基於伊波拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應用的製作方法

2023-11-11 05:21:27 1

基於伊波拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於伊波拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應用。本發明公開的一種蛋白或該蛋白的截短體，該蛋白為如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.3所示的蛋白；（2）將SEQ?ID?No.3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。本發明公開的抗原及其截短體能夠誘導較強的體液免疫反應，具有良好的免疫原性，可應用於伊波拉病毒疫苗的開發及中和抗體的製備。
【專利說明】基於伊波拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基於伊波拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應用。
【背景技術】
[0002]伊波拉病毒(Ebola virus, EBOV)是烈性傳染病伊波拉出血熱(EHF)的病原體，為絲狀病毒屬，非節段單股負鏈RNA病毒，有5個亞型，即Zaire Ebola (ZEBOV), SudanEbola(SEBOV), Cote d，Ivoire Ebola(CIEBOV), Bundibugyo Ebola (BEBOV)與 RestonEbola (REBOV) (Kuhn, JH, Becker et al.Arch.Virol, 2010，155，2083 - 2103)。自 1976 年首次發現Ebola病毒以來，EHF的爆發造成了大量人員死亡，死亡率接近90%。Ebola病毒感染後，相關疾病症狀很快出現，包括頭痛、肌痛、發熱、多器官功能衰竭及休克等(KsiazekTG et al.J Disl999; 179 (Suppll): S177 - S187)。目前，沒有有效的疫苗及藥物用於伊波拉病毒感染的預防及治療。
[0003]伊波拉病毒基因組全長19kb，編碼7種蛋白質，包括4種結構蛋白(包膜蛋白GP、核糖核蛋白NP、基質蛋白VP24和VP40)、2種非結構蛋白(VP30和VP35)以及病毒RNA聚合酶L。包膜蛋白GP覆蓋於病毒顆粒表面，是EBOV唯一的宿主粘附功能蛋白，在介導病毒侵入宿主細胞過程中發揮關鍵作用。此外，GP可選擇性地降低細胞表面與細胞粘附和免疫功能相關的大分子的表達，導致細胞的脫落死亡(Gene, 0.G et al.1nfect.Disord.DrugTargets, 2009, 9:191 - 200 ；Sullivan NJ, et al.Virol, 2005，79:547-553)。成熟的 GP 蛋白是三聚體形式，由三個GP1-GP2異源二聚體組成，其中亞基GPl的功能是將病毒錨定於宿主細胞，亞基GP2則負責病毒與細胞的融合(Kathryn Schornberg, et al.JOURNAL OFVIROLOGY, 2006, p.4174 - 4178)。
[0004]近十年來，隨著Ebola病毒致病機制的闡明，Ebola病毒疫苗的研究工作取得了巨大的進展，已研究了滅活疫苗、DNA疫苗、VEEV複製子疫苗、病毒顆粒疫苗(eVLP)、HPIV3載體疫苗、rAD5載體疫苗、rVSV載體疫苗等。上述已研究的疫苗主要是基於包膜蛋白GP抗原，其中重組腺病毒5 (rAD5)載體疫苗與重組皰疹口炎病毒(rVSV)載體疫苗，均在NHP模型中獲得了很好的保護活性(Sullivan NJ, et al.PLoS Med, 2006,3:177 ；Thomas W Geisbert et al.Vaccine，2008，26:6894-6900 ;Thomas W Geisbert et al.JViro, 2009, 80 (14): 7296-7304)。由於嵌入完整GP蛋白的病毒載體疫苗具有一定的複製能力及恢復毒性的風險，安全問題是這類疫苗不可忽視和亟待克服的問題。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種基於伊波拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應用。
[0006]本發明提供的一種蛋白或該蛋白的截短體，該蛋白為如下(I)或(2)所示:
[0007](1) SEQ ID N0.3 所示的蛋白；
[0008](2)將SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質；[0009]該蛋白的截短體為如下(3) - (8)任一所示:
[0010](3) SEQ ID N0.4 所示的蛋白；
[0011](4)將SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質；
[0012](5) SEQ ID N0.5 所示的蛋白；
[0013](6)將SEQ ID N0.5所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質；
[0014](7) SEQ ID N0.6 所示的蛋白；
[0015](8)將SEQ ID N0.6所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。
[0016]上述蛋白或該蛋白的截短體的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。
[0017]上述編碼基因中，所述蛋白的編碼基因為如下I)-3)任一所示:
[0018]I) SEQ ID N0.1中自5』末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子；
[0019]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中(I)或(2)所述蛋白質的DNA分子；
[0020]3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1中(I)或
(2)所述蛋白質的DNA分子；
[0021]所述截短體的編碼基因為如下4) -12)任一所示:
[0022]4) SEQ ID N0.1中自5』末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子；
[0023]5)在嚴格條件下與4)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中(3)或(4)所述蛋白質的DNA分子；
[0024]6)與4)或5)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1中(3)或
(4)所述蛋白質的DNA分子；
[0025]7) SEQ ID N0.1中自5』末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子；
[0026]8)在嚴格條件下與7)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中(5)或(6)所述蛋白質的DNA分子；
[0027]9)與7)或8)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1中(5)或
(6)所述蛋白質的DNA分子；
[0028]10) SEQ ID N0.1中自5』末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子；
[0029]11)在嚴格條件下與10)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中(7)或(8)所述蛋白質的DNA分子；
[0030]12)與10)或11)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1中(7)或(8)所述蛋白質的DNA分子。
[0031]含有上述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。
[0032]所述重組載體是將SEQ ID N0.1中自5』末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子、SEQ ID N0.1中自5』末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子、SEQ ID N0.1中自5』末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子、SEQ ID N0.1中自5』末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子分別插入pVAXl的EcoRI與XhoI位點間得到的。
[0033]上述蛋白或該蛋白的截短體、上述基因或上述重組載體在製備免疫原和/或抗原中的應用也屬於本發明的保護範圍；
[0034]所述免疫原或抗原是針對伊波拉病毒或伊波拉病毒包膜蛋白GP的。
[0035]上述蛋白或該蛋白的截短體、上述基因或上述重組載體作為抗原在製備針對伊波拉病毒的抗體中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0036]上述蛋白或該蛋白的截短體、上述基因或上述重組載體在製備預防和/或治療伊波拉病毒引起的疾病的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍；
[0037]所述伊波拉病毒具體為Zaire亞型伊波拉病毒。[0038]GP蛋白的生物學功能主要是通過GPl亞基吸附細胞膜、GP2亞基發揮融合功能，從而使得伊波拉病毒進入宿主細胞。
[0039]暴露於GP蛋白表面的中部區域(aa393_556)在GP蛋白功能的發揮中具有關鍵作用，且該區域含有豐富的GP蛋白抗原表位。本發明提供的抗原片段是來自伊波拉病毒(Zaire)包膜蛋白GP的一段序列(aa393_556)以及該序列的截短體。本發明提供的抗原片段L具有作為GP蛋白相似的抗原潛力，免疫產生的中和抗體能夠有效抑制病毒的感染。與完整的GP蛋白抗原相比，該抗原片段不具有GP蛋白的生物學功能(不具有GPl亞基與GP2亞基的功能，在病毒進入過程中只發揮輔助功能)，因此不能使病毒進入宿主細胞，該片段用於病毒載體疫苗的構建時具有更好的安全性，也更方便用於多價疫苗製備。抗原片段L進一步截短後也能夠誘導較強的體液免疫反應，具有良好的免疫原性，可應用於伊波拉病毒疫苗的開發及中和抗體的製備。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1 為 1% 瓊脂糖凝膠分析 pVAXl-GP，pVAXl-L，pVAXl-LA，pVAXl-LM，pVAXl-LB 的電泳圖。
[0041 ] 圖2為重組蛋白GP的表達及純化後SDS-PAGE電泳分析圖。
[0042]圖3為重組蛋白L的表達及純化後SDS-PAGE電泳分析圖。
[0043]圖4為重組質粒免疫小鼠血清的ELISA分析圖。
[0044]圖5為GP蛋白和L蛋白免疫小鼠血清的ELISA分析圖。
[0045]圖6為Concanavalin A (ConA)或GP蛋白刺激後GP免疫組與L免疫組的淋巴細胞刺激指數分析。
[0046]圖7為GP蛋白和L蛋白及片段免疫血清對假病毒感染靶細胞的中和活性分析圖。【具體實施方式】
[0047]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0048]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0049]下述實施例中所用的酶，除特殊說明外，均購自TAKARA公司。
[0050]下述實施例中所用的細胞培養基及血清，除特殊說明外，均購自Gibco公司。
[0051]PVAXl 購自 Invitrogen 公司。
[0052]pCAGGS-GP購自上海捷瑞生物工程有限公司，GP基因GenBank號為U28077.1。[0053]6周齡Balb/C雌性小鼠購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號=SCXK-(軍)2012-0004。
[0054]HRP標記的Goat ant1-mouse IgG抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司。
[0055]達優小鼠淋巴細胞分離液購自達科為生物技術公司，產品目錄號為DKW33-R0100。
[0056]Cell Counting Kit_8 (CCK_8Kit)購自日本同仁化學研究所，產品目錄號為CK04。
[0057]293FT 細胞購自 ATCC。
[0058]pNL4_3.1uc.RE 質粒在文獻 「L.Du et al., Development of a safe andconvenient neutralization assay for rapid screening of influenza HA-specificneutralizing monoclonal antibodies,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, 2010, 397:580 - 585」中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得。
[0059]Bright-Glo? Luciferase Assay System 購自 Promega 公司，產品目錄號為E2610。
[0060]實施例1、抗原及其片段的免疫原性分析
[0061]一、重組質粒的構建
[0062]同時構建pVAXl-GP，pVAXl-L重組質粒以及L截短體LA、LB、LM的重組質粒pVAXl-LA, P VAX 1-LM 和 pVAXl-LB。
`[0063]具體步驟如下:
[0064](一)設計併合成如下引物:
[0065]GPF:5』 -GAATTCGCCACCATGGGTGTTACAGGAATATTG-3』
[0066]GPR:5，-CCGCTCGAGTTAAAAGACAAATTTGCATAT-3，
[0067]LF/LAF: 5，-GAATTCGCCACCATGGTGTATAAACTTGACATCTCTG-3，
[0068]LR/LBR: 5，-CCGCTCGAGTTAACAGATTAAACCATCTTG-3 』
[0069]LAR: 5，-CCGCTCGAGTTATAGCTTCCCGCTGCTGGC-3，
[0070]LMF:5，-GGAATTCGCCACCATGAACACGAGCAAGGGTAC-3，
[0071 ] LMR: 5 』 -CCGCTCGAGTTAAGTCCAGTAATGTAAATT-3，
[0072]LBF:5，-GGAATTCGCCACCATGGGCTTAATTACCAATACT-3』
[0073](二)GP基因擴增
[0074]以pCAGGS-GP為模板，以GPF和GPR為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物I。
[0075]PCR 反應體系:pCAGGS-GP 為模板 I μ 1，2XPrime STAR GC buffer (Mg2+，plus)25 μ l,dNTP mix (2.5mM each)4 μ 1，上遊引物 GPFl μ 1，下遊引物 GPRl μ l，PrimeSTAR DNApolymerase0.5 μ I,補加滅菌水至 50 μ I。
[0076]PCR程序:94°C預變性4分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，30個循環，最後72°C延伸lOmin，4°C保溫。
[0077]GP基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0078](三)L、LA、LM與LB基因擴增
[0079]1、以pCAGGS-GP為模板，以LF/LAF和LR/LBR為弓丨物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物2 (L基因)。PCR擴增的退火溫度為54°C，72°C延伸30秒。
[0080]L基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5』末端起第1177位至第1668位核苷酸所示，其編碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0081]2、以pCAGGS-GP為模板，以LF/LAF和LAR為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物3 (LA基因)。PCR擴增的退火溫度為57°C，72°C延伸20秒。
[0082]LA基因如SEQ ID N0.1中自5』末端起第1177位至第1437位核苷酸所示，其編碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0.4所示。[0083]3、以pCAGGS-GP為模板，以LMF和LMR為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物4(LM基因)。PCR擴增的退火溫度為53°C，72°C延伸20秒。
[0084]LM基因如SEQ ID N0.1中自5』末端起第1306位至第1557位核苷酸所示，其編碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0085]4、以pCAGGS-GP為模板，以LBF和LR/LBR為弓丨物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物5 (LB基因)。PCR擴增的擴增退火溫度為54°C，72°C延伸20秒。
[0086]LB基因如SEQ ID N0.1中自5』末端起第1438位至第1668位核苷酸所示，其編碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0087](四)EcoRI與XhoI分別雙酶切PCR擴增產物1、PCR擴增產物2、PCR擴增產物3、PCR擴增產物4和PCR擴增產物5，得到GP、L、LA、LM和LB基因；EcoRI與XhoI雙酶切載體pVAXl，得到載體大片段；將GP、L、LA、LM和LB基因分別與載體大片段連接，得到重組質粒pVAXl-GP, pVAXl-L, pVAXl-LA, pVAXl-LM 和 pVAXl-LB。
[0088]1% 瓊脂糖凝膠分析重組質粒 pVAXl-GP，pVAXl-L，pVAXl-LA，pVAXl-LM，pVAXl-LB結果如圖1所不。
[0089]將重組質粒pVAXl-GP，pVAXl-L，pVAXl-LA，pVAXl-LM 和 pVAXl-LB 測序，結果正確。
[0090]二、重組蛋白GP和L的表達及純化
[0091 ](一)以pCAGGS-GP為模板，以24aGPF和24aGPR為弓丨物進行PCR擴增，得到GP Δ TM基因(SEQ ID N0.7) ,EcoRI 與 XhoI 雙酶切 GP Λ TM 基因，得到 GP Λ TM 片段;EcoRI 與 XhoI雙酶切pET24a ( + )載體(購自Novagen公司)，得到載體大片段；將GP Λ TM基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒，將其命名為pET24a ( + ) -GP。
[0092]24aGPF:5』 -GGAATTCATCCCACTTGGAGTCATCCAC-3』
[0093]24aGPR:5』 -CCGCTCGAGGTCCGGAAGGGTTTTATCAAC-3』
[0094]GP Δ TM蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
[0095]以pCAGGS-GP為模板，以24aLF和24aLR為引物進行PCR擴增，得到L基因，EcoRI與XhoI雙酶切L基因，得到L基因片段；EcoRI與XhoI雙酶切L基因，得到L基因；EcoRI與XhoI雙酶切pET24a ( + )載體，得到載體大片段；將L基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒，將其命名為pET24a ( + )-L。
[0096]24aLF:5』 -GGAATTCGTGTATAAACTTGACATCTCTG-3』
[0097]24aLR:5』 -CCGCTCGAGCCCACAGATTAAACCATC-3』
[0098]將pET24a (+) -GP 和 pET24a (+) -L 送測序結果正確。
[0099](二)pET24a (+) -GP 與 pET24a (+) -L 轉化感受態細胞
[0100]pET24a(+)-GP轉化Rosetta (DE3)感受態細胞(購自北京康為世紀生物科技有限公司)，pET24a(+)-L轉化BL21(DE3)感受態細胞(購自北京康為世紀生物科技有限公司)。各取I μ I質粒加入相應的感受態細胞中，冰浴30分鐘，42°C熱激90秒，再冰浴150秒，向感受態中加入900 μ I無抗性LB培養基，370C，150rpm復甦45分鐘，將復甦菌液均勻塗布在卡那黴素抗性的LB平板，37°C倒置培養16小時。
[0101](三)重組蛋白的誘導表達
[0102]挑取各重組菌的單克隆菌落，加入10πι150μ g/ml卡那黴素抗性的LB培養基，370C，220rpm培養12h ;按照體積比1:100接種菌液至1L50 μ g/ml卡那黴素抗性的LB培養基，370C，220rpm培養至OD6tltl=0.6，大約2小時，加入IPTG至終濃度ImM，30°C誘導表達6小時後離心收集GP重組菌菌體和L重組菌菌體。
[0103](四)重組蛋白的純化
[0104]重組蛋白GP為包涵體形式，其純化過程如下:
[0105]NTA-ObufferC20mM Tris-HCl pH7.9,500mM NaCl，體積百分含量為 10% 的甘油)重懸GP重組菌菌體，超聲破菌(功率400W，工作5秒，間歇5秒，總時間40分鐘)，4°C，1000Orpm離心30分鐘，收集破菌上清以及包涵體；UNTA-0buffer (20mM Tris_HClpH7.9,500mMNaCl，體積百分含量為10%的甘油，8M尿素)重懸包涵體沉澱，37°C，攪拌變性30分鐘，4°C，1000Orpm離心30分鐘，收集包涵體溶解液上清，將其0.45 μ m濾膜過濾後上NTA-Ni親和柱進行純化，收集穿透液、雜蛋白洗脫液和目的蛋白洗脫液。將破菌上清、包涵體溶解液上清、穿透液、雜蛋白洗脫液和目的蛋白洗脫液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖2所示。
[0106]Macrosep超濾離心管(50K)(購自Millipore公司)超濾濃縮目的蛋白洗脫液,得到蛋白GP (SEQ ID N0.8所示)，大 小約為70kD。
[0107]重組蛋白L為可溶形式，其純化過程如下:
[0108]NTA-ObufferC20mM Tris-HCl pH7.9,500mM NaCl，體積百分含量為 10% 的甘油)重懸L重組菌菌體，超聲破菌(功率400W，工作5秒，間歇5秒，總時間40分鐘)，4°C，1000Orpm離心30分鐘，收集破菌上清，0.45 μ m濾膜過濾後上NTA-Ni親和柱進行純化，收集穿透液、雜蛋白洗脫液和目的蛋白洗脫液。將破菌上清、穿透液、NTA-50洗脫液、NTA-100洗脫液和目的蛋白洗脫液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖3所示。
[0109]Macros印超濾離心管(IOK)(購自Millipore公司)超濾濃縮目的蛋白洗脫液，得到蛋白L (SEQ ID N0.3所示)，大小約為20kD。
[0110]三、抗原免疫活性測定
[0111](一)免疫方法
[0112]分組:
[0113]動物選取6周齡Balb/C雌性小鼠，分為生理鹽水I組，pVAXl載體組，pVAXl-GP組，pVAXl-L組，pVAXl-LA組，pVAXl-LM組和pVAXl_LB5組；生理鹽水2組，GP蛋白組及L蛋白組，每組10隻小鼠。
[0114]免疫方式:
[0115]生理鹽水I 組，pVAXl 載體組，pVAXl-GP 組，pVAXl-L 組，pVAXl-LA 組，pVAXl-LM組和pVAXl-LB組採取肌肉注射，不加佐劑，2周免疫一次(分別在第O天、第14天和第28天免疫)，100 μ g質粒/只(質粒濃度lmg/ml)，生理鹽水免疫體積為100 μ I/只，共3次。
[0116]生理鹽水2組，GP蛋白組，L蛋白組採取皮下注射，2周免疫一次(分別在第O天和第14天免疫)，35 μ g蛋白/只(蛋白濃度350 μ g/ml),生理鹽水免疫體積為100 μ I/只，共免疫2次，首次免疫採用弗氏完全佐劑(購自Sigma公司)，第二次免疫採用弗氏不完全佐劑(購自Sigma公司)，以1:1混合。
[0117]採血方式及時間:
[0118]尾靜脈米血，米血時間為免疫前米血I次，每次免疫後第10天米血I次。
[0119](二)血清中抗體滴度測定
[0120]1、所採各組小鼠的血液置於室溫凝固收縮2小時後，6000rpm離心8分鐘，收集上
清，即為血清。
[0121]2、重組蛋白GP (步驟二的(四)製備)鋪板(Nunc酶標板)，0.5 μ g/孔，4°C過夜，用PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；將板用5g/100ml的脫脂牛奶的PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液37°C封閉2小時，PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；加入步驟I得到的免疫血清，37°C孵育I小時，PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；加入HRP標記的Goat ant1-mouse IgG抗體，37°C孵育I小時，PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；100 μ I/孔加入TMB顯色液，室溫避光反應15分鐘，加入2Μ硫酸終止反應，0D450讀數(儀器為Thermo MULTI SCAN FC酶標儀)。
[0122]生理鹽水I 組，pVAX I 載體組，pVAX 1-GP 組，pVAX 1-L 組，pVAX 1-LA 組，pVAX 1-LM 組和pVAXl-LB5組血清中抗體滴度結果如圖4所示。
[0123]生理鹽水2組，GP蛋白組，L蛋白組血清中抗體滴度結果如圖5所示。
`[0124]圖4和圖5表明，無論採取質粒免疫還是重組蛋白免疫，抗原L誘導的抗體反應水平均與抗原GP誘導的抗體反應水平相當，二者之間無顯著性差異。
[0125](三)脾淋巴細胞增殖實驗
[0126]通過分析淋巴細胞增殖水平，可以判斷細胞免疫反應水平。
[0127]1、於最後一次免疫後，無菌條件下取GP蛋白組和L蛋白組小鼠的脾臟，按照Mouse I X Lymphocyte Separation Medium的說明，從達優小鼠淋巴細胞分離液分離小鼠脾淋巴細胞並製備淋巴細胞懸液(重懸於RPMI1640培養基)，按照2.5X IO5Cell/孔鋪96孔板，按100 μ I/孔加入重組蛋白GP (步驟二的(四)製備)溶液(25 μ g/ml，溶於RPMI1640培養基)或Concanavalin A (ConA,購自Sigma公司)，每組細胞設置3個復孔,將96孔板置於370C，5%C02培養箱中培養72小時。
[0128]2、按照CCK-8KU說明，將WST-8按10 μ I/孔加入各細胞孔中，繼續培養4小時後，測定0D.，計算刺激指數(SI)，結果如圖6所示。
[0129]圖6表明，蛋白GP (步驟二的(四)製備)刺激時，L蛋白組SI低於GP蛋白組，表明L蛋白組特異性細胞免疫水平弱於GP蛋白組；Concanavalin A刺激時,L蛋白組SI顯著高於GP蛋白組，表明L蛋白組非特異性細胞免疫狀態更為活躍，即抗原L能在一定程度上提高機體的細胞免疫反應水平。
[0130]蛋白GP作為特異性刺激源，可刺激淋巴細胞產生特異性增殖反應，抗原GP含較多的T細胞表位，能夠誘導更強烈的特異性細胞免疫反應，而抗原L含有較少的T細胞表位(無已報導的T細胞表位)，故誘導的特異性細胞免疫反應弱於抗原GP ；ConA是非特異性刺激源，抗原L可能具有某種上調機體淋巴細胞絲裂原受體表達水平的功能，因此在ConA刺激時，抗原L免疫的小鼠脾淋巴細胞增殖反應較抗原GP更為強烈。
[0131](四)假病毒感染中和實驗
[0132]採用經典的假型病毒的感染中和實驗方法(Arnab Basu, et al.JOURNAL OFVIROLOGY,Apr.2011，p.3106 - 3119;L.Du, et al.Res.Commun.(2010)，do1:10.1016/j.bbrc.2010.05.161)驗證抗原片段L誘導產生有效中和抗體的能力，為抗原片段L應用於疫苗或中和抗體的開發提供依據。
[0133]具體步驟如下:
[0134]1、假病毒包裝:293FT細胞以5X IO5Cell/孔鋪6孔板，37°C，5%C02培養箱培養過夜，至90%融合度。2yg pNL4-3.1uc.RE質粒與2yg pVAXl-GP質粒共轉染293FT細胞，轉染試劑lipofectamine2000 (購自Invitrogen公司)。轉染48小時後，收集培養上清，
0.22 μ m濾膜過濾分裝，即為假病毒溶液。
[0135]2、假病毒感染中和實驗:於實驗前一天，按IX IO4Cell/孔將293FT細胞鋪於96孔板，待到次日生長至80%融合度。將10 μ I步驟(二)製備的生理鹽水I組(圖7中的saline), pVAXl 載體組，pVAXl-GP 組，pVAXl-L 組，pVAXl-LA 組，pVAXl-LM 組和 pVAXl-LB組免疫血清與10 μ I步驟I製備的假病毒溶液混合於Iml DMEM培養基中，37°C孵育2小時得到混合液。將200 μ I/孔混合液替換96孔板細胞培養基，每組血清設置4個復孔，將96孔板置於37°C，5%C02培養箱中培養。24小時後，更換新鮮的含10%FBS的DMEM培養基，繼續培養 48 小時後，按照 Bright-Glo Luciferase Assay System 說明，使用 PerkinElmerEnSpire?2300MUltiable Reader儀器測定各組發光值，計算假病毒感染抑制率，結果如圖7所示。
[0136]圖7表明，pVA`Xl載體組的實驗結果與生理鹽水I組的實驗結果無顯著性差異。抗原L能夠有效誘導中和抗體的產生，對假病毒感染細胞的中和能力與抗原GP相當。抗原L的三個截短體LA、LB及LM也能不同程度地抑制假病毒的感染，即三個截短體也能夠產生不同水平的中和抗體。
【權利要求】
1.一種蛋白或該蛋白的截短體，該蛋白為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.3所示的蛋白； (2)將SEQID N0.3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質； 該蛋白的截短體為如下(3)- (8)任一所示: (3)SEQ ID N0.4所示的蛋白； (4)將SEQID N0.4所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質； (5)SEQ ID N0.5所示的蛋白； (6)將SEQID N0.5所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質； (7)SEQ ID N0.6所示的蛋白； (8)將SEQID N0.6所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白或該蛋白的截短體的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於:所述蛋白的編碼基因為如下中1)-3)任一所示: O SEQ ID N0.1中自5』末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中(I)或(2)所述蛋白質的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1中(I)或(2)所述蛋白質的DNA分子； 所述截短體的編碼基因為如下中4) -12)任一所示:4)SEQ ID N0.1中自5』末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子； 5)在嚴格條件下與4)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中(3)或(4)所述蛋白質的DNA分子； 6)與4)或5)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1中(3)或(4)所述蛋白質的DNA分子；7)SEQ ID N0.1中自5』末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子； 8)在嚴格條件下與7)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中(5)或(6)所述蛋白質的DNA分子； 9 )與7 )或8 )限定的DNA分子具有90 %以上的同一性且編碼權利要求1中(5 )或(6 )所述蛋白質的DNA分子；10)SEQ ID N0.1中自5』末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子； 11)在嚴格條件下與10)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中(7)或(8)所述蛋白質的DNA分子； 12)與10)或11)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1中(7)或(8)所述蛋白質的DNA分子 。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.權利要求1所述的蛋白或該蛋白的截短體、權利要求2或3所述的基因或權利要求4所述的重組載體在製備免疫原和/或抗原中的應用； 所述免疫原或抗原是針對伊波拉病毒或伊波拉病毒包膜蛋白GP的。
6.權利要求1所述的蛋白或該蛋白的截短體、權利要求2或3所述的基因或權利要求4所述的重組載體作為抗原在製備針對伊波拉病毒的抗體中的應用。
7.權利要求1所述的蛋白或該蛋白的截短體、權利要求2或3所述的基因或權利要求4所述的重組載體在製備預防和/或`治療伊波拉病毒引起的疾病的產品中的應用。
【文檔編號】C12N15/40GK103864904SQ201410076320
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月4日 優先權日:2014年3月4日
【發明者】戴秋雲, 王於, 劉珠果, 張科軍, 朱翠, 餘碩 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所