一種從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法
2023-12-05 15:51:11 2
專利名稱：一種從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法
技術領域：
本發明涉及植物有效成分提取技術，尤其涉及一種從雷公藤葉子中分離雷公 藤內酯醇的方法。
背景技術：
雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook.f，簡稱TWHF)是衛矛科(Celastraceae) 雷公藤屬木質藤本植物，是雷公藤(Tripterygium)屬植物的一種，主要分布於我 國長江以南地區和東北長白山區。雷公藤作為一種傳統的中藥(traditional Chinesemedicine,TCM)在中國有數百年的應用歷史，最早記錄於《神農本草經》， 名莽草，在《綱目拾遺》中有詳細記載，又稱斷腸草、山砒霜、南蛇藤，由於 毒性大，民間也有用於殺蟲、毒鼠等。作為藥物，雷公藤的主要藥理作用是免 疫系統作用、抗炎、抗生育作用。雷公藤提取物在治療風溼性關節炎，牛皮癬， 紅斑狼瘡等顯示出了良好的效果。
雷公藤中的藥效成分主要是雷公藤二萜內酯、雷公藤三萜類、雷公藤生物 鹼等，其中屬於二萜內酯的雷公藤內酯醇(Triptolide)，又稱雷公藤甲素，被認為 是最主要的生理活性成分，因此從雷公藤中提純雷公藤內酯醇具有重要的價值。 1972年Kupchan等(Kupchan SM et al.，J.Am.Chem.Soc.l972.94(20)7194-7195) 首次用乙醇提取，乙酸乙酯一水體系分配，再用反覆柱層析的方法從雷公藤中 分離出了具有免疫哮性的雷公藤內酯醇、雷公藤內酯二醇和雷公藤內酯酮。其 它提純雷公藤內酯醇的方法有採用溶劑梯度萃取(Lipsky PE et al.,US Patent 5294443,1996)，有乙醇提取後的浸膏分別用氯仿(Ren K et al., US Patent 2004018260， 2004) 、 二氯甲烷(Wiedmann TWT et al. ， Patent WO 9513082， 1995) 和水分配的，再通過多步的柱層析過程得到雷公藤內酯醇純品。綜上，目前提 純雷公藤內酯醇方法是雷公藤提取物經過多次反覆柱層析。由於柱層析的不可 逆吸附導致雷公藤內酯醇的得率較低。
高速逆流色譜是(high-speed countercurrent chromatography,HSCCC)是20 世紀80年代發展起來的一種連續高效的液一液分配色譜分離技術(Ito Y，Joumal
4of chromatography A，2005.1065(2):145-468)。高速逆流色譜與柱色譜(CC)相比， 不存在固體支撐，避免了不可逆吸附，從而避免了樣品損失、失活、變性，分 離時間短，節省溶劑；與製備高效液相色譜(PHPLC)相比，樣品可以直接進 樣，沒有純度要求，而且樣品可以全部回收，上樣量大，重複性好，設備操作 方便簡單。通過以上對高速逆流色譜的了解，高速逆流色譜適用於植物有效成 分的提取，特別是適用於植物提取的最後精製純化步驟。本發明的最後精製過 程使用了高速逆流色譜分離技術。
本發明從雷公藤內酯醇的溶解特性(雷公藤內酯醇易溶於乙酸乙酯、乙醇 、甲醇，難溶於石油醚，基本不溶於水)出發，用幾種對環境影響較小的常用 溶劑，通過乙醇提取，乙酸乙酯-水體系和石油醚-甲醇體系分配，儘可能地減少 了提取過程中雷公藤內酯醇的損失，同時減少了柱層析的上樣量降低了成本， 通過一次簡單柱層析，得到雷公藤內酯醇粗品。為了減少高速逆流色譜的上樣 量，提高生產效率，將雷公藤內酯醇粗品用高速逆流色譜常用的四元兩相溶劑 體系進行分配，能夠有效地除去一些雜質，富集雷公藤內酯醇。最後通過高速 逆流色譜(HSCCC)精製得到純度95%左右的雷公藤內酯醇，相對幹葉子的得 率在0.008%以上。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種從雷公藤葉中分離雷公 藤內酯醇的方法。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的 一種從雷公藤葉中分離雷公 藤內酯醇的方法，包括以下步驟
(1) 將雷公藤葉子磨成粉末，過篩，用乙醇回流提取2~4次，每次提取時間1~3
小時，每次每克雷公藤葉粉末用4-6毫升乙醇，然後合併提取液，蒸乾乙 醇得到乙醇提取物；
(2) 乙醇提取物用乙酸乙酯和水攪拌溶解並過濾，每克乙醇提取物需加入飽和 了水的乙酸乙酯5-20毫升，加入飽和了乙酸乙酯的水5-20毫升，濾液分層 12-24小時，分液，上相蒸乾得到乙酸乙酯萃取物；
(3) 乙酸乙酯萃取物用60-9CTC石油醚和甲醇溶解，每克乙酸乙酯萃取物需加 入飽和了 60-9(TC石油醚的甲醇5-20毫升，加入飽和了甲醇的石油醚5-20 毫升，濾液分層1-10小時，分液，下相蒸乾得到甲醇萃取物；
(4) 甲醇萃取物上矽膠柱層析，每克甲醇萃取物吸附在一克矽膠上，每克甲醇 萃取物需矽膠填料50 100克，需用體積比為1 : 0.8 1.2的正己垸和乙酸乙酯的混合物250 500毫升洗脫，洗脫液濃縮蒸乾得到雷公藤內酯醇粗 p
(5) 雷公藤內酯醇粗品用正己垸 乙酸乙酯 乙醇 水所構成的四元兩相體 系分配，所述正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水體積比為7 10 : 2 4 : 4 6
:4 6，分液，下相蒸乾得到四元分配物； '
(6) 四元分配物上高速逆流色譜進行精製，所用的溶劑體系為正己烷 乙酸乙 酯 乙醇 水，所述正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水的體積比為3 5 : 4 6
:3 5:4 6，置於分液漏鬥中，搖勻、靜置分層，平衡後，將上、下相 分開。用上相作固定相，下相作流動相，用上相充滿整個高速逆流色譜中 色譜柱，調整高速逆流色譜主機正轉，將下相從柱子的首端泵入柱內進行 洗脫，待整個體系建立動態平衡後由進樣閥進樣；或者下相作為固定相， 上相作流動相，用下相充滿整個高速逆流色譜中色譜柱，調整高速逆流色 譜主機正轉，將上相從柱子的尾端泵入柱內進行洗脫；待整個體系建立動 態平衡後，由進樣閥進樣；根據檢測器的譜圖分步收集目標物，減壓濃縮 得到雷公藤內酯醇精品。 本發明的有益效果是通過乙酸乙酯-水和石油醚-甲醇體系的分配，儘可能 多地保留了雷公藤內酯醇，同時有效減少了柱層析步驟的上樣量；用正己烷(或 者環己垸或者正庚垸或者60-9(TC的石油醚) 乙酸乙酯 乙醇(或者甲醇) 水構成的四元兩相體系對該粗品進行分配，有效減少了高速逆流色譜步驟的上 樣量；此外本方法所涉及的溶劑不含對環境影響較大的氯代溶劑，相對環保。
具體實施例方式
本發明從雷公藤內酯醇的溶解特性(雷公藤內酯醇易溶於乙酸乙酯、乙醇 、甲醇，難溶於石油醚，基本不溶於水)出發，用幾種對環境影響較小的常用 溶劑，通過乙醇提取，乙酸乙酯-水體系和石油醚-甲醇體系分配，儘可能地減少 了提取過程中雷公藤內酯醇的損失，同時減少了柱層析的上樣量降低了成本， 通過一次簡單柱層析，得到雷公藤內酯醇粗品。
為了減少高速逆流色譜的上樣量，提高生產效率，將雷公藤內酯醇粗品用 高速逆流色譜常用的四元兩相溶劑體系進行分配，能夠有效地除去一些雜質， 富集雷公藤內酯醇。最後通過高速逆流色譜(HSCCC)精製得到純度95%左右 的雷公藤內酯醇，相對幹葉子的得率在0.008%以上。
本發明從雷公藤葉子中分離純化雷公藤內酯醇的方法，包括以下步驟1、 將乾燥的雷公藤葉子磨成粉末，過40-200目篩，用乙醇回流(60-7(TC)提 取2 4次，每次提取時間為1~3小時，每次每克雷公藤葉粉末用4-6毫升乙醇， 然後合併提取液，蒸乾乙醇得到乙醇提取物。
2、 乙醇提取物用乙酸乙酯和水攪拌溶解並過濾，每克乙醇提取物需加入飽和了 水的乙酸乙酯5-20毫升,加入飽和了乙酸乙酯的水5-20毫升，濾液分層12-24小 時，分液，上相蒸乾得到乙酸乙酯萃取物；
3、 乙酸乙酯萃取物用60-9(TC石油醚(或者正己垸或者正庚烷)和甲醇溶解， 每克乙酸乙酯萃取物需加入飽和了 60-9(TC石油醚的甲醇5-20毫升,加入飽和了 甲醇的石油醚5-20毫升，濾液分層1-10小時，分液，下相蒸乾得到甲醇萃取物；
4、 甲醇萃取物上60-100目矽膠柱層析，每克甲醇萃取物吸附在一克矽膠上，每 克甲醇萃取物需矽膠填料50 100克，需用體積比為1 : 0.8-1.2的正己垸(或者 60-9(TC石油醚)和乙酸乙酯的混合物250 500毫升洗脫，洗脫液濃縮蒸乾得到 雷公藤內酯醇粗品；
5、 雷公藤內酯醇粗品用正己烷(或者環己垸或者正庚烷或者60-9(TC的石油 醚) 乙酸乙酯 乙醇(或者甲醇) 水所構成的四元兩相體系分配，其體積 比為7 10 : 2 4 : 4 6 : 4 6，分液，下相蒸乾得到四元分配物；
6、 四元分配物上高速逆流色譜進行精製，所用的溶劑體系為正己垸(或者正庚 烷或者60-90。C的石油醚) 乙酸乙酯 乙醇(或者甲醇) 水，其體積比為3 5 : 4 6 : 3 5 : 4 6，置於分液漏鬥中，搖勻、靜置分層，平衡後，將上、下 相分開。用上相作固定相，下相作流動相，用上相充滿整個高速逆流色譜中色 譜柱，調整高速逆流色譜主機正轉，將下相從柱子的首端泵入柱內進行洗脫， 待整個體系建立動態平衡後由進樣閥進樣；或者下相作為固定相，上相作流動 相，用下相充滿整個高速逆流色譜中色譜柱，調整高速逆流色譜主機正轉，將 上相從柱子的尾端泵入柱內進行洗脫；待整個體系建立動態平衡後，由進樣閥 進樣；根據檢測器的譜圖分步收集目標物，減壓濃縮得到雷公藤內酯醇精品。
高速逆流色譜可以採用上海同田生化公司的TBE1000高速逆流色譜。
下面根據實施例詳細說明本發明，本發明的目的和效果將變得更加明顯。 實施例1
200g乾燥的雷公藤葉子磨成粉末，先用乙醇攪拌回流提取三次，每次提取1 小時，每次乙醇用量為800毫升，合併乙醇提取液，濃縮蒸乾得到乙醇提取物。 將乙醇提取物用250毫升飽和了水的乙酸乙酯和250毫升飽和了乙酸乙酯的水 溶解、過濾、並靜置分層24小時，乙酸乙酯相濃縮蒸乾得到乙酸乙酯萃取物。 將乙酸乙酯萃取物用250毫升飽和了甲醇的石油醚和250毫升飽和了石油醚的甲醇溶解靜置分層IO小時，分液，甲醇相蒸乾得到甲醇萃取物。甲醇萃取物上 矽膠柱層析，用體積比l: 1的正己烷和乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液濃縮蒸 千得雷公藤內酯醇粗品克。雷公藤內酯醇粗品用正己垸-乙酸乙酯-乙醇-水分配
所構成四元兩相體系，其體積比為8:2:5:5 (40毫升:IO毫升:25毫升:25毫 升)，分液，下相蒸乾得到雷公藤內酯醇富集物。雷公藤內酯醇富集物用高速逆 流色譜精製，所用的兩相溶劑體系為正己垸-乙酸乙酯-乙醇-水，其體積比為 4.5: 5: 4.5: 5，上相為固定相下相為流動相，儀器操作條件為轉速500r/min， 流速5mL/min，收集含雷公藤內酯醇部分濃縮蒸乾得到雷公藤內酯醇精品17.3 毫克，經HPLC檢測其純度為98. 7%。
實施例2
200g乾燥的雷公藤葉子磨成粉末，先用乙醇攪拌回流提取三次，每次提取2 小時，每次乙醇用量為1000毫升，合併乙醇提取液，濃縮蒸乾得到乙醇提取物， 將乙醇提取物用500毫升飽和了水的乙酸乙酯和500毫升飽和了乙酸乙酯的水 溶解、過濾、並靜置分層12小時，乙酸乙酯相濃縮蒸乾得到乙酸乙酯萃取物。 將乙酸乙酯萃取物用300毫升飽和了甲醇的石油醚和300毫升飽和了石油醚的 甲醇溶解靜置分層2小時，分液，甲醇相蒸乾得到甲醇萃取物。甲醇萃取物上 矽膠柱層析，用體積比l: 1.2的正己烷和乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液濃縮 蒸乾得雷公藤內酯醇粗品。雷公藤內酯醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水分配 所構成四元兩相體系，其體積比為10 : 3 : 6 : 6 (50毫升:15毫升:30毫升:30毫 升)，分液，下相蒸乾得到雷公藤內酯醇富集物。雷公藤內酯醇富集物用高速逆 流色譜精製，所用的兩相溶劑體系為60-9(TC石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，其體 積比為4: 5: 4: 5，儀器操作條件為轉速500r/min，流速5mL/min，收集含雷公 藤內酯醇部分濃縮蒸乾得到雷公藤內酯醇精品。收集含雷公藤內酯醇部分濃縮 蒸乾得到雷公藤內酯醇精品16. 1毫克，經HPLC檢測其純度為95. 4%。
實施例3
200g乾燥的雷公藤葉子磨成粉末，先用乙醇攪拌回流提取三次，每次提取3 小時，每次乙醇用量為1200毫升，合併乙醇提取液，濃縮蒸乾得到乙醇提取物， 將乙醇提取物用150毫升飽和了水的乙酸乙酯和150毫升飽和了乙酸乙酯的水 溶解、過濾、並靜置分層18小時，乙酸乙酯相濃縮蒸乾得到乙酸乙酯萃取物。 將乙酸乙酯萃取物用150毫升飽和了甲醇的石油醚和150毫升飽和了石油醚的 甲醇溶解靜置分層8小時，分液，甲醇相蒸乾得到甲醇萃取物。甲醇萃取物上矽膠柱層析，用體積比l: 0.8的正己垸和乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液濃縮 蒸乾得雷公藤內酯醇粗品。雷公藤內酯醇粗品用正己垸-乙酸乙酯-乙醇-水分配
所構成四元兩相體系，其體積比為10 : 4 : 4 : 6 (50毫升:20毫升:20毫升:30毫 升)分配，分液，下相蒸乾得到雷公藤內酯醇富集物。雷公藤內酯醇富集物用 高速逆流色譜精製，所用的兩相溶劑體系為正己垸-乙酸乙酯-乙醇-水，其體積 比為3. 5: 5:3. 5: 5，上相為固定相下相為流動相，儀器操作條件為轉速500r/min， 流速5mL/min，收集含雷公藤內酯醇部分濃縮蒸乾得到雷公藤內酯醇精品17.4 毫克，經HPLC檢測其純度為94. 3%。
上述實施例用來解釋說明本發明，而不是對本發明進行限制，在本發明的 精神和權利要求的保護範圍內，對本發明作出的任何修改和改變，都落入本發 明的保護範圍。
權利要求
1、一種從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將雷公藤葉磨成粉末，過篩，用乙醇回流提取2～4次，每次提取時間1～3小時，每次每克雷公藤葉粉末用4-6毫升乙醇，然後合併提取液，蒸乾乙醇得到乙醇提取物。(2)乙醇提取物用乙酸乙酯和水攪拌溶解並過濾，每克乙醇提取物需加入飽和了水的乙酸乙酯5-20毫升，加入飽和了乙酸乙酯的水5-20毫升，濾液分層12-24小時，分液，上相蒸乾得到乙酸乙酯萃取物。(3)乙酸乙酯萃取物用60-90℃石油醚和甲醇溶解，每克乙酸乙酯萃取物需加入飽和了60-90℃石油醚的甲醇5-20毫升，加入飽和了甲醇的石油醚5-20毫升，濾液分層1-10小時，分液，下相蒸乾得到甲醇萃取物。(4)甲醇萃取物上矽膠柱層析，每克甲醇萃取物吸附在一克矽膠上，每克甲醇萃取物需矽膠填料50～100克，需用體積比為1∶0.8～1.2的正己烷和乙酸乙酯的混合物250～500毫升洗脫，洗脫液濃縮蒸乾得到雷公藤內酯醇粗品。(5)雷公藤內酯醇粗品用正己烷～乙酸乙酯～乙醇～水所構成的四元兩相體系分配，所述正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水體積比為7～10∶2～4∶4～6∶4～6，分液，下相蒸乾得到四元分配物。(6)四元分配物上高速逆流色譜進行精製，所用的溶劑體系為正己烷～乙酸乙酯～乙醇～水，所述正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水的體積比為3～5∶4～6∶3～5∶4～6，置於分液漏鬥中，搖勻、靜置分層，平衡後，將上、下相分開。用上相作固定相，下相作流動相，用上相充滿整個高速逆流色譜中色譜柱，調整高速逆流色譜主機正轉，將下相從柱子的首端泵入柱內進行洗脫，待整個體系建立動態平衡後由進樣閥進樣；或者下相作為固定相，上相作流動相，用下相充滿整個高速逆流色譜中色譜柱，調整高速逆流色譜主機正轉，將上相從柱子的尾端泵入柱內進行洗脫；待整個體系建立動態平衡後，由進樣閥進樣；根據檢測器的譜圖分步收集目標物，減壓濃縮得到雷公藤內酯醇精品。
2. 根據權利要求l所述從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法，其特徵在於， 所述步驟(1)中，所述雷公藤葉粉末過40-200目篩。
3. 根據權利要求l所述從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法，其特徵在於， 所述步驟(3)中，所述60-9(TC石油醚用正己烷或正庚烷替換。
4. 根據權利要求1所述從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法，其特徵在於，所述步驟(4)中，所述甲醇萃取物上60-100目矽膠柱層析，所述正己垸用60-90 "C石油醚替換。
5. 根據權利要求1所述從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法，其特徵在於， 所述步驟(5)中，所述正己烷用環己垸、正庚烷或60-9(TC的石油醚替換。
6. 根據權利要求1所述從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法，其特徵在於， 所述步驟(6)中，所述正己烷用正庚烷或60-9(TC的石油醚替換。
全文摘要
本發明公開了一種從雷公藤葉中分離雷公藤內酯醇的方法，雷公藤葉粉末通過乙醇提取，乙醇提取物先用乙酸乙酯—水體系分配，上相蒸乾得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物再用石油醚—甲醇體系分配，下相蒸乾得到甲醇萃取物，通過以上兩次分配減少了柱層析步驟的上樣量。經過簡單柱層析，蒸乾洗脫劑得到雷公藤內酯醇粗品，用四元兩相體系對該粗品進行分配，除去色素等雜質，減少了高速逆流色譜步驟的上樣量，最後通過高速逆流色譜精製得到了雷公藤內酯醇精品，其純度在95％左右，相對幹葉子得率在0.008％以上。本方法所涉及到的溶劑不含對環境和人體損害較大的氯代溶劑。
文檔編號C07J73/00GK101445545SQ200810164190
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月29日 優先權日2008年12月29日
發明者何潮洪, 明 劉, 徐亞蘭, 劍 沈 申請人:浙江大學