豬鏈球菌2型hp0245基因編碼蛋白作為保護性抗原的應用的製作方法

2023-11-11 01:07:12

專利名稱：豬鏈球菌2型hp0245基因編碼蛋白作為保護性抗原的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於獸醫微生物學和動物傳染病技術領域。具體涉及一個豬鏈球菌2型的保護性抗原基因分離、克隆以及它編碼的蛋白在疫苗和ELISA診斷試劑盒中的應用。
背景技術：
豬鏈球菌(Streptococcus suis)是引起豬鏈球菌病的病原菌，能夠導致豬腦膜炎、敗血症、肺炎、心內膜炎、關節炎，甚至死亡，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。在已知的33個血清型(1-31，33，1/2)中，豬鏈球菌2型是流行範圍最廣，致病性最強的血清型， 並且可以導致特定人群的感染。至1968年丹麥學者首次報導人感染豬鏈球菌2型以來，全世界已有550多份人感染豬鏈球菌2型的病例。其中，1998、2005年在我國江蘇省和四川省爆發了較大規模的人感染豬鏈球菌2型的疫情，分別導致14和38人死亡。流行病學調查結果顯示，豬鏈球菌2型是造成我國2003-2007年豬鏈球菌病的優勢血清型，分離率達到了 43. 2%。該血清型菌株造成宿主系統性感染，導致多器官病變壞死，並且豬鏈球菌2型常與豬繁殖與呼吸綜合症病毒、豬圓環病毒一起引起混合感染(Wei Z，Li R,Zhang A,He H,Hua Y,Xia J,Cai X,Chen H and Jin Μ. Characterization of Streptococcus suis isolates from the diseased pigs in China between 2003 and 2007. VetMicrobiol,2009,137 196-201)。鑑於豬鏈球菌2型的流行範圍之廣、危害性之強，因此，我們亟需有效的預防和治療手段來控制豬鏈球菌病的發生和流行。目前，國際上報導的關於豬鏈球菌的疫苗種類有滅活苗、弱毒苗、基因缺失疫苗以及亞單位疫苗。然而，由於滅活疫苗、弱毒苗和基因缺失疫苗存在毒力返強的生物安全隱患，基於保守蛋白質所設計的亞單位疫苗被認為是豬鏈球菌疫苗研究領域的一個熱點。豬鏈球菌是細胞外病原菌，其細胞表面結構蛋白和分泌蛋白在刺激機體產生免疫反應過程中發揮了重要作用，因此，這類蛋白成為了豬鏈球菌亞單位疫苗研究的候選蛋白。以豬鏈球菌毒力因子MRP，EF以及溶血素為目標的亞單位疫苗由於一些菌株不含這些毒力因子而逐漸被淘汰應用(Jacobs A A, Loeffen P L, van den Berg A J and Storm P K. Identification, purification, and characterization of a thiol-activated hemolysin(suilysin)of Streptococcus suis. Infect Immun,1996,62 :1742-1748 ; Wisselink H J, Vecht U, Stockhofe-Zurwieden N and Smith H E.Protection of pigs against challengewith virulent Streptococcus suis serotype 2 strains by a muramidase-released protein and extracellular factorvaccine. Vet Rec,2001,148 473-477)。隨後，一些具有較好免疫保護力的豬鏈球菌細胞表面蛋白被先後報導出來，包括38KDa 蛋白(Okwumabua 0 and Chinnapapakkagari S. Identification of the gene encoding a38-kilodalton immunogenic and protective antigen of Streptococcus suis.Clin Diagn Lab Immunol, 2005,12 :484-490), Sao (Li Y, Gottschalk M, Esgleas M，Lacouture S，Dubreuil J D，Wilson P and Harel J. Immunizationwith recombinant Sao protein confers protection against Streptococcus suis infection.ClinVaccine Immunol,2007,14 :937-943), SsuiDRAFT 0103(Aranda J, Garrido M Ε, Cortes P, Llagostera M and Barbe J. Analysis ofthe protective capacity of three Streptococcus suis proteins induced under divalent-cation-limited conditions. Infect Immun，2008，76 :1590-1598)以 ^SePGDCTan C, Liu Μ, Liu J, Yuan F, Fu S, Liu Y, Jin M, Bei W andChen H. Vaccination with Streptococcus suis serotype 2 recombinant 6PGD protein provides protection against S. suis infection in swine. FEMS Microbiol Lett，2009，296 :78-83)。其中，Sao蛋白還具有較好的豬鏈球菌病診斷應用前景。近年來，隨著基因組測序以及蛋白質組學技術在豬鏈球菌研究中的運用，越來越多的保護性抗原被鑑定出來。張安定等發現了 3個細菌細胞表面蛋白免疫小鼠或豬後能夠使其對抗豬鏈球菌2型強毒的感染，這3個蛋白分別是Enolase (Slang A，Chen B, Mu X, Li R,Zheng P,Zhao Y,Chen H and Jin Μ. Identification and characterization of a novel protective antigen, Enolase of Streptococcus suis serotype 2.Vaccine, 2009,27 :1348-1353), HPO197 (Zhang A, Chen B, Li R, Mu X，Han L, Zhou H, Chen H and Jin M. Identifi cation ofa surface protective antigen, HPO197 of Streptococcus suis serotype 2. Vaccine, 2009, 27 :5209-5213)禾口 HP0272(Chen B,Zhang A,Li R,Mu X， He H,Chen H and Jin M. Evaluation of the protective efficacy of a newlyidentified immunogenic protein,HP0272,of Streptococcus suis. FEMS Microbiol Lett,2010,307 12-18)。申請人:在之前所進行的關於篩選豬鏈球菌2型在宿主體內上調表達基因的研究(Li W，Liu L，Qiu D，Chen H and Zhou R. Identification of Streptococcus suis serotype 2 genes preferential expressed in the naturalhost. Int J Med Microb， 2010,300 :482-488)中報導了一系列預測為豬鏈球菌2型細胞表面蛋白基因，其中包括 hp0245。該基因名稱是根據已測序菌株S. suis 0Μ 133的基因組序列注釋(GenBank accession no. NC009442)。hp0245編碼的膜蛋白含有一較長的胞外段，該肽段作為潛在的抗原表位可以刺激機體產生免疫反應。因而，hp0245有可能作為豬鏈球菌2型亞單位疫苗的候選蛋白基因。

發明內容
本發明的目的在於克隆豬鏈球菌2型的一個免疫原性蛋白基因的部分片段，將該片段轉化到大腸桿菌中進行表達，純化後的重組蛋白應用於製備豬鏈球菌2型亞單位疫苗和ELISA試劑盒。本發明是這樣實現的申請人:從豬鏈球菌2型地方分離株SC_19(菌株來源參見實施例1)中克隆到 hp0245中編碼細胞外肽段的DNA，將其連入表達載體pET48a(+)獲得重組質粒pET48a/ SS2 hp0245K，隨後將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE!3)菌株中進行原核表達。經過測序發現本發明的重組蛋白HP0245ec由783個鹼基編碼，261個胺基酸組成，具有序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列和胺基酸序列。通過室內生物測定證實本發明的重組表達蛋白朋0245^能夠對豬鏈球菌2型感染有保護作用，並且蛋白質免疫印跡實驗表明該蛋白可以與感染豬鏈球菌2型的豬血清發生反應，這就預示著該蛋白具有作為豬鏈球菌2型亞單位
4疫苗以及相應的診斷試劑的應用前景。更詳細的技術方案參考實施例部分的描述。本發明的有益效果在於重組表達的豬鏈球菌2型蛋白HP0245ec具有較強的免疫原性，能夠為免疫動物提供良好的免疫保護，同時由於生產安全，製備工藝簡單，因此可被製備成豬鏈球菌2型的亞單位疫苗用來預防豬鏈球菌病的發生與流行。另外，根據ΗΡ0245Κ 抗原性強這一特點，該蛋白還可以被開發作為豬鏈球菌2型的新的診斷試劑或診斷試劑盒，為監控豬鏈球菌病提供一有力可靠的工具。


序列表SEQ ID NO :1是本發明分離克隆的豬鏈球菌2型免疫原性蛋白基因hp0245 中編碼胞外肽段HP0245e。的核苷酸序列及對應的胺基酸序列。圖1 本發明實施例中豬鏈球菌2型免疫原性蛋白基因hp0245中編碼胞外肽段 HP0245ec的DNA所在的原核表達載體pET48a/SS2 hp0245EC的構建圖和物理圖譜。圖2 本發明實施例中重組質粒pET48a/SS2 hp0245EC的酶切鑑定圖。圖中M為 DNA分子量大小標準；1為質粒pET48a(+) ；2為重組質粒pET48a/SS2 hp0245EC ;3為EcoR I 和 Sal I 雙酶切 pET-28a/SS2 hp0245E。結果。圖3 本發明實施例中豬鏈球菌2型重組蛋白HP0245ec在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表達純化的SDS-PAGE電泳分析。圖中M為蛋白質分子量標準。圖4 本發明實施例中重組蛋白HP0245ec與感染豬鏈球菌2型的豬血清Wfestern Blot反應結果。圖5 本發明實施例中重組蛋白HP0245K和豬鏈球菌2型滅活苗免疫小鼠後的抗體滴度。圖6 本發明實施例中免疫小鼠低劑量攻毒3天後的病理切片圖。圖中a，b為佐劑對照組小鼠的腦組織切片c為滅活苗免疫小鼠的腦組織切片；d為重組蛋白朋0245^免疫小鼠的腦組織切片。
具體實施方案以下敘述是本發明實施方案的實施例。應該說明的是，本發明的實施例對於本發明只有說明作用，而沒有限制作用。有關DNA和蛋白質的標準操作方法和所使用的藥品均參考《分子克隆實驗指南》所描述的內容(參見薩姆布魯克和拉塞爾，分子克隆實驗指南， 第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，北京，2001)。本發明中所涉及的其他各種實驗操作， 均為本領域的常規技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。實施例1重組蛋白HP0245Ee的克隆與表達本發明以SS2地方分離株SC-19作為hp0245中編碼細胞外肽段DNA克隆的來源菌株，該菌株分離自2005年四川省豬鏈球菌病中的一頭病豬，為強毒株，具有MRP+EF+SLY+表型(參見文獻 Li W, Liu L, Qiu D, ChenH and Zhou R. Identification of Streptococcus suis serotype 2 genes preferential expressed in the natural host.IntJ Med Microb，2010，300 :482-488)。1. hp0245中編碼細胞外肽段DNA的克隆
利用豬鏈球菌2型SC-19的基因組為模板，申請人依據NCBI網站(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)上公布的S. suis 0MYH33基因組序列中的hp0245基因序列設計上遊引物Pl :5，-GCGAATTCGGTGCTAGTCGAACGTTG-3，，其中下劃線部分為EcoR I酶切位點；下遊引物P2 :5，-CCGTCGACGGTCATAAGAATTTCAAGTTG-3，，其中下劃線部分為SalI酶切位點，進行 PCR擴增以獲得長度為78;3bp的目標DNA片段。PCR反應的體系和程序如下50 μ L反應體系包含5 μ L 10XPCR反應緩衝液(購自寶生物工程大連有限公司)，5 μ L dNTP (各2. 5mM)，5 μ L特異性上遊引物Pl O μ Μ)，5 μ L特異性下遊引物 Ρ2 (2 μ Μ), 4 μ L模板(豬鏈球菌SC-19基因組)，0. 5 μ L PrimeSTAR HS DNA聚合酶(購自寶生物工程大連有限公司)，加滅菌去離子水至50 μ L0 PCR反應參數和程序為94°C，5min, 1 個循環-M0C, lmin, 56°C, lmin, 72°C, lmin, 30 個循環；72°C, IOmin, 1 個循環。擴增到的目標片段通過DNA回收試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)純化後酶切，再經純化後連接到pET48a(+)(購自德國Merck公司)得到含有hp0245胞外肽段DNA序列的重組質粒pETj8a/SSa!pOM^(圖1)。之後將該重組質粒轉化大腸桿菌 (Escherichia coli)DH5a (購自寶生物工程大連有限公司)，並塗布卡那黴素抗性平板 (使終濃度為50 μ g/mL)。將抗性平板置於37°C培養箱中培養12-1他，待轉化子長到一定大小以後，篩選轉化子。將篩選到的轉化子用5mL的液體LB培養基活化培養，然後抽提質粒進行酶切驗證，酶切片段大小與預期大小一致(圖2)。最後將篩選到的陽性轉化子用5mL 的液體LB培養基活化培養，取ImL的過夜培養物送樣測序(測序由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成)。測序結果顯示本發明克隆的該DNA片段具有如序列表SEQ ID NO=I 中所示的核苷酸序列(包括其對應的胺基酸序列)，申請人將基因片段命名為hp0245K(在本發明中，被命名的基因以斜體小寫表示，下同)。通過軟體分析預測該基因片段可編碼一個如序列表SEQ ID NO :1中所示的由161個胺基酸組成的多肽，預測其分子量為30KDa，申請人將其命名為HP0245K (在本發明中，被命名的蛋白以正體大寫表示，下同)。將上述轉化了的重組質粒pET48a/SS2 hp0245Ee的重組大腸桿菌命名為大腸桿菌 (Escherichia coli) DH5 α /SS2 hp0245EC，於2010年9月30日將該重組大腸桿菌送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO M2010258。2.重組蛋白HP0245EC的表達與純化為了大量表達重組蛋白HP0245E。，申請人將上述攜帶有其編碼序列的重組表達質粒 pET-28a/SS2hp0245EC 轉化至大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)(購自德國 Merck 公司)中，得到了大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 pET-28a/SS2 hp0245EC。將該重組大腸桿菌菌株接種於5mL LB液體培養基中(使終濃度為50yg/mL卡那黴素)，過夜活化。以菌液培養基的體積比為1 100的比例將重組大腸桿菌培養液轉接至50mL新鮮LB液體培養基中，置於37°C搖床培養至0D_為0. 5-0. 8左右，加入1. 0mmol/L的異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(即IPTG，購自sigma公司)於37°C誘導培養池。將上述培養物12000rpm/ min離心Imin收集菌體，根據《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克和拉塞爾，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，北京，2001)上所介紹的包涵體提取方法對重組蛋白ΗΡ0245Κ進行提取並純化。對最終的純化產物進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖3所示，提純的蛋白與蛋白分子量標準比對，估算分子量為35KDa，與預計的蛋白分子量大小基本吻合，證明本發明的豬鏈球菌2型HP0245蛋白胞外片段在大腸桿菌BL21 (DE3)中得到了成功的表達。實施例2重組蛋白HP0245K免疫原性的檢測為了證明重組蛋白HP0245EC具有豬鏈球菌2型天然蛋白HP0245免疫原性的特點， 並且可以作為抗原用於豬鏈球菌2型感染的診斷檢測試劑盒的應用中，申請人通過蛋白質免疫印跡方法(參見薩姆布魯克和拉塞爾，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，北京，2001)將純化後的重組蛋白ΗΡ0245Κ經SDS-PAGE跑膠後轉移到PVDF膜上，並用感染豬鏈球菌2型的豬血清與之雜交，具體步驟如下5 μ g重組蛋白HP0245ec經 SDS-PAGE電泳完畢後，通過轉膜儀(購自美國Bio-Rad公司)將其電轉至PVDF膜上(購自美國hvitrogen公司)，PVDF膜在封閉液(5%脫脂牛奶)中封閉2小時之後與感染豬鏈球菌2型的豬血清(以體積比1 200的比例稀釋)於37°C作用1小時，然後加入辣根過氧化物酶標記的羊抗豬二抗IgG(購自美國SouthernBiotech公司)，繼續孵育30分鐘，每兩步之間都要用洗滌液(TBST 0. 05%吐溫-20，20mM Tris-HCl，150mM氯化鈉)對PVDF膜進行充分洗滌。最後加入底物液3，3' - 二氨基聯苯胺(DAB，購自美國Sigma公司)進行顯色反應。實驗結果如圖4所示為陽性，證明該重組蛋白ΗΡ0245Κ可與感染豬鏈球菌2型的豬血清反應，具有被用於豬鏈球菌2型診斷應用的潛力。實施例3重組蛋白HP0245Ee對豬鏈球菌2型感染保護力的檢測1.對重組蛋白HP0245Ee進行免疫後小鼠抗體水平評價為了對重組蛋白HP0245EC進行免疫後抗體水平評價，申請人將重組蛋白HP0245EC， 滅活苗及佐劑對照進行免疫後小鼠抗體水平評價。方法是將4周齡雌性Balb/c小鼠分成 3組，每組20隻。第1組每隻腹腔注射50 μ gHP0245ECO第2組注射自製的含有1 X IO9CFU 的豬鏈球菌2型滅活苗，滅活苗的製備過程如下用胰大豆培養基(TSB，購自美國BD公司) 培養豬鏈球菌2型過夜，然後向其中加入0. 5%的多聚甲醛溶液靜置培養M小時，取少量滅活後的菌液塗布在胰大豆培養基平板(TSA，購自美國BD公司)上，如果沒有豬鏈球菌2 型菌生長，則說明細菌已經徹底被滅活，可作為滅活苗使用。第3組為對照組，注射磷酸緩衝液(PBS =NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, KH2PO4 0. 24g, Na2HPO4 『 12H20 3. 6^g，溶於 800ml 蒸溜水中，用鹽酸調PH值為7. 4，蒸餾水定容至IOOOml，高壓滅菌，室溫保存)，所有注射物在注射前均與等體積氫氧化鋁佐劑(購自武漢中博生物股份有限公司)混合。2周後加強免疫一次，所用劑量同上。二免後第7天斷尾採血，用包被有HP0245E。(250ng/孔)和SS2滅活苗 (5yg/孔)的ELISA板進行抗體效價的檢測(包被方法見下文)。小鼠血清首先經過體積比為1 100倍稀釋，然後再進行倍比稀釋測效價。結果顯示，經重組蛋白HP0245EC和滅活苗二免後，小鼠的特異性抗體滴度達到較高的水平(圖5)。 2.重組蛋白HP0245rc對豬鏈球菌2型感染保護力的檢測 申請人:在二免後第10天對重組蛋白HP0245E。，滅活苗及佐劑對照免疫小鼠進行豬鏈球菌2型感染試驗。採用腹腔注射的方法，向每組中的10隻小鼠注射 3X IO9CFU(2XLD50)的處於對數生長中期的豬鏈球菌2型SC-19菌株，向另外10隻小鼠注射7. 5 X IO9CFU (5 X LD5tl) SC-19菌株。攻毒後連續觀察7天。免疫保護力率如表1所示， 在低劑量攻毒試驗中HP0245K和滅活苗均能提供100%的免疫保護，在高劑量攻毒試驗中， HP0245E。和滅活苗提供的保護率分別為80%和50%，而對照組的免疫保護效果在兩組攻毒試驗中皆為0% (對照組小鼠在低劑量攻毒第3天還有2隻存活，但是都表現出較嚴重的臨
7床症狀，例如毛被粗糙，嗜睡，眼腫，顫慄，行動遲緩)。取低劑量攻毒3天後的小鼠進行病理解剖觀察(每組2隻)，發現對照組小鼠的腦膜明顯增厚，有大量炎性細胞的浸潤，並且出現腦組織液化的病變特徵(圖6a，6b)，SS2的滅活苗免疫小鼠的腦膜有少量炎性細胞的浸潤 (圖6c)，而HP0245ec免疫小鼠的腦膜正常(圖6d)。表1免疫小鼠攻毒保護結果
權利要求
1.豬鏈球菌2型保護性抗原蛋白的應用，其特徵在於，該抗原為hp0245基因編碼蛋白的胞外肽段HP0245Ee，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2.一株表達豬鏈球菌2型HP0245胞外肽段HP0245Ee的大腸桿菌(Escherichia coli) DH5 α /SS2 hp0245EC，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2010258，其含有權利要求1所述的抗原蛋白基因。
3.權利要求1的應用，其中包括在製備豬鏈球菌2型亞單位疫苗中的應用。
4.權利要求1的應用，其中包括在製備豬鏈球菌2型ELISA診斷試劑盒中的應用。
5.權利要求2所述的大腸桿菌在製備豬鏈球菌2型亞單位疫苗中的應用。
6.權利要求2所述的大腸桿菌在製備豬鏈球菌2型ELISA診斷試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明屬於獸醫微生物學和動物傳染病技術領域。具體涉及豬鏈球菌2型的一個具有免疫原性蛋白基因的分離、克隆表達它所編碼蛋白中的胞外肽段以及重組蛋白在疫苗和診斷中的應用。本發明從豬鏈球菌2型強毒株SC-19菌株中分離得到一個新的具有免疫原性的蛋白基因hp0245；其中編碼胞外肽段的DNA(hp0245EC)具有如序列表SEQ ID NO1所示核苷酸序列，編碼261個胺基酸。重組蛋白HP0245EC保留了原始蛋白免疫原性的特點；對小鼠感染豬鏈球菌2型SC-19菌株能提供有效的免疫保護力，具有潛在的疫苗應用價值。本發明還包括豬鏈球菌2型HP0245-ELISA診斷試劑盒的構成和製備方法，以及克隆hp0245EC大腸桿菌DH5α/SS2 hp0245EC的製備，該重組大腸桿菌已保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC NOM2010258。
文檔編號C07K14/315GK102443053SQ201010509839
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者劉磊, 周銳, 李薇 申請人:華中農業大學