一種對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸及其製備和應用的製作方法

2023-12-05 11:04:01

專利名稱：一種對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸及其製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學，具體的說是一種水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸及其製備和應用。
背景技術：
隨著捕撈資源的急劇衰減，海水養殖已成為國際社會為滿足人類日益增長的蛋白質需求普遍採納的主要舉措。根據世界糧農組織(FAO)數據，自2000年以來水產品的增長主要來自海水養殖。近年來，我國的海水養殖業取得了長足發展，一躍進入世界先進行列。 按2007我國漁業統計年鑑資料顯示，2007年我國水產品總產量4747. 52萬噸，養殖產量 3278. 33萬噸，佔總產量的69%。海水養殖業已成為我國國民經濟的重要組成部分，是促進農村經濟發展、調整農業產業結構、增加農民就業和收入的有效途徑之一，對建設和諧社會具有重要作用。然而海水養殖業多年來集約式、工廠化的快速發展，引起養殖環境不斷惡化，多種養殖品種的病害頻繁發生。目前常見病害就有300種以上，涉及的病原種類超過200多種， 導致每年約有1/10的養殖面積受到病害侵襲，年損失產量佔養殖總產量的15% 30%，直接經濟損失上百億元，並且呈上升趨勢。病害頻繁發生以及控制難度的增加已經嚴重影響到農民養殖的積極性。由於安全有效的生物漁藥的嚴重匱乏以及利益驅動，在養殖中普遍存在大量使用化學消毒劑、抗生素、不安全添加劑等不良問題，結果形成了比較嚴重的藥物殘留的問題，影響水產品質量的安全，對消費者的健康構成了直接威脅，嚴重影響到水產品的對外貿易和我國的國際形象。同時還造成了病原微生物耐藥性增強及養殖環境惡化。病害已成為當前水產養殖業最為突出和亟待解決的問題，如有關的科學問題不能得到有效的解決，不僅海水養殖業持續發展受到阻礙，而且將直接威脅到現有產業的生存。為控制病害的頻發，新型生物漁藥和飼料添加劑的開發顯得至關重要。在此方面， 研究的主要進展集中於魚類等的高效疫苗的研製和開發上。疫苗的廣泛使用，有效地抵抗了多種重要水產病原的感染，大大減少了抗菌素等藥物在養殖魚類方面的使用量。挪威、美國、加拿大、荷蘭等國魚用疫苗產業化程度高、市場成熟，培育出眾多從事魚用疫苗開發的跨國公司，如Alpharma、Aqua Health、htervet、Bayotek等。然而蝦蟹類無脊椎動物因缺少獲得性免疫體統，疫苗是無法應用於這些動物的病害防治，其漁藥的製備主要利用生物活體或生物代謝過程中產生的具有生物活性的物質或從生物體提取的物質作為防治水產動物病害的藥物。雖然目前通過基因工程、發酵工程、生化製備工程技術等手段，在一些微生態環境改良劑(光合細菌、消化菌、放線菌及其它生物活性劑等)、免疫促進劑(肽聚糖、 葡聚糖、多肽等)、抗微生物製劑(幹擾素、抗菌肽、凝集素、抗病毒肽、溶菌酶等)、生物防治劑(病毒製劑、噬菌體製劑、微生物製劑等)等的研製方面顯示出廣闊的應用前景。但整體而言，針對海洋無脊椎動物病害控制的有效藥物或飼料添加劑的研究進展仍十分緩慢。

發明內容
本發目的在於提供一種對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸及其製備和應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為—種對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸特異的免疫增強活性的CpG 寡聚核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列。對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸的製備方法將人工設計合成的CpG寡聚核苷酸序列與pUC57質粒相連，而後轉化入大腸桿菌DH5 α菌株中，37 °C， 200-220rpm震蕩培養4- ;將上述菌液按1 100的體積比接種與發酵培養基中，發酵培養7-9h ；收集富含CpG寡聚核苷酸的發酵培養物於STET緩衝液中懸浮菌體並震蕩攪拌，而後在每毫升菌體重懸液中加入80-100 μ g攪拌均勻於36. 5-37. 5°C中水浴20-30min，隨後將裂解液於沸水浴中加熱10-15min，沸水加熱後冷卻至室溫，離心取上清；將上清加入到上清液0.6倍體積的預冷的異丙醇中，室溫下沉降離心沉澱，即得具有序列表SEQ ID NO. 1 所示的鹼基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs。所述發酵培養基的組成成分5g/L胰化蛋白腖，5g/L酵母提取物，4g/L KH2PO4, 4g/L K2HPO4, 7g/L Na2HPO4,1. 2g/L (NH4) 2S04,0. 2g/LNH4Cl，加氨苄青黴素至 50 μ g/ml ；發酵過程中的補加培養基成分:71g/L酵母提取物，71g/L蛋白腖，170g/L甘油，5. 7g/L MgSO4 ；所述STET 緩衝液成分80g/L 蔗糖，2. 0 % ( Φ) TritonX-100,100mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-Cl, ρΗ8· 5。水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸的應用所述序列表SEQ IDN0. 1所示的鹼基序列CpG寡聚核苷酸可作為水產養殖飼料的添加劑或免疫增強劑。將上述序列表 SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列CpG寡聚核苷酸加入到飼料中，每千克飼料中添加IO-IOOmg 上述序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列的CpG ODNs寡聚核苷酸。本發明所具有的優點1.從生產效率上講，本發明利用生物工程發酵的技術來大量擴增目的基序，比實驗室條件下更省時省力，效率也更高，便於工業化推廣；並且本發明的核酸大量提取實驗， 費時少，一次至少可提取十升發酵產物，只需約4. 5h ；2.從人力資源成本上講，本發明涉及的核酸大量提取實驗，技術簡單，非專業人員也可進行操作，節約人力成本，便於工業化推廣；3.從涉及的藥品和儀器上講，本發明涉及的核酸大量提取實驗所需要的試劑、儀器和相關設備等均為常規儀器，購買方便。4.本發明CpG寡聚核苷酸(CpG ODNs)，可增強水產養殖動物的固有免疫反應，從而達到抵禦病害的目的，並且本發明的核苷酸產物使用簡單，不用經過其他任何處理，即可直接添加入水產養殖的飼料中。


圖1為本發明異丙醇沉澱前後核酸溶液的紫外掃描圖(波長220nm-350nm)，其中 A為裂解上清液；B為異丙醇沉降後的上清液；圖2.異丙醇沉降前後對比，其中泳道1為空白對照；泳道2為異丙醇沉降後的上清液；泳道3為異丙醇沉降後的重懸液；泳道4為粗裂解液；M為λ -Hind III digest DNA Marker0
具體實施例方式下面的實驗例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限於此。實驗例1對蝦、蟹等水產養殖動物具有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸如序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列。SEQ ID NO. 1ACCGATGTCGTTGCCGGTGAGGGGGACGATCGTCGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTCCATGACGTCCCTGATGCTCTCGAGGA(a)序列特徵 長度116bp 類型DNA 鏈型雙鏈(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源人工合成(f)特異性名稱gene實施例21、富含CpG寡聚核苷酸序列(CpG ODNs)的質粒構建和轉化設計五段具有CpG特徵的基序，將其首尾相連人工合成(上海生工)，即得一段富含CpG寡聚核苷酸的序列(CpG-ODN)，將合成的CpG-ODN與pUC57質粒(上海生工)相連。隨後將重組質粒導入大腸桿菌DH5 α菌株中，具體步驟如下所述。重組質粒和大腸桿菌DH5 α感受態細胞分別預冷30min後，將5 μ L質粒加入到感受態細胞中，在42°C中準確熱激90s，迅速置於冰上anin。隨後加入200 μ L LB液體培養基，37°C，200rpm,培養45min。 取80 μ L塗布於含有50μ g/ml氨苄青黴素的平板上，37°C培養約12h。隨機挑取數個單克隆菌落於含有50 μ g/ml氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C，200rpm，培養約4H將上述挑取的單克隆培養物利用載體引物 (M13F (-21)5 『 TGTAAAACGACGGCCAGT3 『和 M13R 5 『 CAGGAAACAGCTATGAC3 『)進行菌落 PCR,篩選陽性克隆，測序驗證CpG ODNs序列。2、CpG寡聚核苷酸序列(CpG ODNs)的大量製備利用生物工程技術即大規模發酵的方法對重組質粒轉化的大腸桿菌菌株DH5 α 進行擴增。取上述適量菌體接種於IL含有50 μ g/ml氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C， 200rpm培養過夜。隨後，將其加入到已加入發酵培養基的發酵罐中發酵。單次發酵總體積約為10L，發酵時間控制在他左右，發酵時溶氧量在30%以上，pH控制在7. 0左右，溫度為 37 °C。發酵培養基的組成成分5g/L胰化蛋白腖，5g/L酵母提取物，4g/LKH2P04，4g/LK2HPO4, 7g/L Na2HPO4,1. 2g/L (NH4)2 SO4,0. 2g/L NH4Cl,加氨苄青黴素至 50 μ g/ml ；發酵過程中補加培養基成分71g/L酵母提取物，71g/L蛋白腖，170g/L甘油，5. 7g/L MgS04。3、CpG寡聚核苷酸序列(CpG ODNs)的分離提純收集發酵產物後，利用適量修飾的STET緩衝液懸浮菌體，置於磁力攪拌儀上 IOOOrpm, 30mino向菌體重懸液中加入新鮮配製的溶菌酶，保證其終濃度為100μ g/mL，攪拌均勻後於37°C中水浴20-30min。隨後將裂解液沸水浴中加熱約15min，迅速置於冰上冷卻至室溫。12，OOOg離心30min，取上清。將上清加入到0. 6倍體積的預冷的異丙醇中，混勻後室溫下沉降20min。12，00(^離心15!^11。棄掉上清，無菌水溶解沉澱。冷凍乾燥，濃縮即得具有序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs的提取物。修飾的STET 緩衝液成分80g/L 蔗糖，2. 0% ( Φ) TritonX-100,1 OOmmo 1/L EDTA, 50mmol/L Tris-Cl, ρΗ8· 5。實施例3將上述實施例2所得具有序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs的提取物(CpG ODNs)作為添加劑添加到凡納濱對蝦飼料(飼料成分參見表1)中，將經過^d的養殖，每千克飼料中添加40mg上述序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs時，明顯促進對蝦的生長，具體情況簡表2的添加組的相對增長率和增重率均高於基礎飼料組，增長率比基礎飼料組高9. 7 %，增重率比基礎飼料高19. 4%。表1凡納濱對蝦基礎飼料組成
權利要求
1.一種對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸，其特徵在於對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列。
2.一種按權利要求1所述的對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸的製備方法，其特徵在於將人工設計合成的CpG寡聚核苷酸序列與PUC57質粒相連，而後轉化入大腸桿菌DH5a菌株中，37°C，200-220rpm震蕩培養4- ；將上述菌液按1 100的體積比接種與發酵培養基中，發酵培養7-9h ；收集富含CpG寡聚核苷酸的發酵培養物於STET 緩衝液中懸浮菌體並震蕩攪拌，而後在每毫升菌體重懸液中加入80-100 μ g攪拌均勻於 36. 5-37. 50C中水浴20-30min，隨後將裂解液於沸水浴中加熱10-15min，沸水加熱後冷卻至室溫，離心取上清；將上清加入到上清液0. 6倍體積的預冷的異丙醇中，室溫下沉降離心沉澱，即得具有序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs。
3.按權利要求2所述的對水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸的製備方法，其特徵在於所述發酵培養基的組成成分5g/L胰化蛋白腖，5g/L酵母提取物，4g/L KH2PO4, 4g/L K2HPO4, 7g/L Na2HPO4,1. 2g/L (NH4) 2S04，0. 2g/L NH4Cl，加氨苄青黴素至 50 μ g/ml ； 發酵過程中的補加培養基成分71g/L酵母提取物，71g/L蛋白腖，170g/L甘油，5. 7g/L MgSO4 ；所述 STET緩衝液成分80g/L蔗糖，2. 0% ( Φ) TritonX-100,100mmol/L EDTA,50mmol/ L Tris-Cl, ρΗ8· 5。
4.一種按權利要求1所述的水產動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸的應用，其特徵在於所述序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列CpG寡聚核苷酸可作為水產養殖飼料的添加劑或免疫增強劑。
5.按權利要求4所述的具有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸的應用，其特徵在於將上述序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列CpG寡聚核苷酸加入到飼料中，每千克飼料中添加IO-IOOmg上述序列表SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列的CpG ODNs寡聚核苷酸。
全文摘要
本發明涉及分子生物學，具體的說是一種對蝦、蟹等水產養殖動物有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸及其製備和應用。具有免疫增強活性的CpG寡聚核苷酸具有序列表SEQ ID NO.1所示的鹼基序列。將富含CpG寡聚核苷酸序列的質粒轉化到大腸桿菌DH5α菌株中，隨後進行發酵。收集發酵產物，採用異丙醇沉降法進行CpG ODNs的分離純化。應用所述序列表SEQ IDNO.1所示的鹼基序列CpG寡聚核苷酸可應用於水產養殖飼料添加劑或免疫增強劑，如每千克飼料中添加10-100mg上述CpG寡聚核苷酸可明顯促進養殖動物的生長。本發明利用生物工程發酵的技術和簡化的提取方法來大量擴增和提取CpG寡聚核苷酸，比實驗室條件下更省時省力，效率也更高，便於工業化推廣。
文檔編號C12N15/10GK102399784SQ20101028022
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月10日 優先權日2010年9月10日
發明者孫瑞, 宋林生, 嶽峰, 張峘, 張瑩, 王玲玲, 邱麗梅 申請人:中國科學院海洋研究所