一種快速鑑定平頭炭疽病菌的分子檢測方法以及應用的製作方法
2023-11-09 22:04:42
一種快速鑑定平頭炭疽病菌的分子檢測方法以及應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及對戊唑醇和腈菌唑具有天然不敏感性的辣椒平頭炭疽病菌(C.truncatum)的快速檢測和鑑定及其在田間病害防治中的科學用藥的應用。具體公開了一種快速檢測和鑑定辣椒平頭炭疽病菌(C.truncatum)的分子檢測方法及專用引物。該特異性引物對，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的DNA分子組成。本發明提供的檢測和鑑定辣椒平頭炭疽病菌(C.truncatum)的分子檢測方法，具有快速、穩定、準確的特點，可以用於高通量地檢測和鑑定田間是否存在平頭炭疽病菌(C.truncatum)，這對炭疽病的科學有效防治具有重要的指導意義。
【專利說明】一種快速鑑定平頭炭疸病菌的分子檢測方法以及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及炭疽病菌（Colletotrichum truncatum)分子檢測、鑑定以及在平頭炭 疽導致的炭疽病防治中藥劑選擇的應用，具體公開一種快速鑑定對戊唑醇和腈菌唑具有天 然不敏感性的平頭炭疽病菌C. truncatum的方法和專用引物，屬於分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 炭疽病菌（Colletotrichum truncatum)是一種重要的病原菌，可以侵染超過460 種植物，同時也可以引起人體的疾病，該病原菌引起的植物病害-炭疽病在世界各地均有 廣泛報導，每年給農業生產帶來嚴重的損失。我國是世界上辣椒重要的生產國家，由該病原 菌引起的辣椒炭疽病，是我國辣椒上的重要病害，每年給我國辣椒生產造成嚴重損失，減產 可達 30-40 % (http://faostat. fao. org, http://nt. ars-grin. gov/fungaldatabases/, Qing L et al. ,2005)。
[0003] 該病害的防治目前包括農業措施，抗病育種以及化學防治，其中化學防治仍然是 最主要和最有效的防治手段，在眾多防治藥劑中，唑類藥劑是使用最廣泛的藥劑，其在農業 和醫學上均被大量使用。在我國炭疽病防治中，唑類藥劑也是登記藥劑品種最多的一類殺 菌劑，該類藥劑的作用靶標是留醇生物合成途徑中的cyp51蛋白，它們在真菌病害的防治 中表現處優異的防治效果，較少有田間抗性報導。戊唑醇和腈菌唑也是其中最常用的藥劑 之一。引起炭疽病的病原菌有炭疽屬內的多個種（Colletotrichum spp.)，其中，平頭炭疽 病菌（Colletotrichum truncatum)是我國很多地區炭疽病菌中的優勢種，但本研究通過前 期進行的藥劑敏感性測定研究發現，戊唑醇和腈菌唑對C. truncatum菌絲生長的抑制率很 差，而對其它幾種常見炭疽病菌的抑菌活性很高，即平頭炭疽病菌（C. truncatum)對戊唑 醇和腈菌唑具有天然不敏感性，如果田間引起炭疽病的優勢種群是平頭炭疽病菌，則生產 中病害的防治就需要選用其它藥劑，而不能盲目使用戊唑醇和腈菌唑進行病害防治，因此 該病原菌的快速鑑定和分子診斷顯得尤為重要。
[0004] 目前該病原菌的鑑定主要通過形態學和多基因測序聯合建樹進行鑑定，由於需要 對菌株選用多個基因進行測序，因此導致鑑定周期較長，實用性較差。如果當需要鑑定的菌 株數量較大時，導致鑑定成本較高，工作量也很大，試驗周期較長，影響病原診斷的速度。
[0005] 因此發明一種快速準確的檢測方法就顯得尤為重要，即可以節省鑑定成本，縮短 鑑定周期，明顯提高檢測效率，有利於為田間病害的科學有效防治提供更快速準確的指導。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種鑑定C. truncatum的分子檢測方法及其特異性引物。
[0007] 本發明提供的分子檢測和鑑定C. truncatum的方法包括如下步驟：
[0008] 以待測炭疽病菌的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的特 異引物對CCCYP51F，CCCYP51R進行PCR擴增，若PCR擴增產物為1721bp的條帶，則所述待 測菌株為C. truncatum。
[0009] 上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為59°C。
[0010] 上述鑑定專用引物對屬於本發明的保護範圍。
[0011] 上述應用中，經鑑定為C. truncatum的菌株對戊唑醇和腈菌唑具有天然抗性。
[0012] 本發明所提供的檢測和鑑定炭疽病菌（C. truncatum)的方法，有助於快速、準確 地檢測和鑑定田間炭疽病菌中是否存在C. truncatum以及其是否是優勢種群，為田間合 理、科學用藥提供技術支持，便於及時調整病害防治策略，以更有效的防治該病害。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1為特異引物對CCCYP51F，CCCYP51R對引起我國辣椒炭疽病的主要幾種炭疽 病菌進行PCR擴增的結果。每個種選了三株菌株，點樣孔2-4為C. truncatum，1700bp處目 的條帶單一 ；5_16 分別為 C. gloeosporioides，C. fructicola，C. scoveillie，C. fioriniae。 無條帶擴增出。
【具體實施方式】
[0014] 下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0015] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0016] 下述實施例中使用的炭疽菌株均來自全國多個地區，菌株種類為：C. truncatum, C. gloeosporioides, C. fructicola, C. scoveillie, C. fioriniae,數量均為 50 株。
[0017] 上述菌株採自中國多個辣椒種植區。通過發病症狀及現有的形態學初步鑑定為炭 疽病菌。
[0018] 上述各個菌株均經過菌落生長測定法進行敏感性測定。
[0019] 實施例1、炭疽病菌對戊唑醇和腈菌唑的敏感性測定
[0020] 炭疽菌株均來自全國多個地區，菌株種類為：C. truncatum, C. gloeosporioides， C. fructicola，C. scoveillie，C. fioriniae 數量均為 50 株。
[0021] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA)培養基：馬鈴薯200g，瓊脂粉13g，葡萄糖18g，蒸餾水定 容至1L，121°C溼熱滅菌20分鐘。
[0022] 1、實驗步驟如下：
[0023] 1)將戊唑醇和腈菌唑用甲醇配成IO5 μ g/ml的母液。對於辣椒炭疽病菌對戊唑 醇的敏感性測定，將戊唑醇逐級稀釋成1〇〇μ g/mL，500y g/mL，1000y g/mL，2. 5Χ103μ g/ mL，5X103y g/mL，10X103y g/mL，20X 103y g/mL的濃度梯度；對於辣椒炭疽病菌對腈菌 唑的敏感性測定，將供試藥劑腈菌唑逐級稀釋成2. 5 X 103ug/mL，5 X IO3 μ g/mL，IO4 μ g/mL， 2 X IO4 μ g/mL，4X IO4 μ g/mL，8 X IO4 μ g/mL，IO5 μ g/mL 的濃度梯度。
[0024] 2)辣椒炭疽病菌對戊唑醇和腈菌唑的敏感性測定方法：用移液槍吸取藥液60 μ I 加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml PDA培養基中，使溶劑含量為1%。，混勻，將帶藥的培養基 倒入直徑為9cm的培養皿中，設只加60 μ 1甲醇的處理為空白對照，每個比例藥劑設3次重 復；
[0025] 3)辣椒炭疽病菌在PDA平板上培養5天後，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為 0. 5cm的菌餅，菌絲面向下接種於步驟2)中的帶藥和對照培養基中，置於28°C培養箱中黑 暗培養，4d後測量菌落直徑。
[0026] 4)十字交叉法測量菌落直徑，根據菌落平均直徑值計算出各復配比例對供試菌株 的菌絲生長的抑制率。然後將抑制率轉化成機率值（Y)，藥劑濃度轉換成以10為底的對數 值（X)，在Microsoft Excel中作回歸直線，分別求出供試辣椒炭疽菌株的毒力回歸曲線方 程Y = a+bX，以及相關係數r和有效抑制中濃度EC5tl值，並計算每一種炭疽病菌的平均EC5tl 值和標準差。
[0027] 2、結果
[0028] 表1炭疽屬不同種的辣椒炭疽菌株對戊唑醇和腈菌唑的敏感性
[0029]
【權利要求】
1. 一種快速鑑定平頭炭疽病菌的分子檢測方法以及應用，包括如下步驟： 以待測辣椒炭疽病菌的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示引物 對CCCYP51F和CCCYP51R進行PCR擴增，若能成功擴增出1721bp的條帶，則所待鑑定的辣 椒炭疽病菌為 Colletotrichum truncatum。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述PCR擴增中，退火溫度為59°C。
3. -種快速檢測和鑑定辣椒炭疽病菌中是否存在C. truncatum的引物對，由CCCYP51F 和CCCYP51R所示DNA分子組成。
4. 權利要求1或2所述引物對和方法在檢測和鑑定辣椒平頭炭疽病菌（C. truncatum) 對殺菌劑不敏感性中的應用；所述不敏感性為抗戊唑醇和腈菌唑。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於：辣椒平頭炭疽病菌（C. truncatum)具有 天然對戊唑醇和腈菌唑的不敏感性。 6. SEQ ID NO :3所示基因。 7. SEQ ID NO :4所示蛋白。
【文檔編號】C12Q1/06GK104293924SQ201410485680
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月23日 優先權日:2014年9月23日
【發明者】劉西莉, 刁永朝, 張燦, 劉利, 王為鎮, 劉鵬飛, 黃中喬 申請人:中國農業大學