一種分離純化皮膚表皮幹細胞的方法
2023-12-04 18:54:26
專利名稱：一種分離純化皮膚表皮幹細胞的方法
技術領域：
本發明屬生物醫學工程中人類和哺乳動物成體幹細胞分離純化技術領域，具體涉及一種人類和哺乳動物皮膚表皮幹細胞的分離純化、擴增等方法。
背景技術：
表皮幹細胞(Epidermal stem cells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潛能的幹細胞，它的正常增殖和分化是維持皮膚及其附屬器(汗腺毛髮、皮脂腺)結構和功能完整性的基本要求。在生理條件下，表皮幹細胞通過不對稱分裂方式分化為一個幹細胞和一個短暫擴充細胞(transit amplifying cellsTA細胞)，TA細胞再經過多次分裂後分化為有絲分裂後細胞(Post-mitotic cells)及終末分化細胞(terminally-differentiated cells)，以補充表皮細胞不斷更新的需要。研究表明表皮幹細胞不僅能在體外長期傳代培養，並保持其增殖分化潛能(Dunnwald et al，Exp Dermatol，2001，1045-54.Papini et al.stemcells，2003，21481-494)，而且，在一定環境條件下還表現出與胚胎幹細胞相似的分化潛能[Liang et al，stem cells，20022021-31]。因此，獲得純化的表皮幹細胞不僅可為構建有生理功能的人工皮膚提供種子細胞，而且可用於基因治療和轉基因動物的生產。然而，分離純化表皮幹細胞至今仍是一個難題。國內外學者普遍採用酶消化法，獲得含有表皮幹細胞的混合細胞群。根據表皮幹細胞對特異底物的粘附性[Jones.et al.cell.1993，73(4)713-724；Bickenbach et al，Exp cellRes.1998.224(1)184-185]，或用一些表皮幹細胞的相關標誌物或特殊染色劑對表皮幹細胞進行標記，用流式細胞儀進行分選[Li et al，PNAS，1998，95(7)，3902-3907，Tani et al，PNAS，2000，97(20)10960-10965。Dunnwald et al，Exp Dermatol 2001，1045-54]。由於還沒有找到一種能精確反映表皮幹細胞的特異性分子標記，上述分離方法很難將表皮幹細胞與TA細胞完全分開。探索一種有效安全的分離純化表皮幹細胞的方法仍是本領域的技術人員面臨的一大難題[AlonsoL and Fuchs E，www.PNAS.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1734203100]。
發明內容
為了克服現有技術中採用的組織塊培養法和酶消化法獲得的是混合細胞群的缺點，根據表皮幹細胞克隆性生長的特性，本發明的目的是提供一種採用組織塊培養法與克隆篩選法相結合，不藉助任何化學試劑及複雜儀器而達到安全有效分離純化表皮幹細胞的方法。
為了實現上述目的，本發明採取如下的技術解決方案一種分離純化皮膚表皮幹細胞的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)首先將已脫離人或動物的皮膚，置於含青鏈素各500U/ml的生理鹽水中帶回實驗室，在超淨工作檯上用生理鹽水衝洗，去血汙及毛髮；2)在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開，將皮膚切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小塊，按上皮面朝上貼於直徑為60mm玻璃平皿中，每皿3-4塊，加培養基；所述培養基的配方為90％Medium199+10％FBS+10μg/mlinsulin+10ng/mL LIF+1～1.5μg/mL氫化可的松+100U/mL青黴素+100U/mL鏈黴素；3)置於CO2培養箱中培養，培養箱內的條件為5％CO2，飽和溼度，37℃，每兩天換液一次；4)經3～4天後，從組織塊邊緣長出上皮樣細胞鋪路石樣生長，7～12天後，在上皮樣細胞層上有小圓形細胞聚集呈克隆樣生長，待這些克隆直徑達約100～150μm時，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin處理，用玻璃針將這些細胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用無血清培養基培養；無血清培養基的配方為100％F12+(1％～1.2％)BSA+(20～25ng/ml)EGF+5ug/ml insulin+(15～20ng/ml)IGF-1+20ng/mL LIF+0.05μg/mL氫化可的松+100U/mL青黴素+100U/mL鏈黴素；5)待細胞增殖達70～80％融合時，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA進行消化，傳代培養，即用上述無血清培養基將關中奶山羊表皮幹細胞傳25代凍存，或用上述無血清培養基將人類表皮幹細胞傳15代凍存；6)對所獲得細胞進行當前同行公認的表皮幹細胞分子標誌的檢測CK19，β1-integrin-P63，α6-integrin均為陽性，即證明所分選的是純化的表皮幹細胞。
本發明在皮膚組織塊培養過程中採用自行設計的培養基能有效抑制成纖維細胞的生長，從組織塊四周生長出均一的上皮樣細胞，誘發表皮幹細胞遷移出原來的微環境，在新生成的上皮樣細胞層上重新聚集生長。這類克隆性生長的細胞與其依賴的飼養層細胞有明顯形態學上的差別。藉助解剖鏡和玻璃針就能將其挑選出來，進行單獨擴增培養。
本發明克服了傳統酶消化法的缺點，直接利用幹細胞的生物學行為獲得純化的表皮幹細胞，是一種有效安全的分離純化表皮幹細胞的方法，可用於人類和哺乳動物表皮幹細胞的分離純化。
圖1是組織塊培養獲得關中奶山羊原代表皮幹細胞克隆，X200；圖2是第二代關中奶山羊表皮幹細胞α6-integrin陽性，x100圖3是第二代關中奶山羊表皮幹細胞β1-integrin陽性，X200；圖4是第二代關中奶山羊表皮幹細胞CK19陽性，X100；圖5是第二代關中奶山羊表皮幹細胞P63陽性X400。
以下結合實施例對本發明作進一步的描述。
具體實施例方式
本發明是基於發明人在長期實驗研究中發現皮膚組織在申請人設計的培養基中培養7～12天後，從皮膚組織中遷移出來一些體積小、核質比高、折光性強的球形細胞，在鋪路石樣生長的上皮細胞層上增殖形成克隆，其形態特徵和生長方式與分化的上皮細胞有明顯差別，因此而發明的一種新的分離純化表皮幹細胞的方法，具體包括下列步驟1)首先將從醫院或屠宰場收集的人或動物的皮膚，置於含青鏈素各500U/mL的生理鹽水中帶回實驗室，在超淨工作檯上用生理鹽水衝洗，去血汙及毛髮；2)在解剖鏡下(Olmpus Tokyo 305047，Made In Japan)將皮膚與皮下組織分開，將皮膚切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小塊，按上皮面朝上貼於直徑為60mm玻璃平皿或塑料皿中，每皿貼3～4塊，在37℃恆溫臺上放置15～20分鐘後加培養基1～2mL；培養基的配方為90％Medium199(Gibco，Lot No.1129880)+10％FBS(胎牛血清，鄭州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+10μg/ml insulin(胰島素，購自北京鼎國生物技術有限責任公司，http//www.digguo.com，Sigma分裝，原產品編號為15500)+10ng/mL LIF(白血病抑制因子，Stem CellTechnologies，Lot 2A083629)+1～1.5μg/mL氫化可的松+100U/mL青黴素(購自哈藥集團製藥總廠，批號B01124412)+100U/mL鏈黴素(硫酸連黴素購自華北製藥股份有限公司，批號010724)；3)置於CO2培養箱(WTB CO2培養箱，美國)中培養，培養箱內的條件為5％CO2，飽和溼度，37℃，每兩天換液一次。
4)經3～4天後，從組織塊邊緣長出上皮樣細胞鋪路石樣生長，7～12天後，在上皮樣細胞層上有小圓形細胞聚集呈克隆樣生長，待這些克隆直徑達約100μm～150μm時，在解剖鏡(Olympus Tokyo，305047，Made in Japan)下用玻璃針將這些細胞克隆與其下面的滋養層細胞分離，用吸胚管將細胞克隆移到盛有0.5mL 0.20％Trypsin(胰蛋白酶)的檢胚杯中處理3～5分鐘後，用培養液中和。在解剖鏡下用玻璃針將克隆離散成單個細胞或小細胞團。用吸胚管將細胞吸入鋪有明膠(Sigma，Lot50K02505)的3.5cm塑料皿(CELLSTAR Lot 02030151)中，用無血清培養基培養；無血清培養基的配方為100％F12(Initrogen CorporationLot1116568)+(1％～1.2％)BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+(20～25ng/ml)EGF(表皮細胞生長因子，Sigma，[email protected]，Product Number E 9644)+5ug/ml insulin(胰島素)+(15～20ng/ml)IGF-1胰島素類生長因子-1，[email protected]，product Number I3769)+20ng/mLLIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+0.05μg/ml氫化可的松+100U/mL青黴素(購自哈藥集團製藥總廠，批號B01124412)+100U/mL鏈黴素(硫酸連黴素購自華北製藥股份有限公司，批號010724)；5)待細胞增殖達70～80％融合時，用0.2％Trypsin(胰蛋白酶1∶250，華美生物工程公司)+0.02％EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)進行消化，傳代培養。
6)對所獲得細胞進行當前同行公認的表皮幹細胞分子標誌的檢測CK19(角蛋白19，Sigma，sigma-aldrich.com，Product Number C6930)，β1-integrin(整合素-β1Product Number I 8638)，p63(SantaCruz Biotechnology，Inc.4A4sc-8431)，α6-integrin(整合素-α6，Sigma，CD49f，VLA-6a，Product Number I6653)均為陽性，證明所分選的是純化的表皮幹細胞。
本發明的方法所獲得的關中奶山羊表皮幹細胞繫於2004年9月14日送中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏編號C200412，該中心於2004年12月10日檢測結果為存活。申請人提供該中心2006年3月9日提供的受理通知書複印件。
以下是發明人給出的具體實施例。
實施例1關中奶山羊表皮幹細胞的分離純化擴增在經正常屠宰死亡後(30分鐘內)的關中奶山羊(2.5-3.5歲)耳中部血管相對較少處，刮毛消毒，用耳號鉗剪下一塊大小約0.5×0.5cm2的皮膚，置於含青鏈素各500μ/ml的生理鹽水中帶回無菌間，用生理鹽水衝洗數遍，去血汙及毛髮。在解剖鏡下將皮膚與軟骨分開，將皮膚切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小塊，按上皮面朝上貼於直徑為60mm玻璃平皿中，每皿3-4塊，在37℃恆溫臺上放置15～20分鐘後加培養基1～2mL，培養基的配方為90％Medium199(Gibco，LotNo.1129880)+10％FBS(新生牛血清，鄭州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+10μg/ml insulin(胰島素，購自北京鼎國生物技術有限責任公司，http//www.digguo.com，Sigma分裝，原產品編號為15500)+10ng/mL LIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+(1～1.5μg/ml)氫化可的松+100u/mL青黴素(購自哈藥集團製藥總廠，批號B01124412)+100u/mL鏈黴素(硫酸連黴素購自華北製藥股份有限公司，批號010724)，置於CO2培養箱(5％CO2，飽和溼度，37℃)中培養，每兩天換液一次。3～4天後，從組織塊邊緣長出上皮樣細胞鋪路石樣生長，7～12天後，在上皮樣細胞層上有小圓形細胞聚集呈克隆樣生長(圖1)，待這些克隆直徑達約100～150μm時，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin適當處理，用玻璃針將這些細胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用自行設計的無血清培養基培養，100％F12(InitrogenCorporation Lot1116568)+(1～1.2％)BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT716H9310)+(20～25)ng/ml EGF(表皮細胞生長因子，Sigma，[email protected]，Product Number E 9644)+5ug/ml insulin(胰島素)+(15～20)ng/ml IGF-1胰島素類生長因子-1，[email protected]，product Number I3769)+20ng/mLLIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+0.05μg/ml氫化可的松+100U/mL青黴素(購自哈藥集團製藥總廠，批號B01124412)+100U/mL鏈黴素(硫酸連黴素購自華北製藥股份有限公司，批號010724)；待細胞增殖達70～80％融合時，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA進行消化，傳代培養，用無血清培養基將關中奶山羊表皮幹細胞傳25代凍存，幹細胞鑑定採用免疫組織化學法檢測β1-integrin(整合素β1)，CK-19(角蛋白19)，p63，α6integrin，具體操作按北京中山生物試劑有限公司免疫組化染色試劑盒(HistostainTMPius Kits)說明書進行，結果表明所得到的幹細胞β1-integrin，CK-19，p63，α6-integrin均為陽性(圖2-5)。
圖1是採用本發明的方法中組織塊培養獲得關中奶山羊原代表皮幹細胞克隆，X200；圖2是原代關中奶山羊表皮幹細胞α6integrin陽性，X100；圖3是第一代關中奶山羊表皮幹細胞β1-integrin陽性，X200；圖4是第二代關中奶山羊表皮幹細胞CK-19陽性，X100；圖5是第二代關中奶山羊表皮幹細胞p 63陽性X400。
實施例2人類表皮幹細胞的分離純化擴增取醫院小兒包皮環切術後廢棄的一塊大小約0.5×0.5cm2的皮膚，置於含青鏈黴素各500U/ml的生理鹽水中帶回無菌間，用生理鹽水衝洗數遍，去血汙。在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開，將皮膚切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小塊，按上皮面朝上貼於直徑為60mm玻璃平皿中，每皿3-4塊，在37℃恆溫臺上放置15～20分鐘後加培養基1～2mL，培養基的配方為Medium19990％+10％FBS(新生牛血清，鄭州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+10μg/ml insulin(胰島素，購自北京鼎國生物技術有限責任公司，http//www.digguo.com，Sigma分裝，原產品編號為15500)+10ng/mL LIF(StemCell Technologies，Lot2A083629)+1-1.5μg/ml氫化可的松+100u/mL青黴素(購自哈藥集團製藥總廠，批號B01124412)+100u/mL鏈黴素(硫酸連黴素購自華北製藥股份有限公司，批號010724)，置於CO2培養箱(5％CO2，飽和溼度，37℃)中培養，每兩天換液一次。3～4天後，從組織塊邊緣長出上皮樣細胞鋪路石樣生長，7～12天後，在上皮樣細胞層上有小圓形細胞聚集呈克隆樣生長(圖1)，待這些克隆直徑達約100～150μm時，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin適當處理，用玻璃針(自製)將這些細胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用自行設計的無血清培養基培養，無血清培養基的配方為F12100％(Initrogen CorporationLot1116568)+(1～1.2％)BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+(20～25ng/ml)EGF(表皮細胞生長因子，Sigma，[email protected]，Product Number E 9644)+5ug/ml insulin(胰島素)+(15～20ng/ml)IGF-1胰島素類生長因子-1，[email protected]，product Number I3769)+20ng/mLLIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+0.05μg/ml氫化可的松+100U/mL青黴素(購自哈藥集團製藥總廠，批號B01124412)+100U/mL鏈黴素(硫酸連黴素購自華北製藥股份有限公司，批號010724)；待細胞增殖達70～80％融合時，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA進行消化，傳代培養，用無血清培養基將成人包皮來源的表皮幹細胞傳15代凍存，幹細胞鑑定採用免疫組織化學法檢測β1-integrin(整合素β1)，CK19(角蛋白19)，P63，α6integrin，具體操作按北京中山生物試劑有限公司免疫組化染色試劑盒(HistostainTMPius Kits)說明書進行，結果表明本發明所得到的幹細胞β1-integrin，CK19，P63，α6-integrin均為陽性。
權利要求
1.一種分離純化皮膚表皮幹細胞的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)首先將已脫離人或動物的皮膚，置於含青鏈素各500U/ml的生理鹽水中帶回實驗室，在超淨工作檯上用生理鹽水衝洗，去血汙及毛髮；2)在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開，將皮膚切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小塊，按上皮面朝上貼於直徑為60mm玻璃平皿中，每皿3～4塊，加培養基；所述培養基的配方為90％Medium199+10％ FBS+10μg/mlinsulin+10ng/mL LIF+1～1.5μg/mL氫化可的松+100U/mL青黴素+100U/mL鏈黴素；3)置於CO2培養箱中培養，培養箱內的條件為5％CO2，飽和溼度，37℃；，每兩天換液一次；4)經3～4天後，從組織塊邊緣長出上皮樣細胞鋪路石樣生長，7～12天後，在上皮樣細胞層上有小圓形細胞聚集呈克隆樣生長，待這些克隆直徑達約100～150μm時，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin處理，用玻璃針將這些細胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用無血清培養基培養；所述的無血清培養基的配方為100％F12+(1％～1.2％)BSA+(20ng/mL～25ng/mL)EGF+5ug/mL Insulin+(15ng/ml～20ng/mL)IGF-1+20ng/mL LIF+0.05μg/mL氫化可的松+100U/mL青黴素+100U/mL鏈黴素；5)待細胞增殖達70～80％融合時，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA進行消化，傳代培養，即用上述無血清培養基將關中奶山羊表皮幹細胞傳25代凍存，或用上述無血清培養基將人類表皮幹細胞傳15代凍存；6)對所獲得細胞進行當前同行公認的表皮幹細胞分子標誌的檢測CK19，β1-integrin，P63，α6-integrin均為陽性，即證明所分選的是純化的表皮幹細胞。
全文摘要
本發明公開了一種分離純化皮膚表皮幹細胞的方法，在皮膚組織塊培養過程中採用自行設計的培養基能有效抑制成纖維細胞的生長，從組織塊四周生長出均一的上皮樣細胞，誘發表皮幹細胞遷移出原來的微環境，在新生成的上皮樣細胞層上重新聚集生長。這類克隆性生長的細胞與其共生的上皮樣細胞有明顯形態學上的差別。藉助解剖鏡和玻璃針就能將其挑選出來，進行單獨擴增培養。對所獲得細胞進行當前同行公認的表皮幹細胞分子標誌的檢測CK19，β
文檔編號C12N5/071GK1865436SQ20061004197
公開日2006年11月22日 申請日期2006年3月27日 優先權日2006年3月27日
發明者楊學義, 竇忠英 申請人:西北農林科技大學