乳酸鏈黴菌及其應用的製作方法

2023-11-11 02:12:22 1

專利名稱：：乳酸鏈黴菌及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明是屬於微生物
技術領域：
,具體地說，涉及一種新的鏈黴菌及其應用。
背景技術：
：土壤中存在著大量的放線菌，放線菌對人類貢獻極大。目前發現的幾千種抗生素中，有一半以上是由放線菌產生的。另外，它的菌落顏色鮮豔，呈放射狀，對人體無害，因此，人們常用它作食品染色劑，既美觀，又安全。利用放線菌還可以生產維生素B12、蛋白酶和葡萄糖異構酶等醫藥用品。因此積極地從土壤中篩選具有不同功能的放線菌，具有重要的意義。
發明內容本發明的目的是提供一種能夠產生乳酸的新種鏈黴菌——乳酸鏈黴菌。本發明所述的鏈黴菌命名為乳酸微桿菌5^印Mwk"GIMN4.001，保藏編號為CCTCCNo.M208214。本發明所述的乳酸鏈黴菌是由廣州白雲區番茄根際土中採集的土壤，經分離培養獲得。該菌培養條件為-(l辨養基採用高氏合成l號瓊脂培養基。具體配方為可溶性澱粉20.0g，硝酸鉀(KN03)l.Og，磷酸氫二鉀(K2HP04)0.5g，硫酸鎂(MgS04.7H20)0.5g，氯化鈉(NaCl)0.5g,硫酸亞鐵(FeS04.7H20)0.01g，瓊脂20.0g，水1000ml，pH7,27.4;(2)培養溫度28°C。本發明乳酸鏈黴菌(沒wptowycestoctoGIMN4.001)的分子分類地位的確定。該菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示。本發明的乳酸鏈黴菌與其序列同源性最高的師崗鏈黴菌ATCC19166T的DNA-DNA雜交率為14.43%，與燻衣草灰鏈黴菌ATCC133061的DNA-DNA雜交率為20.00%。綜合16SrDNA序列分析和DNA-DNA雜交結果(1987年國際系統細菌學委員會ICSB規定，DNA同源性小於70。/。或雜交分子的熱解鏈溫度差小於或等於2'C為細菌種的界線，Wayneet3al,1987),本發明的乳酸鏈黴菌是一種新的放線菌，命名為乳酸鏈黴菌GIMN4.001。本發明乳酸鏈黴菌具有以下有益效果本發明的乳酸鏈黴菌的代謝產物上清液中有乳酸存在，能夠產生乳酸，該菌可用於生產乳酸。本發明菌株乳酸鏈黴菌S^eptowycw/actoGIMN4.001已於2008年11月10日保藏於國家知識產權局指定的保藏單位中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢大學校內)，保藏編號為No.M208214。圖l是本發明乳酸鏈黴菌孢子的掃描電子顯微鏡照片(lpm);圖2是本發明乳酸鏈黴菌產生晶體的照片(A:30pmB:10nm);圖3是本發明乳酸鏈黴菌及部分相關菌株依據16SrDNA序列構建的系統發育樹；圖4和圖5是本發明乳酸鏈黴菌氣質聯用分析產乳酸的結果圖。具體實施例方式以下通過具體實施例來詳細說明本發明。實施例1:本發明乳酸鏈黴菌的分離培養方法從廣州白雲山森林土壤中採集植物根際0-30cm土樣，取10g土壤放入裝有90mL無菌水的三角瓶中(帶玻珠)，在180rpm轉速下振蕩30分鐘，靜置10分鐘後取上層液稀釋10倍，取O.lmL均勻塗布在高氏合成1號瓊脂培養基板上，翻轉平板置於28'C培養箱中培養3天，即可獲得本發明所述的乳酸鏈黴菌Srep/om;;cesto""GIMN4.001，CCTCCNo.M208214。高氏合成l號瓊脂培養基可溶性澱粉20.0g,硝酸鉀(KN03)l.Og，磷酸氫二鉀(K2HP04)0.5g，硫酸鎂(MgS04.7H20)0.5g，氯化鈉(NaCl)0.5g,硫酸亞鐵(FeS04.7H20)O.Olg，瓊脂20.0g，水1000ml，pH7.27.4。本發明的乳酸鏈黴菌5^ep/ow_ycM/actoGIMN4.001具有下述微生物學特徵A.形態特徵在掃描電鏡下可見，該菌株孢子少，孢子鏈柔曲，孢子長柱形，表面光滑(見圖1)。B.培養學上的特徵該菌株在酵母精麥芽精瓊脂(ISP2)、燕麥粉瓊脂(ISP3)和高氏合成一號瓊脂培養基等不同的培養基上的培養特徵見表1。tableseeoriginaldocumentpage5本發明的乳酸鏈黴菌在培養基上所產生的晶體(見圖2)具有以下特性典型的雙錐型，菌體越老晶體越多，晶體形成在菌絲外面，可能由代謝物形成；晶體不溶於水、丙酮、乙醇、醋酸、甲醇、甲醛、乙酸乙酯；溶於10%鹽酸(有氣泡產生)、20%硫酸(有氣泡產生)、10%NaOH、10%EDTA、醋酸(有氣泡產生)、草酸；含有晶體的培養液能使KMn04退色。C.生理生化特徵該菌株兼性厭氧，革蘭氏陽性，接觸酶陽性，不產生類黑色素和H2S，牛奶凝固，明膠不液化，不水解澱粉，硝酸鹽還原陽性。能利用葡萄糖、D-果糖、木糖、肌醇為碳源，但不能利用D-半乳糖、蔗糖。D.其它性質該菌株最適生長溫度28t:;細胞壁含有LL二氨庚二酸，屬細胞壁I型；細胞水解物中含有甘露糖、半乳糖和核糖。甲基萘醌的主要類型是MK-7，含有Q-IO。細胞壁脂肪酸種類和含量如下表2細胞壁脂肪酸種類和含量tableseeoriginaldocumentpage6實施例2:本發明乳酸鏈黴菌菌株16SrDNA的序列測定及系統發育樹的構建具體按照下述操作進行1.所用試劑(1)5MNaCl(2)TE1(10mMTris,25mMEDTA)pH8.0;TE2(10mMTris,lmMEDTA)pH8.0(3)腦SDS(4)氯仿:異戊醇(24:1)(5)異丙醇(6)CTAB/NaCl(7)蛋白酶K(上海寶生物公司)母液20mg/ml2.DNA提取方法(1)將菌絲轉移至滅過菌的研缽中，充分研磨。(2)加567^1TE懸浮，並加入30nll0。/。SDS,3^120mg/ml蛋白酶K，混勻，37'C溫育1小時;(3)加腳15mol/LNaCl，混勻；(4)加CTAB/NaCl溶液，混勻，65。C溫育20分鐘；(5)用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提，10,000rpm離心10分鐘，將上清液移至乾淨離心(6)用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清液移至乾淨管中；(7)加0.6倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止l小時，沉澱DNA:(8)14，000rpm離心20分鐘，收集DNA沉澱；(9)DNA沉澱加50(^170%乙醇漂洗，自然風乾；(10)力卩50|ilTE溶解DNA，-2(TC保存。3.PCR擴增方法利用通用引物正向引物F27(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和反向引物1522R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')，引物序列的設計參照Edwards&Rogall(1989)的文章(EdwardsU,RogallT，BlockerHE.1989.Isolationanddirectcompletedeterminationofentiregenes.NucleicAcidsRes，17:78437853)，引物由上海英駿公司合成，擴增所用的試劑盒購買於大連寶生物公司。PCR擴增體系為成分濃縮反應緩衝液dNTP混合物TaqDNA聚合酶正向引物反向引物模板無菌水PCR反應程序終濃度1X工作濃度(50mM/LKCL,10mM/LTris-HCl，1.5mM/LMgCl2)每種鹼基0.2mmol/L0.51.0U/50|Jl|imol/Lmol/L102105ng/50jal將反應體積補足至30個循環94°C94°C58。C72。C72°C5minlminlmin2min7min16SrDNA的序列測定委託上海英俊生物科技有限公司進行。將本發明乳酸鏈黴菌GIMN4.001的16SrDNA序列登錄GenBank資料庫(登錄號是GQ184344)，與GenBank資料庫中的已知序列進行BLAST比較，確定與菌株GIMN4.001親緣關係最近的種屬，並從資料庫獲得相關種屬的16SrDNA序列，構建系統發育樹。序列比對用CLUSTALX1.83program,進化樹的構建用Neighbour-joining方法，進化樹分枝模式的穩定性用SEQBOOT和CONSENSEprogram進行bootstrap分析，重複次數為1000，計算各分支的置信度。本發明乳酸鏈黴菌及部分相關菌株依據16SrDNA序列構建的系統發育樹見圖3。本發明所述的乳酸鏈黴菌其形態特徵與其他的鏈黴菌有顯著差異，與基因序列同源性達98%-99°/0的鏈黴菌相比，也完全不同。本發明的乳酸鏈黴菌與部分相關菌株依據16SrDNA序列構建了系統發育樹，本發明的乳酸鏈黴菌與師崗鏈黴菌(l印to，a^附orootoe"^)和燻衣草灰鏈黴菌(5^印to/^，c^/ave"^/fgn'w一的親緣關係最近，師崗鏈黴菌與本發明的乳酸鏈黴菌16SrDNA序列同源性最高有98.9%，但師崗鏈黴菌在4種ISP培養基和澱粉合成瓊脂培養基上都能生長，不產生晶體。而本發明的乳酸鏈黴菌在ISP3和澱粉瓊脂培養不能生長，在馬鈴薯瓊脂培養基上生長茂盛；師崗鏈黴菌硝酸鹽不還原，而本發明的乳酸鏈黴菌硝酸鹽還原陽性；燻衣草灰鏈黴菌與本發明的乳酸鏈黴菌16SrDNA序列同源性最高有98.7。/。，但它們之間的生理生化特徵有區別，燻衣草灰鏈黴菌硝酸鹽還原弱，產生類黑色素和H2S，而本發明的乳酸鏈黴菌不產生類黑色素和H2S，而且本發明的乳酸鏈黴菌能產生大量雙錐型晶體。用馬鈴薯葡萄糖液體培養基發酵能產生乳酸。乳酸鏈黴菌與其同源性最高的鏈黴菌菌株微生物學特性比較見表3。表3乳酸鏈黴菌與其同源性最高的鏈黴菌菌株微生物學特性比較乳酸鏈黴菌師崗鏈黴菌燻衣草灰鏈黴菌特性浙e/7to附yce《/"c"、(&"to附戸s(，一畫》'cesGIMN4.001woraoA:ae,、)/"vra血/ig"'sew)注表中+表示陽性，-表示陰性，W表示反應弱，ND表示沒有測定。實施例3:本發明的乳酸鏈黴菌產乳酸能力的測定將本發明乳酸鏈黴菌菌株接種於馬鈴薯葡萄糖液體培養基中發酵14天後，發酵液7000rpm離心5min，取上清。取lml樣品，用N2吹乾，加入BSTFA(99%)，TMLS(1%)70'C衍生30min，然後取lpil樣品上氣質聯用分析儀(GC-MS)上分析。儀器為ThermoFinniganTraceDSQ，所用色譜柱為DB-5ms，規格為30mx0.25mmx0.25|im。升溫程序75。C保持lmin，然後以每分鐘l(TC的速度升溫，一直到30(TC，保持10min。質譜條件40-500質量掃描範圍，離子源溫度230。C，傳輸線溫度28(TC，進樣口溫度250°C(不分流)。測量結果表明，發酵上清液中存在乳酸，結果見圖4和圖5。其中，乳酸的保留時間為5.41min。圖4中縱坐標為相對峰度，橫坐標為保留時間。9ISP2培養基上菌落顏色孢子形態孢子鏈形態可溶性色素的顏色牛奶凝固牛奶腖化澱粉水解液化明膠是否產生H2S是否產生黑色素硝酸鹽還原蜜二糖D隱果糖糖糖灰白色長柱形，表面光滑柔曲++ND+++NDND棕色卵圓形至長柱形，表面光滑+ND++++++NDND+灰黃褐色橢圓至長方形++++wND+++NDND+糖乳醇露伯木半肌甘拉序列表廣東省微生物研究所乳酸鏈黴菌及其應用1PatentInversion3.111425bprDNAS^一omyce51/orcto1gctaccatgcagtcgacgatgatccggtttcggccggggattagtggcga50acgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccct100gg謹cggggtctaataccggatacgacctgccaaggcatgtcggggggt150ggaaagctccggcggtgcag;gatgagcccgcggcctatcagcttgUggt200ggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcga250ccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagca300gtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtg350agggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgt400gagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagcc450gcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgt雄ga500gctcgtaggcggcttgtcgcgtcggatgtgaaagcccggggcttaacccc550gggtctgcattcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaa600ttcctggtgtagcggtg.tgcgcagatatcaggaggaacaccggtggc650gaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtgggg700agcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggcac750taggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaag800tgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgac850gggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcga900agaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaacggccagagatggtcgc950ccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtc1000gtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgUctgtgtt1050gccagcatgcctttcggggtgatggggactcacaggagactgccggggtc1100aactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtct1150tgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgatgccgtg1200aggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgca1250actcgaccccatgaagttggagttgctagtaatcgcagatcagcattgct1300gcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaa1350agtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccttgtggagggagccgtc1400gaaggtgggactggcgattgggacg142權利要求1.一種乳酸鏈黴菌(StreptomyceslactisGIMN4.001)，其特徵在於其保藏編號為CCTCCNo.M208214。2.根據權利要求1所述的乳酸鏈黴菌(&re/7tow》，c^/actoGIMN4.001)，其特徵在於該鏈黴菌16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示3.根據權利要求1或2所述的乳酸鏈黴菌(5^eptowyw/uc似GIMN4.001)，其特徵在於具有以下微生物學特徵-A.形態特徵乳酸鏈黴菌在掃描電鏡下觀察，該菌株孢子少，孢子鏈柔曲，孢子長柱形，表面光滑，能產生雙錐型的晶體；B.生理生化特徵乳酸鏈黴菌兼性厭氧，革蘭氏陽性，接觸酶陽性，不產生類黑色素和H2S，牛奶凝固，明膠不液化，不水解澱粉，硝酸鹽還原陽性，不能利用D-半乳糖、蔗糖；C.其他特徵乳酸鏈黴菌細胞壁含有LL二氨庚二酸，屬細胞壁I型；細胞水解物中含有甘露糖、半乳糖和核糖。4.權利要求1-3任一項所述的乳酸鏈黴菌(沒repto/^c"GIMN4.001)在產乳酸中的應用。全文摘要本發明公開了一種乳酸鏈黴菌StreptomyceslactisGIMN4.001，該鏈黴菌已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期為2008年11月10日，保藏編號為CCTCCNo.M208214。本發明的乳酸鏈黴菌的代謝產物上清液中有乳酸存在，能夠產生乳酸，該菌可用於生產乳酸。文檔編號C12N1/20GK101619296SQ20091004062公開日2010年1月6日申請日期2009年6月26日優先權日2009年6月26日發明者孫曉棠,朱紅惠,羊宋貞,俊郭,黎志坤申請人:廣東省微生物研究所