從竹葉中製備高純度苜蓿素的方法

2023-12-08 19:44:16

專利名稱：從竹葉中製備高純度苜蓿素的方法
技術領域：
本發明屬於天然產物化學領域，涉及一種天然產物苜蓿素的製備方法，特別涉及 一種從竹葉中製備天然產物苜蓿素的方法，更特別涉及一種從竹葉中製備高純度天然產物 苜蓿素的方法。本發明還涉及由本發明方法獲得的苜蓿素，以及苜蓿素在製備抗腫瘤藥物 中的用途。
背景技術：
苜蓿素(tricin)又稱小麥黃素、麥黃酮。苜蓿素為黃色針狀結晶(醋酸-水)，黃 色粉末(氯仿-甲醇)，熔點^H92°C。苜蓿素存在於禾本科植物芒(Miscanthus sinensis Anderss.)的莖、葉中，豆科植物紫苜蓿(Medicago sativa L.)，菊科植物等植物中。苜蓿 素對離體豚鼠腸管有鬆弛作用，有輕度抗氧化作用，可防止腎上腺素氧化，並有輕度雌激素 樣作用。可用作染料中間體。目前，市場上售苜蓿素相關產品大多從紫苜蓿中製備而來，且資源有限，工藝復 雜、成本高、產品純度低，售價高。儘管我國竹葉資源豐富，但我國竹葉資源在大部分竹產區被棄用，所以，如何充分 利用我國豐富的竹葉資源，開發出高附加值的竹葉化學成分產品是當前科研工作者研究熱；ο竹葉作為一種「藥食兩用的天然植物」已被廣大消費者所接受，竹葉提取物主要 功能性成分為竹葉黃酮糖苷，具有抗氧化和抑菌活性，可以作為一種生物黃酮類保健營養 素進行開發，前景廣闊。目前，以竹葉為原料，利用矽膠柱層析、大孔樹脂柱層析、有機溶劑 液液萃取等方法製備的竹葉黃酮粉產品已經上市，而且把竹葉黃酮粉在食品、保健品、化妝 品、藥物等領域的開發應用也很多，但很少有分離製備黃酮單體純品，應用於抗腫瘤藥物， 且大部分產品生產工藝複雜、成本高、產品的總黃酮含量大多在40%以下，並且黃酮得率 低，這直接導致了產品售價較高。雖然從竹葉這種資源廣泛的材料中提取各種類型的黃酮 已有許多文獻報導，但從竹葉或其粗製提取物中製備高純度苜蓿素尚未見有報導。因此，尋找一種從竹葉中高效率製備高純度天然產物苜蓿素的方法，填補市場空 白，仍是本領域技術人員為之努力的方向。

發明內容
本發明的目的是為製備高純度苜蓿素而提供一種簡便的從竹葉中提取高純度苜 蓿素的方法。本發明人令人意外地發現，通過對竹葉粗提，然後進行酸解，再進一步進行C18 柱層析分離，最後通過凝膠分離純化，可以獲得純度在99%以上的苜蓿素純品。本發明基於 上述發現而得以完成。發明概述為此，本發明第一方面提供了一種從竹葉中製備高純度苜蓿素的方法，其包括以 下步驟(a)使乾燥竹葉用95%乙醇提取，用石油醚萃取，水相濃縮成浸膏；(b)使浸膏上AB-8大孔樹脂柱，先用純水洗脫，再用80%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮並乾燥；(c)向步驟(b) 乾燥產物中加入鹽酸甲醇溶液，加熱進行酸解處理；(d)使步驟(c)所得酸解液上Cw柱層 析洗脫，收集苜蓿素級分，濃縮；(e)使步驟(d)所得濃縮物上凝膠分離柱，用純甲醇作流動 相洗脫，收集苜蓿素級分，濃縮到乾燥，即得苜蓿素。本發明第二方面提供一種竹葉提取物，其中包含純度大於95wt%的苜蓿素。本發明第三方面提供苜蓿素或包含苜蓿素的提取物在製備抗腫瘤的藥物中的用 途。發明詳述本發明第一方面提供了一種從竹葉中製備高純度苜蓿素的方法，其包括以下步 驟(a)使乾燥竹葉用95%乙醇在60°C回流提取三次，將合併的提取液濃縮至無醇 味，再用石油醚萃取，水相濃縮成浸膏；(b)使浸膏用少量95%乙醇溶解後上AB-8大孔樹脂柱，先用純水洗脫，再用80% 乙醇洗脫，將洗脫液濃縮並乾燥；(c)向步驟(b)乾燥產物中加入鹽酸甲醇溶液，加熱進行酸解處理，處理完畢後用 用稀NaOH溶液中和；(d)使步驟(C)所得酸解液與樣品同等重量的C18填料混合，濃縮拌樣乾燥，再使 乾燥的Cw填料拌樣固體上樣，按1 10的樣品和填料比例上C18柱層析，先用20%甲醇水 溶液洗脫，再用60%甲醇水溶液洗脫，收集苜蓿素級分，濃縮；(e)使步驟(d)所得濃縮物用甲醇溶解，按1 10的樣品和填料比例，上凝膠分離 柱，用純甲醇作流動相洗脫，收集苜蓿素級分，濃縮到乾燥，即得苜蓿素。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，其中在步驟(a)中，所述三次回 流提取的料液比分別是1/10、1/8、1/5，回流提取時間分別為;3h、2h、a!。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，其中在步驟(a)中，所述石油醚 萃取是萃取三次，並且每次石油醚體積大約為濃縮液體積的1/3。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，其中在步驟(C)中，所述鹽酸甲 醇溶液是甲醇與25%鹽酸的混合物。在一個實施方案中，所述甲醇與25%鹽酸的混合物是 二者以體積比O 6) 1「2 5) 1、或約4 1的混合物，優選是約4 1的混合物。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，其中在步驟(C)中，所述加熱是 在沸水浴中加熱。在一個實施方案中，所述加熱是在沸水浴中回流。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，其中在步驟(C)中，所述酸解處 理的時間為1 3小時。在一個實施方案中，所述酸解處理的時間為1. 5 2. 5小時。在 一個實施方案中，所述酸解處理的時間為約2小時。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，其中在步驟(C)中，所述步驟(b) 乾燥產物與鹽酸甲醇溶液的比為50mg (IOml 50ml)。在一個實施方案中，所述步驟 (b)乾燥產物與鹽酸甲醇溶液的比為50mg (15ml 40ml)、50mg (20ml 30ml)、或約 50mg 25ml，優選的比為約 50mg 25ml。本領域技術人員理解，根據所述步驟(b)乾燥產物中的苜蓿素的含量不同，所述 步驟(b)乾燥產物與鹽酸甲醇溶液的比可以作適當的改變，以獲得較佳的酸解效果；類似地，其它因素亦可作適當改變。在一個實施方案中，在步驟(C)中，所述鹽酸甲醇溶液是甲 醇與25%鹽酸二者以體積比約4 1的混合物，所述加熱是在沸水浴中回流，所述酸解處理 的時間為約2小時，所述步驟(b)乾燥產物與鹽酸甲醇溶液的比為約50mg 25ml。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，其中在步驟(d)和步驟(e)中，各 步驟在洗脫時是通過HPLC監控並收集苜蓿素級分的。在一個實施方案中，所述HPLC監控各 自獨立地是採用包括以下的色譜條件色譜柱、流動相、包括等度和/或梯度的洗脫程序、 以及裝配有二極體陣列檢測器或紫外檢測器的色譜儀。在一個實施方案中，所述色譜柱是 ODS柱。在一個實施方案中，所述色譜柱是5 μ m粒度填料的ODS柱。在一個實施方案中，所 述色譜柱是5 μ m粒度填料的ODS柱。在一個實施方案中，所述色譜柱是5 μ m粒度填料的 YMC-Pack ODS AQ型色譜柱。在一個實施方案中，所述色譜柱是5 μ m粒度填料的YMC-Pack ODS AQ型G.6mmx 250mm)色譜柱，或者是具有在本發明所述色譜條件下與該5 μ m粒度填 料的YMC-Pack ODS AQ型6mm χ 250mm)色譜柱分離效果相當的色譜柱。在一個實施 方案中，所述流動相包括流動相A和流動相B，所述流動相A是乙腈，所述流動相B是0. 5% (V/V)磷酸水溶液。在一個實施方案中，所述流動相是乙腈0. 5% (V/V)磷酸水溶液以體 積比為(10 50) (90 50)比例的混合物，優選是(10 45) (90 55)比例的混 合物，優選是(15 30) (85 70)比例的混合物。在一個實施方案中，所述洗脫程序是 以0. 5 2ml/min(優選約lml/min)的流速，在第一洗脫時間段內以包含10 15%流動 相A和加至100%流動相B的混合液中進行等度洗脫，然後在第一洗脫時間段內從上述混 合液經線性梯度變化到包含40 50%流動相A和加至100%流動相B的混合液中進行梯 度洗脫。在一個實施方案中，所述第一洗脫時間段使用的洗脫液是包含約12%流動相A和 約88%流動相B(本領域技術人員理解，⑴二者之和為100%，和/或⑵兩種流動相的比 例可作適當調整以獲得更佳的分離效果；此(1)和(2)在其它情況下亦是適用的)的混合 液。在一個實施方案中，所述第二洗脫時間段使用的梯度洗脫液是包含約12%流動相A和 約88%流動相B的混合液經線性梯度變化到包含約45%流動相A和約55%流動相B的混 合液。在一個實施方案中，所述第一洗脫時間段為30 60min，優選35 55min，優選40 50min，優選約45min。在一個實施方案中，所述第二洗脫時間段為30 60min，優選35 55min，優選40 50min，優選約45min。本領域技術人員理解，在優選的情況下，所述第一 洗脫時間段洗脫操作完畢後，即刻開始所述第二洗脫時間段。在一個實施方案中，所述色譜 系統設定的檢測波長為320 380nm，優選330 370nm，優選340 360nm，優選約350nm。 在一個實施方案中，所述色譜柱的柱溫控制在15 45°C，優選20 40°C，優選25 35°C， 優選約30°C。在第一方面所述方法的一個實施方案中，該方法包括以下步驟(1)提取稱取一定量原料，用95%乙醇，溫度60°C，回流提取三次，料液比分別是 1/10，1/8，1/5，回流提取時間分別為3h，2h，2h ；(2)濃縮使以上提取液濃縮至無醇味；(3)萃取使以上濃縮得到的無醇味濃縮液，若溶解不好，可適當加溫和加入少量 乙醇輔助溶解，然後用石油醚萃取三次，每次石油醚體積大約為濃縮液體積的1/3，石油醚 相棄去，水相濃縮成浸膏；(4)初步分離純化原料提取物浸膏用儘量少的95%乙醇溶解後上AB-8大孔樹脂柱，先用純水洗脫，再用80 %乙醇洗脫，收集洗脫液，把80 %乙醇洗脫液濃縮乾燥成粉末，(5)酸解稱取乾燥的樣品50. Omg，置於50mL平底燒瓶中，先加入20mL甲醇，測其 PH值後再加入25%鹽酸5mL，裝好冷凝回流玻璃裝置，在沸水浴中加熱酸解2小時，迅速冷 卻後，備用；(6)濃縮拌樣把酸解後的溶液，用稀NaOH溶液調節PH值到酸解前PH值數值後， 加入和樣品同等重量的C18填料，濃縮拌樣乾燥後備用；(7) C18柱層析分離把乾燥的Cw填料拌樣，固體上樣，按1 10的樣品和填料比 例，上C18柱層析，先用20%的甲醇水溶液洗脫雜質，再用60%的甲醇水溶液洗脫並收集苜 蓿素級分；(8)凝膠分離純化把C18柱層析分離後的樣品用甲醇溶解，按1 10的樣品和填 料比例，上凝膠分離柱，用純甲醇作流動相洗脫，按一定的體積分別收集苜蓿素級分(9)濃縮乾燥將合併的純苜蓿素收集液進行濃縮乾燥，即得。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，該方法的收率為50wt%以上，優 選收率為60wt%以上，優選收率為70wt%以上，以乾燥竹葉計。在本發明第一方面所述方法的一個實施方案中，該方法所得苜蓿素的純度大於 95wt %，優選純度大於96wt %，優選純度大於98wt %，優選純度大於99wt %。本發明第二方面涉及一種竹葉提取物，其中包含純度大於95wt%的苜蓿素，優選 純度大於96wt %，優選純度大於98wt %，優選純度大於99wt %。在本發明第二方面所述提取物的一個實施方案中，其中該提取物中通過本發明第 一方面任一項所述方法獲得的。在本發明第二方面所述提取物的一個實施方案中，其中該提取物是基本上純淨的苜蓿素。在本發明第二方面所述提取物的一個實施方案中，其中該提取物是苜蓿素純品。本發明第三方面涉及苜蓿素或包含苜蓿素的提取物(例如包含苜蓿素的竹葉提 取物，例如本發明第二方面所述竹葉提取物)在製備抗腫瘤的藥物中的用途。在本發明第三方面所述用途的一個實施方案中，其中所述腫瘤是肺癌或肝癌。本發明第一方面所述方法的各個實施方案可以與一個或多個其它實施方案進行 任意組合，只要這種組合不會出現矛盾。當然在相互之間組合時，必要的話可對相應特徵作 適當修飾。對於本發明的其它方面的各個實施方案亦可以類似地進行任意組合。本發明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用併入本文，並且如果這些文 獻所表達的含義與本發明不一致時，以本發明的表述為準。此外，本發明使用的各種術語和 短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發明仍然希望在此對這些術語和 短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發明所表 述的含義為準。如本文使用的，術語「竹葉提取物(bamboo leaves extract) 」，是指以竹葉為原 料，用一定的提取、初步分離方法而得到竹葉的粗提物或進一步精製的精提物的統稱，其中 包含竹葉黃酮類化合物，例如本發明所述苜蓿素等。如本文使用的，術語「酸解」，亦可稱為「酸水解」。
在本發明中，術語「 ％ 」時，如基礎物質是液態並且分散於該基礎物質中的物質是 固體，則該％是重量/體積表示的百分數。其它情況下使用％亦具有類似含義。為了克服現有的從苜蓿中製備天然產物苜蓿素工藝複雜、成本高、純度低、得率低 的不足，改變市場沒有苜蓿素純品的現狀，本發明的第一方面的目的是提供一種竹葉天然 產物苜蓿素純品，該天然產物苜蓿素純品的純度明顯高於現有的苜蓿素產品。本發明的第 二方面目的是提供一種製備竹葉天然產物苜蓿素純品的方法，本發明第三方面的目的是提 供所述竹葉天然產物苜蓿素純品的用途。本發明結合溶劑提取、酸解和色譜層析的組合，可以從具有豐富來源的竹葉中以 較高收率提取高純度苜蓿素。


圖1描繪了酸解時間對苜蓿素含量的影響。圖2是60%的甲醇水溶液洗脫苜蓿素收集液檢測圖。圖3是凝膠分離純化後純苜蓿素收集液檢測圖。圖4是·「蓿素質譜圖。圖5是·「蓿素紅外光譜圖。圖6是·「蓿素紫外光譜圖。圖7是·「蓿素碳譜圖。圖8是·「蓿素氫譜圖。圖9是·「蓿素DEPT135譜圖。圖10是]鮮蓿素DEPT90譜圖。圖11是]鮮蓿素HMBC譜圖。圖12是]鮮蓿素HSQC譜圖。
具體實施例方式下面通過具體的實施例/實驗例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施 例和實驗例僅僅是用於更詳細具體地說明之用，而不應理解為用於以任何形式限制本發 明。本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖 然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此 作儘可能詳細描述。本領域技術人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和 操作方法是本領域公知的。實施例一、苜蓿素的製備1.製備工藝(1)提取工藝的選擇①水提法以純水進行提取，設不同提取時間和不同提取溫度；②醇提取法用醇(如50 98%的乙醇)進行提取，設不同提取時間和不同提取溫 度；③有機溶劑提取法用有機溶劑，如乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等進行提取，設不同提取時間和不同提取溫度。利用液-質聯用儀、高效液相色譜儀等分析檢測提取物中黃酮等活性物質的得 率，核算成本，對以上① ③的提取技術進行優化。本發明人發現，用以下工藝提取，可獲得最佳的產品收率，即熱回流提取法稱取 乾燥竹葉原料10kg，用95%乙醇，溫度60°C，回流提取三次，料液比分別是1/10，1/8，1/5， 回流提取時間分別為:3h，2h，a!。(2)濃縮把以上提取液濃縮至無醇味。(3)萃取把以上濃縮得到的無醇味濃縮液，若溶解不好，可適當加溫和加入少量乙醇輔助 溶解，然後用石油醚萃取三次，每次石油醚體積大約為濃縮液體積的1/3，石油醚相棄去，水 相濃縮成浸膏。(4)初步分離純化考察以下方法進行分離純化①柱層析法用聚醯胺柱層析法、矽膠柱層析法、葡聚糖凝膠柱層析法、大孔樹脂柱 層析法；②膜分離法用超濾、微濾、納濾和反滲透方法；③高效製備液相法用高效製備液相色譜方法。利用液-質聯用儀、高效液相色譜儀等分析檢測黃酮等活性物質的純度，核算成 本，對分離製備技術進行優化。本發明人發現，採用以下分離純化工藝可以獲得最佳的分離 純化效果原料提取物浸膏用儘量少的95%乙醇溶解後上AB-8大孔樹脂柱，先用純水洗脫 去除糖類、蛋白質等雜質後，再用80%乙醇洗脫，收集洗脫液，把80%乙醇洗脫液濃縮乾燥 成粉末，備用。(5)酸角軍①初步確定的酸解方法稱取乾燥的樣品50. Omg，置於50mL平底燒瓶中，先加入20mL甲醇，測其PH值後再 加入25%鹽酸5mL，裝好冷凝回流玻璃裝置，在沸水浴中加熱進行酸解。②酸解時間的確定稱取乾燥的樣品50.011^，置於501^平底燒瓶中，先加入201^甲醇，再加入25% 鹽酸5mL，裝好冷凝回流玻璃裝置，在沸水浴中分別加熱酸解20min，迅速冷卻後，倒入50mL 容量瓶中，用甲醇定容，待測。重複上述步驟八次，酸解時間分別為30、50、60、90、120、150、 180、M0min。對酸解後樣品測定結果顯示，樣品中苜蓿素含量隨酸解時間變化明顯(見圖1)。 從圖1可以看出樣品酸解20min，苜蓿素含量均為最低，隨著酸解時間的增加，苜蓿素含量 逐漸增加，樣品酸解120min，苜蓿素含量達到最高值，酸解時間超過120min後，隨酸解時間 的增加，苜蓿素含量略有下降且漸趨穩定。因此，樣品酸解120min為最佳酸解時間。③最終確定的酸解方法稱取乾燥的樣品50.011^，置於501^平底燒瓶中，先加入201^甲醇，測其PH值後 再加入25%鹽酸5mL，裝好冷凝回流玻璃裝置，在沸水浴中加熱酸解2小時，迅速冷卻後，備用。此方法可按同比進行放大。(6)濃縮拌樣把酸解後的溶液，用稀NaOH溶液調節PH值到酸解前PH值數值後，加入和樣品同 等重量的C18填料，濃縮拌樣乾燥後備用。(7) C18柱層析分離把乾燥的C18填料拌樣，固體上樣，按1 10的樣品和填料比例，上Cw柱層析，先 用20%的甲醇水溶液洗脫雜質，再用60%的甲醇水溶液洗脫苜蓿素並收集(見圖幻，濃縮 備用。洗脫過程中使用紫外檢測器進行監控，檢測波長為350nm。(8)凝膠分離純化把Cw柱層析分離後的樣品用甲醇溶解，按1 10的樣品和填料比例，上凝膠分離 柱，用純甲醇作流動相洗脫，按一定的體積分別收集，備用。洗脫過程中使用紫外檢測器進 行監控，檢測波長為350nm。(9) HPLC 檢測把凝膠分離純化後按一定的體積分別收集的待測液，用液相色譜檢測(見圖3)， 根據HPLC檢測結果合併純苜蓿素收集液。(10)濃縮乾燥把根據檢測結果合併的純苜蓿素收集液進行濃縮，乾燥，即得苜蓿素20克。(11)純度和收率測定根據以下色譜條件測定本實施例所得苜蓿素(i)、餼譜條件使用YMC-Pack ODS-AQ不鏽鋼色譜柱(5 μ m, 4. 6謹X 250mm)；以乙腈作為流動相 A,0.5% (V/V)的磷酸水溶液作為流動相B。洗脫程序為以12%流動相Α/88%流動相B的混合液為流動相平衡色譜柱；將樣 品或標準品注入液相色譜儀後，以12%流動相Α/88%流動相B的混合液作為洗脫溶液等度 洗脫45min ；然後使洗脫溶液從上述混合液開始，在45分鐘時間內線性梯度變化到45%流 動相A/55%流動相B的混合液進行洗脫。柱溫30°C。進樣量10μ L。檢測波長350nm。(ii)純度結果通過面積歸一化法計算純度，為99. 48%，並且通過上述色譜條 件，採用二極體陣列檢測器在200-400nm的波長範圍內掃描，未見有其它雜質。(iii)收率結果，採用本發明製備方法所得酸解液測定其中苜蓿素含量，換算為投 料竹葉中苜蓿素總含量，此總含量除根據本發明製備方法獲得的終產物量，算得苜蓿素收 率為77. 2%。實施例二、結構鑑定利用上述實施例一製備的苜蓿素，利用液-質聯用儀、高效液相色譜儀、核磁共振 波譜儀等對其進行了結構鑑定。⑴理化性狀
苜蓿素為橙黃色粉末，熔程為(mp)為251. 2 252. 1°C，不易溶於甲醇。(2)質譜(ESIMS)苜蓿素質譜圖見圖4。由圖4可知，負模式ESIMS (m/z) :329. 1[M-H]_， 681.0[2M-2H+Na]_，其中329. 1 [M_H]_為準分子離子峰，苜蓿素的分子量為330. 1。(3)紅外光譜(FTIR)苜蓿素的紅外光譜圖見圖5。黃酮的羰基吸收峰大約在1649CHT1 ；酚羥基、糖基 上的羥基在3200 3650CHT1範圍吸收峰；苯環骨架振動在 1450CHT1、 ΙδΟΟαιΓ1、 1580CHT1、 1600cm-1有吸收峰；氧雜環在 HOOcnT1、 ΙδΟΟαιΓ1、 1600cm-1有吸收峰。 由圖 4 可知，FTIR(KBr) υ max (cm-1) :3422. 7，1654. 6，1612. 4，1578. 5，1507. 7，1465. 5， 1433. 3，1359. 2，1337. 4，1306. 3，1263. 5，1182. 3，1169. 1，1118. 6,837. 1，與黃酮類化合物 吸收峰一致，可以判斷苜蓿素為黃酮類化合物。⑷紫外光譜(UV)苜蓿素的紫外光譜圖見圖6。黃酮母體的甲醇溶劑紫外數據為250，294，307sh ； 由圖5可知，帶I在352. 2nm，在300 400nm的範圍內，帶II在270. lnm，在240 280nm 的範圍內，可以判斷苜蓿素為黃酮類化合物。(5)核磁共振譜(NMR)苜蓿素的碳譜(1 NMR)見圖7。從圖7可知，從碳譜可知該化合物有17個C，其 中δ = 181.889ppm處黃酮4位羰基碳，δ = 139. 781 166. 401ppm為黃酮骨架和氧相 連接的碳，δ = 94. 872 121. 239ppm黃酮骨架不和氧相連接的碳，δ = 148. 725ppm為兩 個碳疊加峰，且為季碳(黃酮B環3』，5』)，δ = 104.812ppm為兩個碳疊加峰(黃酮B環 2』，6』)，δ = 56. 789ppm為兩個連接在3』和5』碳上兩個甲氧基的CH3的碳疊加峰。苜蓿素的氫譜(1H NMR)見圖8。從圖8可知，從氫譜可明顯看到11個氫，有3個 羥基活潑氫不出峰；根據碳和氫的數量以及分子量推算出含有氧的個數。苜蓿素的1H NMR、13C 匪R、DEPT、HSQC, HMBC 波譜數據見表 1 (DEPT135、DEPT90、 HMBC、HSQC圖譜見圖9、圖10、圖11、圖12)。從表1可知，根據DEPT譜判斷每個所有21個 C的類型，即為C、CH、CH2、CH3，確定每個C連接H的個數。根據苜蓿素的碳氫相關關係HSQC 和HMBC，可分別確定每個碳和氫相連接的位置和關係。表1 苜蓿素的1H NMR^13C 匪R、DEPT、HSQC、HMBC波譜數據(300MHz，DMS0_d6，δ ppm)
NO.13C NMR(6C)1H NMR(6H)DEPTHSQC 相關性HMBC 相關性1-----2161.809-C--3103.8046.913(s, 1H)CHC-3C-2,4,10,1'4181.889-C--5166.401-C--699.7106.133(s, 1H)CHC-6C-5,7,10,87161.809-C--894.8726.471(s, 1H)CHC-8C-7,9,6,109157.906-C--10103.475-C--1'121.239-C--2'104.8127.300(s, 1H)CHC-2'C-l',3',2,6',4'3，148.725-C--4，139.781-C--5'148.725-C--6'104.8127.300(s, 1H)CHC-6'C-l，,5，,2,2，，4，3'-OCH356.7893.873(s, 3H)CH3C-3'-OCH3C-3'5'-OCH356.7893.873(s, 3H)CH3C-5'-OCH3C-5'綜合該天然產物的各種圖譜，初步鑑定該天然產物為5，7，4』 -三羥基-3』，5』_ 二 甲氧基黃酮後，再對該天然產物結構的各個C和H在碳譜和氫譜上進行指認，指認結果見表 1。確認該天然產物為苜蓿素；分子量330. 1 ；分子式=C17H14O7 ；分子結構式如下
苜蓿素二、浦胃白■中膽附·(搬■中獻m式I )1、實驗原理四氮唑 DWTT，3—4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一種能接受氫原子的染料。活細胞線粒體中與NADP相關的脫氫酶在細胞內 可將黃色的MTT轉化成不溶性的藍紫色的formazon，而死細胞則無此功能。用DMSO溶解 formazon後，在一定波長下用酶標儀測定光密度值，既可定量測出細胞的存活率。2、實驗方法和結果1)選用對數生長期的貼壁腫瘤細胞，用胰酶消化後，用10%小牛血清的RPMI1640 培養液配成5000個/ml的細胞懸液，接種在96孔培養板中，每孔接種IOOul，37°C ,5%C02培養Mh。2)實驗組加樣品(來自實施例1的苜蓿素)IOul，每孔終體積為200ul，用1640培 養液補足。37°C，5% CO2培養3d。3)棄上清液，每孔加入IOOul新鮮配製的0. 5mg/ml MTT的無血清培養液，37°C繼續培養4h。小心棄上清，並加入200ulDMS0溶解MTT formazon沉澱，用微型超聲振蕩器混 勻，在酶標儀上測定波長處的光密度值。實驗用腫瘤細胞A-549 (人肺癌細胞)；BEL-7402 (人肝癌細胞)；HCT_8 (人結腸 癌細胞)。結果評定以下式計算腫瘤細胞生長抑制率(％ )
權利要求
1.一種從竹葉中製備高純度苜蓿素的方法，其包括以下步驟(a)使乾燥竹葉用95%乙醇在60°C回流提取三次，將合併的提取液濃縮至無醇味，再 用石油醚萃取，水相濃縮成浸膏；(b)使浸膏用少量95%乙醇溶解後上AB-8大孔樹脂柱，先用純水洗脫，再用80%乙醇 洗脫，將洗脫液濃縮並乾燥；(c)向步驟(b)乾燥產物中加入鹽酸甲醇溶液，加熱進行酸解處理，處理完畢後用用稀 NaOH溶液中和；(d)使步驟(c)所得酸解液與樣品同等重量的Cw填料混合，濃縮拌樣乾燥，再使乾燥 的Cw填料拌樣固體上樣，按1 10的樣品和填料比例上C18柱層析，先用20%甲醇水溶液 洗脫，再用60%甲醇水溶液洗脫，收集苜蓿素級分，濃縮；(e)使步驟(d)所得濃縮物用甲醇溶解，按1 10的樣品和填料比例，上凝膠分離柱， 用純甲醇作流動相洗脫，收集苜蓿素級分，濃縮到乾燥，即得苜蓿素。
2.根據權利要求1的方法，其中在步驟(a)中，所述三次回流提取的料液比分別是 1/10、1/8、1/5，回流提取時間分別為3h、2h、2h。
3.根據權利要求1的方法，其中在步驟(a)中，所述石油醚萃取是萃取三次，並且每次 石油醚體積大約為濃縮液體積的1/3。
4.根據權利要求1的方法，其中在步驟(c)中，所述鹽酸甲醇溶液是甲醇與25%鹽酸 的混合物。
5.根據權利要求1的方法，其中在步驟(c)中，所述酸解處理的時間為1 3小時。
6.根據權利要求1的方法，在步驟(c)中，所述鹽酸甲醇溶液是甲醇與25%鹽酸二者 以體積比約4 1的混合物，所述加熱是在沸水浴中回流，所述酸解處理的時間為約2小 時，所述步驟(b)乾燥產物與鹽酸甲醇溶液的比為約50mg 25ml。
7.根據權利要求1的方法，該方法的收率為50wt%以上，和/或該方法所得苜蓿素的 純度大於95wt%。
8.—種竹葉提取物，其中包含純度大於95wt%的苜蓿素。
9.苜蓿素或包含苜蓿素的提取物在製備抗腫瘤的藥物中的用途。
10.權利要求9的用途，其中所述腫瘤是肺癌或肝癌。
全文摘要
本發明公開了從竹葉中製備高純度苜蓿素的方法。該方法包括以下步驟(a)使乾燥竹葉用95％乙醇提取，用石油醚萃取，水相濃縮成浸膏；(b)使浸膏上AB-8大孔樹脂柱，先用純水洗脫，再用80％乙醇洗脫，將洗脫液濃縮並乾燥；(c)向步驟(b)乾燥產物中加入鹽酸甲醇溶液，加熱進行酸解處理；(d)使步驟(c)所得酸解液上C18柱層析洗脫，收集苜蓿素級分，濃縮；(e)使步驟(d)所得濃縮物上凝膠分離柱，用純甲醇作流動相洗脫，收集苜蓿素級分，濃縮到乾燥，即得苜蓿素。本發明以一種簡便的方法以高收率獲得了高純度的苜蓿素。
文檔編號A61K31/352GK102040578SQ201010605530
公開日2011年5月4日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者姚曦, 嶽永德, 湯鋒, 王進, 郭雪峰 申請人:國際竹藤網絡中心