檢測澱粉樣蛋白β肽的新測定的製作方法

2023-11-06 02:11:12 3

專利名稱：檢測澱粉樣蛋白β肽的新測定的製作方法
檢測澱粉樣蛋白β肽的新測定本發明大體涉及使用Αβ (1-40)作為生物標記(biomarker)來檢測和診斷阿爾茨海默病，並且還涉及檢測生物學樣品中的Αβ (1-40)的新方法。
背景技術：
阿爾茨海默病是痴呆的最常見形式，並且具有在所有痴呆病症中約65_70%的流行程度。由增加的預期壽命所致，這種疾病在諸如日本和中國的高度發達的工業化國家以及美國和歐洲已成為特別的問題。阿爾茨海默病患者的數量估計從2001年的2. 4X IO7增加至2040年的8. I X IO7 (Ferri et al.，2005)。目前，全世界用於AD患者的治療和護理的費用總計每年約2. 5X IO11美元。該疾病的發展相對緩慢，並且在首發症狀發生後阿爾茨海默病通常會持續10-12 年。目前，進行AD的可靠和早期診斷並將其與痴呆的其他形式區分是非常困難的。具有超過90%可靠性的良好診斷僅在該疾病的較晚階段是可能的。在此之前，僅可能作出阿爾茨海默病是可能或很可能的預測；這裡診斷依賴於使用Knopman et al. , 2001; Waldemar et al.，2007或Dubois et al.，2007的某些標準。但是神經變性在注意到首發臨床症狀之前20-30年開始(Blennow et al. , 2006; Jellinger KA, 2007) 臨床期的發生通常特徵在於所謂的「輕度認知障礙」(MCI)，其中患者會表現出可測量的認知缺陷，所述認知缺陷不足以使得能夠以明確的方式診斷痴呆疾病(Petersen et al. , 1999;Chetkow et al.，2008)。許多患有MCI的患者會具有神經病理變化，所述神經病理變化對於AD是典型的，並且意味著AD的較早階段是可能的,但不確定(Scheff et al. , 2006;Markesbery et al., 2006; Bouwman et al.，2007)。但是有許多MCI病例不會發展為阿爾茨海默病；在這些病例中，其他因素導致認知缺陷(Saito et al. , 2007; Jicha et al.，2006和Petersen et al. , 2006) 0雖然一些MCI患者不會表現出他們的疾病狀況的任何惡化或者甚至一些改善，但是對於大多數MCI病例，認知缺陷會持續至臨床痴呆。這種轉化的年增長率為約 10-19%(Gauthier et al. , 2006;Fischer et al.，2007)。目前有臨床方法、神經心理學方法和成像方法的組合，其能夠區分輕度認知障礙的各種亞型(Devanand et al.，2007; Rossi et al. , 2007;Whitwell et al. , 2007;Panza et al.，2007)。但是,關於痴呆的進一步發展， 這些亞型之間沒有顯著差異(Fischer et al.，2007)。因此，開發方法以使能夠在早期，優選在阿爾茨海默病發作或MCI期間明確和可靠地診斷阿爾茨海默病是至關重要的。現有技術生物標記阿爾茨海默病的生物標記已在現有技術中描述。除了公知的心理測試，例如 ADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT或Clock Drawing測試，據認為生物標記提高首次診斷以及監控疾病發展的診斷靈敏度和特異性。關於開發AD/MCI的生物標記的目前狀態，據建議使未來的疾病與其他診斷標準關聯(Whitwell et al. , 2007;Panza et al. , 2007;Hyman SE，2007)。據認為生物標記在未來支持或代替傳統的神經心理測試。普遍相信作為開發抗阿爾茨海默病劑的替代標記，它們會非常重要(Blennow K, 2004;Blennow K, 2005;Hampel et al. , 2006;Lewczuk et al. , 2006;Irizarry MC, 2004)。
結構生物標記「磁共振成像」(MRI)是允許檢測腦中的變性萎縮的成像方法(Barnes Jet al.，2007; Vemuri et al.，2008)。因此，內側顳葉萎縮(MTA)對老年患者腦中海馬區的變性敏感；通過MRI可以使其非常清楚可見，但並不是阿爾茨海默病特異性的。輕度MTA在其他痴呆中沒有更頻繁地遇到(Barkhof et al.，2007)，但是其的確與MCI相關(Mevel et al.，2007)。因為這個原因，不可能僅從MRI數據確定神經變性是否為阿爾茨海默病或阿爾茨海默病早期。另一成像方法為正電子成像術(PET)，其使得澱粉樣蛋白沉積上的檢測分子 (PIB)的積累可視。已檢測到硫黃素T-類似物(11C) PIB在分別患有MCI或輕度阿爾茨海默病的患者的腦的某些區域中積累(Kemppainen et al. , 2007;Klunk et al. , 2004;Rowe et al.，2007)。但是，其在未表現出痴呆的症狀的個體中也可檢測(Pike et al.，2007)。反過來，這可能表明通過PET檢測澱粉樣蛋白沉積允許檢測阿爾茨海默病的臨床前階段；如果這種現象在進一步研究中被證實。除了最常用的方法MRI和PET，已知有阿爾茨海默病的其他結構生物標記CBF-SPECT、CMRgl-PET (葡萄糖代謝質子能譜學(H-IMRS)、高場強功能 MRI、基於體素的形態計量法、內側基底顳葉的增強活化(通過fMRI檢測)、用於檢測小膠質細胞的(R)-[(11)C]PKll 195PET(Huanget al. , 2007;Kantarci et al. , 2007;Petrella et al. , 2007;Hamalainen et al. , 2007;Kircher et al. , 2007;Kropholler et al.，2007)。CSF生物標記老年斑是阿爾茨海默病的病理特徵之一。這些斑塊大部分由Αβ (1-42)肽組成 (Attems J，2005)。在一些研究中可以顯示MCI患者的CSF中低水平的A β (1-42)特異性地與阿爾茨海默病的發展相關(Blennow and Hampel, 2003;Hansson et al., 2006and 2007)。 在CSF中的減少可能是由於腦中增加的Αβ (1-42)聚集(Fagan et al. , 2006;Prince et al. , 2004; Strozyk et al.，2003)。另一可能的解釋是半可溶性A β (1-42)寡聚體的出現(Walsh et al.，2005)，其會導致CSF中較低水平的檢測。特別是在阿爾茨海默病的早期，會檢測到降低的Αβ (1-42)濃度，同時可以分別檢測到CSF中增加的Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的量(Ewers et al. , 2007;Lewczuk et al.，2004)。為了提供更好的生物標記的可預測性，通常試圖使用Tau/Αβ (1-42)比例，並且使其與沒有痴呆的老年人(Fagan et al.,2007;Gustafson et al.,2007;Hansson et al. , 2007;Li et al.,2007;Stomrud et
al. , 2007)以及 MCI 患者(Hampel et al. , 2004;Maccioni et al. , 2006; Schonknecht
et al. , 2007)的認知缺陷的預測相關。在AD患者中檢測到腦的Αβ (1_42)的死前CSF 水平、Tau、磷酸化Tau-Thr231與死後組織病理學變化之間的進一步相關性(Clark et al., 2003; Buerger et al.，2006)。然而，在其他研究中，沒有檢測到CSF生物標記與 Αβ (1-42)之間、伴APOE ε 4_等位基因的總Tau與磷酸化Tau之間、屍體解剖後斑塊與纏結負荷之間的相關性(Engelborghs et al. , 2007;Buerger et al.，2007)。在多中心研究中檢測到有趣的方面。看來升高的總Tau和磷酸化Tau(181)的水平與降低的Αβ (1-42)/ Αβ (1-40)比例相關，但是不與單獨的Αβ (1-42)水平相關(ffiltfang et al.，2007)。但是在其他CNS疾病，如克雅病、腦梗死和腦血管性痴呆中也檢測到升高的CSF水平，所述疾病全部與神經元丟失有關(Buerger et al.，2006 (2) ; Bibl et al.，2008)。另一可能的生物標記是作為MCI的指示的CSF中BACEl活性的增加(Zhong et al.，2007)。還討論增加的BACEl活性會導致增加的A β產生以及因此增加的該肽的聚集。據認為阿爾茨海默病伴隨著神經炎症過程。因此CSF中的抗小膠質細胞抗體是AD中這些炎症過程的可能的生物標記(McRea et al. , 2007)。儘管有許多生物標記，據認為它們使得能夠明確診斷阿爾茨海默病，但是目前沒有可用的確保可靠和明確診斷這種疾病的單一生物標記。因此，阿爾茨海默病領域中的大部分研究使用測定各種生物標記與臨床診斷的結果的比較來確定阿爾茨海默病的階段和嚴重程度。相比之下，生物標記與阿爾茨海默病的病理原因之間的相關性會提供明顯更可靠的該疾病的診斷。 這樣的可能的方法可以是重複分析明確鑑定和定義的神經病理性痴呆疾病的免疫沉澱的CSF樣品，以明確Αβ (1-40)和Αβ (1-42)實際上是否是合適的神經化學痴呆標記(Jellinger et al.，2008)。為了發現新的目前未知的阿爾茨海默病生物標記，通常通過比較蛋白質組學分析來分析CSF樣品來獲得AD診斷的靈敏度增加，並且還使得能夠與其他變性痴呆病症區分(Finehout et al. , 2007;Castano et al. , 2006;Zhang et al. , 2005; Simonsen et al. , 2007; Lescuyer et al. , 2004; Abdi et al.，2006)。蛋白質組學分析後，必須詳細分析潛在的新生物標記的適用性和與病理原因的相關性。通過蛋白質組學分析發現的生物標記典型實例是作為多發性硬化的生物標記的截短的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C。後來證實這種生物標記為存儲人工產物(Irani et al. , 2006;Hansson et al.，2007(2))。血漿生物標記除了常用的血漿生物標記，即Αβ肽，其他炎症性血漿標記用於痴呆(Ravaglia et al. , 2007; Engelhart et al.，2004),特別是阿爾茨海默病(Motta et al. , 2007)的早期診斷。這些炎症性標記對於阿爾茨海默病診斷的適用性和特異性仍在討論。通過來自 AD患者和健康對照的血眾的比較蛋白質組學分析還發現其他可能的生物標記(German et al.，2007; Ray et al.，2007)。對於任何上述生物標記，目前為止沒有令人信服的或合適的數據是可用的。與CSF中澱粉樣蛋白β的分析相反，到目前為止獲得的關於血漿中合適的 Αβ生物標記的結果並不可靠或明確。在一些研究中發現血漿中降低的Αβ (1-42)/ Αβ (1-40)比例與增加的認知正常者分別轉化為MCI或阿爾茨海默病患者之間的相關性 (Graff-Radford et al. , 2007;van Oijen et al. , 2006;Sundelof et al.，2008)。但是其他研究檢測到Αβ (1-42)血眾水平的降低更可能是MCI轉化為AD的標記(Song et al.，2007)，而且不適合作為神經變性目的的標記，這是阿爾茨海默病所遇到的(Pesaresi et al. , 2006) 0然而大部分研究未顯示健康對照與患有散發性阿爾茨海默病的患者之間 Αβ 血眾水平的差異(Fukumoto et al. , 2003;Kosaka et al. , 1997; Scheuner et al. , 1996;Sobow et al. , 2005;Tamaoka et al. , 1996;Vanderstichele et al.，2000)。 一些研究還顯示血眾中Αβ的水平與腦中的水平無關(Fagan et al. , 2006;Freeman et al.，2007),其也與 CSF 中的水平無關(Mehta et al. , 2001; Vanderstichele et al. , 2000) 0在最近的研究中，檢測到Αβ (1-40)和Αβ (1-42)在CSF與血漿之間的相關性，但是僅在健康對照中。這種相關性在MCI和AD中沒有檢測到，這通過由於腦中 Αβ沉積破壞CSF與血漿Αβ之間的平衡來解釋(Giedraitis et al.，2007)。通常，假設血眾A β (1-42)水平不是MCI或AD的可靠生物標記(Blasko et al. , 2008; Mehta etal. , 2000; Brettschneider et al.，2005),而認為血眾 A β (1-38)/A β (1-40)比例的降低是血管性痴呆的生物標記,並且接近CSF標記的可預測性(Bibl et al.，2007)。EP2020602和US20020182660公開檢測血漿樣品中特定全長Αβ肽如Αβ (1-40) 和Αβ (1-42)的方法。該方法採用兩種不同的捕獲抗體，但是不包括免疫沉澱步驟。ΕΡ1944314公開檢測抗A β肽的自身抗體的方法，例如抗A β (21-37)或 Αβ (4-10)的自身抗體。在所述方法中，為了結合併檢測各自的自身抗體，將包含Aβ肽的胺基酸序列的多肽固定化在載體上。因此，顯然需要生物標記，其可靠並且實現阿爾茨海默病階段的早期發生的明確可預測性以及區分阿爾茨海默病與其他痴呆疾病。還需要從血漿提供所述生物標記，與CSF 相比血漿可容易地從患者獲得。此外，需要提供檢測所述生物標記的方法，其使得可靠和明確地測定所述生物標記。然而，這樣的方法，特別是用血漿A β作為生物標記，是極難建立的，因為A β肽是非常疏水的。所有目前已知和描述的測定系統和方法僅達到令人非常不滿意的分析靈敏度，並且遇到關於分析物與基質(即血漿)之間非常複雜的相關作用的大問題。這解釋了上文所述多個研究中非常矛盾的結果。這還導致科學界相信血漿中特定Aβ肽的水平不適合作為AD的生物標記。ELISA或ELISA類型系統(Muliplex)通常用於血漿中的Αβ的定量。這類研究的驗證參數通常僅被不令人滿意地分析或者完全被無視。例如，像回收率的關鍵項目未分析或未在各出版物中提及。然而回收率是正確測定存在於血漿中的那些Aβ肽的水平的決定性參數。因此存在於不同研究中的血漿中的Αβ肽水平的差異可能是由回收率的不正確測定所導致的。ELISA或多重系統的另一重要參數是其線性度。例如，在Hansson et al.，2008 中，計算的I : 20稀釋的血漿Αβ (1-42)濃度的水平比相同樣品的I : 2稀釋中的高3倍 (Hansson et al.，2008)。單獨這個實例表明目前已知的幾個研究中的相同血眾樣品的不同稀釋是不可比的。此外，這類方法完全不適合建立可靠的診斷測定。在一個研究中使用不同稀釋會導致假象並最終導致完全錯誤的結果。只要沒有血漿Aβ分析的標準化方案和方法，這類研究在未來還會矛盾並且不適合用作診斷方法。因此，本發明的目的是提供新方法，其允許高可靠性地特別是在血漿中檢測A β。此外，本發明提供診斷標記，其可以用可靠的方法來測定，並且可以用於可靠和明確地預測阿爾茨海默病。本發明還提供可靠的方法，其特別適合用於多患者研究，其中生物學樣品在不同測量周期中分析。發明概述本發明的目的是通過提供檢測生物學樣品中的澱粉樣蛋白β肽(Abeta或Αβ) 的方法來解決的。所述方法的特徵在於在免疫沉澱步驟中使生物學樣品與至少兩種不同的捕獲抗體接觸。分離、破壞所得的複合物，隨後在A β特異性ELISA中分析捕獲的A β肽。 優選地，這種A β特異性ELISA為夾心ELISA。酶β-和Y-分泌酶順序切割後，Αβ肽從澱粉樣蛋白前體蛋白(APP)釋放。Y-分泌酶切割導致產生上述Αβ (1-40)和Αβ (1-42)肽，其不同之處在於它們的C端，以及表現出不同的聚集、纖維形成和神經毒性潛能。
因此本發明提供測定Αβ (1-40)和Αβ (1-42)肽水平的方法。同樣設想檢測 Αβ (1-40)或Αβ (1-42)的功能性等同物。本發明的方法特別適合測定Αβ (1-40)和/或其功能性等同物的水平。因此，根據上述方法的優選實施方案，待測定的Αβ肽選自Αβ (1-40) (SEQ ID Νο:1)、Αβ (1-42) (SEQ ID No:2)及它們的功能性等同物。在一特別優選的實施方案中，待檢測的Aβ肽為Αβ (1-40) (SEQ ID Νο:2)。根據另一優選實施方案，所述生物學樣品選自血液、血清、尿、腦脊液(CSF)、血漿、 淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑液、淚液、膽汁和胰分泌物。在一特別優選的實施方案中，所述生物學樣品為血漿。所述生物學樣品可以本領域技術人員公知的方式獲得自患者。特別地，血液樣品可以從對象獲得，並且所述血液樣品可以通過常規方法分離為血清和血漿。從其獲得所述生物學樣品的對象疑似患有阿爾茨海默病，有發展阿爾茨海默病的風險和/或有任何其他種類的痴呆的風險或患有任何其他種類的痴呆。特別地，是疑似患有輕度認知障礙(MCI)和/或處於阿爾茨海默病早期的對象。本發明的方法相對於本領域已知的方法具有幾個優勢，即本發明的方法可以用來在早期檢測阿爾茨海默病，以及在疾病發生和發展的早期區分阿爾茨海默病和其他類型的痴呆。一種可能的早期是輕度認知障礙(MCI)。不可能用本領域目前已知的方法進行早期阿爾茨海默病的明確和可靠的診斷，特別地，不可能在所述早期區分阿爾茨海默病的發生和其他形式的痴呆。這特別應用於患有MCI的患者。相比之下，本發明提供的方法適合阿爾茨海默病的鑑別診斷。特別地，本發明提供一種方法，其中可以在獲得自任何上述對象的生物學樣品中以高度重複的方式檢測Αβ 肽。本發明的方法的高重複性是通過在初始免疫沉澱步驟中使用至少兩種不同的捕獲抗體來實現的。優選地，所述至少兩種不同的捕獲抗體針對Αβ靶肽的不同表位。在本發明的方法中特別優選使用A β (1-40)。在另一優選實施方案中，所述生物學樣品為血眾。上述「Αβ靶肽」涵蓋Αβ (1-40)和Αβ (1_42)，包括它們的所有功能性等同物。本發明必須克服的具體問題是待使用的生物標記在阿爾茨海默病早期，例如輕度認知障礙期間改變。本發明的發明者已顯示可以可靠的方式測定Αβ肽，特別是 Αβ (1-40)，並且還首次明確實際上Aβ (1-40)特別適合早發性阿爾茨海默病的診斷。此外，本發明明確Αβ (1-40)水平是早期阿爾茨海默病發生的初始和早期標記， 因為其血漿水平在阿爾茨海默病早期升高，並且在歸類於輕度認知障礙的人中特別高。只有用本發明才可能顯示Aβ (1-40)的高血漿濃度與阿爾茨海默病的陽性臨床診斷相關。這與現有技術中較早的觀點相反，所述觀點認為A β (1-40)不是合適的AD標記，因為顯示關聯性的嘗試被統計上不顯著的數據終結，並且未建立任何統計上顯著的相關性。本發明的這些令人驚訝的結果是通過使用本發明的方法來獲得的，所述方法將新的二價捕獲系統用於初始免疫沉澱步驟。這種二價捕獲系統定義為兩種抗體分子或兩種以上抗體分子，識別所述Αβ肽的至少兩個不同表位。因此，已證實Αβ (1-40)的顯著增加是阿爾茨海默病發展中的早期事件。根據一優選實施方案，所述至少兩種不同捕獲抗體各自對所述Αβ肽，特別是所述A β (1-40)肽的不同表位具有特異性。
所述免疫沉澱步驟因為幾個原因是有利的其減少基質影響，即其消除雜質(每個生物學樣品中通常包含雜質)從而使得本發明的方法更靈敏。此外，所述免疫沉澱步驟引起所述Αβ肽的預富集，這導致隨後使用的檢測抗體的提高的親和性。定義在本申請的意義上，「捕獲抗體」旨在涵蓋結合靶Αβ肽的那些抗體。優選地，所述捕獲抗體高親和性地結合所述A β肽。在本發明的上下文中，高親和性表示這樣的親和性，其具有10_7Μ或更好的Kd值，優選10_8Μ或更好的Kd值，或者甚至更優選 IO-9M-KT12M 的 Kd 值。術語「抗體」以其最廣泛的含義使用，並且具體涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、從至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段(只要它們表現出期望的生物學活性)。抗體可以是例如IgM, IgG(例如IgGU IgG2、IgG3或 IgG4)、IgD、IgA*IgE。然而，優選所述抗體不是IgM抗體。所述「期望的生物學活性」是結合Αβ肽。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，通常是所述完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段雙抗體；單鏈抗體分子；以及從抗體片段形成的多特異性抗體。如本文所用，術語「單克隆抗體」指獲得自一群基本上均質的抗體的抗體，即該群包含的各個抗體除了少量可能天然存在的突變之外是相同的。單克隆抗體針對單一抗原位點是高度特異性的。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的「多克隆抗體」製品相反，每種單克隆抗體只針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體通常的有利之處是它們通過雜交瘤培養合成，未被其它免疫球蛋白汙染。「單克隆」表示抗體的特徵，其獲得自基本上均質的抗體群體，並且不應理解為需要通過任何特定方法來產生抗體。例如，本發明中使用的單克隆抗體可以通過由ICGhler· et al., Nature, 256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法製備，或者可以通過一般公知的重組DNA方法製備。「單克隆抗體」還可以分離自噬菌體抗體文庫，使用例如Clackson et al. , Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks et al.，J. Mol. Biol.，222:581-597 (1991)所述的技術。本文中的單克隆抗體具體包括嵌合抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈和/或輕鏈與來源於特定物種的抗體或者屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或者同源，而鏈的剩餘部分與來源於另一物種的抗體或者屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或者同源；以及這類抗體的片段，只要它們表現出期望的生物學活性。「人源化」形式的非人(例如，小鼠)抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或它們的片段(如FiFalKFabi、F(ab' ) 2或者抗體的其它抗原結合子序列)，其含有來源於非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(CDR)的殘基由具有期望的特異性、親和性和能力(capacity)的非人物種 (供體抗體)如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架區(FR)殘基由相應的非人殘基代替。此外，人源化抗體可以包含這樣的殘基，其在受體抗體或者引入的CDR或構架序列中均未發現。進行這些修飾以進一步精製和優化抗體的性能。通常，人源化抗體包含基本上所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有⑶R區對應於非人免疫球蛋白的CDR區，並且所有或基本上所有FR區是人免疫球蛋白序列的FR區。人源化抗體最優選還包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fe)，通常為人免疫球蛋白的恆定區。進一步的細節參見 Jones et al. , Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann et al, Nature. 332:323-329 (1988):和 Presta, Curr. Op. Struct. Biel. , 2:593-596(1992)。人源化抗體包括Primatized 抗體，其中所述抗體的抗原結合區來源於通過用所關注的抗原免疫恆河猴所產生的抗體或「駱駝化」抗體。「單鏈Fv」或「sFv」抗體片段包含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。通常地，Fv多肽還包含Vh與\結構域之間的多肽接頭，所述多肽接頭使得 sFv形成抗原結合所期望的結構。關於sFv的綜述參見Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)。術語「雙抗體」指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，該片段包含在相同多肽鏈中與輕鏈可變結構域(Vd)連接的重鏈可變結構域(Vh) (Vh - Vd) 0通過使用過短而不允許相同鏈上兩個結構域之間配對的接頭，迫使所述結構域與另一鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙抗體更全面地描述於Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sol. USA, 90:6444-6448(1993)。「分離的」抗體是已經鑑定並從其天然環境的組分中分離和/或回收的抗體。其天然環境的汙染組分是會干擾抗體的診斷或治療用途的物質，並且可以包括酶、激素以及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化至(I)如通過勞裡(Lowry) 方法所測定的，以重量計大於95%，並且最優選以重量計大於99% ； (2)通過使用旋杯測序儀足以獲得N端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度；或者(3)通過還原或非還原條件 SDS-PAGE使用考馬斯藍或優選銀染的均一性。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為不存在抗體天然環境的至少一種成分。然而，通常分離的抗體通過至少一個純化步驟來製備。如本文所用，表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可互換使用，並且所有這些名稱均包括後代。因此，詞語「轉化子」和「轉化的細胞」包括初始的對象細胞以及從其衍生的培養物而不論轉移的數目。還應當理解，由於有意或無意的突變，所有後代的DNA含量可以不完全相同。本發明包括經篩選與原始轉化的細胞具有相同功能或生物學活性的突變體後代。在使用不同名稱的情況下，從上下文可明了。如本文所用，術語「多肽」、「肽」和「蛋白」可互換使用，並且定義為表示由通過肽鍵連接的胺基酸組成的生物分子。如本文所用，術語「一 (a) 」、「一 (an) 」和「所述(the) 」定義為表示「一或多」，並且包括複數形式，除非在上下文中是不適合的。「澱粉樣蛋白β、Αβ或/β_澱粉樣蛋白」是本領域公認的術語，並且指澱粉樣蛋白β蛋白和肽、澱粉樣蛋白β前體蛋白(APP)以及其修飾、片段和任何功能性等同物。特別地，如本文所用，澱粉樣蛋白β表示通過APP的蛋白酶剪切所產生的任何片段，但特別是涉及或與澱粉樣蛋白病理學相關的那些片段，包括但不限於Αβ 1-38, Aβ 1-40, Aβ 1_42。「功能性等同物」涵蓋A β (1-40)和/或A β (1-42)的所有這些突變體或變體，其可以天然存在於已選擇接受如本發明所述的檢測方法或診斷方法的患者組中。更特別地， 在本文的上下文中「功能性等同物」表示Αβ (1-40)或Αβ (1-42)的功能性等同物是其突變體或變體，並且已證實在阿爾茨海默病中積累。與Αβ (1-40)和/或Αβ (1-42)相比，所述功能性等同物具有不超過30個突變，優選不超過20個突變，更優選不超過10個突變，特別優選不超過5個突變，並且最優選2個或僅I個突變。功能性等同物還涵蓋突變的變體， 例如其包括以胺基酸Asp-Ala-Glu開始並分別以Gly-Val-Val和Val-Ile Ala結束的所有 Αβ肽。在本文的上下文中特別有用的Αβ (1-40)和Αβ (1-42)等同物是由Irie et al.，2005所述的那些等同物，即Αβ的鳥取、佛蘭德、荷蘭、義大利、北極和愛荷華突變。功能性等同物還涵蓋來源於在β-或Y-分泌酶切割位點旁邊含有突變的澱粉樣蛋白前體蛋白的Αβ肽，如瑞典、奧地利、法國、德國、佛羅裡達、倫敦、印第安納和澳大利亞變異(Irie et al. , 2005)。「夾心ELISA」通常包括使用兩種抗體，每種能夠結合至待檢測的蛋白的不同免疫原性部分或表位。在夾心測定中，通過固定化在固體支持物上的第一抗體結合測試樣品分析物，然後第二抗體結合至分析物，因此形成不溶的由三部分組成的複合物。所述第二抗體本身可以用可檢測的部分標記(直接夾心測定)，或者可以利用用可檢測的部分標記的抗免疫球蛋白抗體來測量(間接夾心測定)。例如，夾心測定的一種優選類型是ELISA測定， 在這種情況下所述可檢測的部分是酶。


圖I 二價免疫沉澱系統提高捕獲效率(A)通過使用不同抗體組合從Cyp18溶液和人血漿回收A β I-40(B) 二價捕獲系統的示意圖(陰影4G8抗體，灰色x_40抗體，黑色綴合至磁珠的抗小鼠抗體)。圖2 DemTect測試，DemTect量表的AD患者和健康對象中的分類差異結果的平均值 (平均值土 SD)。圖3 簡易精神狀態測試，簡易精神狀態測試的AD患者和健康對象中的分類差異結果的平均值(平均值土 SD)。圖4 畫鍾測試，畫鍾測試的AD患者和健康對象中的分類差異結果的平均值(平均值土 SD)。圖5 Αβ (1-40)濃度分別對DemTect (A)和MMSE⑶的分數的圖。圖6 相對血漿A β (1-40)水平，標準化至內部血漿標準品(ITS)，平均值和SEM。序列
Αβ 1-42 (SEQ ID NO. I)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-AlaΑβ 1-40 (SEQ ID NO. 2)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val發明詳述本發明提供檢測和測定生物學樣品中的Αβ肽的方法。所述方法的特徵在於在免疫沉澱步驟中使生物學樣品與至少兩種不同的捕獲抗體接觸。將所得的複合物分離，破壞， 隨後將捕獲的Aβ肽在Αβ特異性ELISA中分析。優選地，這種Aβ特異性ELISA為夾心 ELISA。如上文所提到的，用於初始捕獲步驟的至少兩種抗體應當選擇對所述A β肽的不同表位具有不同特異性的抗體。本發明的方法包括以下步驟i)在免疫沉澱步驟中使生物學樣品與至少兩種不同捕獲抗體接觸。使所述生物學樣品與上述至少兩種不同的捕獲抗體接觸之後，所述至少兩種不同的捕獲抗體與所述Aβ肽之間會形成免疫複合物。這個步驟的作用不是特異性分離全長 Αβ (1-40)和/或Αβ (1-42)，而是捕獲和分離所有Aβ種類，特別是在位置40和/或位置 42結束的Αβ種類。ii)然後通過二抗檢測該複合物。適合地，所述二抗固定化在磁珠上。利用磁性分離器可以容易地將所述免疫複合物與磁珠一起從體液(血漿/血清CSF等)分離。iii)將所述免疫複合物從珠洗脫。適合地，通過將攜帶所述免疫複合物的珠在包含50%甲醇/0. 5%甲酸的溶液中於室溫下溫育Ih來進行洗脫步驟。由此，所有分子間的相互作用被破壞，並且分離自所述生物學樣品的所有Αβ肽分子從所述溶液中的珠釋放。iv)將釋放的分離的Αβ肽在隨後的步驟中定量，例如通過特異性檢測全長 Αβ (1-40)和 / 或 Αβ (1-42)的夾心 ELISA。在多患者診斷研究中，例如當必須分析超過100個生物學樣品時，必須在幾周或幾個月的時間中進行幾個測量周期。由於這段延長的時間和在不同時間點進行的不同測量周期，不同測量周期之間的批間變化可能高概率地發生。批間變化可以在某些步驟發生， 例如在免疫沉澱步驟期間(例如因為沉澱抗體的不同批次)，或者Αβ (1-40)ELISA(由於 ELISA試劑盒的不同批次)。由於這些批間變化，生物學樣品中測定Αβ靶肽的量在不同測量周期之間可能不可比，而且包括在所述多患者研究中獲得的所有生物學樣品的Αβ靶肽量的統計分析以及區分AD患者和健康個體變得不可能。為了避免所述批間變化並使來自不同測量周期的結果可比和對於統計分析可行， 本發明的方法優選在存在內部標準樣品的條件下進行。這樣的內部標準品例如內部血漿標準-樣品(ITS)，其應當獲得自良好定義的對照對象，優選健康對象。諸如A β (1-40)或 Αβ (1-42)的Αβ靶肽的濃度在每個ITS樣品中是恆定的。因此，在不同測量周期中發現的ITS樣品中A β靶肽濃度的變化反映批間變化性。根據本發明的優選實施方案，每個測量周期中包括一個或多個ITS樣品。測定諸如血漿樣品的生物學樣品中的Αβ肽水平之後，將所述生物學樣品的Αβ靶肽濃度如 Αβ (1-40)或Αβ (1-42)濃度標準化至ITS樣品中測定的相應Αβ靶肽的濃度，獲得每個測試樣品的相對A β靶肽水平。在另一優選實施方案中，本發明的方法包括另一步驟，將所述生物學樣品的Αβ 靶肽濃度如Αβ (1-40)或Αβ (1-42)濃度標準化至ITS樣品中測定的相應Αβ靶肽的濃度， 導致每個生物學樣品的相對Aβ靶肽水平。結果，在不同測量周期(時間點、抗體批次、ELISA批次)中測定的生物學樣品中的相對Αβ靶肽水平的比較比未標準化的Αβ靶肽水平的比較更可靠。在本發明的方法中，ITS的使用特別優選用於測定Αβ (1-40)和/或Αβ (1-42)的濃度，最優選用於A β (1-40)的濃度。本發明的方法不限於血漿樣品。如果在本發明的方法中應當使用其他體液(腦脊液、尿、淋巴，、唾液、汗液、胸膜液、滑液、房水、淚液、膽汁、胰分泌物)，這些液體必須取自良好定義的對照對象，優選健康對象，如本文中對血漿樣品所證實的。然後這些液體用作內部標準品。因此，本發明的內部標準樣品優選選自血漿樣品、腦脊液樣品、尿樣品、淋巴樣品、 唾液樣品、汗液樣品、胸膜液樣品、滑液樣品、房水樣品、淚液樣品、膽汁樣品、胰分泌物樣品。最優選地，所述內部標準樣品為血漿樣品。適合地，驗證了本發明的方法，其中作為生物學樣品供體的對象關於神經變性疾病的狀態已被良好表徵。所述表徵可以利用常規心理測試來進行，例如DemTect、簡易精神狀態測試、畫鍾測試、ADAS-Cog (阿爾茨海默病評價量表-認知)、Blessed測試、CANTAB (劍橋神經心理自動化成套測試)、Cognistat (精神行為認知狀態檢查)、神經精神症狀問卷 (NPI)、阿爾茨海默病病理行為評分表(BEHAVE-AD)、CERAD(美國阿爾茨海默病聯合登記協作組織)臨床和神經心理學測試、康奈爾痴呆抑鬱量表(CSDD)、老年抑鬱量表(OTS)以及7 分鐘篩選量表。在本文的上下文中合適的用於免疫沉澱的可能的抗體如下，雖然本發明並不限於這些具體的工作實例
3D6,表位1-5 (Elan Pharmaceuticals, Innogenetics)
pAb-EL16，表位l-7
2H4,表位1-8 (Covance)
IElI,表位1-8 (Covance)
20. I,表位1-10 (Covance, Santa Cruz Biotechnology)
兔抗Αβ多克隆抗體，表位1-14(Abeam)
AB 10,表位1-16 (Chemicon/Upstate-part of Millipore)
82E1，表位:1-16 (IBL)
pAbl-42，表位:1-11
NAB228, 表位1-11 (Covance, Sigma-Aldrich, Cell Signaling, Santa Cruz
Biotechnology, Zymed/Invitrogen)
DE2,表位1-16 (Chemicon/Upstate-part of Millipore)
DE2B4,表位1-17 (Novus Biologicals, Abeam, Accurate, AbD Serotec)
6E10,表位1-17 (Signet Covance, Sigma-Aldrich)
10D5,表位3-7 (Elan Pharmaceuticals)
W0-2,表位4-10 (The Genetics Company)
IA3,表位 5_9 (Abbiotec)
pAb-EL21，表位 5-11
310-03,表位 5-16 (Abeam, Santa Cruz Biotechnology)
雞抗人Αβ多克隆抗體，表位12-28 (Abeam)
雞抗人A β多克隆抗體，表位25-35 (Abcam)
兔抗人Αβ多克隆抗體，表位Ν端(ABR)
兔抗人Αβ多克隆抗體(Anaspec)
12C3,表位 10-16 (Abbiotec, Santa Cruz Biotechnology)
16C9,表位 10-16 (Abbiotec, Santa Cruz Biotechnology)
19B8,表位 9-10 (Abbiotec, Santa Cruz Biotechnology)
pAb-EL26，表位:11-26
BAM90. 1，表位13-28 (Sigma-Aldrich)
兔抗澱粉樣蛋白(pan)多克隆抗體，表位15-30 (MBL)
22D 12,表位18-21 (Santa Cruz Biotechnology)
266,表位16-24(Elan Pharmaceuticals)
pAb-EL17 ;表位15-24
4G8,表位17-24(Covance)
兔抗Αβ多克隆抗體，表位22-35 (Abeam)
G2-10 ;表位31-40 (The Genetics Company)
兔抗 A3，aa 32-40 多克隆抗體(GenScript Corporation)
EP 1876Y，表位x_40 (Novus Biologicals)
G2-11,表位33-42 (The Genetics Company)
16C 11,表位33-42 (Santa Cruz Biotechnology)
21F 12,表位34-42 (Elan Pharmaceuticals, Innogenetics)
1A10，表位:35-40 (IBL)
D-17 山羊抗 Αβ 抗體，表位C 端(Santa Cruz Biotechnology)
用於免疫沉澱的特別優選的抗體是3D6 (Elan)、BAN50 (Takeda)、82E1 (IBL)、6E 10(Covance) > W0-2(The Genectics Company)>266 (Elan) > BAM90. I (Sigma)>
4G8(Covance)、G2-10(The Genetics Company) > IA 10 (IBL)、BA27(Takeda)、 11A5-B10(Millipore)、12F4(Millipore)、21F12(Elan)。用於免疫沉澱的特別優選的抗體對是4G8 和 11A5-B10、3D6 和 4G8、6E10 和 4G8、82E1 和 4G8、4G8 和 12F4、4G8 和 21F12、 3D6 和 21F12、6E10 和 21F12、BAN50 和 4G8、3D6 和 11A5_B10、3D6 和 1A10、3D6 和 BA27、6E10 和 11A5-B10、6E10和 1A10、6E10和 BA27、4G8和 11A5_B10、4G8和 1A10、4G8和 BA27、4G8 和12F4、4G8 和 21F12。除了上文指明的抗體，適合免疫沉澱的所有其他澱粉樣蛋白β特異性抗體(單克隆和多克隆)均可以用於本發明的方法(其他合適的抗體可以例如來自WWW. alZforum, org)。對於良好的捕獲效率決定性的並且因此構成本發明的關鍵元素的是使用具有不同表位的兩種、三種或更多種不同抗體。使用超過一種抗體類型用於Aβ肽的免疫沉澱提供合作的和令人驚訝的協同結合效應(親和力)，這最終允許實現極高的捕獲效率(參見圖I)。步驟ii)中的二抗是特異性針對捕獲抗體的宿主抗體類型的。優選的二抗為抗小鼠抗體和抗兔抗體。步驟iii)中將複合物與磁珠溫育之後，可以將珠用洗滌緩衝液洗滌(參見本發明的實施例)。含有防止非特異性結合的去汙劑或其他添加劑的洗滌緩衝液可以用於這個步驟。洗滌緩衝液的非限制性實例是-含有10mg/ml 親環蛋白 18 (Cyp 18)和 O. 05% 吐溫-20 的 D-PBS，-PBS+0. 05% 吐溫-20，-TBS+0. 05% 吐溫-20，-PBS+l%(w/v)BSA+0. 05% 吐溫-20，-TBS+l%(w/v)BSA+0. 05% 吐溫-20，以及-Pierce ELISA 阻斷劑(含有吐溫-20)。步驟iv)中將免疫複合物從珠洗脫之後，將溶液在稀釋緩衝液中稀釋。可以防止與表面和固定化的第一 ELISA抗體的非特異性相互作用的任何稀釋緩衝液可以用於這個步驟。稀釋緩衝液的非限制性實例是-EIA緩衝液(IBL 1-40 (N)ELISA試劑盒的稀釋緩衝液)，-PBS+1% (w/v) BSA+0. 05% 吐溫-20，-TBS+1% (w/v) BSA+0. 05% 吐溫-20，以及-Pierce ELISA 阻斷劑(含有吐溫-20)。能夠定量全長Αβ (1-40)的ELISA試劑盒可商購。本發明的方法中用於定量 Αβ (1-40)的合適的 ELISA 試劑盒例如澱粉樣蛋白 _β (1-40) (N)ELISA(IBL, JP27714)； A β [1-40]人ELISA試劑盒(Invitrogen);人澱粉樣蛋白β (澱粉樣蛋白-β )，aa 1-40ELISA 試劑盒(Wako Chemicals USA, Inc.);澱粉樣蛋白 β 1-40ELISA 試劑盒(The Genetics Company)。能夠定量全長Αβ (1-42)的ELISA試劑盒也可商購。本發明的方法中用於定量 Αβ (1-42)的合適的 ELISA 試劑盒例如澱粉樣蛋白 _β (1-42) (N) ELISA (IBL, JP27712)； A β [1-42]人ELISA試劑盒(Invitrogen)、人澱粉樣蛋白M澱粉樣蛋白-β )，aa 1-42ELISA 試劑盒(Wako Chemicals USA, Inc.)、澱粉樣蛋白 β 1-40ELISA 試劑盒(The Genetics Company)、INNOTEST β -澱粉樣蛋白(1_42) (Innogenetics)。本發明的方法不限於上述示例性的可商購的Αβ (1-40)或Αβ (1-42)的ELISA試劑盒。用於全長Aβ (1-40)或Αβ (1-42)的許多其他夾心ELISA在現有技術中可以獲得或者可以由技術人員開發。所有這些全長Aβ 1-40或Αβ 1-42夾心ELISA應當也包括在本發明的方法中，並且通常應當包含合適的捕獲和檢測抗體對，所述抗體對分別對A β (1-40) 和/或Αβ (1-42)的完整N端具有特異性以及對在胺基酸40或42結束的C端具有特異性。
這樣的全長A β (1-40)夾心ELISA可以包含特異性識別A β (1-40)的C端的第一固定化抗體，以及特異性識別A β (1-40)的完整N端的第二標記檢測抗體。全長Αβ (1-42)夾心ELISA可以包含特異性識別Aβ (1-42)的C端的第一固定化抗體，以及特異性識別Αβ (1-42)的完整N端的第二標記檢測抗體。全長Αβ (1-40)夾心ELISA還可以包含特異性識別Aβ (1-40)的完整N端的第一固定化抗體，以及特異性識別A β (1-40)的C端的第二標記檢測抗體。全長Αβ (1-42)夾心ELISA還可以包含特異性識別Aβ (1-42)的完整N端的第一固定化抗體，以及特異性識別A β (1-42)的C端的第二標記檢測抗體。用於本發明的方法的合適的A β (1-40/42) N端特異性抗體例如3D6 (Elan)、 W0-2 (The Genetics Company)、82E I (IBL)、BAN_50 (Takeda)。許多其他 Αβ (1_40/42)Ν端特異性抗體在現有技術中可以獲得或者可以由技術人員開發。所有這些Αβ (1-40/42)Ν端特異性抗體也包括在本發明的方法中。合適的Αβ (1-40)C 端特異性抗體例如 G2_10(The Genetics Company)； 11A5-B10 (Millipore) ； IAlO (IBL) ；BA27 (Takeda) ；EP1876Y (Novus Biologicals)。許多其他Αβ (1_40)C端特異性抗體在現有技術中可以獲得或者可以由技術人員開發。所有這些 A β (1-40) C端特異性抗體也包括在本發明的方法中。合適的Αβ (1-42)C 端特異性抗體例如 G2-11 (The Genetics Company)； 12F4 (Millipore)；抗人 Αβ (38-42)兔 IgG(IBL) ；21F12(Elan) ；BC05 (Takeda)； 16C11 (Santa Cruz Biotechnology)。許多其他Αβ (1-42)C端特異性抗體在現有技術中可以獲得或者可以由技術人員開發。所有這些Αβ (1-42)C端特異性抗體也包括在本發明的方法中。根據優選的實施方案，所述檢測抗體是標記的。為了診斷應用，所述檢測抗體通常用可檢測的部分標記。許多標記可用，其一般可以分為以下類別(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和mI。所述抗體可以利用如Current Protocols in Immunology, Volumes land 2，Giitigen et al. , Ed. , Wiley-Interscience. New York, New York. Pubs.，(1991)所述的技術,用放射性同位素標記,放射性可以利用閃爍計數來測量。(b)可以利用螢光標記，如稀土金屬螯合物(銪螯合物)或者螢光素及其衍生物、 若丹明及其衍生物、丹磺醯、麗絲胺(Lissamine)、藻紅素和德克薩斯紅(Texas Red)。可以利用例如上文的Current Protocols in Immunology所公開的技術將突光標記綴合至抗體。螢光可以使用螢光計定量。(c)各種酶-底物標記可用。酶一般催化生色底物的化學改變，這可以利用各種技術測量。例如，酶可催化底物的顏色改變，這可以通過分光光度計測量。或者，酶可改變底物的螢光或化學發光。定量螢光變化的技術如上文所述。化學發光底物通過化學反應變成電子激發的，然後可以發出可測量的光(例如利用化學發光計測量)或者將能量供給螢光接受體。酶標記的實例包括螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利第
4,737, 456 號)、螢光素、2，3- 二氫 2, 3- 二氣雜蔡二麗(2, 3-dihydrophthalazinedione)、 蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、鹼性磷酸酶、O-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(如尿酸氧化酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。 將酶綴合至抗體的技術描述於 O' Sullivan et al. , Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)。酶-底物組合的實例包括例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)與作為底物的過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3'，5，5'-四甲基鹽酸聯苯胺(TMB))；(ii)鹼性磷酸酶(AP)與作為生色底物的磷酸對硝基苯酯；以及(iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)與生色底物(例如對硝基苯基_β _D_半乳糖苷酶)或突光底物4_甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷酶(4-methylumbelliferyl-β-D-gala ctosidase)。許多其它酶-底物組合對於本領域技術人員是可用的。(d)用於檢測抗體的另一可能的標記是短核苷酸序列。然後通過RT-PCR系統 (Imperacer , Chimera Biotech)來測定濃度。有時，將標記與抗體間接綴合。技術人員應當知道實現這個目的的各種技術。例如，可以將抗體與生物素綴合，並且可以將任何上述三大類的標記與抗生物素蛋白綴合，或者反之亦然。生物素選擇性地結合至抗生物素蛋白，並且因此可以將該標記以這種間接方式與抗體綴合。或者，為了實現標記與抗體的間接綴合，將抗體與小的半抗原(例如地高辛)綴合，並且將上述不同類型標記中的一種與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)綴合。 因此，可以實現標記與抗體的間接綴合。本發明的抗體可用於任何已知的測定方法，如競爭性結合測定、直接和間接夾心測定以及免疫沉澱測定。Zola, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pp. 147-158(CRC Press. Inc. , 1987).競爭性結合測定依賴於標記的標準品與測試樣品分析物競爭結合有限量的抗體的能力。測試樣品中的Αβ肽的量與結合至抗體的標準品的量成反比。為了便於測定結合的標準品的量，抗體在競爭之前或之後一般是不溶的，從而結合至抗體的標準品和分析物可以方便地與保持未結合的標準品和分析物分離。為了分析人中的Αβ (1-40)濃度，可以使用所有以下體液血液、腦脊液(CSF)、 尿、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑液、房水、淚液、膽汁、胰分泌物。新方法由本發明者利用血液樣品建立(參見本發明的實施例)。然而本發明不應當理解為僅限於血液樣品。利用CSF、腦提取物和尿樣品，以及所有其他人體液，例如上文所提到的，也可以相同方式採用所述方法。特別優選血漿樣品。為了進行免疫組織化學分析，組織樣品可以是新鮮或冷凍的，或者可以包埋在石蠟中並用諸如福馬林的防腐劑固定。在步驟iv)中，本發明的方法並不限於夾心ELISA作為定量方法。本發明的方法還涵蓋免疫沉澱步驟後用於定量Aβ靶肽，特別是Αβ (1-40)的任何其他方法。用於定量例如Αβ (1-40)的合適的方法是I.澱粉樣蛋白 β 1-40 HTRFHUS (CisBio Bioassays)
該測定原理是基於TR-FRET，這是時間分辨螢光與福斯特共振能量轉移的組合。與通常的夾心ELISA相似，Αβ (1-40)由兩種抗體結合；但是，這裡所述抗體未結合在表面上， 相互作用發生在溶液中。兩種抗體均用螢光團標記。當這兩種螢光團通過生物分子相互作用而在一起時，激發期間供體螢光團捕獲的一部分能量通過FRET轉移至受體螢光團，結果受體螢光團被激發。測量受體螢光團的螢光。測量信號與FRET的量相關，並且因此與溶液中的Αβ (1-40)的量相關。相似地，基於可比的原理，可以使用來自Lilly的AlphascreenTM測定。2.多重測定系統多重測定系統可獲得自幾個製造商，並且在本領域中是公知和廣泛使用的。用於本發明的方法的合適的實例是INNO-BIA血眾A β形式測定(Innogenetics)。這個測定是良好標準化的多參數的基於珠的免疫測定，用於同時定量血漿中的人β澱粉樣蛋白形式 Αβ (1-42)和Αβ (1-40)或者Αβ (Χ-42)和Αβ (Χ-40)，利用χΜΑΡ 技術(xMAP是Luminex Corp.的註冊商標)。這個測定系統能夠平行定量多達100個不同分析物。這種方法的基礎是稱為微球或珠的小球形聚苯乙烯顆粒。與ELISA和蛋白印跡類似，這些珠用作生物化學檢測的固相。 這些珠是顏色編碼的，從而可以區分100種不同珠類別。每種珠類別具有固定化在微球表面上的一種特異性抗體(例如抗Αβ (1-40)) ο如果Αβ (1-40)濃度升高，這類珠會結合更多肽分子。分析物的結合的檢測是通過第二抗A β (1-40)抗體來進行的，所述抗體用發射綠光的另一螢光染料標記。將樣品處理成與FACS分析可比。將微球通過流體聚集來成單數並通過基於雷射的檢測系統分析，這可以在綠色螢光的基礎上定量並通過珠的特定著色來鑑定結合的分析物。因此，可以測定一個樣品中的多種分析物的濃度。3.通過質譜分析法定量-為了定量 Αβ (1-40),還使用 SELDI-T0F 質譜分析法(Simonsen et al.，2007(2))。-利用免疫沉澱和MALDI-T0F質譜分析法定量分析Aβ肽。15N標記的標準A β肽用於校準。(Gelfanova et al. , 2007) 4.蛋白印跡分析2D-凝膠電泳加上蛋白印跡分析可以是定量Αβ肽的合適方法(Sergeant et al.,2003;Casas et al.，2004)。診斷試劑盒便利地，本發明的抗體可以在試劑盒中提供，所述試劑盒即預定量的試劑與進行診斷測定的說明書的包裝組合。當抗體用酶標記時，試劑盒包含酶所需的底物和輔因子 (例如提供可檢測的生色團或螢光團的底物前體)。此外，可以包含其它添加劑，如穩定劑、 緩衝液(例如封閉緩衝液或裂解緩衝液)等。各種試劑的相對量可以廣泛變化以提供充分優化測定靈敏度的試劑溶液的濃度。特別地，試劑可以乾粉，通常是凍乾粉末的形式提供， 其包含溶解時提供具有合適濃度的試劑溶液的賦形劑。本發明的診斷試劑盒特別有利於檢測和診斷澱粉樣蛋白相關疾病和疾病狀況，優選阿爾茨海默病。用途
本發明的方法首次使得可以可靠的方式檢測和定量Αβ肽，特別是Αβ (1-40)，或者其功能性等同物。特別地，本發明提供A β (1-40)作為血漿生物標記，其適合阿爾茨海默病的鑑別診斷，特別是在該疾病的早期。因此，在一實施方案中，本發明涉及使用檢測Αβ靶肽的方法診斷阿爾茨海默病， 特別是阿爾茨海默病的鑑別診斷，特別是在該疾病的早期。優選地，阿爾茨海默病的早期是輕度認知障礙。在另一實施方案中，本發明涉及使用Αβ靶肽診斷阿爾茨海默病，特別是阿爾茨海默病的鑑別診斷，特別是在該疾病的早期。優選地，阿爾茨海默病的早期是輕度認知障礙。特別地，優選用本發明的方法檢測和定量應當用於診斷阿爾茨海默病的Αβ靶肽。在一優選實施方案中，所述Aβ靶肽為Αβ (1-40)或其功能性等同物。本發明通過以下實施例來進一步描述，然而這不應當理解為以任何方式限制本發明；本發明僅通過隨本文附上的權利要求界定其範圍。
實施例I.材料和方法I. I患者和健康對照招募患有臨床診斷的AD的患者和健康對照。在研究前檢查中，通過幾個心理測試 (DemTect、簡易精神狀態測試、畫鍾測試)來測試本研究的所有參與者的神經心理功能。DemTect 測試DemTect量表是對痴呆的簡短篩選測試，其包含五個短的分測試(10個單詞列表重複、數字變換編碼、語義詞語流暢性任務、倒背數字廣度、延遲的單詞列表回憶)(Kessler et al.，2000)。將原始分數轉化以給出不依賴於年齡和教育的分數，分類為「疑似痴呆」(分 K 8)、「輕度認知障礙」(分數9-12)和「適合年齡」(分數13-18)。MMSE簡易精神狀態檢查(MMSE)或Folstein測試是用來評價認知的簡短的30分問卷測試。其通常用於醫學以篩選痴呆。在約10分鐘的時間跨度中，其對各種功能採樣，包括算術、記憶和方向。其由Folstein et al.，1975引入，並且廣泛使用，具有小的修改。麗SE包括許多領域的簡單問題和難題測試的時間和地點、重複單詞的列表、算術、語言使用和理解、以及基本運動技能。例如，一個問題是要求複製兩個五邊形的圖(參見表I)。27分(30分中)以上的任何分數是有效正常的。低於該分數，20-26分表示輕度痴呆；10-19分中度痴呆,而低於10分嚴重痴呆。正常值還針對教育程度和年齡進行修正。 低至非常低的分數與痴呆的存在密切相關，儘管其他精神病症也可以導致MMST測試上的異常發現。畫鍾測試時鐘評分是基於Shulmann et al.，1986所用的量表的修改。所有圓是預先繪製的，並且給對象的指令是「設置時間11點10分」。評分系統(參見表2)範圍為I分-6分， 較高的分數反映更大量的錯誤和更多障礙。這個評分系統源於經驗並且在臨床實踐的基礎上進行修改。必要地，其留給單獨的判斷相當大的空間，但是其足夠簡單以具有高水平的評分者間可信度。我們的研究適合分析三個主要組分。這些包括畫鍾測試與認知功能的其他度量的橫向比較；畫鍾測試隨時間的縱向描述，以及畫鍾測試的惡化與制度化的決定之間的關係。表I :典型的簡易精神狀態檢查
權利要求
1.一種檢測生物學樣品中的Αβ靶肽的方法，所述方法包括以下步驟i)使生物學樣品與至少兩種不同的捕獲抗體接觸，ii)檢測所得的免疫複合物，iii)破壞所述免疫複合物，以及iv)定量所捕獲的Aβ肽。
2.權利要求I的方法，其中在存在內部標準樣品的條件下進行所述方法。
3.權利要求I或2的方法，其中所述內部標準樣品選自血漿樣品、腦脊液樣品、尿樣品、 淋巴樣品、唾液樣品、汗液樣品、胸膜液樣品、滑液樣品、房水樣品、淚液樣品、膽汁樣品、胰分泌物樣品。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述內部標準樣品為內部標準血漿樣品(ITS)。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述方法包括將生物學樣品的Aβ靶肽濃度以內部標準樣品中測定的相應Αβ靶肽的濃度進行標準化的另一步驟，獲得每個生物學樣品的相對Αβ靶肽水平，所述Aβ靶肽濃度如Aβ (1-40)或Αβ (1-42)濃度。
6.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述Αβ靶肽為Αβ(1-40)，包括其功能性等同物。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述Αβ靶肽為SEQID Ν0:1的Αβ (1_40)，包括其功能性等同物。
8.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述Aβ靶肽為Αβ (1-42)，包括其功能性等同物。
9.權利要求1-5或8中任一項的方法，其中所述Aβ靶肽為SEQ ID NO: 2的A β (2-42), 包括其功能性等同物。
10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述生物學樣品選自血液、血清、尿、腦脊液 (CSF)、血漿、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑液、淚液、膽汁和胰分泌物。
11 ·前述權利要求中任一項的方法，其中所述生物學樣品為血漿。
12.前述權利要求中任一項的方法，其中所述至少兩種不同的捕獲抗體各自對所述 Αβ靶肽上的不同表位具有特異性。
13.前述權利要求中任一項的方法，其中所述捕獲抗體選自 3D6，表位1-5,pAb-EL16，表位1-7,2H4，表位1-8,IElI，表位1-8,·20.1，表位1-10，兔抗Αβ多克隆抗體，表位1-14(Abeam),AB10，表位1-16,82E1，表位1-16, pAbl-42，表位1-11,NAB228，表位1-11，DE2，表位1-16,DE2B4，表位1-17,.6E10，表位1-17,.10D5，表位3-7，W0-2，表位4-10，.1A3，表位 5-9， pAb-EL21，表位 5-11，.310-03，表位 5-16，雞抗人Αβ多克隆抗體，表位12-28 (Abeam)，.雞抗人A β多克隆抗體，表位25-35 (Abcam)，兔抗人Αβ多克隆抗體，表位Ν端(ABR)，兔抗人Αβ多克隆抗體(Anaspec),.12C3，表位 10-16，.16C9，表位 10-16，.19Β8，表位 9-10， pAb-EL26，表位11-26，BAM90. 1，表位13-28,兔抗澱粉樣蛋白(pan)多克隆抗體，表位15-30 (MBL)，.22D12，表位:18-21,.266，表位16-24， pAb-EL17 ;表位15-24，.4G8，表位17-24，兔抗Αβ多克隆抗體，表位22-35 (Abeam)G2-10 ;表位:31-40,兔抗 A β , aa 32-40 多克隆抗體(GenScript Corporation)，EP1876Y，表位x-40，G2-11，表位:33-42,.16C11，表位:33-42,.21F12，表位:34-42,.1A10，表位:35-40,以及D-17山羊抗Αβ抗體，表位C端。
14.前述權利要求中任一項的方法，其中所述捕獲抗體選自3D6、BAN50、82E1、6E10、 W0-2、266、BAM90. 1、4G8、G2-10、1A10、BA27、11A5-B10、12F4 以及 21F12。
15.前述權利要求中任一項的方法，其中將以下抗體對用作捕獲抗體.4G8 和 11A5-B10,.3D6 和 4G8,.6E10 和 4G8,.82E1 和 4G8,.4G8 和 12F4,.4G8 和 21F12,.3D6 和 21F12,6E10 和 21F12,BAN50 和 4G8，3D6 和 11A5-B10,3D6 和 1A10,3D6 和 BA27,6E10 和 11A5-B10,6E10 和 1A10,6E10 和 BA27,4G8 和 11A5-B10,4G8 和 IAlO，4G8 和 BA27,4G8和12F4,以及 4G8 和 21F12。
16.前述權利要求中任一項的方法，其中通過使用與各捕獲抗體特異性反應的二抗來檢測所述複合物。
17.前述權利要求中任一項的方法，其中所述二抗為抗小鼠抗體或抗兔抗體。
18.權利要求16或17的方法，其中所述二抗是標記的。
19.前述權利要求中任一項的方法，其中所述二抗固定化在磁珠上。
20.前述權利要求中任一項的方法，其中利用磁性分離器將攜帶所述免疫複合物的所述磁珠從所述生物學樣品分離。
21.前述權利要求中任一項的方法，其中在存在50%(v/v)甲醇/0.5%(v/v)甲酸的條件下破壞所述免疫複合物。
22.前述權利要求中任一項的方法，其中定量所檢測的免疫複合物。
23.前述權利要求中任一項的方法，其中通過選自夾心ELISA、澱粉樣蛋白 β1-40 HTRF1、定、Alph ascreen 測定、多重測定系統、質譜分析法和蛋白印跡分析的定量方法定量所捕獲的Aβ肽。
24.前述權利要求中任一項的方法，其中通過夾心ELISA的定量方法定量所捕獲的Aβ肽。
25.權利要求24的方法，其中所述夾心ELISA包括對Aβ (1-40)的完整N端具有特異性的一抗；以及對A β (1-40)在胺基酸40結束的C端具有特異性的檢測抗體。
26.權利要求24的方法，其中所述夾心ELISA包括對Aβ (1-42)的完整N端具有特異性的一抗；以及對A β (1-42)在胺基酸42結束的C端具有特異性的檢測抗體。
27.權利要求24的方法，其中所述夾心ELISA包括對Aβ (1-40)的C端具有特異性的一抗；以及對A β (1-40)以Asp-Ala-Glu開始的完整N端具有特異性的檢測抗體。
28.權利要求24的方法，其中所述夾心ELISA包括對Aβ (1-42)的C端具有特異性的一抗；以及對A β (1-42)以Asp-Ala-Glu開始的完整N端具有特異性的檢測抗體。
29.權利要求25-28中任一項的方法，其中所述一抗是固定化的。
30.權利要求25-28中任一項的方法，其中所述檢測抗體是標記的。
31.權利要求24的方法，其中使用用於定量Αβ(1-40)的ELISA試劑盒。
32.權利要求31的方法，其中所述ELISA試劑盒選自澱粉樣蛋白-β(1-40) (N) ELISAdBL, JP27714) ；Αβ [1-40]人 ELISA 試劑盒(Invitrogen);人澱粉樣蛋白 β (澱粉樣蛋白-β )，aa 1-40ELISA試劑盒(Wako ChemicalsUSA, Inc.);以及澱粉樣蛋白 β 1-40ELISA 試劑盒(The Genetics Company)。
33.權利要求24的方法，其中使用用於定量Αβ(1-42)的ELISA試劑盒。
34.權利要求33的方法，其中所述ELISA試劑盒選自澱粉樣蛋白-β(1-42) (N) ELISAdBL, JP27712) ；Αβ [1-42]人 ELISA試劑盒(Invitrogen)、人澱粉樣蛋白 β (澱粉樣蛋白-3)，aa 1-42ELISA 試劑盒(Wako ChemicalsUSA, Inc.)、澱粉樣蛋白 i3 1_40ELISA 試劑盒(The Genetics Company)、INNOTEST β-澱粉樣蛋白(1-42) (Innogenetics)。
35.前述權利要求中任一項的方法，其中進行一個或多個心理測試以表徵作為所述生物學樣品的供體的個體的神經變性疾病狀態。
36.前述權利要求中任一項的方法，其中所述心理測試選自DemTect測試、簡易精神狀態測試、畫鍾測試、ADAS-Cog, Blessed 測試、CANTAB、Cognistat, NPI、BEHAVE-AD、CERAD, CSDD、⑶S以及7分鐘篩選量表。
37.前述權利要求中任一項的檢測Aβ靶肽的方法用於診斷阿爾茨海默病的用途。
38.權利要求37的用途，用於阿爾茨海默病的鑑別診斷。
39.權利要求37或38的用途，用於阿爾茨海默病的早期診斷。
40.權利要求38或39的用途，用於輕度認知障礙的診斷。
41.一種用於診斷阿爾茨海默病的體外方法，其中使用權利要求1-36中任一項所述的用於檢測A β靶肽的方法。
42.Aβ靶肽在診斷阿爾茨海默病中的用途。
43.權利要求42的用途，用於阿爾茨海默病的鑑別診斷。
44.權利要求40或41的用途，用於阿爾茨海默病的早期診斷。
45.權利要求43或44的用途，用於輕度認知障礙的診斷。
46.權利要求37-45中任一項的方法，其中所述Αβ靶肽為Αβ(1_40)，包括其功能性等同物。
全文摘要
本發明涉及一種檢測Aβ肽，特別是血漿中的Aβ肽的新方法，並且涉及Aβ肽在診斷阿爾茨海默病中的用途。
文檔編號G01N33/68GK102612653SQ201080052274
公開日2012年7月25日 申請日期2010年9月17日 優先權日2009年9月18日
發明者C·格特利希, H-U·德穆特, M·克蘭施米特 申請人:前體生物藥物股份公司