPS脂質嚢(其可提高活性)就具有活性。WO02/086118還教導包括至少一種特殊磷脂與至少一種絲氨酸蛋白酶活化的凝血因子的混合物的組合物用於治療凝血障礙，減少給予凝血因子的需求。另外，WO02/30479主張並使用鞣花酸及諸如沸石、矽石及無機氧化物的其它促進劑促進凝血。根據WO02/086118，凝血因子定義為絲氨酸蛋白酶活化的凝血因子(第5頁第13至15行)。因此TF可能不被認為是凝血因子，因為TF不是絲氨酸蛋白酶，而是因子Vila的特異性細胞表面受體。在本專利申請中，發明人證實磷脂(不同百分比及摩爾濃度的磷脂醯絲氨酸及磷脂醯膽鹼)不提高由脂化的TF介導的促凝效果(表21)，這表示美國專利第4,721,618號及WO02/086118所主張的協同作用僅限於絲氨酸蛋白酶活化的凝血因子，不適用於諸如TF的膜受體。令人意外的是，當脂化的TF同時結合負電荷的無機表面(NCIS)時，在體外及體內實驗條件下觀察到顯著的協同作用。本說明書中所用的NCIS是由脂質與血液凝固促進劑-鞣花酸的混合物組成。該脂質具有淨負電荷，這意味著該脂質混合物可包括中性或兩性離子脂肪，但一定包含一定量的使該混合物具有陰離子特性的負電荷的脂質。舉例來說，但不限於此例，負電荷的脂質可以是鞘脂(諸如神經醯胺-l-磷酸鹽、糖基化的磷脂醯乙醇胺、羥基化或非羥基化的硫苷脂、神經節苷脂)或基於甘油的脂質(諸如磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯肌醇磷酸、磷脂酸、磷脂醯甘油、心磷脂)。市售的NCIS，諸如DadeActin(DadeBehring)商標，例如DadeActinFS。總而言之，本專利申請描述了新的局部用止血劑，其特徵在於與市售的藥物相比其具有下列優點(1)容易局部給藥(2)局部給藥不需要使用特殊的裝置(3)治療目標廣泛(FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏症)(4)對所有的出血事件均可給予適當治療(鼻出血、牙出血、黏膜皮膚出血、創傷性出血及外科手術出血)(5)發揮有效的急性作用(6)形成生理性纖維蛋白凝塊(凝塊穩定性極端高)(7)無副作用(8)治療費用低WHO、FDA、MEA及其它/^共衛生才幾構的主要目標是減少與使用人來源的血液製品相關的危險的副作用。本發明的設計符合這些未被滿足的需求。發明概述TF::FVIIa複合物在凝血中的作用是公知的。TF::FVIIa複合物用作底物，使得發生FX活化。最近的研究已經鑑定了TF賴氨酸165殘基及賴氨酸166殘基與活化形式及非活化形式的FX的Gla結構域相互作用。不同於TF::FVIIa複合物的是，TF與FX及FXa的相互作用所知甚少。僅描述了TF可用作FXa的刺激劑以便FVII活化。也就是說，FXa與TF的結合將刺激FVII活化，進而增加FX活化。發明人發現TF作為FXa的刺激劑的作用對於止血是更為重要的關鍵(圖3)。公知皮摩爾濃度的FXa對凝血及血小板聚集不能夠產生任何作用。雖然TF公認的角色是作為FVII的膜受體，但是發明人證實TF也用作FXa的刺激劑，以增強其主要的蛋白水解活性、水解凝血酶原、導致纖維蛋白凝塊形成。令人驚訝的是，當TF存在時(即，受傷或外源性給予)，皮摩爾濃度的FXa引起凝血酶原水解，導致纖維蛋白凝塊形成，甚至在其配體FVII/VIIa不存在時也亦然。整體結果顯示TF用作FXa的刺激劑，並且FXa與TF的特異性結合是引發凝血的第一步。發明人的數據表明凝血發生的速度取決於TF與先前敘述的所有形式的FXa之間的相互作用。在存在不能獨自啟動凝血的生理濃度的FXa(<150pM)時，脂化的TF由於其作為輔因子的作用而能夠快速啟動凝血酶形成。令人驚訝的是這些止血作用不依賴於FVII和FVIIa的存在，所以由內源性TF::FXa複合物(FXa〈150pM)所介導的促凝作用在缺乏FVII的樣品中特別有效且重要。然而，在來自患有先天性缺乏其它凝血因子的患者的樣品中，該其它凝血因子例如FVIII(血友病A)、FIX(血友病B)、FXI(血友病C)、FV、FX、FXII及FXIII，以及患有先天性血小板疾病的個體的樣品中，該先天性血小板疾病例如貝-蘇症候群及格蘭茨曼病和血小板減少症，也發現了強效的止血作用。因此，本發明是基於單獨的或與FXa和/或與NCIS組合的脂化的TF作為FXa的新刺激劑用於局部治療健康個體或具有出血素質的患者中存在的出血的用途。發明人得到的結果開啟了使用非脂化的TF或其功能片段治療缺乏Fvn個體的出血。所述治療可通過使用用於腸胃外給予非脂化的TF的適當藥物給藥形式來完成。因此一方面，本發明涉及脂化的TF或其功能片段在製備用於局部治療個體出血的藥物中的用途。另一方面，本發明涉及包含單獨的脂化的TF或脂化的TF與FXa和/或NCIS的組合的產品。該產品作為藥物的用途或在製備用於治療個體出血的藥物中的用途構成了本發明的另一方面。另一方面，本發明涉及由脂化的TF與選自FXa、NCIS或二者的組合的化合物形成的複合物。該複合物作為藥物的用途或在製備用於治療個體出血的藥物中的用途構成本發明的另一方面。另一方面，本發明涉及包含脂化的TF和藥物可接受的載體的藥物組合物。在特定的實施方案中，該藥物組合物還包含FXa和/或NCIS。另一方面，本發明涉及包含所述藥物組合物及載體的產品。在特定的實施方案中，所述藥物組合物還包含FXa和/或NCIS。另一方面，本發明涉及非脂化的TF或其功能片段在製備用於治療缺乏FVII的個體出血的藥物中的用途。在特定實施方案中，所述藥物被配製為適於腸胃外給予非脂化的TF的藥物給藥形式。附圖的簡單說明圖l是顯示FXa基礎濃度與纖維蛋白凝塊形成的示意圖。圖2是顯示典型的內源凝血途徑及外源凝血途徑的示意圖。圖3是顯示本發明的脂化的TF作為FXa的刺激劑的新調節作用的示意圖。本發明的詳細說明本文所描述的發現首次顯示，脂化的TF在其配體-FVII/VIIa不存在時，其用作FXa的刺激劑，使得此酶啟動凝血酶原水解，進而使凝血發生。這項新的機制在FXa濃度水平非常低時(低於生理濃度150pM)特別重要。公知有一些血小板疾病會造成血小板聚集異常及具有更高的出血傾向。因此外源性給予脂化的TF不僅用於先天性凝血病，而且還在先天性及後天性血小板疾病中進行止血，如格蘭茨曼病、貝-蘇症候群及血d、板減少症。因此，發生凝血的速度並非如目前為止所認為的取決於TF::FVIIa複合物的形成及隨後的FX活化，而是取決於TF與生理基礎濃度(〈150pM)的FXa的相互作用。形成此相互作用的最重要的生物結果是快速地引起凝血開始，並且這僅需要血液中存在生理濃度的FXa及FXa與其刺激劑TF的相互作用。不論是因為TF::FVIIa複合物或因為凝血酶本身，此過程因為複合物初期所形成的凝血酶及大量產生的FXa而^皮立刻才廣大。因此發明人的發現明確地顯示，當不存在FVIIa，但是存在不能獨自啟動凝血的生理濃度(〈150pM)的FXa時，脂化的TF因為其作為FXa的刺激劑的新作用而快速地啟動凝血酶形成，促使凝血酶原開始水解。另一方面，發明人的發現顯示，當同時給予脂化的TF及低濃度的FXa(對於獨自發揮抗出血作用是無效的)時，脂化的TF及低濃度的FXa能夠快速地引起纖維蛋白凝塊開始形成。使用TF::FXa組合所觀察到的作用，尤其是使用FXa濃度〈150pM時所觀察到的作用，遠優於單獨給予脂化的TF時所觀察到的作用。FXa及脂化的TF與NCIS的組合更可以增強止血作用。所得到的結果支持了這一觀點，即血漿中存在不能獨自產生初步的促凝反應的基礎濃度的FXa時(<150pM)，當TF用作FXa的刺激劑4吏該反應發生。因此，脂化的TF可單獨地或與FXa和/或NCIS聯合用作新的局部止血劑，以用於治療健康個體或具有出血素質的患者中存在的出血。非脂化的TF或其功能片段同樣可以用作新的止血劑，以用於治療，優選通過腸胃外給藥來治療FVII缺乏的患者中存在的出血。I.脂化的TF在局部治療出血中的用途發明人意外地發現脂化的TF增加FXa的蛋白水解活性，進而促進凝血酶產生[見本說明書中所包括的實施例結果的第1節]。發明人還觀察到脂化的TF在體外[見本說明書中所包括的實施例結果的第1至5節]和體內[見本說明書中所包括的實施例結果的第6至7節]，使健康個體及凝血因子缺乏患者和抗凝血患者(使用藥物進行抗凝處理，該藥物諸如肝素、低分子量肝素或香豆素衍生物，這些都是非限制性實例)的血漿和血液凝固，所述凝血因子缺乏患者包括FV、FVII、FVin、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏患者。發明人還發現脂化的TF使患有血小板疾病的患者的血液凝固[見本說明書中所包括的實施例結果的第5節]。這些結果清楚顯示，脂化的TF是用於局部治療個體出血的4元出血劑。以現有技術而言，無法顯而易見地想到將TF作為健康個體或血友病患者(FVin、FIX和FXI缺乏)的促凝血的局部單一治療。在如下患者中均是絕對不可能想到的FVII缺乏患者，因為不能形成TF-FVII複合物；FV或FX缺乏患者，因為不能使凝血酶原酶複合物集合；肝素處理的患者，因為凝血酶和FXa均;陂抗凝血酶III阻斷；及華法林處理的患者，因為所有的維生素K依賴性凝血因子(FVII、FIX及FX)的合成均被完全破壞。因此，一方面，本發明旨在脂化的TF或其功能性脂化片段在製備用於局部治療個體出血的藥物中的用途。TF是廣泛存在於動物界的完整的膜糖蛋白。TF蛋白具有結構域結構，也就是說其是具有獨立的功能區的蛋白。人TF脫輔基蛋白的每一結構域具有獨特的結構及功能特徵(l)具有32個胺基酸前導序列的信號肽或區域，當該蛋白從未成熟形式被加工為成熟形式時，該信號肽或區域被翻譯後加工；(2)包含約219個末端胺基酸的N-糖基化的親水性胞外結構域；(3)約23個胺基酸的片段，主要為疏水性，這些胺基酸被認為是跨膜結構域胺基酸；及(4)21個胺基酸的羧基端，其被認為是蛋白胞質片段的胺基酸形成部分。這種人TF蛋白質的結構域結構允許產生，例如，蛋白或其功能片段的胞外結構域。人TF蛋白的胺基酸序列是已知的，並可在諸如NCBI的蛋白質資料庫中查到(hTF，訪問號碼(Accessnumber):P13726)。本文所使用的術語"脂化的TF"指任何來源的完全或部分嵌入脂質嚢泡或細胞膜中的TF。示例性地，"脂化的TF"來源的非限制性實例是含脂化的TF的提取物(其可從多種組織中分離出，例如腦、胎盤組織和肺組織、來自不同動物的組織，例如綿羊、母牛、兔、犬、人等)；純化的及(再)脂化的TF蛋白質組分(從提取物或從重組TF中純化)，也就是在其純化後將脂質組分加入，並可通過示例性地非限制性實例，如根據Morrisey先前所述的方案進行製備[見本說明書中所包括的實施例]。在該方案中，使用非離子清潔劑將非脂化的TF併入磷脂嚢泡內，該非離子清潔劑例如N-辛基-Z3-D-葡萄吡喃糖苷。根據本發明，可在脂化的TF中使用的脂質可能具有任何來源(動物、植物或合成性)。幾乎所有的脂質均可被用來製備本發明的脂化的TF。可在脂化的TF的製備中使用的脂質的示例性、非限制性實例包括磷脂(諸如磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯乙醇胺等)、鞘脂(諸如神經醯胺、鞘胺醇-l-磷酸、肌醇磷酸神經醯胺、甘露糖基-肌醇磷酸神經醯胺、甘露糖基-二肌醇磷酸神經醯胺等)、磷脂醯肌醇(諸如L-a-磷脂醯肌醇、L-a-溶血磷脂醯肌醇等)或磷脂醯肌醇磷酸(諸如L-a-[磷脂醯肌醇-4-磷酸]、1，2-二辛醇-sn-甘油基-3-[磷脂醯肌醇-3，4，5-三磷酸]等)。TF蛋白質組分:脂質的比(摩爾比、重量比或體積比)可能在廣泛的範圍內變化，例如約1:50,000至約1:3,000。本文所使用的術語TF包括多種野生型TF變異體及突變體，它們保留了野生型TF功能中的至少一種功能，有利的是保留至少一種涉及凝血的野生型TF功能。在特定實施方案中，用於實現本發明的脂化的TF是脂化的人TF，並由得自組織提取物的TF組成；或TF存在於組織提取物的純化的蛋白質組分中並嵌入到脂質組分中(蛋白質:月旨質的摩爾比為約1:8700);或者TF由通過僅作為示例並非限制性實例的美國專利第6,261,803號所述的方法得到的重組TF(rTF)組成。提取物的取得及TF的純化可在不同組織中，例如腦、胎盤組織和肺組織，以及不同動物中，例如綿羊、母牛、兔、犬、人中進行。本說明書中所使用的術語"脂化的TF的功能片段"包括但不限於TF的肽衍生物，特別是TF的蛋白質組分，包括野生型TF的蛋白質組分的突變體及變異體，其保留一或多種TF功能，優選地保留涉及凝血的功能，例如結合FXa和/或NCIS的能力以及在傷口癒合期間產生其抗出血功能及血管形成功能的能力。所述TF的功能片段的胺基酸序列可以與野生型TF的蛋白質組分片段的胺基酸序列完全相同，或可以插入、刪除或修飾一個或多個胺基酸，前提是保留野生型TF功能中的至少一種功能，有利的是保留至少一種涉及凝血的功能。為了簡單起見，本文所使用的術語"脂化的TF"包括脂化的TF的任何功能片段。實施本發明所^f吏用的TF的蛋白質組分還可是融合蛋白的一部分。就這方面而言，所述融合蛋白可含有與由TF的其它片段組成的區域B結合的、由TF蛋白或所述TF蛋白的功能片段組成的區域A。所述區域B結合所述TF蛋白或所述TF蛋白片段的氨基端區域，或可選地，所述區域B可能結合所述TF蛋白或所述TF蛋白片段的羧基端區域。區域A及區域B均可直接結合，或通過所述區域A與所述區域B之間的連接物多肽進行結合。所述融合蛋白可通過化學合成，或利用編碼所述融合蛋白的核苦酸序列在適當的宿主細胞中進行基因表達來獲3曰付。本文所使用的術語"局部治療"是指在所需要的部位直接應用治療，例如在皮膚的不連續部分(割傷等)和血管組織(血管破裂等)應用治療。用作FXa的刺激劑以提高其蛋白水解活性，並因此產生凝血酶原，所以其可以被用來治療或醫治出血性疾病，特別是那些與出血素質有關的出血性疾病。術語"出血素質，，是指引起止血障礙的過程，並由此導致出血症候群的發生，該出血症候群有時可能發生長期的大量出血。出血素質可能由先天性或後天性凝血病和/或先天性或後天性血小板疾病引起。術語"凝血病，，是指凝血因子異常。這種異常可能是因為特定的凝血因子缺乏或不足引起的，該凝血因子缺乏或不足的結果是發生出血症候群，或是因為凝血因子異常所致。凝血病通常可以是先天性凝血病或後天性凝血病。先天性凝血病的示例性及非限制性實例可以是選自FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXII、FXIII或其組合的凝血因子的缺乏。後天性凝血病可能有不同來源。示例性實例包括在嚴重的肝衰竭中凝血因子合成不足及抗凝血劑治療(諸如肝素、低分子量肝素、華法林、香豆素衍生物、雙香豆素等)。另一機制是基於過度消耗凝血因子，使得在出血損傷中無可利用的凝血因子來形成凝塊。這種機制發生在如下情況中彌散性血管內凝血症候群，因多重疾病消耗所致的凝血病，該多種疾病諸如損害微循環內皮、活化血小板及凝血因子、形成多重微血栓的嚴重膿毒病；TF入侵血液中，如胎盤釋放；死胎滯留；具有組織碎裂的多重損傷；毒蛇咬傷等等。在血管炎中，血管壁及內皮損傷釋放出凝血活化劑。由於為抗血小板劑及抗凝血劑的胞漿素的作用及PDF釋放，凝血因子的消耗因許多微血栓的纖維蛋白的溶解而加劇。術語"血小板疾病"是指血小板的數量及功能上的疾病，其結果是發生出血症候群。所述血小板疾病可能是先天性或後天性。在特定實施方案中，所述血小板疾病是先天性血小板疾病。先天性血小板疾病的示例性、非限制性的實例包括格蘭茨曼病、貝-蘇綜合;f正、Bolin畫Jamieson，s症候群、維誦奧綜合4正(Wiskott-Aldrichsyndrome)、Paris-Trousseau-Jacobsen綜合^正、X染色體血小4反減少症、灰色血小板症候群(Grayplateletsyndrome)、Sebastian症候群及範科尼貧血(Fanconianemia)。在另一特定實施方案中，所述血小板疾病是後天性血小板疾病。後天性血小板疾病的示例性、非限制性實例包括骨髓增生性疾病，諸如血小板增多、紅細胞增多或慢性粒細胞白血病等；骨髓外化生中的功能性血小板疾病，伴隨出血時間延長、玻璃珠滯留缺陷(retentiondefects)、血小板聚集缺陷、異常釋放及血小板因子III缺陷。已在壞血病、先天性心臟疾病和肝硬化中的異常蛋白血症發現了功能性血小板缺陷。術語"後天性凝血病，，及"後天性血小板疾病"指疾病的來源，其可能為醫源性或繼發於其它疾病。本文所使用的術語"個體"包括動物種類的任何成員，包括人類；舉例來說(但不限於該例)，所屬個體可以是哺乳類，諸如靈長類、家畜、嚙齒類等，所述個體優選為以任何年齡和種族的男人或女人。在特定實施方案中，所述個體是無止血障礙史的人，諸如無凝血病或血小板疾病的個體。在另一特定實施方案中，所述個體是有止血障礙史的人，諸如具有出血素質的個體，例如凝血病，如先天性或後天性凝血病，或血小板疾病，諸如先天性或後天性血小板疾病。因此在特定實施方案中，本發明涉及脂化的TF在製備用於局部治療無止血障礙史的人類出血的藥物中的用途。在另一實施方案中，本發明涉及脂化的TF在製備用於局部治療具有出血素質的人類出血的藥物中的用途。為了對個體給藥，所述脂化的TF將被配製成為適於其局部給藥以局部治療出血的藥物形式。所述藥物形式的示例性、非限制性實例包括氣溶膠、溶液、懸浮液、乳劑、凝膠、軟膏、乳膏、敷料、貼片、油膏、漱口液等。為此，含有脂化的TF的藥物製劑將包括為製備所選定的藥物給藥形式所需的藥物可接受的載體及賦形劑(更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節)。待向個體給藥的脂化的TF的劑量可在非常廣泛的範圍內變化，例如約0.01/ig活性蛋白質/ml至100/ig活性蛋白質/ml。待給藥的脂化的TF的劑量將取決於多種因素，其中包括所使用的TF蛋白的特性，例如其活性及生物半衰期，製劑中TF蛋白的濃度，個體或患者的臨床狀態，待治療的出血性疾病等(更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節)。II.組合產品及其應用II.1月旨4匕的TF+FXa公知的是在血液凝固的外源途徑中，TF結合循環的FVII/FVIIa以形成TF::FVII複合物，並且在4丐離子存在時用作底物使得FX活化發生。外源途徑的活化涉及TF與其配體，FVII/FVIIa的相互作用。此TF::FVIIa複合物用作底物，使得FX通過FVIIa發生活化。現在發明人意外發現，脂化的TF與FXa—起誘導凝血，即使在FVII缺乏個體中也亦然，因此脂化的TF用作FXa的刺激劑，使這個絲氨酸蛋白酶啟動凝血酶原水解以產生凝血酶原，並^f吏凝血的起源得以發生。本文所使用的"FXa"是指一種蛋白質，特別是絲氨酸蛋白酶，其活化形式負責啟動凝血酶原水解，進而使凝血開始發生。這種蛋白水解是通過FXa結合活化的血小板表面，以及當FVa及4丐離子存在時水解凝血酶原來進行。更具體的說，發明人意外地發現即使FXa濃度如此低以至不能夠獨自誘導凝血的情況下，脂化的TF與FXa的組合也使血漿凝固[例如見本說明書中所包括的實施例結果的第1(1.5)及2節]。因此另一方面，本發明涉及包含(i)脂化的TF及(ii)FXa的產品。根據先前所提到的結果，所述產品可以用作藥物，特別是其可以被用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。所述組分(i)及(ii)可以是一起的或是分開的。在特定實施方案中，用於製備本產品的脂化的TF是脂化的人TF。在特定實施方案中，本發明提供了包含(i)脂化的TF及(ii)FXa的產品。這兩種組分在對個體給藥前可以^皮組合或一起在同一組合物中。在另一特定實施方案中，本發明提供了分別包含(i)脂化的TF及(ii)FXa的產品。在另一特定實施方案中，本發明提供了分別包含(i)脂化的TF及(ii)FXa的產品，該脂化的TF和FXa作為組合用於對個體同時或相繼給藥。所述組分(i)及(ii)對個體的聯合給藥可以同時進行或按任何順序、間隔一段時間相繼進行，也就是先給予脂化的TF再給予FXa，或反之亦然。或者，所述脂化的TF及FXa可同時給藥。為了對個體給藥，將所述先前定義的產品配製成藥物給藥形式，優選適合其局部給藥的藥物給藥形式，為此將包含適於製備所需要的藥物給藥形式的藥物可接受的載體及賦形劑。有關所述載體及賦形劑的信息，以及關於適於給予本發明所述產品的給藥形式，可參考格林藥學論述(galenicpharmacytreatises)。更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節。對所述個體給藥的脂化的TF及FXa的劑量可在廣泛的範圍內變化。舉例來說，脂化的TF的給藥劑量可能是約0.01/tg活性蛋白/ml至lOOpg活性蛋白/ml。同樣的，FXa的給藥劑量可能是約17pM至17nM(0.00lMg活性蛋白/ml至10/ig活性蛋白/ml)。一般來說，脂化的TF及FXa的給藥劑量將取決於多種因素，包括所使用的TF蛋白及FXa的特性，例如其活性及生物半衰期，製劑中FXa及TF蛋白的濃度，該個體或患者的臨床狀態、待治療的出血性疾病等(更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節)。所述產品中存在的脂化的TF與FXa的重量比可在廣泛的範圍內變化；舉例來說，該TF:FXa的重量比為106:1至10:1，雖然其它重量比也是可以的；在特定實施方案中，本發明所述產品包含重量比為1比0.001的脂化的TF及FXa，也就是說對於每毫克的TF蛋白，該混合物中存在l微克的FXa蛋白。本發明的其它方面涉及先前所定義的產品作為藥物的用途，尤其是所述產品在製備用於治療個體出血，特別是局部治療個體出血的藥物中的用途。II.2脂化的TF+NCIS發明人也意外地發現，脂化TF與負電荷無機表面(NCIS)的組合在體外[見本說明書中所包括的實施例結果第1(1.4)、2(2.2)、3(3.4)、4(4.2)及5(5.2及5.4)節]和體內[見本說明書中所包括的實施例結果第6.1節]，均使健康個體及凝血因子缺乏患者的血漿及血液凝固。本文所使用的術語"負電荷無機表面，，或"NCIS，，是由脂質及血液凝固促進劑的混合物組成，所述血液凝固促進劑例如鞣花酸、沸石、矽石、無機氧化物等。所述脂質具有淨負電荷，這意味著該脂質混合物可包括中性或兩性離子脂質，但一定包含一定量的使該混合物具有陰離子特性的負電荷脂質。舉例來說，但不限於此例，負電荷脂質可以是鞘脂(諸如神經醯胺-l-磷酸鹽、糖基化的磷脂醯乙醇胺、羥基化或非羥基化硫苷脂、神經節苷脂等)或基於甘油的脂質(諸如磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯肌醇磷酸、磷脂酸、磷脂醯甘油、心磷脂)。在本專利申請中，市售的DadeActin⑧產品(DadeBehring，商標)用作NCIS的來源。因此另一方面，本發明涉及包含(i)脂化的TF及(ii)NCIS的產品。根據先前提到的結果，所述產品可用作藥物，其可特別用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。所述組分(i)及(ii)可以是一起的或是分開的。在特定實施方案中，本發明提供包含(i)脂化的TF及(ii)NCIS的產品。這兩種組分在對個體給藥之前可以被組合或一起在同一組合物中。在另一特定實施方案中，本發明提供了分別包含(i)脂化的TF及(ii)NCIS的產品。在另一特定實施方案中，本發明提供了分別包含(i)脂化的TF及(ii)NCIS的產品，該脂化的TF和NCIS作為組合用於對個體同時給藥或相繼給藥。所述組分(i)及(ii)對個體的聯合給藥可以同時進行或按任何順序、間隔一段時間相繼進行，也就是說先給予脂化的TF再給予NCIS,或反之亦然。或者，該脂化的TF及NCIS可同時給藥。為了對個體給藥，將所述先前定義的產品配製成藥物給藥形式，優選適合其局部給藥的藥物給藥形式，為此將包含適於製備所需要的藥物給藥形式的藥物可接受的載體及賦形劑。有關所述載體及賦形劑的信息，以及關於適於給予本發明所述產品的給藥形式，可參考格林藥學論述。更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節。對所述個體給藥的脂化的TF及NCIS的劑量可在廣泛的範圍內變化。舉例來說，脂化的TF的給藥劑量可能是約O.Ol]Ltg活性蛋白/ml至100/xg活性蛋白/ml。同樣的，舉例來說，就每Mg脂化的TF活性蛋白而言，NCIS的給藥劑量(體積)可能是約0.1/d至100^1。一般來說，脂化的TF及NCIS的給藥劑量將取決於多種因素，包括所使用的TF蛋白及NCIS的特性，例如其活性及生物半衰期、製劑中TF蛋白及NCIS的濃度、該個體或患者的臨床狀態、待治療的出血性疾病等(更多信息請見本說明書關於"藥物組合物"一節)。所述產品中存在脂化的TF與NCIS的重量/體積比(w/v)可在廣泛的範圍內變化；舉例來說，所述脂化的TF:NCIS的w/v比為1:1至1:106，雖然其它w/v比也是可以的；在特定實施方案中，對於每微克的脂化的TF活性蛋白，本發明所述產品包含O.l至100微升的NCIS。本發明的其它方面涉及先前所定義的產品作為藥物的用途，尤其是該產品在製備用於治療個體出血，特別是局部治療個體出血的藥物中的用途。II.3月旨化的TF+FXa+NCIS發明人還意外地發現，脂化的TF、FXa與NCIS的組合在體外使健康個體及凝血因子缺乏患者的血漿及血液凝固[見本說明書中所包括的實施例結果第1(1.6)及2(2.2)節]。因此另一方面，本發明涉及包含(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的產品。根據先前提到的結果，所述產品可用作藥物，其可特別用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。所述組分(i)、(ii)及(iii)可以是一起的或是分開的。或者，兩種組分是一起的，例如(i)+(ii)、(i)+(iii)或(ii)+(iii)，第三種組分是單獨的。在特定實施方案中，本發明提供包含(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的產品。這些組分在對個體給藥前可以^皮組合或一起在同一組合物中。在另一特定實施方案中，本發明提供分別包含(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的產品。在另一特定實施方案中，本發明提供分別包含(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的產品，所述脂化的TF、FXa及NCIS作為組合用於對個體同時給藥或相繼給藥。所述組分(i)、(ii)及(iii)對個體的聯合給藥可以同時進行或按任何順序、間隔一段時間相繼進行，也就是說先給予脂化的TF、再給予FXa、然後給予NCIS，或先給予脂化的TF、再給予NCIS、然後給予FXa,或先給予FXa、再給予脂化的TF、然後給予NCIS,或先給予FXa、再給予NCIS、然後給予脂化的TF，或先給予NCIS、再給予FXa、然後給予脂化的TF,或先給予NCIS、再給予脂化的TF、然後給予FXa。或者，所述組分中的任意兩種組分可以混合在同一組合物中並同時全會藥，而第三種組分則在所述雙重組分組合物給藥前或給藥後給予。在另一可選擇的實施方案中，該脂化的TF、FXa及NCIS同時給藥。為了對個體給藥，將所述先前定義的產品配製成藥物給藥形式，優選適合其局部給藥的藥物給藥形式，為此將包含適於製備所需要的藥物給藥形式的藥物可接受的載體及賦形劑。有關所述載體及賦形劑的信息，以及關於適於給予本發明所述產品的給藥形式，可參考格林藥學論述。更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節。對所述個體給藥的脂化的TF、FXa及NCIS的劑量可在廣泛的範圍內變化。舉例來說，脂化的TF的給藥劑量可能是約O.OljLtg活性蛋白/ml至100/ig活性蛋白/ml。同樣的，舉例來說，FXa的給藥劑量可能是約17pM至17nM(0.00lMg蛋白/ml至10gg蛋白/ml)。另外，舉例來說，NCIS的給藥劑量(體積)可能是對於每微克脂化的TF活性蛋白而言，給予約O.lpd至IOO;aI。一般來說，月旨化的TF、FXa及NCIS的給藥劑量將取決於多種因素，包括所使用的TF蛋白、FXa及NCIS的特性，例如其活性及生物半衰期，製劑中TF蛋白、FXa及NCIS的濃度、該個體或患者的臨床狀態、待治療的出血性疾病等(更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節)。所述產品中存在的脂化的TF、FXa及NCIS的重量比可在廣泛的範圍內變化，如先前在IU及IL2節中所述；然而在特定實施方案中，本發明所述產品包含l:0.001:100(w:w:v)的脂化的TF:FXa:NCIS。本發明的其它方面涉及先前所定義的產品作為藥物的用途，尤其是所述產品在製備用於治療個體出血，特別是局部治療個體出血的藥物中的用途。III.複合物及其應用III.1TF::FXa複合物如先前所述(見本說明書的II.l節)，發明人發現即使FXa濃度如此低以至不能夠獨自誘導凝血的情況下，脂化的TF與FXa的組合仍使血漿凝固。雖然不旨在與任何理論聯繫，但不論是聯合給予或分開(按任何順序)給予所述脂化的TF及FXa，均導致複合物的形成，所述複合物能夠在應該發揮治療效果的部位發揮所述治療效果(抗出血，特別是局部抗出血)。因此，另一方面，本發明涉及本說明書中稱為TF::FXa的複合物，其包含脂化的TF及FXa。雖然為了簡單起見將該複合物表示為TF::FXa，但是該複合物事實上可以由多個單位的每一所述組分形成；所有這些可能性均包含在本發明的範圍內。根據先前提到的結果，該複合物可以用作藥物，其可特別用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。在特定實施方案中，用於製備此複合物的脂化的TF是脂化的人TF。為了對個體給藥，將該先前定義的產品配製成藥物給藥形式，優選適合其局部給藥的藥物給藥形式，為此將包含適於製備所需要的藥物給藥形式的藥物可接受的載體及賦形劑。有關所述載體及賦形劑的信息，以及關於適於給予本發明所述產品的給藥形式，可參考格林藥學論述。更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節。對所述個體給藥的所述複合物中存在的脂化的TF及FXa的劑量可在廣泛的範圍內變化。一般來說，所述劑量對應於在涉及包含脂化的TF及FXa的產品的II.l節中先前提到的劑量。該TF::FXa複合物中存在的脂化的TF與FXa的重量比可在廣泛的範圍內變化；不過通常對應於在涉及包含脂化的TF及FXa的產品的II.l節中先前提到的重量比。本發明的其它方面涉及先前所定義的所述複合物作為藥物的用途，尤其是該複合物在製備用於治療個體出血，特別是局部治療個體出血的藥物中的用途。III.2TF::NCIS複合物如前所述(見本說明書的II.2節)，發明人發現脂化的TF與NCIS的組合可在體外及體內使健康個體及凝血因子缺乏患者的血漿及血液凝固。雖然不旨在與任何理論聯繫，但不論是聯合給予或分開(按任何順序)給予該脂化的TF及NCIS,均導致複合物的形成，該複合物能夠在應該發揮治療效果的部位發揮所述治療效果(抗出血，特別是局部抗出血)。因此，另一方面，本發明涉及本說明書中稱為TF::NCIS的複合物，200680036920.2說明書第25/57頁其包含脂化的TF及NCIS。雖然為了簡單起見將該複合物表示為TF::NCIS,但是該複合物事實上可以由多個單位的每一所述組分形成；所有這些可能性均包含在本發明的範圍內。根據先前提到的結果，該複合物可以用作藥物，其可特別用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。在特定實施方案中，用於製備此複合物的脂化的TF是脂化的人TF。為了對個體給藥，將該先前定義的產品配製成藥物給藥形式，優選適合其局部給藥的藥物給藥形式，為此將包含適於製備所需要的藥物給藥形式的藥物可接受的載體及賦形劑。有關所述載體及賦形劑的信息，以及關於適於給予本發明所述產品的給藥形式，可參考格林藥學論述。更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節。對所述個體給藥的該複合物中存在的脂化的TF及NCIS的劑量可在廣泛的範圍內變化。一般來說，該劑量對應於在涉及包含脂化的TF與NCIS的組合的產品的IL2節中先前提到的劑量。該TF::NCIS複合物中存在的脂化的TF與NCIS的w/v比可在廣泛的範圍內變化；不過通常對應於在涉及包含脂化的TF及NCIS的產品的II.2節中先前提到的w/v比。本發明的其它方面涉及先前所定義的該複合物作為藥物的用途，尤其是該複合物在製備用於治療個體出血，特別是局部治療個體出血的藥物中的用途。III.3脂化的TF::FXa::NCIS複合物如前所述(見本說明書中的II.3節)，發明人發現脂化的TF、FXa與NCIS的組合使血漿凝固。雖然不與任何理論聯繫，但不論是聯合給予或分開(按任何順序)給予該脂化的TF、FXa與NCIS，均導致複合物形成，該複合物能夠在應該發揮治療效果的部位發揮所述治療效果(抗出血，特別是局部抗出血)。因此，另一方面，本發明涉及本說明書中稱為TF::FXa::NCIS的複合物，其包含脂化的TF、FXa及NCIS。雖然為了筒單起見，將該複合物表示為TF::FXa::NCIS，但是該複合物事實上可以由多個單位的每一所述組分形成，以及由所述組分之間的任何可能的相互作用形成，例如TF::NCIS::FXa、FXa::NCIS::TF、FXa::TF::NCIS、NCIS::TF::FXa或NCIS::FXa::TF;所有這些可能性均包含在本發明的範圍內。根據先前提到的結果，該複合物可以用作藥物，其可特別用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。在特定實施方案中，用於製備此複合物的脂化的TF是脂化的人TF。為了對個體給藥，將該先前定義的產品配製成藥物給藥形式，優選適合其局部給藥的藥物給藥形式，為此將包含適於製備所需要的藥物給藥形式的藥物可接受的載體及賦形劑。有關所述載體及賦形劑的信息，以及關於適於給予本發明所述產品的給藥形式，可參考格林藥學論述。更多信息請見本說明書中關於"藥物組合物"一節。對所述個體給藥的該複合物中存在的脂化的TF、FXa及NCIS的劑量可在廣泛的範圍內變化。一般來說，該劑量對應於在涉及包含脂化的TF、FXa及NCIS的組合的產品的II.3節中先前提到的劑量。該TF::FXa::NCIS複合物中存在的脂化的TF、FXa與NCIS的比例可在廣泛的範圍內變化；不過通常對應於在涉及包含脂化的TF、FXa及NCIS的產品的II.3節中先前提到的比例。本發明的其它方面涉及先前所定義的該複合物作為藥物的用途，尤其是該複合物在製備用於治療個體出血，特別是局部治療個體出血的藥物中的用途。IV.藥物組合物如前所述，脂化的TF可用作止血劑，特別是用作用於局部應用的止血劑。因此，在另一方面，本發明涉及藥物組合物，下文稱為本發明的藥物組合物，其包含脂化的TF及藥物可接受的載體。在特定實施方案中，該脂化的TF是脂化的人TF。為了對個體給藥，將該先前定義的產品配製成藥物給藥形式，優選適合其局部給藥的藥物給藥形式，為此將包含適於製備所需要的藥物給藥形式的藥物可接受的載體及賦形劑。有關所述載體及賦形劑的信息，以及關於適於給予本發明所述產品的給藥形式，可參考格林藥學論述。一般藥物的不同藥物給藥形式及其製備方法的論述，可參見"TratadodeFarmaciaGal6nica"("GWem'c屍^r則cy7Vea"W)—書,C.FauliiTrillo編著，第1版，1993,Luzdn5,S.A.ofEdicione。雖然可以使用脂化的TF的不同藥物給藥形式，但局部給予所述化合物在實踐中是最有利的，因此將該脂化的TF被配製成適於其局部給藥的藥物形式。該藥物形式的示例性、非限制性實例包括氣溶膠、溶液、懸浮液、乳劑、凝膠、軟膏、乳膏、敷料、貼片、油膏、漱口液等。為此，含有脂化的TF的藥物製劑將包括為製備用於局部給予脂化的TF的藥物給藥形式所需要的、藥物可接受的載體及賦形劑。因此，在特定實施方案中，本發明的藥物組合物是用於局部給予脂化的TF的藥物組合物，其包含脂化的TF及適於局部給予該脂化的TF的藥物可接受的載體。本發明的藥物組合物中存在治療有效量的脂化的TF。該量可在廣泛的範圍變化，例如，約0.01jUg活性蛋白/ml至100/ig活性蛋白/ml。在另一特定實施方案中，本發明的藥物組合物a)包含含有(i)脂化的TF及(ii)FXa的產品與藥物可接受的載體；或b)分別包含(i)脂化的TF與藥物可接受的載體，及(ii)FXa與藥物可接受的載體；或c)包含含有(i)脂化的TF及(ii)NCIS的產品與藥物可接受的載體；或d)分別包含(i)脂化的TF與藥物可接受的載體，及(ii)NCIS與藥物可接受的載體；或e)包含含有(i)脂化的TF、(ii)FXa及(iii)NCIS的產品與藥物可接受的載體；或f)分別包含(i)脂化的TF與藥物可接受的載體、(ii)FXa與藥物可接受的載體，及(iii)NCIS與藥物可接受的載體；或g)包含TF::FXa複合物及藥物可接受的載體；或h)包含TF::NCIS複合物及藥物可接受的載體；或i)包含TF::FXa::NCIS複合物及藥物可接受的載體。由此可見，先前定義的本發明的藥物組合物包含脂化的TF作為活性成分，該脂化的TF單獨存在或與FXa和/或NCIS組合，或與FXa和/或NCIS形成複合物。在特定實施方案中，先前定義的本發明的藥物組合物中存在的脂化的TF是脂化的人TF。同樣的，在特定實施方案中，將先前定義的本發明的藥物組合物配製成用於局部給予所述活性成分(單獨的脂化的TF或與FXa和/或NCIS組合的脂化的TF，或與FXa和/或NCIS形成複合物的脂化的TF)的藥物形式。該藥物形式的示例性、非限制性實例包括氣溶膠、溶液、懸浮液、乳劑、凝膠、軟膏、乳膏、敷料、貼片、油膏、漱口液等。為此，含有前述活性成分的藥物製劑包括為製備局部給予所述活性成分的藥物給藥形式而需要的、藥物可接受的載體及賦形劑。本發明的藥物組合物中存在治療有效量的活性成分。對所述個體給藥的活性成分的劑量將取決於所述個體所患疾病的嚴重性、選擇的藥物給藥形式等因素。由於此原因，本發明中提到的劑量應只作為對本領域所屬技術人員的指導，本領域所屬技術人員應根據先前提到的變量調整劑量。然而，本發明的藥物組合物可以一天給藥一次或多次，以用於預防或治療性目的。本發明的藥物組合物可以與其它用於預防和/或治療出血素質的另外的藥物(例如凝血因子、人血漿等)一起使用，以提供聯合療法。該另外的藥物可以是同一藥物組合物的一部分，或者以單獨組合物的形式提供，以便與本發明的藥物組合物同時給藥或相繼(間隔一段時間)給藥。V.支持藥物組合物(supportedpharmaceuticalcomposition)本發明的藥物組合物可以被放置在支持體上。因此，另一方面，本發明涉及包含本發明的藥物組合物及支持體的產品。本文所使用的術語"支持體"是指合適材料的基質，其允許本發明的藥物組合物沉積其上，將組合物運載至所需要的部位並在此部位釋放，所述部位例如本發明的藥物組合物發揮其治療作用的部位。所述支持體可以是固體支持體或非固體支持體，例如液體支持體或氣體支持體。固體支持體的示例性、非限制性實例包括敷料、急救繃帶、敷布、膠布等。液體支持體的示例性、非限制性實例包括凝膠、噴霧、漱口液等。氣體支持體的示例性、非限制性實例包括空氣、推進劑等。在特定實施方案中，沉積於所述支持體上的本發明的藥物組合物包括(a)(i)支持體、(ii)包含脂化的TF和FXa的產品及藥物可接受的載體、(iii)包含脂化的TF和NCIS的產品及藥物可接受的載體、以及(iv)包含脂化的TF、FXa和NCIS的產品及藥物可接受的載體；或(b)TF::FXa複合物及藥物可接受的載體，或(c)TF::NCIS複合物及藥物可接受的載體，或(d)TF::FXa::NCIS複合物及藥物可接受的載體。在特定實施方案中，本發明的藥物組合物中存在的脂化的TF是脂化的人TF。包含沉積在支持體上的本發明藥物組合物的產品，可通過常規方法獲得，例如通過將本發明的藥物組合物與支持體混合得到。本發明用，這取決於本發明的藥物組合物成分的性質及所使用的支持體。VI.非脂化的TF在治療出血中的用途由發明人實施的測定中得到的結果清楚地顯示TF:-增加FXa的蛋白水解活性，進而產生凝血酶，-使健康個體及凝血因子缺乏患者的血漿及血液凝固，包括缺乏FVII的血液-使患有血小板疾病的患者的血液凝固，及-在不同動物模型中體內停止嚴重的致命性出血。因此，整體看來這些結果明確顯示，脂化的TF是用於治療健康個體及凝血因子缺乏患者的出血的抗出血劑，該凝血因子缺乏患者包括Fvni、fix、fxi、fxiii、fvii、f及fx缺乏患者。歐洲專利EP266993公開了非脂化的TF在治療出血中的用途，特別是用於治療因凝血因子缺乏所致的出血，特別是選自FVIII、FIX、FXI或FXIII的凝血因子。然而，該專利並未公開及建議使用非脂化的TF來治療FVII缺乏所導致的出血的可能性。發明人目前的發現是涉及TF作為FXa蛋白水解活性刺激劑的作用，無論所述個體是否缺乏FVII，該作用允許非脂化的TF或其功能性非脂化片段可以用於治療FVII缺乏個體的出血。因此，本發明的另一方面涉及非脂化的TF或其功能性非脂化片段在製備用於治療FVII缺乏個體的出血的藥物中的用途。本文所使用的術語"非脂化的TF"是指純化的TF(無細胞質脂膜)。本文所使用的術語TF包括野生型TF的變異體及突變體，該變異體和突變體保留了野生型TF功能中的至少一種功能，有利的是保留至少一種涉及凝血的野生型TF功能。可從許多組織中，例如腦、胎盤組織及肺組織，以及從不同動物的組織中，例如綿羊、母牛、兔、犬、人等中實施TF的分離及純化。TF也可以是重組TF(rTF),其通過僅作為示例並非限制性實例的美國專利第6,261,803號所述的方法得到。在特定實施方案中，為實現本發明所使用的非脂化的TF是非脂化的人TF，並由完全去除細胞質脂膜的從人組織中分離並純化的TF的蛋白質組分組成。本說明書中所使用的術語"非脂化的TF的功能片段"，包括但不限於TF的肽衍生物，特別是TF的蛋白質組分，包括野生型TF的蛋白質組分的突變體及變異體，其保留一種或多種TF功能，優選涉及凝血的功能，例如結合FXa和/或NCIS的能力，以及在傷口癒合期間產生其抗出血功能及血管形成功能的能力。所述TF的功能片段的胺基酸序列可以與野生型TF的蛋白質組分片段的胺基酸序列完全相同，或可以插入、刪除或修飾一個或多個胺基酸，前提是保留野生型TF功能中的至少一種功能，有利的是保留至少一種涉及凝血的功能。為了簡單起見，本文所使用的術語"非脂化的TF"包含非脂化的TF的任何功能片段。非脂化的TF可通過常規方法得到。舉例來說，通過用有機溶劑提取，從脂質組分中分離出TF的蛋白質組分。該有機溶劑的示例性實例包括吡啶、乙醇、庚烷-丁醇混合物等。TF的蛋白質組分可通過常規化學方法純化。該化學方法的實例包括用清潔劑處理，該清潔劑例如脫氧膽酸鹽、TritonX-100等，在十二烷基硫酸鈉存在下在聚丙烯醯胺凝膠上實施凝膠過濾及製備電泳，使用與瓊脂糖凝膠柱結合的刀豆素A(concavalinA)、使用利用抗TF蛋白質組分(蛋白質)的抗體的親和柱等。為了對FVII缺乏個體給藥，將非脂化的TF配製成適於將其通過任何適當途徑進行給藥的藥物形式。雖然實際上可以使用任何藥物形式，但用於腸胃外給予該非脂化的TF的藥物形式的應用是有利的。因此，在特定實施方案中，本發明涉及非脂化的TF或其非脂化片段在製備用於腸胃外給予該非脂化的TF或其非脂化片段的藥物中的用途。在這種情況下，該含有非脂化的TF及藥物可接受的賦形劑或載體的藥物組合物，將被調配成如下形式以用於其腸胃外給藥例如適當劑型的無菌溶液、懸浮液或冷凍乾燥產品；在這種情況下，該藥物組合物將包括適當的賦形劑，諸如緩衝劑、表面活性劑等。在任何情況下，根據所選定的藥物給藥形式來選擇賦形劑。有關所述載體及賦形劑的信息，以及關於適於給予本發明所述產品的給藥形式，可參考格林藥學論述。一般藥物的不同藥物給藥形式及其製備方法的綜述，可參見"TratadodeFarmaciaGal6nica"("Ga/em'c屍Aar附acy7"mz"W)—書，C.FauliiTrillo編著，第1版，1993,Luzdn5,S.A.ofEdiciones。對FVII缺乏個體給藥的非脂化的TF的劑量可在廣泛的範圍內變化，例如約O.Ol]tig活性蛋白/ml至100/ig活性蛋白/ml。非脂化的TF的給藥劑量將取決於如下因素，包括所使用的TF蛋白的特性，例如其活性及生物半衰期、製劑中TF蛋白的濃度、該患者的臨床狀態、待治療的出血性疾病等。實施例為了評估脂化的TF作為FXa的刺激劑的能力，實施一系列的體外及體內測定，具體是1.證實脂化的TF(單獨的和組合的)用作FXa的直接刺激劑，在FVII不存在時(由不存在、不足或免疫阻斷引起)，引起纖維蛋白凝塊形成及血液凝固的體外測定。1.1脂化的TF增加FXa的蛋白水解活性，進而在FVII不存在時促使凝血酶產生(溶液及洗滌血小板懸浮液中的顯色測定)。1.2脂化的TF能夠使來自FVII缺乏患者的血漿及血液凝固(血漿及無抗凝全血中的凝固分析)。1.3脂化的TF能夠在抗FVII的單克隆抗體存在下使健康個體的血漿凝固(凝固分析)。1.4脂化的TF與NCIS的組合協同增強缺乏FVII血漿的凝血(凝固分析)。1.5脂化的TF與FXa的組合在抗FVII的單克隆抗體存在時協同增強凝血(缺乏FX血漿的凝固分析)。1.6脂化的TF、FXa與NCIS的組合在抗FVII的抗體存在時協同增強凝血(缺乏FX血漿的凝固分析)。2.證實脂化的TF與低濃度FXa(不能夠引起任何促凝作用)的組合引起缺乏FX血漿凝固的體外測定。2.1當FXa以低濃度存在時，脂化的TF用作此絲氨酸蛋白酶的刺激劑。2.2脂化的TF與FXa及NCIS的組合在FXa的刺激下協同作用。3.證實脂化的TF(單獨的或組合的)在除FVII以外缺乏其它凝血因子的患者中引起凝血的體外測定。3.1脂化的TF使來自凝血因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏的患者的血漿及血液凝固(缺乏凝血因子血漿中及缺乏FVin及FIX的未凝全血中的凝固分析)。3.2脂化的TF使先前被肝素化的全血及血漿凝固。3.3脂化的TF使來自華法林處理的動物的血漿凝固。3.4脂化的TF與NCIS的組合在來自凝血因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏患者的血漿(缺乏凝血因子血漿的凝固分析)中及在來自血友病患者的全血中協同增強血液凝固。4.證實脂化的TF(單獨的或組合的)引起健康個體血液凝固的體外測定。4.1脂化的TF使來自健康個體的血漿及血液凝固。4.2脂化的TF與NCIS的組合協同增強來自健康個體的血漿及血液的凝血。當脂化的TF結合磷脂時不存在協同作用。5.證實脂化的TF(單獨的或組合的)在來自患有先天性及後天性(血小板減少性)血小板疾病的患者的血漿中具有凝血效果的體外測定。5.1脂化的TF使來自患有先天性血小板疾病的患者的血漿凝固。5.2脂化的TF與NCIS的組合增強了來自先天性血小板疾病患者的全血的凝固。5.3脂化的TF使血小板減少的樣品凝固。6.在對照大鼠中證實TF是用於局部抗出血治療的試劑的體內測定(通過直接單獨應用於或與NCIS的組合一起應用於預先截斷的血管)。6.1脂化的TF(單獨的或與NCIS組合的)在大鼠近側斷尾所致的嚴重出血動物模型中用作局部止血劑。6.2脂化的TF在用肝素或華法林預先處理的嚴重出血動物模型中用作局部止血劑。6.3脂化的TF在大鼠近側斷尾所致的致死性出血動物模型中用作局部止血劑。I.材料及方法材料人重組組織因子(rTF)，ThromborelS和NeoplastinPlus用作脂化的TF的來源。具體地使用下列商品化製劑人重組組織因子(非脂化的)(AmericanDiagnostica,USA),根據Morrissey所述的方法再脂化；含4丐的冷凍乾燥的人胎盤促凝血酶原激酶(ThromborelS,DadeBehringInc);含4丐的；令凍乾燥的兔月滷(NeoplastinPlus,DiagnosticaStago-Roche)。4吏用人重組脂化的TF(AmericanDiagnosticsUSA)作為標準物質，由標準曲線確定TF蛋白的促凝活性，該TF蛋白的促凝活性在文中以/ig活性蛋白/ml表示以及在表中以pg/ml表示。為了簡單起見，在此實施例中，除非另外說明，術語rTF或TF是指脂化的TF。使用HaematologicTechnologies(血液學技術)的商用化合物作為FXa、因子II及FVa的來源。使用商品化的DadeActinFS試劑(DadeBehring),作為NCIS。商用的缺乏凝血因子血漿(FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII)是購自DadeBehringMarburgGmbH。方法在脂質嚢泡中利用辛基葡萄糖苷透析使TF再脂化的方法(Morrisey法)使用非離子清潔劑N-辛基-Z3-D-吡喃葡萄糖苷(辛基葡萄糖苷)，將非脂化的TF併入脂質嚢泡中。將TF及脂質均溶於辛基葡萄糖苷中以形成膠束。由於辛基葡萄糖苷的高臨界膠束濃度(CMC-20-50mM)，可通過透析將其容易地從溶液中除去。當除去辛基葡萄糖苷時，所述脂質組織成單層嚢泡。TF憑藉其跨膜結構域被浸入在這些嚢泡中。一般來i兌，50%至80%的TF分子由嚢泡向外排列。緩衝液及儲備溶液來自Calbiochem的辛基葡萄糖苷(n-辛基-(8-D-吡喃葡萄糖苷)。tableseeoriginaldocumentpage40tableseeoriginaldocumentpage41製備辛基葡萄糖苷的脂質溶液(OG)1.使用所需要的脂質摩爾半徑(molarradius)，在玻璃管中為每一樣品製備2.6微摩爾的總脂質。2.在氬氣或氮氣流下乾燥該脂質混合物。3.當玻璃管呈現乾燥時，再真空乾燥60分鐘。4.向含有乾燥脂質的玻璃管中加入400/xl的OG/HBS的新鮮溶液(在室溫下)。tableseeoriginaldocumentpage41再脂化向含有400/^1的OG/脂質及足夠HBSA的玻璃管中加入所需要量的TF，直至最終體積為lml。在室溫下實施此步驟。獲得洗滌血小板懸浮液根據RadomskiM.等人所述的方法(RadomskiM,MoncadaS.;1983ThrombRes.此為用前歹'J環素洗滌人血小板的改良方法15;30(4):383-9)，由健康志願者的血液提取物(3.15%檸檬酸鈉)製備洗滌血小板懸浮液。血液提取後總是即刻在室溫下對樣品實施處理。利用聚集試驗，在實施試驗前和實施試驗過程中測定血小板的活化及功能狀態。通過用已知的激動劑(膠原)進行活化，估計自我活化及功能性。琳賴定顯色測定在溶液及活化的血小板懸浮液中設計不同的顯色測定，以i正實rTF對FXa蛋白水解活性的作用。使用S-2765(Chromogenix)作為FXa的顯色底物，通過顯色測定確定FXa的醯胺水解活性，而使用S-2238(Chromogenix)作為凝血酶的顯色底物，分析凝血酶形成活性。顯色測定是在懸浮液(緩衝液)中實施並使用洗滌血d、板懸浮液。將適當體積的待研究的每一因子分配在ELISA板上，如果使用洗滌血小板懸浮液，則所加入的適當體積使培養基中濃度為250,000血小板/]nl。最後加入特異的顯色底物，在405nm通過分光光度讀數，將所研究的蛋白水解活性定量化。在確定醯胺水解活性的測定中，只需分配FXa及不同的rTF濃縮物，而在確定凝血酶形成活性的測定中，還需要加入因子II(凝血酶原)及FVa(後者只用於在懸浮液中的測定，因為在洗滌血小板測定中這些測定已包含內源性FVa)。血漿凝固分析法在凝血計(FibrintimerBFT-IIclot陽timerDade隱Behring，德國)中，利用特定步驟，通過凝固分析法測量血漿中自發性促凝血活性(未經刺激)。簡而言之，向已預熱的比色杯中加入50ai1血小板不足的血漿及50/xl蒸餾水。在37。C下靜置混合物以孵育此混合物60秒，並立刻加入50/xl的25mM氯化4丐，在凝血計中以秒確定凝血時間(通過)見察凝塊形成)。每一樣品均測定兩次。血小板不足的血漿是通過離心過程獲得，血小板數由Coulter測定。全血凝固分析法通過凝固法確定無抗凝全血的促凝活性。將待研究的不同試劑加入到lml的無抗凝全血中，用記時計測量從開始抽血到出現穩固的血塊的凝血時間。通過不同試劑縮短或延長凝血時間來評估它們的效果。大鼠近側斷尾的嚴重出血模型將23隻體重為350至450克的Sprage-Dawley雄性大鼠隨機分為3個治療組對照組，由14隻4妄受生理鹽水溶液局部治療的動物組成，而另外兩組分別由5隻接受1.2jtig/mlrTF局部治療的動物，及4隻接受1.2/xg/mlrTF+NCIS(體積:體積4:2)局部治療的動物組成。利用塑料Eppendorf吸量管，使所有的化合物局部接觸動物尾的近側截面，以發揮止血作用。通過確認不再出血來表明形成穩固的凝塊。用抗凝藥物處理的動物中大鼠近側斷尾的嚴重出血模型將27隻體重為350至450克的Sprage-Dawley雄性大鼠隨機分為5個治療組對照組，由14隻接受生理鹽水溶液局部治療的動物組成。兩組在開始截尾操作前15分鐘靜脈注射接受200U/kg肝素(3隻用TF治療，5隻用鹽水治療)，另外兩組在開始截尾操作前三天每天口服接受0.1mg/kg的華法林(3隻用TF治療，2隻用鹽水治療)。每一治療組中^f叉一組;波給予1.2ptg/mlrTF的局部治療。因此對於每一抗凝處理，這是對照治療組。利用塑料Eppendorf吸量管，使脂化的TF局部接觸動物尾的近側截面以發揮止血作用。通過確認不再出血來表明形成穩固的凝塊。大鼠頸動脈穿剌的致死出血模型將4隻體重為350至450克的Sprage-Dawley雄性大鼠隨機分為2個治療組，每組包括2隻大鼠。對照組動物接受生理食鹽水溶液作為治療，而另一組接受局部給藥的脂化的TF(最終劑量為2/ig活性蛋白)。根據標準程序進行大鼠頸動脈穿刺，以建立致死出血模型。在穿刺點覆蓋分別含有3ml脂化的TF及3ml生理鹽水溶液的敷料，來直接給予脂化的TF和生理鹽水溶液。同時在2分鐘內施加壓力並4妄觸相應的治療。II.結果1.i正實脂化的TF(單獨的和組合的)用作FXa的直4^刺激劑，在FVII不存在時(由不存在、不足或免疫阻斷引起)，引起纖維蛋白凝塊形成及血液凝固的體外測定。1.1脂化的TF增加FXa的蛋白水解活性，進而在FVII不存在時促使凝血酶產生為了評估脂化的TF在FVII不存在時作為因子Xa刺激劑的能力，實施多種體外測定(i)溶液中FXa醯胺水解活性的顯色測定；及(ii)洗滌血小板懸浮液中凝血酶形成活性的顯色測定。FXa醯胺水解活性的顯色測定使用FXa-特異性底物S-2765,在溶液中進4亍FXa醯胺水解活性的直接測定，顯示脂化的TF能夠非常顯著地提高FXa的蛋白水解活性。當存在高濃度的(l/ig/ml)的rTF時，觀察到由低濃度及高濃度的FXa產生的活性均增加(pO.OOl)。當存在低濃度的脂化的TF時(0.1gg/ml),也觀察到類似的顯著刺激作用(pO.OOl)。表1顯示5次獨立實驗得到的結果。表1在FVII不存在時脂化的TF增加FXa的蛋白水解活性無rTF_rTF01jitg/mlrTF1/xg/mlFXa30nM_550±512,108士613,316±89FXa5nM0341士32505士63洗滌血小板懸浮液中凝血酶形成活性的顯色測定當使用血小板懸浮液作為促凝表面的來源，並利用特異性底物S-2238測量凝血酶形成時，檢測的促凝效果較高(表2)。在外源性FXa不存在時，脂化的TF對凝血酶形成產生顯著的刺激作用(pO.OOl)。在低濃度和高濃度的外源性FXa存在時也觀察到類似的刺激效果(pO.OOl)。表2存在FI但不存在FVa(已存在於血小板中)和FVII時，脂化的TF誘導洗滌血小板中的凝血酶形成tableseeoriginaldocumentpage451.2脂化的TF能夠使來自FVII缺乏患者的血漿及血液凝固(血漿及無抗凝全血中的凝固分析)實施一系列的體外凝固分析以顯示脂化的TF在來自FVII缺乏患者的血漿及無抗凝全血中的凝血作用，因此脂化的TF是用於抗出血治療的有用試劑。在商品化的缺乏FVII血漿及來自FVII缺乏患者的無抗凝全血中的凝固分析使用商品化的缺乏FVII血漿及來自2名患有FVII缺乏症患者的無抗凝全血，通過凝固分析，研究脂化的TF對凝血的作用(表3)。脂化的TF能夠以濃度依賴性方式顯著促進缺乏FVII血漿的凝固。同樣的，來自FVII缺乏患者的無抗凝全血也可在低濃度、中濃度及高濃度的脂化的TF存在時凝固，這表示即使不存在FVII，也能夠通過脂化的TF產生正常的凝固。表3顯示對缺乏FVII血漿進行的5次獨立實驗的結果。表3證實脂化的TF在缺乏FVII血漿中的促凝作用tableseeoriginaldocumentpage46脂化的TF對來自健康志願者的血液的作用在濃度大於0.01/ig/ml時有顯著作用，然而在FVII缺乏患者中需要更高的濃度(表4)。雖然在0.1/xg/ml之後檢測到顯著的促凝效果(p0.001)，但是脂化的TF能夠在濃度為0.01/ig/ml時使凝血時間正常化，在基礎狀態的正常個體中與在具有所述濃度的脂化的TF的FVII缺乏個體中檢測的凝血時間之間並無差異。最後，雖然1/ig/ml的脂化的TF在缺乏FVII血漿中不能引起同樣強烈的促凝作用，但觀察到了非常顯著的效果，這表示脂化的TF可以使這些患者的止血功能正常化。表4脂化的TF在來自健康個體及FVII缺乏個體的無抗凝全血中的促凝作用tableseeoriginaldocumentpage46tableseeoriginaldocumentpage47n.d.:未測定1.3脂化的TF能夠在抗FVII的單克隆抗體存在下使健康個體的血漿凝固(凝固分析)實施體外凝固分析以顯示脂化的TF在抗FVII單克隆抗體(此抗體能夠阻斷正常血漿的凝固)存在時在健康個體血漿中的凝血作用。在抗FVII單克隆抗體存在時，使用來自健康志願者的血漿，通過凝固分析研究脂化的TF對血漿凝固的作用(表5)。脂化的TF甚至在抗FVII單克隆抗體存在時能夠引起凝固(該抗體能夠完全抑制凝血)。在這些實驗條件下(類似於缺乏FVII樣品)，脂化的TF能夠使血漿凝固。表5證實在抗FVII單克隆抗體存在時TF在正常血漿中的促凝作用無rTF有rTFl/Ag/ml正常血漿_126，828，1有抗FVII抗體(400ptg/ml)的正常血漿216,842,51.4脂化的TF與NCIS的組合協同增強缺乏FVII血漿的凝血(凝固分析)實施一系列體外凝固分析以顯示脂化的TF與負電荷無機表面[NCIS]的組合在缺乏FVII血漿中的凝血作用。此促凝作用超越了單獨使用脂化的TF作為促凝劑時所得到的作用。這些結果顯示脂化的TF所介導的作用不依賴於FVII,並且甚至在其特異性配體不存在時能夠引起血漿凝固。表6顯示5次獨立實驗獲得的結果。tableseeoriginaldocumentpage481.5脂化的TF與FXa的組合在抗FVII的單克隆抗體存在時協同增強凝血(缺乏FX血漿的凝固分析)在用抗FVII抗體免疫阻斷的缺乏FXa血漿中，研究了脂化的TF與低濃度FXa(170pM及1700pM)的組合在FVII不存在時的促凝作用(表7)。表7tableseeoriginaldocumentpage481.6脂化的TF、FXa與NCIS的組合在抗FVII的抗體存在時協同增強凝血(缺乏FX血漿的凝固分析)還研究了脂化的TF、低濃度FXa(170pM及1700pM)及NCIS的組合在缺乏FXa血漿中的促凝作用(表8)。表8tableseeoriginaldocumentpage492.證實脂化的TF與低濃度FXa(不能夠引起任何促凝作用)的組合引起缺乏FX血漿凝固的體外測定2.1當FXa以低濃度存在時，脂化的TF用作此絲氨酸蛋白酶的刺激劑在凝血FX缺乏的血漿中實施體外凝固分析以顯示脂化的TF對FXa的協同作用(向缺乏FX血漿中加入低濃度的FXa(170pM及nOOpM),因此這些血漿不能/人任何凝血途徑產生FXa)。脂化的TF與低濃度FXa的組合的促凝作用見表9。表9tableseeoriginaldocumentpage492.2脂化的TF與FXa及NCIS的組合在FXa的刺激下協同作用還研究了脂化的TF、低濃度FXa(170pM及1700pM)及NCIS的組合在缺乏FX血漿中的促凝作用(表10)。表10脂化的TF與FXa及NCIS的組合在缺乏FXa血漿中的促凝作用缺乏FX血漿凝血時間(秒)__有NCIS(1m1)有NCIS(2j[d)基礎狀態(5mM4丐離子)_>400_〉400290±10.2rTFlj^g/ml+FXa(170pM)124±6.1*109±4.1*84±3*rTF1/ig/ml+FXa(1700pM)83,1±3.2*65,5±5.2*45,5±3.2*坊值iS五M卩"=5」，*;<0.0W無iVCZS^f才iVCZS/5Vw^"f"一}-發3.證實脂化的TF(單獨的或組合的)在除FVII以外缺乏其它凝血因子的患者中引起凝血的體外測定3.1脂化的TF使來自凝血因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、fxii及Fxni缺乏的患者的血漿及血液凝固使用通過免疫親和技術清除凝血因子的商用血漿，以及來自3名被診斷為患有血友病A的患者(FVIII缺乏)及2名被診斷為患有血友病B的患者(FIX缺乏)的血漿，研究脂化的TF(單獨使用)對缺乏凝血因子血漿的促凝作用。表ll顯示這些結果。在濃度為1/xg/ml時，脂化的TF能夠有效凝固所有的缺乏FV、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII的血漿。另外，在已知的FXa輔因子FVa不存在時，脂化的TF也能產生血漿凝固，雖然只有在高濃度或中濃度時產生血漿凝固。在其它凝血因子缺乏的情況下，所有測試濃度的脂化的TF均有效，在非常低的濃度時獲得極好的結果。即使在FX(l。/。)不存在時，脂化的TF仍能夠凝血，但僅在高濃度時。所有這些結果經過來自血友病A及血友病B患者的樣品的證實。表11脂化的TF在缺乏凝血因子血漿中的促凝作用凝血時間(秒)tableseeoriginaldocumentpage51利用凝固分析，評估脂化的TF(單獨使用)在來自血友病A及B患者的人無抗凝全血中的促凝作用。通過估計凝塊固結的時間(分鐘)來確定凝塊形成。脂化的TF在來自健康志願者的血液中的作用從0.001/xg/ml的濃度開始顯著，然而在血友病患者中需要更高的劑量，從0.01]Lig/ml開始檢測到顯著的促凝效果(p〈0.001)。當濃度為0.1/ig/ml時，脂化的TF能夠使凝血時間完全正常化，在正常個體與血友病個體中4企測的凝血時間之間並無差異。表12顯示從4名健康個體(樣品編號1-4)、3名患有血友病A的患者及2名患有血友病B的患者的樣品中得到的結果。表12脂化的TF在來自健康個體及血友病患者的無抗凝全血中的促凝作用tableseeoriginaldocumentpage52凝J^好/《f以々斧《^,'在克我凝A濕摔品,凝塊馬潛摩需要的萌3.2脂化的TF使預先被肝素化的全血及血漿凝固脂化的TF能夠使預先用高濃度肝素孵育的血漿(表13)及無抗凝全血(表14)凝固，這證實其對FXa的作用不受該抗凝藥物介導的抑制作用的影響，即使肝素型抑制劑存在下也亦然。表13脂化的TF對肝素化的血漿的作用(以秒表示凝血時間)無脂化的TF_有脂化的TF對照組_320，4±160_17.2士1肝素3U/ml〉60058±12表14脂化的TF對肝素化的全血的作用(以分鐘表示凝血時間)無脂化的TF_有脂化的TF對照組_3.96±0.54_0.4±0.28_肝素0.25U/ml12.45±0.6915.7±0.22肝素1U/ml26.6±5.764.5士2.383.3脂化的TF使來自華法林處理的動物的血漿凝固脂化的TF能夠使來自華法林處理的大鼠的血漿凝固，該處理是根據方法中描述的步驟進行。表15所示的結果顯示即使當所有維生素K依賴性凝血因子的合成均被阻斷，脂化的TF仍能凝固血漿，這證實其對FXa的作用不受此抗凝藥物介導的抑制作用的影響。表15脂化的TF對來自華法林處理的動物的血漿的作用(以秒表示的凝血時間)無脂化的TF有脂化的TF(1jgg/ml)對照組_49±10.2_10,9±2.2_華法林處理的血漿60,1±5.612,8±3.2(0.1mg/kg給藥3天)_3.4脂化的TF與NCIS的組合在來自凝血因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII缺乏患者的血漿(缺乏凝血因子血漿的凝固分析)中及在來自血友病患者的全血中協同增強血液凝固實施一系列的體外凝固分析，以顯示脂化的TF與NCIS的組合在來自凝血因子缺乏患者(FV、FVII、FVin、FIX、FX、FXI、FXII及FXIII)的血漿中的凝血作用。該促凝作用超越了單獨使用脂化的TF作為促凝劑時得到的作用。即使脂化的TF在低濃度(l/ig/ml)時，在此濃度下脂化的TF不能使缺乏FV血漿(FV-D血漿)凝固，但這兩種試劑的組合產生顯著的促凝作用。同樣的，當使用缺乏FVII血漿(FVII-D血漿)時，也可得到類似的協同作用。這些結果顯示脂化的TF介導的作用不依賴於FVII,並且即使在FV不存在時該作用仍能夠引起血漿凝固。類似的，該組合(脂化的TF+NCIS)也能在來自血友病(A及B)患者的血漿樣品中發揮有效的促凝作用。表16顯示5次獨立實驗得到的結果。表16tableseeoriginaldocumentpage54使用來自患有血友病A(3名)及血友病B(2名)患者的血液，通過凝固分析，還研究了脂化的TF與NCIS的組合在無抗凝全血中的促凝作用。通過與單獨使用脂化的TF的分析(表12)進行比較，該組合(rTF+NCIS)的促凝效果明顯(pO.001)更高(表17)。表17tableseeoriginaldocumentpage54tableseeoriginaldocumentpage554.證實脂化的TF(單獨的或組合的)引起健康個體血液凝固的體外測定4.1脂化的TF使來自健康個體的血漿及血液凝固實施一系列的體外凝固分析，以顯示脂化的TF在來自無止血障礙史的健康志願者的血漿及無抗凝全血中的凝血作用。表18顯示在健康血漿中實施5次獨立實驗獲得的結果，表19為在無抗凝全血中實施5次獨立實驗獲得的結果。表18脂化的TF在來自健康個體的血漿中的促凝作用正常血漿凝血時間(秒)tableseeoriginaldocumentpage55表19tableseeoriginaldocumentpage55tableseeoriginaldocumentpage564.2脂化的TF與NCIS的組合協同增強來自健康個體的血漿及血液的凝血。當脂化的TF結合磷脂時不存在協同作用實施一系列的體外凝固分析，以顯示rTF與NCIS的組合在來自健康志願者的血漿中的凝血作用。表20顯示在5次獨立實驗中得到的結果。通過與單獨使用rTF的分析進行比較，該組合(rTF+NCIS)在所使用的每一濃度下均有顯著(pO.001)更高的促凝作用。表20脂化的TF和NCIS的組合在正常血漿中的促凝作用tableseeoriginaldocumentpage56表21顯示當脂化的TF與磷脂結合時不存在協同作用(0.66mM的PC/PS;不同摩爾比的磷脂醯膽鹼/磷脂醯絲氨酸)。表21_磷脂對脂化的TF的促凝活性的影響_脂化的TF凝血時間(秒)56(0.1/ig/ml)無PC/PS37.9有PC/PS90/104480/2039.770/3041.760/4040.150/5043.540/6034.630/7041.520/8044.310/9041.95.證實脂化的TF(單獨的或組合的)在來自患有先天性及後天性(血小板減少性)血小板疾病的患者的血液中具有凝血效果的體外測定5.1脂化的TF使來自患有先天性血小板疾病的患者的全血凝固使用來自2名分別患有格蘭茨曼病和貝-蘇症候群患者的血液，通過凝固分析，研究脂化的TF對患有血小板疾病患者的血液凝固的促凝作用。rTF能夠以濃度依賴性方式非常顯著地促進患有格蘭茨曼病患者和患有貝-蘇症候群患者的凝血(表22);因此rTF是用於所述個體的抗出血治療的有用試劑。表22TF對患有血小板疾病患者的促凝作用基礎^l大態rTF0.01/ig/ml0.1jLtg/ml1jtig/ml1號對照樣品5.83,32.11,36號格蘭茨曼病患者13.67.33.42.97號貝-蘇症候群患者11.97.14.13.15.2脂化的TF與NCIS的組合增強了來自先天性血小板疾病患者的全血的凝固實施一系列的體外凝固分析，以顯示rTF與NCIS的組合在來自患有先天性血小板疾病患者的全血中的凝血作用。表23顯示從2名分別患有格蘭茨曼病及貝-蘇症候群的患者中得到的結果。通過與單獨使用rTF的分析比較，該組合(rTF+NCIS)在每名患者中均有顯著(p〈0.001)更高的促凝效果。表23脂化的TF與NCIS的組合在全血中的促凝作用tableseeoriginaldocumentpage58凝j&^/W以》辨^^」.'^無在凝j&該存品哞凝塊茵錄摩,要的^河5.3脂化的TF使血小板減少的樣品凝固實施一系列的體外凝固分析，以顯示脂化的TF在不同血小板計數的血漿中的凝血作用。表24顯示從正常血小板計數到血小板減少疾病狀態中得到的結果。表24tableseeoriginaldocumentpage58tableseeoriginaldocumentpage596.在對照大鼠中證實TF是用於局部抗出血治療的試劑的體內測定(通過直接應用於預先截斷的血管)6.1脂化的TF在大鼠近側斷尾所致的嚴重出血動物模型中用作局部止血劑實施體內測定以顯示單獨給藥或與NCIS聯合給藥的脂化的TF是用於局部抗出血治療的有用試劑。採用由大鼠近側斷尾產生的嚴重出血動物模型，評估脂化的TF作為單獨給藥或與NCIS聯合給藥的局部止血劑的用途。表25顯示所得結果。由表中所見，在該嚴重出血模型中，對照動物(PSS對照組，用生理鹽水溶液治療)在18.1±5.98分鐘後出血自動凝固；然而，局部給予脂化的rTF(單獨)產生顯著的減少(ll.l±5.54分鐘，pO.OOl)。當rTF與NCIS聯合給藥時，促凝效果甚至更強(5.0±1.1分鐘；pO.OOl)。表25由大鼠近側斷尾產生的嚴重出血模型的出血凝固時間tableseeoriginaldocumentpage59結果以達到固結的凝固的時間(分鐘)表示。在相同的實驗條件下評估非脂化的TF(n=3)。觀察到無任何作用，出血凝固時間與對照動物類似。這些結果顯示，非脂化的TF不用於局部治療出血事件。6.2脂化的TF在用肝素或華法林預先處理的嚴重出血動物模型中用作局部止血劑實施體內測定以顯示，單獨給藥的脂化的TF是抗凝狀態下用於局部抗出血治療的有用試劑(表25)。採用由預先處理的大鼠近側斷尾產生的嚴重出血動物模型評估脂化的TF作為單獨給藥的局部止血劑的用途，該大鼠在開始截尾操作前15分鐘用200U/kg的肝素靜脈注射進行預先處理，或在開始截尾操作前三天每天口服0.1mg/kg的華法林進行預先處理。所得結果顯示於表26。如該表所示，在該嚴重出血模型中，用生理鹽水溶液治療的鹽水對照組在18.1±5.98分鐘後自動凝血。肝素處理對照組無法自動凝血(>90分鐘)，華法林處理對照組在41.6±8.5分鐘後自動凝血。表26顯示脂化的TF(單獨)的局部給藥在所有治療組中均產生明顯的減少。表26在抗凝處理的動物中由大鼠近側斷尾產生的嚴重出血模型的出血凝固時間出血凝固時間(分鐘)tableseeoriginaldocumentpage60潛果以這到^潛^凝^的^河(^、妒)《^。6.3脂化的TF在頸動脈穿刺所致的致死性出血動物模型中用作局部止血劑實施體內測定以顯示單獨給藥的rTF是直接應用於血管上的用於局部抗出血治療的有用試劑。採用由頸動脈穿刺產生的致死性出血動物模型，評估單獨給藥的脂化的rTF的用途。得到的結果顯示於表27中並非常顯著。如該表所示，在對照動物組中(以生理鹽水溶液治療的PSS對照組)，所有的動物出血致死，但是在脂化的TF組中沒有動物死亡，且在所有情況下，傷口均成功癒合及凝血。就實現穩定的凝血及穿刺傷口癒合所需要的時間而言，該治療是有效的。表27由大鼠頸動脈穿刺產生的致死性出血模型對照SF__1號動物_^_3號動物_1252號動物死亡4號動物135平均值士SD"0土7J潛果"這^/^潛的凝^及,^y^口,會合的^河(^^衷^。如X^摩迷，WF的發^*量為;^/4f冷。結論實施例1的結果清楚顯示1)當配體FVII不存在時，脂化的TF能直接與FXa相互作用，從而顯著增加其蛋白水解活性(醯胺水解及凝血酶形成活性)，此結果首次顯示脂化的TF的新作用，即用作FXa的新的輔因子(與公知的FVa無關)。2)脂化的TF能夠使缺乏FVII血漿凝固。因此，脂化的TF是用於這類患者的良好的替代治療(目前唯一存在的治療是昂貴的人重組FVIIa)。3)脂化的TF與NCIS及FXa(在不能產生凝血的低濃度下)協同作用。實施例2的結果清楚顯示1)脂化的TF使不能產生任何促凝效果的生理濃度的FXa啟動凝血酶原水解，/人而發生凝血酶形成。2)脂化的TF具有新的作用，其用作所有形式的FXa(可溶性FXa和與凝血酶原酶複合物結合的FXa)的所有蛋白水解活性的輔因子。3)甚至缺乏FX血漿(含痕量的FX)可被脂化的TF凝固。因此，脂化的TF是用於這類患者的良好的替代治療。4)在FXa活性的刺激作用方面，脂化的TF與NCIS協同作用。實施例3的結果清楚顯示1)脂化的TF能使血友病患者(FVIII、FIX及FXI)凝血。因此，月旨化的TF是用於這類患者的良好的替代治療。2)脂化的TF甚至在FV不存在時也能引起凝血。這些結果清楚地顯示脂化的TF對FXa具有強烈的刺激作用，因為當其輔因子不存在時(缺乏FV血漿)，脂化的TF用作引起相同刺激作用的輔因子。3)甚至在缺乏FX血漿中(含痕量FX)，脂化的TF能引起凝血。因此，脂化的TF是用於這類患者的替代治療。4)脂化的TF能在肝素及華法林處理的血漿中引起凝血，這表示脂化的TF幹擾抗凝血酶III的作用，以及可能通過其對基礎濃度的FXa的刺激作用，其甚至可以在華法林處理的血漿中引起凝血。5)最後，脂化的TF與NCIS協同作用，在所有凝血因子缺乏中觀察到促凝作用。實施例4的結果清楚顯示1)脂化的TF能在健康個體中引起凝血。因此，脂化的TF是用於治療健康個體的出血事件的良好替代治療。2)脂化的TF與NCIS協同作用，在健康個體觀察到促凝作用，但只含磷脂時無協同作用。實施例5的結果清楚顯示l)脂化的TF能在患有血小板疾病的患者中引起凝血，該血小板疾病例如先天性或後天性血小板疾病(即，血小^1減少症)。因此，脂化的TF是用於治療患有血小板數和/或功能變化的患者的出血事件的良好替代治療。實施例6的結果清楚顯示l)局部給藥的脂化的TF能在嚴重出血(近側全尾截斷)的動物模型中停止出血。2)局部給藥的脂化的TF能在嚴重出血(近側全尾截斷)並用抗凝療法處理(肝素或華法林)的動物模型中停止出血。3)局部給藥的脂化的TF能在致死性出血(頸動脈穿刺)動物模型中停止出血。權利要求1.脂化的組織因子(TF)或其功能片段在製備用於局部治療個體出血的藥物中的用途。2.如權利要求l所述的用途，其中所述個體是健康個體或具有出血素質的個體，其中所述出血素質包括凝血病和/或血小板疾病。3.如權利要求2所述的用途，其中所述凝血病是先天性凝血病或後天性凝血病。4.如權利要求3所述的用途，其中所述先天性凝血病是基於凝血因子缺乏的凝血病，所述凝血因子選自凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子vm、凝血因子ix、凝血因子x、因子xi、凝血因子xn、凝血因子xm或其組合。5.如權利要求4所述的用途，其中所述先天性凝血病是基於凝血因子缺乏的凝血病，所述凝血因子選自凝血因子V。6.如權利要求4所述的用途，其中所述先天性凝血病是基於凝血因子缺乏的凝血病，所述凝血因子選自凝血因子VII。7.如權利要求4所述的用途，其中所述先天性凝血病是基於凝血因子缺乏的凝血病，所述凝血因子選自凝血因子X。8.如權利要求2所述的用途，其中所述個體具有由使用抗凝血劑的抗凝血治療所產生的後天性凝血病。9.如權利要求8所述的用途，其中所述抗凝血劑是肝素、低分子量肝素、華法林、香豆素衍生物或雙香豆素。10.如權利要求2所述的用途，其中所述個體具有先天性血小板疾病或後天'f生血小板疾病。11.如權利要求IO所述的用途，其中所述先天性血小板疾病選自格蘭茨曼病、貝-蘇症候群、Bolin-Jamieson，s症候群、維-奧症候群、Paris-Trousseau-Jacobsen症候群、X染色體的血小板減少症、灰色血小板症候群、Sebastian症候群或範科尼貧血。12.如權利要求IO所述的用途，其中所述後天性血小板疾病選自骨髓增生性疾病，諸如血小板增多、紅細胞增多或慢性粒細胞白血病；骨髓外化生；在壞血病、先天性心臟疾病及肝硬化中的異常蛋白血症。13.如權利要求1所述的用途，其中所述脂化的TF是脂化的人TF。14.包含(i)脂化的TF和(ii)活化的凝血因子X(FXa)的產品。15.分別包含(i)脂化的TF和(ii)活化的FXa的產品。16.分別包含作為組合用於對個體同時給藥或相繼給藥的(i)脂化的TF和(ii)FXa的產品。17.包含(i)脂化的TF和(ii)負電荷無機表面(NCIS)的產品。18.分別包含(i)脂化的TF和(ii)NCIS的產品。19.分別包含作為組合用於對個體同時給藥或相繼給藥的(i)脂化的TF和(ii)NCIS的產品。20.包含(i)脂化的TF、(ii)FXa和(iii)NCIS的產品。21.分別包含(i)脂化的TF、(ii)FXa和(iii)NCIS的產品。22.分別包含作為組合用於對個體同時給藥或相繼給藥的、(i)脂化的TF、(ii)FXa和(iii)NCIS的產品。23.如權利要求14至22中任一權利要求所述的產品，其中所述脂化的TF是脂化的人TF。24.如權利要求14至23中任一權利要求所述的產品，其為藥物。25.權利要求14至23中任一權利要求所述的產品在製備用於治療個體出血的藥物中的用途。26.權利要求14至23中任一權利要求所述的產品在製備用於局部治療個體出血的藥物中的用途。27.包含脂化的TF和FXa的複合物(TF::FXa)。28.如權利要求27所述的複合物，其為藥物。29.權利要求27所述的複合物在製備用於治療個體出血的藥物中的用途。30.權利要求27所述的複合物在製備用於局部治療個體出血的藥物中的用途。31.包含脂化的TF和NCIS的複合物TF::NCIS。32.如權利要求30所述的複合物，其為藥物。33.權利要求31所述的複合物在製備用於治療個體出血的藥物中的用途。34.權利要求31所述的複合物在製備用於局部治療個體出血的藥物中的用途。35.包含脂化的TF、FXa和NCIS的複合物TF::FXa::NCIS。36.如權利要求35所述的複合物，其為藥物。37.權利要求35所述的複合物在製備用於治療個體出血的藥物中的用途。38.權利要求35所述的複合物在製備用於局部治療個體出血的藥物中的用途。39.包含脂化的TF和藥物可接受的載體的藥物組合物。40.用於將脂化的TF局部給藥的藥物組合物，其包含脂化的TF和適於將所述脂化的TF局部給藥的藥物可接受的載體。41.藥物組合物，其a)包含權利要求14所述的產品及藥物可接受的載體；或b)分別包含(i)脂化的TF與藥物可接受的載體，及(ii)FXa與藥物可接受的載體；或c)包含權利要求17所述的產品及藥物可接受的載體；或d)分別包含(i)脂化的TF與藥物可接受的載體，及(ii)NCIS與藥物可接受的載體；或e)包含權利要求20所述的產品及藥物可接受的載體；或f)分別包含(i)脂化的TF與藥物可接受的載體、(ii)FXa與藥物可接受的載體，及(iii)NCIS與藥物可接受的載體；或g)包含權利要求27所述的TF::FXa複合物與藥物可接受的載體；或h)包含權利要求31所述的TF::NCIS複合物與藥物可接受的載體5或i)包含權利要求35所述的TF::FXa::NCIS複合物與藥物可接受的載體。42.如權利要求41所述的藥物組合物，其為用於將其局部給藥的藥物給藥形式。43.包含權利要求39至42中任一權利要求所述的藥物組合物和支持體的產品。44.包含藥物組合物的產品，所述藥物組合物包含(i)支持體、(ii)權利要求14所述的產品及藥物可接受的載體、(iii)權利要求17所述的產品及藥物可接受的載體和(iv)權利要求20所述的產品及藥物可接受的載體；或權利要求27所述的TF::FXa複合物及藥物可接受的載體，或權利要求30所述的TF::NCIS複合物及藥物可接受的載體，或權利要求34所述的TF::FXa::NCIS複合物及藥物可4妄受的載體。45.非脂化的TF或其功能片段在製備用於治療凝血因子VII缺乏個體的出血的藥物中的用途。46.如權利要求45所述的用途，所述用途為在製備用於腸胃外給予非脂化的TF或其片段的藥物中的用途。全文摘要活化的凝血因子X(FXa)刺激劑可被用於治療個體出血。本發明描述了特別用於局部治療健康個體或具有出血素質患者的出血的化合物和組合物。文檔編號A61P7/04GK101291686SQ200680036920公開日2008年10月22日申請日期2006年8月2日優先權日2005年8月3日發明者哈維爾·佩德雷尼奧埃赫亞,路易斯·卡韋達卡塔蘇斯申請人:斯洛柏塔蓋茲歐洲有限公司