用於hsv-2的疫苗的製作方法

2023-12-02 18:57:46 2

用於hsv-2的疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明提供了重組HSV-2蛋白和諸如佐劑等先天免疫系統激動劑的組合物作為疫苗。蛋白質包括包膜糖蛋白和不同於包膜糖蛋白的結構蛋白，例如衣殼蛋白或被膜蛋白。所述疫苗是用於HSV-2血清陽性或血清陰性受試者。
【專利說明】用於HSV-2的疫苗
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請根據35U.S.C. § 119(e)要求美國臨時專利申請號61/647,764(2012年5 月16日提交）、61/679, 387 (2012年8月3日提交）以及61/714,158 (2012年10月15日 提交）的權益，所有這些臨時專利申請以全文引用的方式併入本文中。
[0003] 參考序列表
[0004] 本專利申請的序列表單獨以文件名"47733_SeqListing. txt"提供。此文件（其 形成於2013年5月16日，並且由45,969位元組組成）的內容以其全文併入。

【技術領域】
[0005] 用於單純皰疹病毒_2感染的疫苗以及相關方法和組合物。

【背景技術】
[0006] HSV-2 (單純皰疹病毒-2)是皰疹病毒科的一個成員，皰疹病毒科是一組DNA病 毒，其往往引起皮膚損害（例如水痘和熱病性皰疹）並且特徵在於潛伏性和復發性感染。 HSV-2是生殖器潰瘍的主要原因，生殖器潰瘍可表現為充滿流體的小水泡的群集，所述充滿 流體的小水泡破裂並且形成含人痛苦的瘡，需要數周來治癒。其它症狀可包括發熱、全身不 適感、肌肉疼痛、排尿痛苦、陰道分泌物以及腹股溝區域淋巴結腫大、疼痛。產生復發是有可 能的。病毒可在受感染受試者的一生中存在於神經細胞中，並且不定期重新激活，從而形成 皮膚潰瘍。甚至在不存在實際潰瘍的情況下，病毒也可產生並且在個體之間傳播。其目前 是不可治癒的。
[0007] 生殖器皰疹是最普遍的性傳播疾病。在美國，超過16%的人口或六個人中約一人 感染HSV-2,其中對女性（女性約20%而男性12% )和非洲裔美國人（總體約40%而非 洲裔美國人女性將近50%)造成不成比例的負擔。（MorbidityandMortalityWeekly R印ort,59:456-459, 2010年4月23日）。在美國總共約5000萬人受感染，其中約80 %未 意識到其感染，但仍可能是感染的。在世界上其它地方，HSV-2也達到流行病比例。WHO小 組估計2003年世界範圍內53600萬人受感染，並且以每年約2300萬出現新的感染（Looker 等，BullWorldHealthOrgan. 86:805_812,2008)。儘管發病率因區域不同而不同，但大 體上發病率隨年齡增加而增加，並且與在男性中相比在女性中更高。此外，發展中國家的 HSV-2發病率高於發達國家，例外為北美，其具有高HSV-2發病率；以及南亞，其具有相對低 的HSV-2發病率。最高發病率發現在撒哈拉以南非洲，其中幾乎80%的女性和45%的男性 感染HSV-2。其它區域（值得注意的是東亞和東南亞）接近此水平。除性傳播之外，HSV-2 可典型地在分娩時從女性傳播至嬰兒。伴隨在成人美國人口的HSV-2流行性，新生兒感染 的發生率也已顯著增加。在美國每年出現約1，800例新生兒HSV感染，這是比新生兒HIV 感染更高的病例數。
[0008] HSV-2感染的健康暗示是搖擺不定的。儘管絕大多數感染個體是無症狀的，但病 毒仍可傳播。那些具有症狀者忍受其生殖器和肛門區域的令人痛苦的瘡並且往往具有流感 樣症狀，諸如發熱和腺體腫脹。不幸的是，那些首次發作HSV-2者在單單第一年內就很可能 再發作若干次（典型地四次或五次）。不管症狀的嚴重性如何，得知感染往往造成壓力並 且可負面影響生活質量（Rosenthal等，SexTransmInfect. 82:154, 2006;Crosby等Sex Health，5:279-283, 2008)。在感染HSV-2的嬰兒中，因HSV感染造成的新生兒腦炎的死亡 率甚至在治療的情況下還>15%，並且在HSV-2感染嬰兒中在倖存案例中神經病學發病率 又是30-50%。伴隨著HSV-2的高發病率，存在一種很明顯的認識：HSV-2感染基本上增加 了HIV-1感染和傳播的危險。來自非洲的資料顯示HSV-2感染可使HIV傳播的危險增至高 達七倍並且新感染的HIV病例中高達一半是直接歸因於HSV-2感染。總的說來，在HSV-2 感染個體中HIV感染的相對危險性增至超過兩倍。HSV-2對HIV感染的協同作用比任何其 它性傳播感染更大，這加強了對能夠使當前HSV-2流行性的影響減到最低程度的有效公眾 健康策略的需要。
[0009] 儘管廣泛使用藥理學幹涉，在成人和兒科群體中HSV-2發病率仍逐漸增加。在感 染早期以高劑量給予諸如阿昔洛韋（acyclovir)等抗病毒藥物可減少HSV傳播，但這並不 阻止神經元神經節的潛伏性感染。抗病毒治療具有許多缺點，包括作為副作用的噁心、嘔 吐、皮疹以及腎功能減退，並且應謹慎使用，因為它們可能產生畸形並且對發育中的胚胎具 毒性。此外，不管早期幹涉如何，連續抑制性施用伐昔洛韋（valcyclovir)使HSV傳播減 至小於50%。即使此水平的影響是可接受的，但考慮高成本和80%受感染者未意識到其狀 態，所述方法是不切實際的。諸如局部殺微生物劑等抗病毒藥物替代物在臨床上未經證實， 並且物理屏障（例如保險套）具有邊際"現實世界"功效。由於這些原因，接種對與HSV-2 感染鬥爭並且減小其健康影響來說必不可少。
[0010] 首株HSV疫苗在二十世紀二十年代產生，並且從那時起，已試驗過多種疫苗途徑， 全部無效。包括全病毒、滅活病毒、減毒活病毒、修飾型活病毒以及細胞培養物衍生的亞單 位的常規歷史悠久的疫苗類型大部分是不成功的或功效低（Stanberry，Herpes11 (增刊 3)161A-169A，2004)。隨著重組DNA技術的出現，已產生重組亞單位疫苗。這些疫苗包含 一種或兩種與佐劑組合的包膜糖蛋白。糖蛋白是有吸引力的候選物，主要因為它們是中和 抗體的目標並且它們在HSV-2株中高度保守。在最近十年間，對兩種候選疫苗的廣泛臨床 試驗（一個由Chiron發起並且另一個由GlaxoSmithKline發起）皆因功效不夠而停止。 Chiron的疫苗包含與佐劑MF59組合的兩種HSV-2糖蛋白的截短形式gD2和gB2。所述疫 苗最多提供針對HSV-2的暫時保護，不過產生抗體對HSV-2的高效價（Stanberry，同前）。 GlaxoSmithKline(GSK)研發並且測試了一種類似疫苗；然而其僅含有單一糖蛋白gD2以及 明礬和MPL作為佐劑。在八年的研究和臨床試驗之後，GSK於2010年10月宣布其失敗。疫 苗在預防血清陰性女性（已似乎有益的早期臨床試驗中僅有的組）感染方面不成功。


【發明內容】

[0011] 在本公開的一個實施方案中，提供一種選自以下的HSV-2多肽的免疫原性片 段：（a)UL19多肽的免疫原性片段，其缺乏SEQIDN0:4的第1-450位胺基酸的至少75%並 且缺乏SEQIDN0:4的第1055-1374位胺基酸的至少75% ;(b)SEQIDN0:12中所示的序 列；(c) (a)或（b)的免疫原性變體，其在至少15個連續胺基酸上保持至少85%胺基酸同一 性；(d) (a)或（b)的免疫原性片段；以及（e) (a)、(b)、（c)或⑷的嵌合融合體。在另一個 實施方案中，提供一種編碼以上所提到的多肽的分離的多核苷酸。
[0012] 本公開還提供藥物組合物。在一個實施方案中，提供一種包含以下的免疫原性藥 物組合物：⑴選自以下的HSV-2多肽的免疫原性片段：（a)UL19多肽的免疫原性片段，其 缺乏SEQIDN0:4的第1-450位胺基酸的至少75 %並且缺乏SEQIDN0:4的第1055-1374 位胺基酸的至少75%; (b)SEQIDNO: 12中所示的序列；（c) (a)或（b)的免疫原性變體，其 在至少15個連續胺基酸上保持至少85%胺基酸同一性；（d) (a)或（b)的免疫原性片段；以 及（e) (a)、（b)、（c)或⑷的嵌合融合體；（ii)任選地，激活先天免疫的試劑；以及（iii) 藥學上可接受的載體。
[0013] 在另一個實施方案中，提供以上所提到的組合物，其進一步包含UL25或其免疫原 性片段。在另一個實施方案中，組合物進一步包含gD2或其免疫原性片段。
[0014] 在本公開的另一個實施方案中，提供以上所提到的組合物，其中所述試劑是佐劑。 在一個實施方案中，所述佐劑是GLA。在另一個實施方案中，GLA呈水包油乳液或水溶液形 式。在某些實施方案中，水包油乳液包含角鯊烯。
[0015] 在本公開的另一個實施方案中，提供一種用於治療受試者的HSV-2感染的方法， 其包括向受試者施用以上所提到的組合物。在另一個實施方案中，提供一種在受試者中產 生免疫反應的方法，其包括向受試者施用以上所提到的組合物。在另一個實施方案中，提 供一種用於針對HSV-2對受試者進行免疫的方法，其包括向受試者施用以上所提到的組合 物。根據公開的各種實施方案，提供一種以上所提到的方法，其中施用途徑是真皮內、經粘 膜、肌肉內、皮下、舌下、直腸或陰道施用。在另一個實施方案中，提供一種以上所提到的方 法，其進一步包括向受試者施用如權利要求3-8中任一項所述的第二、第三或第四組合物。
[0016] 所要求的發明是針對適用於預防或治療受試者（優選地人類，在一個實施方案中 人類是女性，而在另一個實施方案中人類是男性）的HSV-2(單純皰疹病毒2)感染的組合 物和方法。組合物包含（i)HSV-2的包膜糖蛋白或HSV-2包膜糖蛋白的免疫原性片段，（ii) HSV-2結構蛋白或HSV-2結構蛋白的免疫原性片段，其中結構蛋白不是包膜糖蛋白中的一 種，（iii)激活受試者的先天免疫的試劑以及（iv)藥學上可接受的載體。在某些實施方案 中，包膜糖蛋白是gD2並且組合物具有gD2，或者在一個替代實施方案中，具有衍生自gD2的 免疫原性片段。在一些實施方案中，結構蛋白是UL47、ICPO、ICP4、ICP47、UL5、UL8、UL15、 UL19、UL25、UL30、UL32、UL46、UL39 (ICP10)、UL7、UL40、UL54 以及UL26 中的一種或多種， 並且如果存在免疫原性片段，那麼其衍生自UL47、ICP0、ICP4、ICP47、UL5、UL8、UL15、UL19、 UL25、UL30、UL32、UL46、UL39 (ICP10)、UL7、UL40、UL54 和 / 或UL26。應了解，從一種皰疹 病毒到另一種皰疹病毒蛋白質的精確序列可不同，並且因此對HSV-2蛋白的所有提及均涵 蓋可獲自任何天然存在的HSV-2的任何所述蛋白質。在其它實施方案中，存在UL19與UL25 兩者或UL19(例如SEQIDN0. 12,一種類型的上域片段）和UL25的片段或全蛋白與片段的 混合物，例如全長UL25與例如SEQIDN0. 12的UL19的片段、任選地與UL47或其片段的混 合物。有時，激活先天免疫的試劑是佐劑。具體地說，佐劑可以是GLA或另一種MALA佐劑。 在一個實施方案中，免疫原性藥物組合物包含gD2、GLA或另一種MALA佐劑以及兩種或三 種選自以下的抗原：全長UL25、UL19以及UL47或其片段；以及藥學上可接受的載體。在相 關實施方案中，免疫原性藥物組合物包含MALA佐劑（優選地具有圖1結構式的GLA)、gD2、 UL25、UL19上域片段以及藥學上可接受的載體；任選地所述組合物進一步包含一種或多種 其它HSV-2結構蛋白或其片段。
[0017] 在一些實施方案中，組合物包含HSV-2的包膜糖蛋白的抗原部分以及藥學上可接 受的載體。術語"免疫原性片段"和"免疫片段"以及"抗原部分"在本文中可互換使用，用 於命名引發抗體反應或細胞毒性反應並且保持全長蛋白的特異性（與其交叉反應性）的蛋 白質片段或部分。在某些實施方案中，抗原部分結合於中和抗體。在某些實施方案中，抗原 部分來自gD2或gB2,而在其它實施方案中，抗原部分無論來自gD2、gB2或另一種包膜糖蛋 白，均包含至少一部分並且任選地所有前導序列。在任一實施方案中，抗原部分包含來自包 膜糖蛋白的兩個或更多個線性表位或包含兩個或更多個不連續表位。在任一實施方案中， 組合物進一步包含激活先天免疫的試劑。所述試劑可以是佐劑，諸如如在例如美國公布號 2009/0181078 中所公開的GLA。
[0018] 所述方法可用於治療HSV-2感染或用於產生免疫反應，其可預防或改善HSV-2感 染。適合用於所述方法的受試者包括是HSV-2血清陽性的受試者以及是HSV-2血清陰性的 受試者。在所述方法中，向受試者施用本文所描述的組合物中的一種。
[0019] 本發明的一些示例性陳述闡述如下，使用標識（xy)，其中X和y各表示字母，標 識表示實施方案，或者當在一個實施方案內標示超過一個（xy)時表示實施方案的群組。 (AA) -種免疫原性藥物組合物，其包含（i)HSV-2的包膜糖蛋白或其免疫片段；（ii)不同 於HSV-2的包膜糖蛋白的HSV-2的結構蛋白或其免疫片段；（iii)激活先天免疫的試劑；以 及（iv)藥學上可接受的載體。（AB)組合物（AA)，其中HSV-2的包膜糖蛋白是gD2,並且組 合物包含gD2。（AC)組合物（AA)，其中組合物包含gD2的免疫片段。（AD)(AA)、（AB)以及 (AC)中的任何一種或多種的組合物，其中HSV-2的結構蛋白是一種或多種選自以下的蛋白 質：見47、10?0、皿25、見46、皿39、見7以及皿26。（4￡)組合物仏4)，其中批￥-2的結構蛋白 是UL19。（AF)組合物（AB)，其中HSV-2的結構蛋白是UL19。（AG)組合物（AA)，其中HSV-2 的結構蛋白是UL19的免疫片段，例如SEQIDN0. 12。（AH)組合物（AB)，其中HSV-2的結構 蛋白是UL47的免疫片段。（AI)組合物（AA)，其中HSV-2的結構蛋白是UL25。（AJ)組合物 (AB) ，其中HSV-2的結構蛋白是UL25。（AK)組合物（AA)，其中HSV-2結構蛋白是UL25的免 疫片段。（AL)組合物（AB)，其中HSV-2的結構蛋白是ICPO。（AM)組合物（AA)，其中HSV-2 的結構蛋白是UL47。（AN)組合物（AB)，其中HSV-2的結構蛋白是UL47的片段。（A0)組合 物（AA)，其中不同於HSV-2的包膜糖蛋白的HSV-2的結構蛋白是UL47,並且是其免疫片段。 (AP)組合物（AB)，其中不同於HSV-2的包膜糖蛋白的HSV-2的結構蛋白是UL47,並且是其 免疫片段。（AQ) (AA)、（AB)、（AC)、（AD)、（AE)、（AF)、（AG)、（AH)、（AI)、（AJ)、（AK)、（AL)、 (AM)、（AN)、（AO)、（AP)中的任何一種或多種的組合物，其進一步包含不同於HSV-2的包膜 糖蛋白的第二HSV-2的結構蛋白或其免疫片段。（AR)組合物（AQ)，其中不同於HSV-2的包 膜糖蛋白的第二HSV-2的結構蛋白選自UL19、UL25以及UL47,其中第二結構蛋白與所述結 構蛋白不同。（AS)組合物（AR)，其包含第二結構蛋白。（AT)組合物（AR)，其包含第二結構 蛋白的免疫片段。（AU) (AE)、（AF)、（AG)和/或（AH)中的任何一種或多種的組合物，其進 一步包含UL25。（AV) (AE)、（AF)、（AG)和/或（AH)中的任何一種或多種的組合物，其進一 步包含UL25的免疫片段。（AW) (AE)、（AF)、（AG)和/或（AH)中的任何一種或多種的組合 物，其進一步包含UL47。（AX) (AE)、(AF)、(AG)和/或（AH)中的任何一種或多種的組合物， 其進一步包含UL47的免疫片段。（AY) (AI)、（AJ)、（AK)和/或（AL)中的任何一種或多種 的組合物，其進一步包含UL19。（AZ) (AI)、（AJ)、（AK)和/或（AL)中的任何一種或多種的 組合物，其進一步包含UL19的免疫片段，例如SEQIDNO12。（BA) (AI)、（AJ)、（AK)和/或 (AL)中的任何一種或多種的組合物，其進一步包含UL47。（BB) (AI)、(AJ)、(AK)和/或（AL) 中的任何一種或多種的組合物，其進一步包含UL47的免疫片段。（BC) (AM)、(AN)、(A0)和/ 或（AP)中的任何一種或多種的組合物，其進一步包含UL19。（BD) (AM)、（AN)、（A0)和/或 (AP)中的任何一種或多種的組合物，其進一步包含UL19的免疫片段。（BE) (AM)、(AN)、(A0) 和/或（AP)中的任何一種或多種的組合物，其進一步包含UL25。（BF) (AM)、（AN)、（AO)和 /或（AP)中的任何一種或多種的組合物，其進一步包含UL25的免疫片段。（BG) (AA)、（AB)、 (AC), (AD), (AE), (AF), (AG), (AH), (AI), (AJ), (AK), (AL), (AM), (AN), (AO), (AP), (AQ), (AR)、（AS)、（AT)、（AU)、（AV)、（AW)、（AX)、（AY)、（AZ)、（BA)、（BB)、（BC)、（BD)、（BE)以及 (BF)中的任何一種或多種的組合物，其中所述試劑是佐劑。（BH)選自（BG)的組合物，其中 佐劑是GLA或另一種MALA佐劑，並且（BG)中的選項各自或每一種獨立地被挑選作為本發 明的不同實施方案。（BI)組合物（AA)，其包含gD2 ;UL25 ;UL19 ;GLA或另一種MALA佐劑；以 及藥學上可接受的載體。（BJ)組合物（AA)，其包含gD2、UL25以及UL19的免疫片段。（BK) 組合物（AA)，其包含gD2、UL19以及UL25的免疫片段。（BL) (BI)、（BJ)以及（BK)中的任何 一種或多種的組合物，其進一步包含UL47。（BM)(BI)、（BJ)以及（BK)中的任何一種或多種 的組合物，其進一步包含UL47的免疫片段。（BN) -種用於治療受試者的HSV-2感染的方 法，其包括向受試者施用（AA)、（AB)、（AC)、（AD)、（AE)、（AF)、（AG)、（AH)、（AI)、（AJ)、（AK)、 (AL) 、（AM)、（AN)、（AO)、（AP)、（AQ)、（AR)、（AS)、（AT)、（AU)、（AV)、（AW)、（AX)、（AY)、（AZ)、 (BA) 、（BB)、（BC)、（BD)、（BE)、（BF)、（BG)、（BH)、（BI)、（BJ)、（BK)、（BL)以及（BM)中的任 何一種或多種的組合物。（BO) -種用於在受試者中產生對HSV-2的免疫反應的方法，其包 括向受試者施用（AA)、（AB)、（AC)、（AD)、（AE)、（AF)、（AG)、（AH)、（AI)、（AJ)、（AK)、（AL)、 (AM) 、（AN)、（AO)、（AP)、（AQ)、（AR)、（AS)、（AT)、（AU)、（AV)、（AW)、（AX)、（AY)、（AZ)、（BA)、 (BB) 、（BC)、（BD)、（BE)、（BF)、（BG)、（BH)、（BI)、（BJ)、（BK)、（BL)、（BM)以及（BN)中的任 何一種或多種的組合物。（BQ)方法（BO)，其中受試者是HSV-2血清陽性並且HSV-1血清陽 性的。（BR)方法（B0)，其中受試者是HSV-2血清陽性並且HSV-1血清陰性的。
[0020] 在一個實施方案中，提供一種組合物，其包含HSV-2的包膜糖蛋白或其免疫片段； 兩種同於HSV-2的包膜糖蛋白的HSV-2的結構蛋白或其免疫片段；激活先天免疫的試劑； 以及藥學上可接受的載體。示例性組合物是包含以下成分的組合物：gD2、UL25以及SEQ IDN0. 12 (UL19的片段）以及單磷醯脂質A(MALA)佐劑，例如GLA。除gD2特異性抗體反應 之外，用此組合物接種可引起與用活病毒進行後續感染相對應的加強的HSV-2抗原特異性 ⑶4和⑶8效應因子和記憶T細胞。值得注意的是，用此組合物進行預防性免疫可大大地 或完全地針對C57BL/6小鼠中致死性陰道內HSV-2感染進行保護，其中生殖器黏膜與背根 神經節兩者中為消除性免疫。此組合物可使通過事先用減毒HSV-2株感染所誘導的CD4與 CD8T細胞兩者增加。與此一致，當用作用於豚鼠的復發性HSV-2損害的治療時，此組合物可 降低復發性損害的頻率。
[0021] 還提供試劑盒。在一些試劑盒中，存在包含藥物組合物的小瓶，所述藥物組合物包 含HSV-2包膜糖蛋白的抗原部分以及藥學上可接受的載體。
[0022]在參考以下詳細描述和隨附圖式之後，本發明的這些和其它方面以及實施方案將 變得很明顯。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1A-B呈現GLA的圖式（用於實施例中的佐劑）以及具有表面活性劑磷脂醯膽 鹼和普盧蘭尼克F68(PluronicF68)的示例性油滴的示意圖。
[0024] 圖2示出了gD2特異性CD4T細胞反應。數據是在用包含如所指示的不同水平的 重組蛋白和GLA的二價疫苗以28天時間間隔將Balb/c小鼠（4隻/組）壁內免疫兩次之 後獲得。這些圖表是關於IL-2、TNF_a以及IFN-Y的細胞內產生的流式細胞術分析的結 果。
[0025] 圖3示出了在引發後D25天（加強後D4)分析的針對0VA257肽的脾⑶8T細胞反 應；重組0VA= 5yg;SE= 2% ;慢病毒s.c.遞送；重組OVAi.m.遞送。
[0026] 圖4是顯示加強之後4天測量的細胞因子陽性⑶8T細胞百分比的圖表。在第0天 進行引發並且在第21天進行加強。柱擬1、(10冊55，(121，？85;擬2，(10，1^-0￥4，(121，？85;擬3， dOLV-OVA,d21LV-0VA；HA4,dOLV-〇VA,d2120ugGLA-SE；HA5,dOLV-〇VA,d210VA+SE；HA6, dOLV-OVA,d210VA+20ugGLA-SE；HA7,dOLV-〇VA,d21,4ug0VA+GLA-SE；HA8,dOLV-〇VA, d210VA+0. 8ugGLA-SE〇
[0027] 圖5A-B示出了在用與5iigGLA-SE組合的5iig重組gD、UL19或UL25蛋白經由 引發/加強免疫方案（d0引發/d21加強）對C57BL/6小鼠組（5隻/組）進行免疫之後獲 得的數據。在加強後第4天，通過在用事先確定為含有關於相應重組蛋白免疫原的⑶4表位 的15-mer肽進行離體再刺激之後進行關於IFN-y、TNF-a以及IL-2的細胞內染色來測量 脾CD4T細胞反應。A)指示了在用相應重組蛋白免疫原免疫的小鼠中各15-mer肽的CD4T 細胞反應的代表性ICS點狀圖。B)描繪了各組的細胞因子陽性CD4T細胞百分比。
[0028] 圖6A-B示出了在用在等摩爾基礎（分別0.8、3.3以及1.4iig蛋白質）上與 5. 5ygGLA-SE組合調配並且以組合形式遞送的重組gD、UL19以及UL25蛋白經由引發/加 強方案（d0引發/d21加強）對一組五隻C57BL/6小鼠進行免疫之後獲得的數據。在加強 後第4天，通過在用事先確定為含有關於各重組蛋白免疫原的⑶4T細胞表位的15-mer肽 離體再刺激之後進行關於IFN-y、TNF-a以及IL-12的細胞內染色來測量脾⑶4T細胞反 應。將來自各肽庫的缺少CD4T細胞表位的個別肽包括在內作為陰性對照。A)描繪了各組 的細胞因子陽性⑶4T細胞百分比。B)在三價疫苗內各重組蛋白免疫原的IgGl亞類抗原特 異性抗體的血清終點效價（定義為>2倍背景值的最高血清稀釋度的倒數）。
[0029] 圖7A-B示出了當用與gGLA-SE組合遞送的g重組UL19蛋白經由引發（d0) 或引發加強（d0引發/d21加強）免疫方案對各組C57BL/6小鼠（5隻/組）進行免疫時 獲得的數據。在最後一次免疫後第4天或第10天，通過在用事先確定為含有關於UL19的 ⑶4T細胞表位的15-mer肽離體再刺激之後進行關於IFN-y、TNF-a以及IL-12的ICS來 測量脾CD4T細胞反應。A)指示了在用相應重組蛋白免疫原免疫的小鼠中UL19 15-mer肽 297的⑶4T細胞反應的代表性ICS點狀圖。描繪了各組的細胞因子陽性DC4T細胞百分比。 B)描繪了各組對UL19 15-mer250或297作出反應的細胞因子陽性⑶4T細胞百分比。
[0030] 圖8A-B示出了當用單獨或與5iigSE或GLA-SE組合遞送的5iig重組UL19蛋 白經由引發（do)或引發加強（do引發/d21加強）免疫方案對各組C57BL/6小鼠（5隻/ 組）進行免疫時獲得的數據。在最後一次免疫後第5天或第10天，通過在用事先確定為含 有關於UL19的⑶4T細胞表位的15-mer肽離體再刺激之後進行關於IFN-y、TNF-a以及 IL-12的ICS來測量脾CD4T細胞反應。A)指示了在用相應重組蛋白免疫原免疫的小鼠中 UL19 15-mer肽297的⑶4T細胞反應的代表性ICS點狀圖。描繪了各組的細胞因子陽性 ⑶4T細胞百分比。B)描繪了各組對UL19 15-mer250或297作出反應的細胞因子陽性⑶4T 細胞百分比。
[0031] 圖9A-C示出了當用在等摩爾或等質量基礎上調配的重組蛋白經由引發加強（d0 引發/d21加強）免疫方案對各組C57BL/6小鼠（5隻/組）進行免疫時獲得的數據。遞送 的總蛋白是5yg或15yg。在最後一次免疫後第5天，通過在用事先確定為含有⑶4T細胞 表位的15-mer肽離體再刺激之後進行關於IFN-y、TNF-a以及IL-12的細胞內染色來測 量脾CD4T細胞反應。A)描繪了對gD肽作出反應的細胞因子陽性CD4T細胞百分比。B)描 繪了對UL19肽作出反應的細胞因子陽性CD4T細胞百分比。C)描繪了對UL25肽作出反應 的細胞因子陽性CD4T細胞百分比。
[0032] 圖10示出了當用以100iil(50iil/腿）肌肉內遞送的與gGLA-SE、單獨SE或 PBS媒介物組合的g重組gD蛋白經由引發/加強免疫方案（d0引發/d21加強）對各組 BALB/c小鼠（5隻/組）進行免疫時獲得的數據。通過ELISA測量IgG、IgGl以及IgG2a同 型抗原的HSV-2gD2特異性抗體。
[0033] 圖11示出了當用三價疫苗或對照疫苗物品對各組的五個C57BL/6小鼠進行單次 肌肉內免疫時獲得的數據，所述三價疫苗由與5iigGLA-SE組合的重組gD2、UL19ud以及 UL25各5yg組成。在免疫後第6天，通過在用gD2、UL19或UL25肽進行脾細胞培養5小 時的離體再刺激之後進行關於IFN-y、TNF-a以及IL-2的細胞內細胞因子染色（ICS)來 測量抗原特異性脾CD4和CD8T細胞反應。A)對gD2、UL19ud或UL25肽作出反應的CD4T 細胞的頻率和細胞因子表型。B)對UL19肽作出反應的CD8T細胞的頻率和細胞因子表型。 C)在早期用具有GLA-SE的三價疫苗免疫4周並且用減毒HSV-2胸苷激酶缺乏型（TK-)病 毒進行皮下激發的小鼠中對UL19肽作出反應的CD8T細胞的頻率。
[0034] 圖12顯示當用二價疫苗對各組的十隻C57BL/6小鼠相隔28天進行兩次肌肉內免 疫時獲得的數據，所述二價疫苗由與5118 61^-5￡或5%右旋糖媒介物組合的重組§02和 UL19ud各5yg組成。用單獨5ygGLA-SE免疫的小鼠充當陰性對照。第二次免疫後22天， 將小鼠用藥性持久的乙酸甲羥孕酮處理並且接著在六天後用50xLD5Q劑量的野生型HSV-2 陰道內激發。每天監測小鼠的生殖器損害形成和存活率。感染後第1天、第3天以及第5 天，收集陰道拭子用於通過PCR定量HSV-2DNA。感染後約2個月，從倖存小鼠收穫背根神經 節並且通過PCR定量潛伏性HSV-2DNA。如圖12中圖片A所描繪，與用單獨gD2和UL19ud 或單獨GLA-SE免疫的小鼠相比，用gD2和UL19ud加上GLA-SE免疫的小鼠的損害形成顯著 降低並且存活率增加。同樣地，如圖12中圖片B所描繪，用gD2和UL19ud加上GLA-SE免 疫的10隻小鼠中9隻到第5天不具有可檢測的HSV-2DNA，然而在任一對照組中的小鼠在5 天中均在陰道中顯示持續水平的HSV-2。如圖12中圖片C所描繪，儘管在僅GLA-SE組中 存在三隻倖存鼠，但是這3隻小鼠中2隻在背根神經節中顯示顯著水平的潛伏性HSV-2,用 gD2和UL19ud加上GLA-SE免疫的小鼠在神經節中顯示極少到不顯示可檢測的HSV-2。
[0035] 圖13顯示當將C57BL/6小鼠（5隻/組）用次致死劑量的減毒HSV-2胸苷激酶缺 乏型（TK-)病毒皮下感染接著用三價疫苗免疫28天後時獲得的數據，所述三價疫苗由與 5iigGLA-SE或5%右旋糖媒介物組合的重組gD2、UL19ud以及UL25各5iig組成。對照組 包括用單獨GLA-SE或單獨媒介物處理的感染小鼠以及用單獨媒介物處理的未感染小鼠。 免疫後六天，在用UL19肽刺激之後通過ICS測量UL19特異性CD8 (上部圖片）和CD4 (下 部圖片）T細胞反應。
[0036] 圖14顯示當用次致死劑量的HSV-2株333病毒陰道內感染豚鼠（7隻/組）並 且接著在感染後第13天和第27天用三價疫苗處理時獲得的數據，所述三價疫苗由與5yg GLA-SE組合的gD2、UL19ud以及UL25各5yg組成。用單獨GLA-SE處理的感染豚鼠充當 陰性對照。每天監測動物的陰道損害並且對各損害日分配以得分0-4。將各組的日損害得 分取平均值並且描繪隨時間變化的曲線。
[0037] 圖15顯示當用三價疫苗對各組的十隻C57BL/6小鼠相隔28天進行兩次肌肉內 免疫時獲得的數據，所述三價疫苗由與5ygGLA-SE或5%右旋糖媒介物組合的重組gD2、 UL19ud(參見SEQIDN0:12)以及UL25各5iig組成。用單獨5iigGLA-SE免疫的小鼠充 當陰性對照。其它對照組由在激發之後24小時開始用5ygGLA-SE和1毫克/ml的阿昔 洛韋（aciclovir;ACV)/飲用水免疫的小鼠組成。第二次免疫後二十二天，將小鼠用藥性持 久的乙酸甲羥孕酮處理並且接著在六天後用50xLD5Q劑量的野生型HSV-2陰道內激發。每 天監測小鼠的生殖器損害形成（圖片A)和存活率（圖片B)。
[0038] 圖16:示出了用三價gD2、UL19ud(SEQIDN0:12)以及UL25疫苗免疫的小鼠的陰 道HSV-2DNA水平（關於各組小鼠的描述參見圖15)。在感染後第1天、第3天以及第5天 收集陰道拭子，用於通過PCR定量HSV-2DNA。

【具體實施方式】
[0039] 本公開提供用於治療或用於預防包括HSV-1和HSV-2感染的單純皰疹病毒感染的 免疫原性藥物組合物和方法。所述組合物包含免疫原性HSV-2病毒蛋白或病毒蛋白的免疫 原性部分，諸如片段或肽；以及至少一種激活先天免疫系統的試劑，優選地TLR4激動劑，例 如如本文所描述的MALA佐劑。病毒蛋白（以及片段和肽）包含至少一種包膜糖蛋白以及 至少一種、兩種、三種或四種不同於包膜糖蛋白的結構蛋白。或者，病毒蛋白（以及片段和 肽）包含至少一種抗原表位並且可包含包膜蛋白的前導肽的一部分或全部。可使用免疫原 性片段。適用於組合物中的一些特定試劑包括佐劑，其為增強對抗原的免疫反應的物質。蛋 白質和片段典型地是通過重組技術產生，其中蛋白質或片段在所培養的細胞中表達。肽還 可以是化學合成的。
[0040]A?作為疫苗組分的HSV-2蛋白
[0041]HSV-2 (2型單純皰疹病毒）是一種包膜病毒。其基因組在75種不同蛋白質上表 達。所述蛋白質中許多是結構蛋白並且用於形成衣殼和被膜，而另外一些是包膜的一部 分。主要衣殼蛋白包括由開放閱讀框（如果常用名稱不同於0RF名稱，那麼括號中為蛋白 質名稱）UL6、UL18(VP23)、UL19(VP5)、UL35(VP26)以及UL38表達的蛋白質；主要被膜蛋 白包括UL7、UL11、UL13、UL14、UL16、UL17、UL21、UL25、UL36、UL37、UL41、UL46 (VP11/12)、 UL47 (VP13/14)、UL48 (VP16)、UL49、UL51 以及US11 ;主要包膜蛋白包括UL1 (糖蛋白 L(gL))、UL10 (gM)、UL20、UL22 (gH)、UL27 (gB)、UL43、UL44 (gC)、UL49A(gN)、UL53 (gK)、 US4(gG)、US5，（gJ)、US6(gD)、US7(gI)以及US8(gE)。（其它蛋白質名稱可已用於文獻中。） 示例性HSV-2基因組序列可見於基因庫登錄號NC001798. 1 (更新日期2010年4月23日 下午2:16,2011年1月10日錄入；以全文併入）。應了解，通常使用的蛋白質名稱可不同於 基因名稱，例如UL19編碼VP5,但在本文中提到基因名稱等同於提到所編碼的蛋白質。還應 了解，從一種皰疹病毒到另一種皰疹病毒蛋白質的確切序列可不同，並且因此對HSV-2蛋 白的所有提及（結構或包膜或非包膜）涵蓋可獲自任何天然存在的HSV-2的任何所述蛋白 質。許多序列是已知的並且存放於資料庫中。編碼具有替代序列的HSV-2蛋白的核酸可容 易地分離或用適當的寡核苷酸探針或引物（例如具體地說在嚴格條件下與參考序列雜交 者）擴增自一種或多種HSV-2 (例如存放的HSV-2或臨床分離物）。在所述群組的編碼例如 UL蛋白的HSV-2蛋白的核酸內，所述群組的一種核酸將在嚴格條件下與所述群組內的另一 種核酸的補體雜交。
[0042]術語"嚴格條件"是指使得探針將優先與其目標子序列並且在更低程度上與或根 本不與其它序列雜交的條件。在諸如南方和北方雜交等核酸雜交實驗的情形中，"嚴格雜 交"和"嚴格雜交洗滌條件"具序列依賴性，並且在不同環境參數下不同。核酸雜交的詳盡指 導可見於Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology- HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分，第 2 章,"Overviewofprinciples ofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays"，Elsevier(New York, 1993)中。在某些實施方案中，高度嚴格雜交和洗滌條件是比特定序列在規定離子強 度和pH值下的熱力學熔點（TJ低約5°C。Tm是使得50%的目標序列與完全匹配的探針雜 交的溫度（在規定離子強度和pH值下）。在某些實施方案中，非常嚴格條件等於特定探針 的V
[0043] 用於在南方或北方墨點法的過濾器上具有超過100個互補殘基的互補核酸的雜 交的嚴格雜交條件的實例是50%福馬林加上lmg肝素，在42°C下，並且進行雜交過夜。高 度嚴格洗滌條件的實例是〇. 15MNaCl，在72°C下持續約15分鐘。嚴格洗滌條件的實例是 在65°C下0. 2xSSC洗滌15分鐘（關於SSC緩衝液的描述參見Sambrook等）。高嚴格洗 滌的前面可以是用於去除背景探針信號的低嚴格洗滌。具有例如超過100個核苷酸的雙鏈 分子子的中等嚴格洗滌的實例是lxSSC，45°C，15分鐘。具有例如超過100個核苷酸的雙 鏈分子的低嚴格洗滌的實例是4-6xSSC，40°C，15分鐘。一般來說，與在特定雜交分析中關 於無關探針所觀測相比2倍（或更高）的信噪比指示檢測到特異性雜交。
[0044] 因為在病毒進入宿主細胞中時涉及一種或多種包膜蛋白，所以包膜蛋白的抗體可 中和病毒，即預防由病毒感染或再感染。在不希望堅持機械理論的情況下，對那些為細胞進 入所必需的包膜蛋白中的一種或多種引發抗體是用於獲得中和抗體的一種方法。包含全病 毒、典型地滅活病毒的疫苗天然地呈現包膜蛋白以免疫細胞。對於包含個別病毒蛋白的疫 苗，用於獲得中和抗體反應的一種策略是在疫苗中包括一種或多種包膜蛋白或免疫原性蛋 白質片段或免疫原性肽或這些的某種組合。
[0045]HSV-2編碼14或更多種包膜相關蛋白質，其中至少一些涉及細胞進入，包括但不 限於gB、gD、gH以及gL。gD似乎特異性結合於細胞上的HSV-2受體，而gB以及雜二聚物 gH/gL似乎介導膜融合。因此，這四種包膜糖蛋白是作為免疫原包括於疫苗中的優良選擇， 因為對這些包膜糖蛋白所引發的抗體可包括中和抗體。或者或此外，參與病毒流出的包膜 糖蛋白也是作為免疫原以包括於疫苗中的候選者。
[0046] 大部分不同於包膜蛋白的HSV-2的結構蛋白可見於衣殼和被膜中。被膜佔據衣殼 與包膜之間的空隙。發現在被膜中存在約20種病毒蛋白。被膜蛋白對於多種病毒功能來 說是重要的，包括免疫調節、病毒組裝以及最終釋放。衣殼蛋白形成包圍病毒體的核酸基因 組的結構。VP5(UL19的產物）是主要衣殼蛋白。往往對結構蛋白和多種HSV蛋白引發細胞 反應（Hosken等，JVirol80:5509-55515, 2006)。一般來說，細胞反應涉及CD4 與CD8T細 胞兩者，它們是在對抗HSV感染中起作用的細胞類型。
[0047]本文所公開的免疫原性藥物組合物（例如疫苗）包含兩種或更多種結構蛋白作為 免疫原，所述兩種或更多種結構蛋白中的一種是包膜糖蛋白而其中另一種不同於包膜糖蛋 白。儘管可使用任一種結構蛋白，但可通過生產容易性、調配成藥物組合物的能力、有關蛋 白質結構的信息以及高表達水平來指導選擇。因為T細胞反應典型地是MHC限制性的，所 以疫苗一般含有對最多數目的MHC類型起反應的蛋白質或肽，並且它還可以含有多種蛋白 質或肽以增加將作出反應的個體的數目。
[0048] 免疫原性藥物組合物優選地是無菌的、不含或基本上不含其它病毒汙染物並且不 含或基本上不含諸如LPS等致熱物質。所述組合物用作疫苗。
[0049]用於在疫苗中作為免疫原的包膜和非包膜結構蛋白典型地是全長的，但還可以是 前體蛋白、片段或融合蛋白的一部分。全長蛋白是指一種成熟蛋白；例如在包膜蛋白的情況 下，成熟蛋白是可見於包膜中的形式（例如缺少前導肽）。前體蛋白（前蛋白）是進行任何 加工之前的初期轉化蛋白或部分加工蛋白。作為融合蛋白的一部分，HSV-2蛋白可呈現前 體或全長蛋白或蛋白質片段形式。蛋白質的片段應具免疫原性，含有一個或多個引發免疫 反應的表位。
[0050]在一些實施方案中，本文所公開的免疫原性藥物組合物（例如疫苗）包含（i)HSV-2的a組基因產物或其免疫片段；和/或（ii)HSV-2的0 1組基因產物或其免疫片段； 和/或（iii)HSV-2的0 2組基因產物或其免疫片段；和/或（iv)HSV-2的y1組基因產物 或其免疫片段；和/或（v)HSV_2的Y2組基因產物或其免疫片段作為免疫原。a1、運2、 Yl以及Y2基因是本領域中熟知的。參見例如HerpesvirusesandTheirReplication, FUNDAMENTALVIROLOGY，第 29 章，1986。
[0051] 因此，本文中術語"免疫原"的任何使用均指全部群組的多肽，即：（a)全長抗原， (2)抗原的免疫原性片段，（3)全長抗原的免疫原性變體或免疫原性片段的變體，（4)其包 含不同多肽的部分的嵌合融合體，以及（5)其綴合物。在各種實施方案中，用於疫苗中的包 膜和非包膜結構蛋白包括包含能夠誘導對蛋白質具特異性的免疫反應的其免疫原性片段 或其變體中的任一種的多肽。
[0052]舉例來說，免疫原性變體在抗原的至少10個連續胺基酸上保持至少90%胺基酸 同一性，或在抗原的至少15個連續胺基酸上保持至少85%胺基酸同一性（例如包膜蛋白 或非包膜結構蛋白）。其它實例包括在抗原的至少50個連續胺基酸上或在抗原的至少 100 個連續胺基酸上至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %同一性。在一個實施方案中，免疫原性變體在特定抗原的全長上具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性。 在一些實施方案中，變體是天然存在的變體。
[0053] 作為另一個實例，免疫原性片段和其變體包含抗原的至少5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、48或50個連續胺基酸。免疫原性片段可包含許多 以上所提到數目之間的連續胺基酸，使得例如免疫原性片段在免疫原性多肽的約6-10、 10-15、15-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100 或更多個連續氨基 酸之間。
[0054] 選擇往往稱為肽的短片段以與MHC分子複合以便結合於T細胞受體並且通常長達 約30個胺基酸長，或長達約25個胺基酸長，或長達約20個胺基酸長，或長達約15個胺基酸 長，長達約12個胺基酸長，長達約9個胺基酸長，長達約8個胺基酸長。一般來說，較短的 肽與MHCI類分子結合或締合而較長的肽與MHCII類分子結合或締合。適合的肽可使用 許多生物信息學程序中的任一種來預測並且使用熟知方法來測試。在本文中也稱為"肽"的 短片段典型地是15-100個胺基酸長；較長片段典型地是100個胺基酸到全長，不過肽（短 片段）和較長片段的長度範圍不是固定的。
[0055] 如本文所公開，適合的蛋白質包括前體蛋白、成熟蛋白、片段、融合蛋白以及肽。在 組合物中，蛋白質可以相同形式或以這些形式的混合物形式存在。舉例來說，包膜糖蛋白可 以呈現成熟蛋白形式並且結構蛋白呈片段形式，或者包膜糖蛋白可呈現片段形式並且結構 蛋白呈片段形式。對於糖蛋白的細胞產生，信號肽可以是前體蛋白的一部分。信號肽包括 糖蛋白D天然序列或本領域中已知的其它序列。還可能需要使用沒有跨膜或胞內區或兩者 的蛋白質。
[0056] 如本文所論述，選擇包膜糖蛋白中含有一個或多個結合於中和抗體的表位的一個 或多個部分（也稱為片段）。含有表位的部分可通過分析諸如中和抗體對細胞病毒感染的 抑制來鑑別。簡言之，將HSV-2包膜糖蛋白的重疊部分與中和抗體（例如來自受感染動物 或人類的血清）混合，將混合物添加至HSV-2和受納細胞系中。如果一個部分具有結合於 抗體的表位，那麼細胞系將感染HSV-2。如果所述部分不具有表位，那麼細胞系將不感染。
[0057] 包含免疫原性HSV-2多肽的至少一個免疫原性片段的組合物可用作免疫原。在一 些實施方案中，通過本文所描述的重組表達載體編碼免疫原性片段。免疫原性片段可由免 疫原性多肽的至少6、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個連續胺基酸組成。免 疫原性片段可包含許多以上所提到數目之間的連續胺基酸，使得例如免疫原性片段在免疫 原性多肽的約 6-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100 或更多個連續胺基酸之間。免疫原性片段可包含充足數目的連續胺基酸從而形成線性表 位，和/或可包含充足數目的連續胺基酸從而允許片段以與衍生片段的全長多肽相同（或 充分類似）的三維構象摺疊，以呈現非線性表位（本領域中也稱為構象表位）。用於評估免 疫原性片段是否摺疊成類似於全長多肽的構象的分析包括例如蛋白質與對天然或未摺疊 表位具特異性的單克隆或多克隆抗體反應的能力、其它配體結合功能的保持以及多肽片段 經蛋白酶消化的敏感性或耐性（參見例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratory Manual，第 3 版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY(2001))。因此，舉例來說，當 片段結合特異性結合於全長多肽的抗體的能力以及結合水平與全長多肽基本上相同（即 與示例性或野生型全長抗原的免疫原性相比結合水平已保持到統計學、臨床和/或生物學 充足程度）時，多肽片段的三維構象充分類似於全長多肽。
[0058] 在諸如上文所描述的分析等分析中所篩檢的片段通常是短的。一般來說，候選片 段的長度長達約40個胺基酸長，或長達約25個胺基酸長，或長達約20個胺基酸長，或長達 約15個胺基酸長，或長達約12個胺基酸長，或長達約9個胺基酸長，或長達約8個胺基酸 長。用於篩檢的片段典型地是重疊的。舉例來說，一組片段可包含20個胺基酸長片段，其 重疊16個胺基酸（即每4個胺基酸錯開）。典型地，重疊組在未加工糖蛋白的N端開始，即 含有前導序列，並且在胞外域的C端胺基酸處結束。
[0059] 選擇結合於中和抗體的片段並且可將其用於如本文所公開的藥物組合物中。片段 可"按原樣使用"或進一步工程改造或與其它片段組合。對於足夠大並且複雜性足以具免疫 原性的片段，其可用於藥物組合物。小於約1000MW的片段不大可能具免疫原性，不過複雜 性也可以在片段是否具免疫原性免疫原性中發揮作用。舉例來說，由單一胺基酸重複單元 組成的均聚物不管其大小如何均是不良免疫原，然而2個或3個胺基酸的共聚物可以是良 好免疫原。穀氨酸和賴氨酸的共聚物需要是至少約30-40,000MW以具免疫原性。具有芳香 族側鏈的胺基酸增加免疫原性，使得僅具有約4000MW的包含酪氨酸和苯基丙氨酸的片段 可以具免疫原性。過短或複雜性不足以具免疫原性的片段可綴合至載體蛋白，諸如KLH(鑰 孔戚血藍素）、卵白蛋白、牛血清白蛋白或其它對接受藥物組合物的受試者來說外來的蛋白 質，或者所述片段可聯接在一起以形成免疫原性蛋白。片段是否具免疫原性可在動物中測 定。舉例來說，可以引發-加強方案向動物施用片段，並且在例如ELISA中使用在加強之後 7-10天抽取的血清來分析片段的抗體。可檢測信號指示片段具免疫原性。更高信號是合乎 需要的。用於免疫原性的其它分析是普通技術人員熟知的。
[0060] 在一些實施方案中，用於組合物中的片段是合成長肽。"合成長肽"（SLP)是指離 體製造並且長度短至約25個胺基酸並且長至約100個胺基酸的蛋白質序列。SLP應足夠長 以由樹突狀細胞吸收並加工以便與MHCI類或II類分子一起呈現於其細胞表面。SLP是衍 生自蛋白質的肽，需要針對所述蛋白質的免疫反應。在一個實施方案中，免疫反應是T細胞 反應。蛋白質可以是已知抗原或在一些蛋白質的情況下其可以是候選抗原。
[0061]SLP包含至少一個⑶4表位或至少一個⑶8表位或至少一個⑶4和至少一個⑶8 表位。CD4表位是指結合於II類MHC的胺基酸序列，而CD8表位是指結合於I類MHC的氨 基酸序列。表位序列衍生自免疫原的胺基酸序列；在體內，簡言之，免疫原由抗原加工細胞 (例如樹突狀細胞）吸收或合成並且降解成肽，其與MHC分子締合併且以MHC-肽複合物形 式呈現於細胞表面上。與MHCI類分子複合的肽與T細胞抗原受體和⑶8+T細胞上的⑶8 相互作用，這些肽稱為⑶8表位；與MHCII類分子複合的肽與T細胞抗原受體和⑶4+T細 胞上的⑶4相互作用，這些肽稱為⑶4表位。激活的⑶8+T細胞變成細胞毒性T細胞，其識 別並且殺死展示MHCI類-CD8表位的靶細胞。往往，靶細胞是感染或腫瘤細胞。激活的 CD4+T細胞變成輔助性T細胞，並且取決於其亞型，幫助B細胞產生抗體或激活天然殺傷細 胞、吞噬細胞以及CD8+T細胞。CD4+T細胞與CD8+T細胞兩者的激活有助於綜合的細胞免疫 反應。
[0062] 如上文所公開，SLP應足夠長以由樹突狀細胞吸收並加工並且與MHC分子一起呈 現於其細胞表面上。與MHCI類分子複合的肽的長度通常是8-11個胺基酸，而與MHCII 類分子複合的肽的長度通常是13-17個胺基酸，不過更長或更短的長度不罕見。因此，SLP 將典型地是至少25個胺基酸長並且長至100個胺基酸長（例如至少30aa、至少35aa、至 少40aa、至少45aa、至少50aa、至少55aa、至少60aa、至少65aa、至少70aa、至少75aa、至少 80aa、至少85aa、至少90aa、至少95aa)。SLP的長度通常將是長約45aa或約50aa。
[0063] 表位可具有已知序列或未知序列。過多的蛋白質已確定了CD4和CD8表位的位 置。對於包含這些表位中的一個或多個的SLP，長度將典型地是約45aa。此外，表位可在N 端並且在C端側以約15aa形成側翼。側翼序列典型地是使表位序列在天然蛋白質中形成 側翼的序列。如上文所論述，SLP可包含多於一個表位，多個表位可以全部是⑶4或⑶8表 位或是⑶4與⑶8表位的混合物。此外，表位可依次重疊（關於包含重疊表位的一些示例 性SLP參見實施例1)。所用SLP的總數目可使得所有已知CD4和CD8表位均得以表示。
[0064]SLP可通過多種方法中的任一種來合成（關於合成法的一般論述參見Corradin 等，SciTranslationalMed2:1,2010)。自動化肽合成器可商購獲得，並且許多公司提 供合成服務（例如Abbiotec、AmericanPeptideCompany、AnaSpec、Bachem、Covance ResearchProducts、Invitrogen)。合成之後，典型地通過HPLC將肽純化，不過諸如離子交 換色譜和凝膠過濾色譜等替代純化方法可以使用。可接受的純度是如通過分析型HPLC所 評估至少90 %或至少95 %或至少98 %。
[0065]當蛋白質尚未確定⑶4表位或⑶8表位或兩者的位置時，可合成一組包含整個蛋 白質序列的SLP。各SLP將典型地是約50aa，並且連續SLP可以約25aa依次重疊。或者或 此外，可使用算法和電腦程式來預測將結合於MHCI類和II類分子的序列。所述程序是 可輕易獲得的，例如RANKPEP(Reche等，HumanImmunol63:701，2002)、Epipredict(Jung 等，Biologicals29:179,2001)以及MHCPred(Guan等NuclAcidsRes31:3621,2003 以 及Guan等，ApplBioinformatics5:55, 2006)、EpiMatrix(EpiVax,Inc.)〇 [0066] 可按最佳生產的需要對SLP的序列進行調節。舉例來說，位於衍生自天然序列的 肽的末端的一個或多個胺基酸可省略，以改善溶解度或穩定性，或增加或降低總體費用。作 為一個特定實例，具有高含量的疏水性胺基酸的肽序列可能難以溶解。作為指導，疏水性含 量理想地小於50%。含有半胱氨酸、甲硫氨酸或色氨酸殘基；尤其多個Cys、Met或Trp殘 基的肽可能難以合成。另一種胺基酸（標準或不標準胺基酸，諸如羥基脯氨酸、氨基丁 酸、正亮氨酸）的取代可改善合成效率或純度。設計SLP時的其它考慮因素包括片形 成的程度、N端胺基酸（例如N端Gin可環化）、使鄰近Ser和Pro殘基減到最少。
[0067] 尤其適用於包括於藥物組合物中的一些結構蛋白包括UL19(SEQIDN0.4)、UL19 上域片段（SEQIDNo.12)，UL25(SEQIDN0.5)以及UL47(SEQIDN0.6)。病毒蛋白的結 構可見於NCBI的MMDB(分子模型化資料庫）中。分子結構信息是可獲得的：UL25(MMDB ID: 37706,Bowman等J.Virol. 80:2309,2006,以全文併入）、VP5(UL19 的產物）（MMDB ID:26005,Bowman等，EMB0J. 22:757-765,2003,以全文併入）、VP13/14(UL47 的產物） (MMDBID:6022)以及包膜蛋白gD2(MMDBID:36244，Krummenacher等EMB0J24:4144-4153， 2005,以全文併入）、ICP34. 5以及許多其它HSV-2蛋白。此外，病毒蛋白的一些T細胞 表位是已知的（Koelle等，JVirol74:10930-10938,2000;Muller等，JGenVirol 90:1153-1163,2009;Koelle等，JImmunoll66:4049-4058,2001;BenMohamed等，JVirol 77:9463-9473,2003 ;美國專利號 6,855,317 ;P.C.T.公布號W0 2004/009021，所有的參考 文獻以全文併入）。
[0068] 這些物質中的任一種的免疫原性片段、變體以及融合蛋白均是蛋白質，具體地說 涵蓋尤其UL19、UL19上域片段、UL25以及UL47以用於本文的免疫原性組合物中。因此，本 公開包括SEQIDN0:4、5、6或12中的任一種的片段或變體，其在其至少10個連續胺基酸上 保留至少90%胺基酸同一性，或在其至少15個連續胺基酸上保留至少85%胺基酸同一性。 作為另一個實例，本公開包括包含所述序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、48或50個連續胺基酸或在所述序列的約6-10、10-15、15-20、20-30、 30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100或更多個連續胺基酸之間的免疫原性片 段。本公開還包括在序列的至少50個連續胺基酸上或在序列的至少100個連續胺基酸上具 有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的變體。在一些實施方案中，變體是天然存在的變體，優選地是在嚴格條件下與編碼 SEQIDNO:4、5、6或12中的任一種的多核苷酸雜交的變體。
[0069] 如本文所公開，非包膜結構蛋白（例如如SEQIDNo. 9和10中所闡述的UL19肽 以及如SEQIDN0. 11中所闡述的UL25肽）和包膜蛋白（例如gD2(SEQIDNo. 7和8)的 免疫原性片段（包括肽）可使用或可以是衍生自蛋白質的較長序列（即片段）的一部分。 如本文所用的肽是指胺基酸的短序列，通常至少15個殘基並且通常至多約100個殘基，或 約20個殘基至約80個殘基，或約30個殘基至約70個殘基。如本文所用的片段是指小於 全長蛋白的任何長度的多肽並且通常是至少100個胺基酸長，不過片段的尺寸範圍可與肽 的尺寸範圍重疊（例如約50個殘基長的片段）。具體地說，UL19上域片段丟失了UL19的 第1-450位殘基和第1055-1374位殘基的至少75%、80%、85%、90%、95%或全部。因此， 上域片段可例如在第337-451位殘基中的任一者處開始，並且在第1055-1294位殘基中的 任一者處結束（並且至少缺乏SEQIDN0:4的第1-336位和第1295-1374位胺基酸）。舉 例來說，UL19片段可以是約第451位殘基至約1054(SEQIDN0:12)。UL19上域片段可包 含SEQID勵：12的約50、100、150、200、250、300、350、400、450 或 500 個胺基酸或更多。
[0070] 此外，本文中的肽和片段可融合至異源肽。異源肽的實例包括來自其它蛋白質的 序列（例如在UL19的情況下，UL19上域片段可融合至來自不是UL19的另一種蛋白質的序 列）或標籤序列，諸如六組氨酸，其通常會位於N端或C端。因此，本文所描述的免疫原性 片段或變體可融合至增強免疫原性的另一種肽、充當標籤或標記的另一種肽或來自另一種 HSV-2結構蛋白的另一種肽。因此，免疫原性多肽可包含由HSV-2結構蛋白的指定片段組成 的片段。在一個實例中，免疫原性多肽包含由SEQIDN0:12或SEQIDN0:12的片段組成 的UL19的片段，其任選地融合至非UL19肽。在另一個實例中，免疫原性多肽包含由在SEQ IDNO: 12的50個連續胺基酸上至少80%或90%同一的胺基酸序列組成的肽，其任選地融 合至非UL19肽。
[0071] 出人意料地，本文中的實例顯示UL19上域片段具有引發保護性抗體HSV-2感染的 能力，從而使得UL19蛋白的其餘部分不必作為免疫原。這個出人意料的發現是偶然的，因 為表達全長UL19的嘗試已證明具挑戰性。舉例來說，全長UL19在大腸桿菌（E.coli)中和 其它表達系統表達以及可溶性全長UL19的後續純化已證明是困難的。
[0072] 典型地，藥物組合物中的蛋白質將不同於前體蛋白，因為在真核細胞中的表達將 典型地產生成熟蛋白，其缺少前導序列（也稱為信號肽）。gD的前導序列涵蓋約第1-25位 的殘基。gB的前導序列涵蓋約第1-22位的殘基。糖蛋白D(SEQIDNo. 2)是393胺基酸蛋 白並且具有跨越約第26-340位殘基的胞外區、跨越約第341-361位殘基的跨膜區以及跨越 約第362-393位殘基的胞質區，以及許多位於第119、146、287位殘基處的N-鍵聯糖基化位 點（UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q69467,條目中的型式49和序列中的型式1)。示例性 gD片段（本文中替代地稱為gD2)包含顯示於SEQIDNO. 3中的序列。
[0073] 在一些實施方案中，來自包膜糖蛋白的抗原片段和免疫原性片段可包含部分或全 部的前導序列，其有時稱為信號肽。前導序列通常是約15-20個胺基酸，並且在正常細胞 代謝過程中，其可能由細胞設備裂解掉，然而，在完整病毒體中糖蛋白中的一些可具有前導 序列。前導序列通常在N端具有一些極性胺基酸並且內部胺基酸通常是疏水性的。如上文 所論述，已確定HSV-2包膜糖蛋白中的一些的前導序列。對於其它HSV-2包膜糖蛋白，可使 用電腦程式來預測信號肽。這些程序中的一些包括SIG_Pred(bmbpcu36.leeds.ac.uk/ prot_analysis/Signal.html) >PrediSi(www.predisi.de) >OCTOPUS(octopus,cbr.su.se) 以及sigcleave(emboss,sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/sigcleave.html) 〇
[0074] 多種技術可用於抑制在用於本文所描述的組合物中的含有前導序列的抗原片段 或免疫原性片段的細胞產生期間信號肽的裂解。舉例來說，在裂解位點形成側翼的一個或 多個胺基酸可改變成不同胺基酸，從而使得序列不被細胞設備識別或裂解。對於此方法，根 據本領域中已知的裂解位點設計變化：甘氨酸不優先用於所述位置中的任一種，酪氨酸很 少可見於在裂解位點之後的最前幾個位置中，然而脯氨酸往往可見於除+1位置外的許多 裂解位點中，並且穀氨醯胺通常可見於+1殘基處（Zhang和Henzel，ProteinSci. 13:219， 2004)。所提出的序列可用預測程序評估以確定是否有可能抑制裂解。如果裂解有可能，那 麼作出其它改變並且對新提出的序列進行再評估。用於抑制信號肽裂解的其它技術包括在 識別序列和裂解序列處添加一個或多個胺基酸、N端添加信號肽以及識別序列以使得所添 加的信號肽優先裂解以及在缺少用於裂解信號肽的機制的宿主細胞中產生。
[0075] 在某些實施方案中，片段包含HSV-2糖蛋白，其包括前導序列。在其它實施方案 中，片段包含HSV-2糖蛋白的一部分，其包括前導序列到跨膜域的起點。在其它實施方案 中，片段包含HSV-2糖蛋白的一部分，其包括前導序列並且在胞外域內結束。在其它實施方 案中，片段包含HSV-2糖蛋白的非連續部分，其中所述部分中的一者包含位於前導序列中 的抗原表位。在其它實施方案中，片段包含HSV-2糖蛋白的非連續部分，其中所述部分包含 表位或者其包含來自不同HSV-2糖蛋白的部分，其中所述部分包含表位。
[0076] 糖蛋白B(SEQIDNO. 1)具有跨越約第23-771位殘基的胞外區、跨越約第772-792 位殘基的跨膜區以及跨越約第793-904位殘基的胞質區，以及許多位於第82、136、393、 425、486、671位殘基處的N-鍵聯糖基化位點（UniProtKB/Swiss-Prot登錄號P08666,條目 中的型式60和序列中的型式2)。糖蛋白K是一種在其N端具有30胺基酸前導序列的338 胺基酸蛋白（RamaswarmyandHolland，Virology186:579-587,1992)。糖蛋白C具有經 預測的第27位胺基酸前導序列，糖蛋白E具有經預測的第23位胺基酸前導序列，並且糖蛋 白L具有經預測的第16位胺基酸前導序列（SignalPeptideResource，proline.bic.nus. edu.sg，2011 年 10 月 06 日錄入）。
[0077] 蛋白質或蛋白質片段優選地是免疫原性的。"免疫原"能夠誘導免疫反應。在至少 一些血清陽性受試者中，免疫原性肽序列通常由T細胞（例如⑶4或⑶8T細胞）識別。肽 序列可通過通常使用一系列重疊肽來篩檢衍生自完整序列的肽來識別。多種分析可用於確 定T細胞是否識別並且對應於一種肽。舉例來說，鉻釋放細胞毒性分析（Kim等，JImmunol181:6604-6615,2008,其分析方案併入本文中）、ELISP0T分析（一種細胞內細胞因子染 色分析）以及MHC多聚體染色（Novak等JClinInvest104:R63_R67,1999;Altman等， Science274:94-96,1996)是適合的分析之中的。在一些情況下，片段包含免疫優勢肽序 列。已針對HSV-2糖蛋白和結構蛋白識別了一些免疫優勢表位（例如Kim等JImmunol 181:6604-6615,2008;Chentoufi等，JVirol. 82:11792-11802,2008;Koelle等，ProcNatl AcadSciUSA100:12899-12904,2003;所有參考文獻均以全文形式併入本文中）。免 疫原性肽還可以通過生物信息學軟體來預測（Flower,MethodsinMolecularBiology 第409卷，2007)。一些不例性程序和資料庫包括FRED(Feldhahn等Bioinformatics 15:2758-9,2009)、SVMHC(D6nnes和Kohlbacher，NucleicAcidsRes34:W1940197， 2006)、AntigenDB(Ansari等，NucleicAcidsRes38:D847-853,2010)、TEPITOPE(Bianand HammerMethods34:468-475,2004)。
[0078]可併入HSV-2蛋白中的任一種（包括前體蛋白、成熟蛋白以及片段，包括肽）作為 融合蛋白的一部分。融合伴侶可以是HSV-2蛋白或非HSV-2蛋白序列中的任一種。一些常 見的使用融合蛋白的原因是為改善所得蛋白質的表達或幫助其純化。舉例來說，可將適合 於表達系統的宿主細胞的信號肽序列連接至HSV-2蛋白或可連接用於蛋白質純化的標籤 序列，並且隨後如果還併入了裂解序列，那麼進行裂解。可融合來自蛋白質中的一種或多種 的多個肽表位，或者可融合來自蛋白質中的一種或多種的片段。舉例來說，可連接結構蛋白 或結構蛋白的片段，諸如融合蛋白VP13/14(UL47)和主要衣殼蛋白（UL19)或UL25和UL47 或UL25以及UL19。融合蛋白的片段可以呈任何順序（這是對於UL19和UL47的融合體來 說），任一種蛋白質均可位於N端。類似地，多個肽表位可以呈任何順序。
[0079]HSV-2蛋白（包括前體蛋白、片段以及融合蛋白）的製造通常是通過在培養細胞中 表達或通過化學合成來實現。（"HSV-2蛋白"在本文中用於包括所有這些形式。）短片段通 常是使用機械加工（許多是可商購獲得的）或人工地化學合成的。如果通過細胞來產生，那 麼多種適合的表達系統（原核與真核系統兩者）是熟知的並且可以使用。常常使用並且適 合用於產生蛋白質的宿主細胞包括大腸桿菌、酵母、昆蟲以及哺乳動物。表達載體和宿主細 胞是可商購獲得的（例如InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA，USA)或可構建的。示例性載體 包含啟動子和編碼所關注的蛋白質的序列的克隆位點，使得啟動子和序列可操作地連接。 可存在其它元件，諸如分泌信號序列（有時稱為前導序列）、標籤序列（例如hexa-His)、轉 錄終止信號、複製起點（尤其如果載體是染色體外複製）以及編碼可選產物的序列。用於 轉染宿主細胞的方法和程序也是熟知的。
[0080] 收集所表達的蛋白質並且"按原樣"使用或更典型地進行分析以及進一步純化。用 於測定純度或量的典型程序包括凝膠電泳、西方墨點法、質譜法以及ELISA。蛋白質的活性 通常是在諸如實施例中所描述的生物分析中進行評估。必要或需要時，可將蛋白質進一步 純化。許多純化方法是熟知的並且包括尺寸色譜法、陰離子或陽離子交換色譜法、親和色譜 法、沉澱以及免疫沉澱。蛋白質的預期用途典型地將決定純化程度，其中用於人類中可能需 要最高水平的純度。
[0081] B.激活先天免疫的試劑
[0082]先天免疫系統包含以非特異性方式針對由其它有機體引起的感染提供防禦的細 胞。先天免疫是即刻防禦，但其針對將來的激發不持久或具保護性。在先天免疫中通常發 揮作用的免疫系統細胞是吞噬細胞，諸如巨噬細胞和樹突狀細胞。先天免疫系統以多種方 式與適應性（也稱為後天）免疫系統相互作用。先天免疫系統的細胞可參與抗原呈現於適 應性免疫系統的細胞，包括表達激活其它細胞的淋巴因子、放出吸引可對侵入物具特異性 的細胞的趨化性分子以及分泌補充和激活適應性免疫系統的細胞的細胞因子。本文所公開 的免疫原性藥物組合物包括激活先天免疫的試劑，以提高組合物的有效性。
[0083] 許多類型的試劑均可激活先天免疫。像細菌和病毒等有機體可激活先天免疫，正 如有機體的組分、諸如2'-5'寡腺苷酸（2' -5'oligoA)等化學品、細菌內毒素、RNA雙鏈、 單鏈RNA以及其它分子。許多試劑通過Toll樣受體（TLR)分子家族起作用。使TLR參與 還會引起細胞因子和趨化因子的產生並且使得與後天免疫的發展有關的組分樹突狀細胞 激活和成熟。TLR家族可對多種試劑作出反應，所述多種試劑包括脂蛋白、肽葡聚糖、鞭毛 蛋白、咪唑喹啉、CpGDNA、脂多糖以及雙鏈RNA(Akira等BiochemicalSocTransactions 31:637-642,2003)。這些類型的試劑有時稱為病原體（或微生物）相關分子模式。
[0084] 在一個方面中，一種或多種佐劑包括於組合物中，以提供激活先天免疫的試劑。佐 劑是併入抗原或與抗原同時施用並且增加免疫反應的物質。已提出多種機制來解釋不同佐 劑如何工作（例如抗原藥性持久劑；樹突狀細胞、巨噬細胞激活劑）。在不希望受理論限制 的情況下，一種機制涉及激活先天免疫系統，從而引起趨化因子和細胞因子的產生，這進而 又激活適應性（後天）免疫反應。具體地說，一些佐劑通過TLR激活樹突狀細胞。因此，佐 劑是一種類型的激活先天免疫系統的試劑，其可用於針對HSV-2的疫苗中。佐劑也可以其 它方式發揮作用以增強後天免疫反應。優選地，佐劑是TLR4激動劑。
[0085] 一種可用於本文所描述的組合物中的佐劑是一元酸脂質A(MALA)型分子。示例性 MALA是如例如UlrichJ.T?和Myers，K.R.，"MonophosphorylLipidAasanAdjuvant，' 第 21 章，VaccineDesign,theSubunitandAdjuvantApproach,Powell,M.F?和Newman, M.J.編著PlenumPress，NY1995中所描述的MPL?佐劑。另一種示例性MALA由化學式 ⑴描述：

【權利要求】
1. 一種HSV-2多肽的免疫原性片段，其選自： (a) UL19多肽的免疫原性片段，其缺乏SEQ ID NO: 4的第1-450位胺基酸中的至少75% 並且缺乏SEQ ID NO:4的第1055-1374位胺基酸中的至少75% ; (b) SEQ ID N0:12中所示的序列； (c) (a)或（b)的免疫原性變體，其在至少15個連續胺基酸上保持至少85%胺基酸同 一I"生； (d) (a)或（b)的免疫原性片段；以及 (e) (a)、（b)、（c)或⑷的嵌合融合體。
2. -種分離的多核苷酸，其編碼如權利要求1所述的多肽。
3. -種免疫原性藥物組合物，其包含： (i) HSV-2多肽的免疫原性片段，其選自： (a) UL19多肽的免疫原性片段，其缺乏SEQ ID NO: 4的第1-450位胺基酸中的至少75% 並且缺乏SEQ ID NO:4的第1055-1374位胺基酸中的至少75% ; (b) SEQ ID N0:12中所示的序列； (c) (a)或（b)的免疫原性變體，其在至少15個連續胺基酸上保持至少85%胺基酸同 一I"生； (d) (a)或（b)的免疫原性片段；以及 (e) (a)、（b)或（c)的嵌合融合體； (ii) 任選地，激活先天免疫的試劑；以及 (iii) 藥學上可接受的載體。
4. 如權利要求3所述的組合物，其進一步包含UL25或其免疫原性片段。
5. 如權利要求3和4中任一項所述的組合物，其進一步包含gD2或其免疫原性片段。
6. 如權利要求3-5中任一項所述的組合物，其中所述試劑是佐劑。
7. 如權利要求6所述的組合物，其中所述佐劑是GLA。
8. 如權利要求7所述的組合物，其中所述GLA呈水包油乳液形式或呈水溶液形式。
9. 如權利要求8所述的組合物，其中所述水包油乳液包含角鯊烯。
10. -種用於治療受試者的HSV-2感染的方法，其包括向所述受試者施用如權利要求 3-9中任一項所述的組合物。
11. 一種在受試者中產生免疫反應的方法，其包括向所述受試者施用如權利要求3-9 中任一項所述的組合物。
12. -種使受試者針對HSV-2免疫的方法，其包括向所述受試者施用如權利要求3-9中 任一項所述的組合物。
13. 如權利要求9-12中任一項所述的方法，其中施用途徑是真皮內、經黏膜、肌肉內、 皮下、舌下、直腸或陰道。
14. 如權利要求9-13中任一項所述的方法，其進一步包括向所述受試者施用如權利要 求3-9中任一項所述的第二、第三或第四組合物。
【文檔編號】G01N33/569GK104412108SQ201380036258
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年5月16日 優先權日:2012年5月16日
【發明者】小託馬士·W.·杜賓斯基, 南西·A.·胡思肯, 史考特·H.·羅賓斯, 瑪格莉特·D.·莫瑞 申請人:免疫設計公司