一種預測2型糖尿病易感性的方法及試劑的製作方法
2023-12-09 08:59:06 1
專利名稱：一種預測2型糖尿病易感性的方法及試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種預測2型糖尿病易感性的方法及試劑，更具體地說是通過測定人TNFRSF9基因多態性預測受試者對於2型糖尿病的易感性，該方法可用於疾病的輔助診斷、治療和新藥開發，屬於生物技術領域。
背景技術：
2型糖尿病(T2DM)是一種常見多發的慢性代謝性疾病，受遺傳和環境因素的雙重影響，具有複雜發病機制，在人群中的患病率約為5％～15％。由於其高比例的大血管併發症，直接導致心、腦血管疾患引起死亡，以及微血管併發症引起的殘疾，已經成為全球嚴重危脅生命和健康的前幾位疾病之一，每年為此消耗了大量人力、物力和財力(錢榮立，楊澤，佟之復主編.21世紀的糖尿病防治.河南醫科大學出版社，鄭州，2000.)。迄今為止，關於T2DM的病因仍然不清，但是即往大量研究表明，T2DM在家系分析、雙生子研究均呈現高度遺傳一致性(Zimmet P，Alberti KG，Shaw J.Globaland societal implications of the diabetes epidemic.Nature，2001；414782-787.)。遺傳因素在發病機制中的重要性得到了很多人群證據的證明，如染色體2q(NIDDM1)位點是墨西哥美國人的相關位點，染色體12q(NIDDM2)是在芬蘭人群中發現的，在Pima印第安人中常染色體基因組掃描發現了幾個LOD分數較高的染色體區域(3q24，9q21和22q12)(Walker M.Gene detection in type 2 diabetes.International DiabetesMonitor，1998；1014-15)。
目前進行T2DM遺傳病因研究，多採用SNPs作為基因組標誌的關聯分析方法，是有效的，已得到證明(Horikawa Y，Oda N，Cox NJ，et al.Genetic variation in the geneencoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus.Nat Genet，2000；26163-175.)。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在人群中的頻率需＞1％，SNPs是雙等位基因標記，這種單鹼基變化中有70.1％為同型鹼基之間的轉換如G/A或T/C，29.1％為發生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C(胞嘧啶)是人類基因組中最易發生變化的位點，因為大多數是甲基化胞嘧啶，能夠自發脫氨基轉換為T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多態性的80-90％，是最常見的遺傳變異。
由於生存的選擇壓力導致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區的數量是編碼區的4倍，總數可達3百萬個(Brookes AJ.Theessence of SNPs.Gene，1999；234177-186.)。SNPs以其密度高，平均每1kb就有1個；代表性強，位於基因內部的SNPs可能直接影響蛋白質結構或表達水平；遺傳穩定性好，同微衛星多態性比較而言；易於自動化分析，因SNPs在人群中為雙等位基因標記，可簡單以「+/-或1/0」直接分型，成為很好的遺傳標誌。(Collins FS，Brooks LD，Chakravarti A.A DNA polymorphism discovery resource for research on human geneticvariation.Genome Res，1998；81229-1231)。
位於染色體1p36的TNFRSF9基因編碼腫瘤壞死因子受體超家族組分9的分子蛋白，具有重要的功能，包括促進免疫反應，細胞凋亡和在自身免疫反應中的重要作用。TNFRSF9也稱為CD137或ILA，編碼255個胺基酸的跨膜蛋白，分為胞外區富半胱氨酸序列；跨膜區和短的氮-端胞槳區含有磷酸化信號傳導位點。有限研究指出，當淋巴細胞和單核細胞活化時，刺激啟動了TNFRSF9表達，而後TNFRSF9呈現抑制活化T淋巴細胞的增殖並誘異細胞出現程序化死亡的作用。(Schwarz H，BlancoFJ，VonKempis J，et al.ILA，a member of the tumor necrosis factor family，is located onchromosome 1p36，in a cluster of related genes，and colocotizes with several malignancies，Biochem Biophys，Res Commun 1997；235699-703)。由於在T2DM發病機制中存在著低水平的免疫反應，包括IL-6、TNFα、C-反應蛋白和resistin等細胞因子在循環中和病灶發生的表型部位均可檢測到。如果病灶發生在肝臟、肌肉和脂肪組織，可以產生胰島素抵抗，如果病灶發生在胰腺可引致胰島素分泌量減少(Ferandez-Real JM，RicartW，Insulin resistance and Chronic cardiovascular in flammatory syndrome，Endocr Rev2003；34278-301)。在T2DM中TNFα的機制已得到證明，因此，TNFRSF9作為受體一定在其中發揮重要作用。
經過現有國內外文獻檢索，未見有TNFRSF9與T2DM相關聯的研究報導，也未見TNFRSF9基因多態性位點與T2DM相關聯的報導。
發明內容
本發明的主要目的是提供一種預測2型糖尿病易感性的方法。
本發明的第二個目的是提供一種預測2型糖尿病的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種預測2型糖尿病易感性的方法，通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的TNFRSF9基因內含子非編碼區第91位鹼基多態性位點的基因型，預測受試者對2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型為T/T純合子時，受試者的易感性最低；TNFRSF9基因型為C/C純合子時，受試者的易感性較高；TNFRSF9基因型為C/T雜合子時，受試者的易感性最高。
本發明提供了一種分離核酸，具有SEQ ID NO1所示的鹼基序列，在第91位為C。該核酸序列為TNFRSF9。圖1為位於1p36的TNFRSF9基因結構及其多態性變異位點的示意圖，附圖中包含有8個外顯子，rs161810位點標在TNFRSF9基因圖中內含子1的相應位置。
本發明提供了一組等位基因特異性的引物，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的鹼基序列，長度為19-22bp，而且可以特異性地擴增出SEQ ID NO1所示序列中第91位的SNP的擴增產物。
本發明提供了一種檢測T2DM易感性的診斷試劑盒，其中含有本發明特異性擴增TNFRSF9基因的引物對和用於PCR擴增檢測的試劑盒的常規組件、試劑、緩衝液等，本領域技術人員熟知這些常規組件和檢測方法。檢測擴增產物與正常TNFRSF9基因第91位SNP相互對比是否存在變異時，所需的化學試劑還包括特異性內切酶等。本發明試劑盒中的全部組分、含量、來源和使用方法如下本發明試劑盒供10人份檢測應用，其組分、含量和來源包括60ul 10X PCR緩衝液(Pharmacia)，50ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自製)，1.5ml純水(自製)，20ul 10X限制酶反應緩衝液(Biolab)，10ul(2unit/ul)限制酶Mn1I(Biolab)。
使用方法1)通過PCR擴增TNFRSF9基因的外顯子1和內含子1部分片段，簡言之，製備混合液，加入基因組DNA溶液100ng、5ul 10X PCR緩衝液、4ul 10mM dNTP、1.25單位Taq DNA聚合酶和50pmolF1和R1分別為有義引物和反義引物，實施例2敘述的每種引物。接著，加入純水，使總體積為50ul。反應在95℃0.5分鐘，58℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘，進行30個循環。反應完成後，將10ul每種PCR反應液在7.5％的聚丙烯醯胺凝膠上電泳檢測，如擴增了253bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴增成功。
2)通過用限制酶處理PCR反應產物測定TNFRSF9基因5』-非編碼區的多態性。往10ul上述擴增的PCR反應產物中加入1ul限制酶反應緩衝液、1ul限制酶Mn1I，並在37℃水浴中消化過夜。之後，在7.5％的聚丙烯醯胺凝膠上電泳。
3)多態性定型用限制酶Mn1I處理片段，在第91個鹼基是T等位基因時，出現151bp和102bp的條帶。如為C等位基因時，僅出現253bp一個條帶。
本發明的測定方法測定了來源於人的基因組DNA，樣品沒有限制如，體液(如血液、腹水和尿液)、組織細胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可製備基因組DNA。
從基因組DNA中，可擴增含TNFRSF9基因突變點的DNA片段，以獲得用於測定的大量樣本。這種通過擴增含TNFRSF9基因突變點的DNA片段獲得的樣品，特別適於用作測定材料。例如，可按PCR方法，使用引物進行擴增，此引物經合理設計以便僅擴增含TNFRSF9基因多態性的非編碼區的部分。這種引物可經常規方法製備。待擴增區的鹼基長度不受限制。在一般情況下，鹼基長度約100bp至500bp。當按本發明所述製備引物時，可獲得適宜的測定樣品，其作為擴增的DNA片段，並具有特異性長度。
進行PCR-RFLP方法時，欲擴增的DNA被設計成含有能適用於此後RFLP方法的特異性酶切位點。
對此設計無限制，只要用酶切割DNA區獲得的片段長度在突變基因和野生型基因的兩種情形中不同。可使用通過TNFRSF9基因的突變產生或丟失的限制酶位點。
因此，根據PCR方法擴增的所需DNA片段，通過上述合理選擇的限制酶得以設計。酶切產生的片段通過電泳證實，它們顯示特定的條帶。根據在上述方法中獲得的帶型，可測定TNFRSF9基因多態性。
在進行本發明的基因診斷時，優選使用用於測定根據TNFRSF9基因的突變類型存在的診斷試劑，診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應於用於測定TNFRSF9基因突變類型的方法。特定的試劑按採用的測定方法來適當地選擇。試劑的特徵是，組成測定由TNFRSF9基因定義的突變類型的手段是必要的，如，DNA片段/和/或作為用於測定的特異限制酶。試劑，例如特定製備的用於PCR擴增步驟的引物，該步驟用於包含TNFRSF9基因的突變點的特定擴增片段，不被認為是本發明診斷試劑的必要成分，它們也包含於本發明的診斷試劑之中。
本發明的優點是本發明首次闡明了TNFRSF9基因多態性位點與T2DM的相關性，提供了一種預測T2DM易感性的方法，該方法可用於T2DM的預防、輔助診斷和治療，還可以用於新藥研發。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步敘述，以使公眾對發明內容有更深入的了解，並非對本發明的限制。
圖1為位於1p36的TNFRSF9基因結構及其多態性變異位點的示意圖。
具體實施例方式
用於下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下。
需要時，用高壓鍋(120℃，20分鐘)滅菌EDTA乙二胺四乙酸二鈉SDS十二烷基硫酸鈉TE10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)10×PCR緩衝液100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化鎂(MgCl2)0.01％(W/V)白明膠dNTP脫氧核苷三磷酸甲醯胺顏料95％去離子甲酞胺，0.05％葡聚糖藍APS過硫酸銨→10×TBETris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶於純水中，總體積為1升。
實施例1血液樣本收集和基因組DNA的提取按WHO(1999)標準明確診斷入選病例，須經空腹8-12小時口服溶入300ml溫水中的75g無水葡萄糖，2小時後檢測其血漿葡萄糖值≥11.1mmol/L或者以前經由縣市以上級別醫院明確診斷的糖尿病患者，共計收集來自黑龍江、北京、大連和銀川的無親緣關係T2DM患者690例，平均年齡49歲±21.2歲，其中男性300例，同地區的健康對照志願者710例，平均年齡47歲±19.6歲，其中男性325例。所有受檢者均為漢族，且籤署知情同意書，這一研究也得到了本單位倫理委員會批准。
根據下列方法，用人外周血製備基因組DNA。在抗凝劑EDTA存在下，將收集的10ml人外周血在2500rpm，離心分離30分鐘除去血清。接著加入0.2％NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，並使其放置於冰上15分鐘。此後，在2500rpm離心分離30分鐘，藉此收集沉澱物。用0.2％的NaCl溶液，以類似於前面的方式再進行洗滌。在如此獲得的沉澱物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以懸浮該沉澱物。將10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然後，在37℃過夜溫育懸液。過夜後，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm進行離心分離10分鐘除去水層。將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合併以3000rpm離心分離10分鐘。除去水層。最後，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，兩倍量的冷無水乙醇，使DNA沉澱。用70％的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。使這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解於TE中，然後定量測定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液濃度校正至30ng/ul，置-20℃冰箱保存。
實施例2 SNP的識別確定本發明採用PCR-RFLP和PCR測序技術同時對TNFRSF9基因的內含子1的第91位SNP位點(其等位位點對為T/C)進行檢測。
1)引物的確定定位在TNFRSF9基因轉錄起始點上遊啟動子區-11bp到內含子1非編碼區+242bp，全長253bp，確定了正義鏈(-11--+8bp)和反義鏈(222--242bp)特異性引物如下F15′-CAG AAG CCT GAA GAC CAAG～3′(SEQ ID NO2)R15′-TTG AGA TGT AAG TTT GTA TGG～3′(SEQ ID NO3)2)通過PCR擴增TNFRSF9基因的外顯子1和內含子1部分片段，簡言之，製備混合液，加入上述實施例1製備的基因組DNA溶液100ng、5ul 10X PCR緩衝液、4ul 10mMdNTP、1.25單位Taq DNA聚合酶和50pmol上述步驟1)敘述的每種引物。接著，加入純水，使總體積為50ul。反應在95℃0.5分鐘，58℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘，進行30個循環。反應完成後，將10ul每種PCR反應液在7.5％的聚丙烯醯胺凝膠上電泳獲得了單一的條帶，觀察在BioRad成像儀，應用Gel Doc 2000程序。
3)通過用限制酶處理PCR反應產物測定TNFRSF9基因5』-非編碼區的多態性簡言之使用F1和R1分別為有義引物和反義引物進行PCR。結果，擴增了253bp的片段。往10ul上述擴增的PCR反應產物中加入1ul限制酶反應緩衝液、1ul限制酶MnlI，並在37℃消化過夜。此後，在7.5％的聚丙烯醯胺凝膠上電泳。多態性的測定為用限制酶Mn1I處理片段，在第91個鹼基是T等位基因時，出現151bp和102bp的條帶。如為C等位基因時，僅出現253bp一個條帶。
實施例3 TNFRSF9基因SNP與T2DM的相關統計方法利用STATA8.0和SPSS11.0軟體中Pearson卡方檢驗計算TNFRSF9基因多態性的等位位點，基因型頻率，Hardy-Weinberg平衡檢測，進行連續校正和單側漸近概率分析，統計學的顯著性水平設定為P＜0.05。採用單因素Logistic回歸分析計算T2DM的患病風險OR值及其95％可信區間(CI)。
結果1)健康人TNFRSF9基因多態性分布按實施例1和2的方法測定了710個健康人的基因多態性。584人在第91位鹼基有多態性，發現231人有T的純合子(32.65％)，353人有T和C的雜合子(49.66％)，126人有C的純合子(17.69％)。
2)T2DM病人TNFRSF9基因多態性分布按實施例1和2的方法測定690個健康人的基因多態性。481人在第91位鹼基有多態性，發現136人有T的純合子(19.70％)，345人有T和C的雜合子(50.00％)，209人有C的純合子(30.30％)。
3)T2DM病例和健康對照組比較T2DM病例和健康對照組比較其TNFRSF9基因上的rs161810，其等位位點對為T/C多態性的頻率分布，詳見表1。
表1 TNFRSF9基因rs161810位點的基因型和等位基因頻率風險性在T2DM和健康正常人群中的比較樣本數 基因型 (％) 等位基因(％)C/C C/T T/TCT2型DM人 690 209 30.30 345 50.00 136 19.70 763 55.30 617 44.70正常人 710 126 17.69 353 49.66 231 32.65 604 42.53 816 7.48P (df＝2)0.0001 0.0026(df＝1)OR(95％CI) 2.458(1.345-4.492)表1可見，TNFRSF9基因第91位的常見SNP位點(rs161810)的A等位位點，即在其DNA互補鏈上為T等位位點，當突變為C，互補鏈上為G時，在患者群體中的分布頻率大大高於在健康正常人群中的頻率，相差約12％，有顯著性差別(P＝0.0026)。而且OR值反映突變位點C的頻率在T2DM中高出正常人2.46倍，95％CI下限＞1，均表明這是T2DM患病的一個較高風險的等位基因。與T2DM顯著相關的SNP(rs161810)位點，位於內含子1靠近外顯子1的剪切點側，可能通過影響DNA的空間結構，從而，這一突變位點影響DNA的轉錄和剪切。
實施例4檢測試劑盒製備檢測T2DM相關風險的試劑盒，包含有可擴增出TNFRSF9基因SNP(rs161810)位點的引物對，及其PCR-RFLP相應試劑，成分和含量如下，於-20℃保存60ul 10X PCR緩衝液(Pharmacia)，50ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自製)，1.5ml純水(自製)，20ul 10X限制酶反應緩衝液(Biolab)，10ul(2unit/ul)限制酶MnlI(Biolab)。
本發明具有實用性的例證1)本發明的TNFRSF9基因多態性的檢測方法可用於分析人常染色體1p36區的TNFRSF9基因上的常見SNP(rs161810)的T等位位點，即在其DNA互補鏈上為A等位位點，應用在對T2DM的輔助性診斷和對個體是否有多大的T2DM患病風險進行評估。以利於開展T2DM的早期幹預和治療。
2)利用本發明闡述TNFRSF9基因第91位鹼基變異，作為生物標誌物之一，可用作藥物設計的分子靶標的篩選，以幫助尋找具有調節TNFRSF9表達的活性分子，促進T2DM新藥開發。
3)本發明建立的檢測TNFRSF9基因多態性的核酸序列和T2DM相關位點，可高靈敏度，特異性地應用於T2DM基因診斷用的試劑盒。
如上所述，得出結論，TNFRSF9基因在第91位鹼基的多態性與T2DM具顯著相關性。因此，根據本發明，測定此多態性可用於進行基因診斷。
本發明敘述了TNFRSF9基因T2DM相關的新突變點，並提供了一種測定TNFRSF9基因多態性的方法。而且，根據本發明，只需要少量DNA樣品就足以測定TNFRSF9基因的多態性。結果，本發明提供了一種測定T2DM相關基因多態性的基因診斷方法。
序列表110衛生部北京醫院120一種預測2型糖尿病易感性的方法及試劑130
1603170PatentIn version 3.321012112116212DNA213人屬，人種(Homo sapiens，human)4001agaccaagga gtggaaagtt ctccggcagc cctgagatct caaggtctgt ccatctgggg 60gagtgggtgg gggcactgag aaggggtgag cttggaactt ttgctccctt tgcccatttc120tagacttttt ctcctaatat gtaataactt ctcttcaata gccctttaaa taaacatcaa180taacttagcc tgaagagttt ttcactcctt agttttgtta ccatacaaac ttcacatctc240aaaacatgtc tctgtttaag aaaatgtgtt agtgagttga acagggaggt ctttccacat300gttagtagtt aggtgttcag ctaaaggggg aagagtgatt atgtgatagc ttcttcttga360
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210221119212DNA213人工合成4002cagaagcctg aagaccaag 19210321121212DNA213人工合成4003ttgagatgta agtttgtatg g 2權利要求
1.一種預測2型糖尿病易感性的方法，其特徵在於該方法通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的TNFRSF9基因內含子非編碼區第91位鹼基多態性位點的基因型，預測受試者對2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型為T/T純合子時，受試者的易感性最低；TNFRSF9基因型為C/C純合子時，受試者的易感性較高；TNFRSF9基因型為C/T雜合子時，受試者的易感性最高。
2.一種分離核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的鹼基序列，在第91位為C。
3.一組預測2型糖尿病易感性的引物，其長度為19～22bp，能特異性地擴增出含TNFRSF9基因的SEQ ID NO.1所示序列中的第91位SNP的擴增產物，具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的鹼基序列。
4.一種預測2型糖尿病易感性的試劑盒，其特徵在於，含有權利要求3所述的引物序列和以下試劑，包括60ul 10X PCR緩衝液，50ul 10mM dNTP混合液，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶，各12ul(50pmol/ul)F1和R1引物，1.5ml純水，20ul 10X限制酶反應緩衝液，10ul(2unit/ul)限制酶Mn1I；本試劑盒供10人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20℃。
全文摘要
本發明公開了一種預測2型糖尿病易感性的方法，通過提取宿主細胞基因組DNA，測定受試者的TNFRSF9基因內含子非編碼區第91位鹼基多態性位點的基因型，預測受試者對2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型為T/T純合子時，受試者的易感性最低；TNFRSF9基因型為C/C純合子時，受試者的易感性較高；TNFRSF9基因型為C/T雜合子時，受試者的易感性最高。本發明中TNFRSF9基因的單核苷酸多態性(SNP)具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列的位於1p36區域定位在內含子1非編碼區第91位(rs161810)位點上的C鹼基替換，是與2型糖尿病發病相關的高風險位點之一。本發明的優點是首次闡明了TNFRSF9基因多態性位點與T2DM的相關性，提供了一種預測T2DM易感性的方法，該方法可用於T2DM的預防、輔助診斷和治療，還可以用於新藥研發。
文檔編號C12N15/11GK1710106SQ200510080248
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月30日 優先權日2005年6月30日
發明者楊澤, 紀立農, 蔡曉凌, 孫宏, 唐雷, 史曉紅, 朱小泉, 孫亮, 屈彥純, 張寧 申請人:衛生部北京醫院