鈣通道阻塞多肽的製作方法

2023-12-10 01:50:21 2

專利名稱：鈣通道阻塞多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種在Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中發現的多肽以及與該多肽具有大致相同的胺基酸順序和活性的一類多肽。此類多肽及其藥學上可接受的鹽能夠阻塞無脊椎動物和脊椎動物細胞(包括神經和肌肉細胞)的鈣通道。本發明還涉及用此類多肽及其鹽阻塞有機體細胞(如神經和肌肉細胞)的鈣通道，以治療哺乳動物由鈣通道傳遞的疾病。另外，本發明還涉及含有該類多肽的合成物及其鹽。
鈣拮抗物有很多用途，臨床上可用於治療心絞通、高血壓、心肌病、室性心律失常、aesophogeal achalasia、早產、雷諾病(Raynaud′s disease)及其它疾病。見W.G.Nayler.Calaium Antagonists，Academic Press Harcourt Brace Jovanovich Publshers.New York，NY 1988，其內容併入本文作為參考。另外，此類合在物還可用於細胞生理(如神經和肌肉細胞生理)的研究。
從Agelenopsis aperta中分離出的其它多肽在美國專利第5122596號中有公開。
本發明涉及從Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中發現的一種多肽。本發明的多肽及其所呈現的部分如下Agelenopsis肽J2有以下的胺基酸順序，SEQ ID NO1。
H2N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-lle-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-Asp-Arg-Leu-Lys-Pro
本發明的多肽能阻塞細胞的鈣通道。因此，此多肽本身可用來阻塞細胞鈣通道。此多肽還用來控制無脊椎的害蟲，治療哺乳動物由細胞鈣通道功能傳遞的疾病。
本發明還包括與上述多肽具有大致相同的胺基酸順序和鈣通道阻塞活性的多肽。
本發明還包括含有該多肽的藥用組合物及該多肽類的施用方法。
Agelenopsis aperta蜘蛛的毒液按本領域技術人員所熟知的電刺激提取方法得到。最好用能夠防止反胃物和血液汙染，這種技術本領域技術人員均熟知。得到的全毒液貯存在-78℃的冷凍狀態下直至用於下述純化過程。全毒液中組分的純化在一第列製備或半製備的色譜柱如C-4和C-18 Vydac
柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road，Noburn Massachusetts 01801)上用反相高效液相色譜法完成。峰值檢測在220-230nm下單色進行，該部分的進一步分析可用例如多色紫外吸收數據收集用一個Waters 990二極體系統檢測儀完成(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)。色譜柱上餾分的收集可用已知方法進行。例如用一個ISCO/「FOXY」餾分收集器和一個ISCO 2159峰值檢測器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)收集。收集到的餾分置於適當大小的器器中，例如無菌聚乙烯的實驗室器皿。然後用從洗脫液中冷凍乾燥再從水中冷凍乾燥的方法濃縮那些餾分。所得餾分的純度可用色譜分析決定，所用分析柱的梯度系統比最終純化餾分系統具有更高的同溶劑性。
本發明的多肽可用已知方法進行順序分析，決定主要結構的一般方法包括例如以下步驟。1)二硫鍵半胱氨酸殘基的還原和S-吡啶化，以增強底物對酶作用的敏感性，2)通過單酶和多步酶消化作用控制肽段分裂，3)通過反相高效液相色譜法(HPLC)分離和純化肽段，4)用N-末端順序測定和離子濺射質譜分析鑑定肽段。
所研究多肽半胱氨酸殘基的S-吡啶化可在多肽胺基酸順序測定後的溶液中進行。可按下述步驟完成。
將約1至10μg的多肽用緩衝液溶解或稀釋至50μl，緩衝液用1份1MTris HCl，PH8.5，含有4mM EDTA和3份8M鹽酸胍，2.5μl的2-巰基乙醇的10%水溶液加入混合物中，室溫、暗處、氬氣中保溫兩小時。保溫後，加入2ml 4-乙烯基吡啶(在氬氣、-20℃下保存的新鮮試劑)，混合物在室溫、暗處、氬氣中再保溫兩小時。然後將混合物脫鹽，最好用色譜法在短的、反相色譜柱中進行。生成的烷基化的多肽用已知的方法進行順序測定。
本公開的另一益處在於，其中Agelenopsis aperta毒液J2片段的肽，還可用從全毒液分離純化以外的方法得到。本發明的多肽可用重組DNA技術通過無性繁殖該多肽或其部分的編碼序列產生。例如，可按照本專業技術人員熟知的方法，運用已知胺基酸序列的雜交探針克隆整個多肽的胺基酸密碼順序。可用重組DNA技術和體外蛋白質合成的方法產生本發明的多肽。這樣的體外蛋白質合成方法包括，但不限於，運用一種ABI 430A固相肽合成器(Applied Biosystems，Inc.850 Lincoln Center Drive，Foster City，California 94404)用標準的Merrifield化學或其它本領域技術人員熟知的固相化學方法。
本專業領域已知多肽中某些胺基酸更替不會影響或大致不會影響該多肽的功能。具體的替代物隨多肽的不同而不同，容許的取代物由本專業技術人中熟知的方法決定。因此，所有具有大致相同的胺基酸順序和大致相同的鈣通道阻塞活性的多肽，均在本發明範圍之內。
本發明的多肽阻塞多種細胞的鈣通道，如脊椎和無脊椎動物的神經和肌肉細胞。
本發明的多肽阻塞鈣通道的能力可用以下步驟來演示。從8天大的鼠小腦製備小腦顆粒細胞(Wilkin et al.，Brain Res，115，181-199，1976)。將Aclar方塊(1cm2)(Proplasties Inc.，5033 Industrial Ave.Wall，NJ 07719)用聚-L-顆氨酸包膜置於含有1ml Eagles基礎培養基的12-孔盤中，分離細胞，將含有6.25×106個細胞的等分試樣加入每一個有Aclar方塊的孔中。24小時後加入胞嘧啶-β-D-阿拉件呋喃糖苷(最終濃度為10μM)。這些細胞在培養6，7和8天後用於fura 2分析。將細胞(粘在Aclar方塊上的)轉移到含有1ml 2μM fura2/AM(Molecular Probes Inc.Eugene，OR 97402)於HEPES緩衝液的12孔盤中。HEPES緩衝液(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸緩衝液含有0.01%的牛血清蛋白，0.01%的葡萄糖，PH值為7.4，不含鎂)。細胞在37℃下保溫40分鐘，取出含有fura 2/AM的緩衝液，再換入同種不含fura 2/AM的緩衝液1ml。在每一個石英比色杯中加2.0ml預熱(37℃)的緩衝液。將Aclar方塊上的細胞置入比色杯中，將比色杯置於裝置有磁力攪拌器的恆溫(37℃)支架上，用一螢光分光光度計(Biomedical Instrument Group，University of Pennsylvania)測定螢光度。螢光信號可穩定約2分鐘。然後將適當濃度的所研究化合物的溶於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，PH7.4)中的貯存溶液5-20μl加入比色杯。每個試驗完成後螢光標記的校準和fura/AM損失的修正按Nemeth et.al.J.Biol.Chem.262，5188(1987)所述的方法進行。最大螢光值(Fmax)由加入35μm的肌黴素後測得。最小螢光度(Fmin由隨後加入EGTA(12mM)螯合鈣之後測得。按照上述步驟，所測多肽的鈣通道阻塞作用表現為加入該多肽後螢光度的減小。本發明的多肽顯示出低的IC50值，低於200nm。相比較，兩種已知的市售鈣通道拮抗物，硝苯吡啶和戊脈安，分別具有33nm和4800nm的IC50值。
本發明的多肽用作細胞鈣通道阻塞劑。因此，此類多肽還可用於無脊椎害蟲的控制及哺乳動物由鈣通道功能傳遞的疾病的治療，如心絞痛，高血壓，心肌病，室性心律失常，aesophogeal achalasial，早產和雷諾病。另外，這類多肽還可用於研究細胞生理，包括(但不限於)神經和肌肉細胞。
本發是範圍還包括本發明的多肽的藥學上可接受的鹽。此種鹽的製備方法為本專業技術人員熟知。例如此多肽的鹼基鹽可按常規的方法製備。
當本發明的多肽用於哺乳動物時，可以單獨使用，也可以與藥學上可接受的載體或按標準藥劑操作稀釋於藥物中使用。該多肽可口服，或按適合於多肽的方法經非腸道途徑施用。非腸道施用包括靜脈注射、肌肉注射、腹膜內注射、皮下注射和局部施用。
本發明的多肽用於口服時，可以片劑或膠囊的形式服用，或以水溶液或懸浮液的形式服用。如以片劑口服，載體通常包括乳糖和粟粉以及潤滑劑，如通常加入硬脂酸鎂。以膠囊形式口服時，稀釋劑通常為乳糖和幹粟粉。當口服水溶懸浮液時，活性成分與乳化和懸浮價質混合。如需要還可加入增甜劑和調味劑。
用於肌肉、腹膜內、皮下和靜脈注射時，通常需要製備活性成分的無菌溶液，溶液的PH應適當地調節和緩衝。用於靜脈注射，應控制溶液的總濃度使其與組織液等滲。
當本發明的多肽及其鹽用於人體時，每日劑量應由處方醫師決定。此外，劑量應隨所齡、體重、病人的個體反應而不同，以及由病症的嚴重性和所施用藥的效能而定。
當本發明的多肽及其鹽用於控制無脊椎的害蟲時，該多肽直接施用於該無脊椎動物體或其環境中。例如，本發明的化合物可以溶液的形式噴灑於該無脊椎動物上。控制此無脊椎動物所需的化合物的量將隨無脊椎動物及其環境條件而變化，由施用者決定。
當本發明的多肽及其鹽用於細胞生理的研究時，該多肽將按照本專業技術人員熟知的方法施用於細胞上。例如，該多肽可於一種適當的生理緩衝液中施於細胞上。這類研究所用的此種多肽的適合濃度應為200μM。但是也可大於或小於200μM。多肽的施用量將由本專業技術人員按熟知的方法決定。
實施例1A.將原Agelenopsis aperta的毒液(約40μl)加入一個反相高效液相色譜儀的色譜柱(VYDAC
C-18，300
，22×250mm)中用一個雙相線性梯度作業系統，由95%A和5%B至80%A至和20%B經30分鐘後，用30%A和70%B25分鐘(A為0.1%的三氟乙酸，B為乙腈)，監測波長為220nm，流速為15ml/min，所需片段在38.3-38.7分鐘內收集。匯集每一次得到的相似片段，然後用冷凍乾燥法濃縮。
B.將從100μ的原毒液按步驟A分離出來的物質，加入一個反向高效液相色譜柱(Vydac
，C-18，300
，22×250mm)中，用線性梯度系統操作，從77%A和23%B至70%A和30%B25分鐘(A為0.1%三氟乙酸，B為乙腈)，監測波長為220nm，流速為12ml/min，所需片段在17.3至17.7分鐘內收集。匯集每次得到的相似片段，然後用冷凍乾燥法濃縮。
肽J2的結構用下述的方法確定和證實。三份1至10nmol樣品用Waters Pico-Tag系統進行異硫氰苯酯(PTC)胺基酸分析。用一個脈衝液相順序分析儀(ABI)測定原來還原和與吡啶乙醇作用過的多肽N-末端順序。多肽的主要結構可用自動脈衝液相順序分析儀(Applied Biosystems，model 473A)測得。用質譜儀的BIO-ION等離子解吸時間可得到質譜分析數據。
適用於N末端順序測定的多肽J2的吡啶乙基化的衍生物可按下列方法製備。將多肽J2(50mg)溶於10μl的緩衝液(比率為1∶3的1M tris，PH8.4，4μM二元EDTA和8M鹽醇胍)，用2μl0.454M(10%V/V)的2-巰基乙醇處理，在室溫、暗處放置3小時。反應混合物在緩衝液中用2μl的4-乙烯基吡啶0.456M的溶液處理，在室溫、暗處放置18小時。反應混合物用90μl的水和40μl的乙腈稀釋經加入一個HPLC色譜柱(Baker WPC-18，4.6-250mm)，用雙相線性梯度系統處理，80%A和20%B5分鐘，然後80%至50%A和29%至50%B經30分鐘(A為三氟乙酸、B為乙腈)，監測波長為220nm，流速為1.0ml/min所需片段在20.8至21.3分鐘內收集，用冷凍乾燥法濃縮。
得到以下數據，確認了多肽J2的結構。
SEQ 1D NO1，48殘基，10個半胱氨酸，5個二硫鍵。
計算質量＝5474.4測得質量＝5474估計長度＝7.98順序表(1)一般資料(ⅰ)申請者(A)名稱Dfizer Inc.
(B)街道235 East 42mol Street(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家美國(F)郵政編碼(ZIP)10017(G)電話(203)441-4905
(H)傳真(203)441-5221(A)名稱NPS Pharmaceuticals，Inc(B)街道420 Chipeta Way(C)城市鹽湖城(D)州猶它州(E)國家美國(F)郵政編碼(ZIP)84108(G)電話(801)583-4939(H)傳真(801)583-4961(ⅱ)發明標題Agetenopsis aperta的鈣通道阻塞多肽(ⅲ)序列編號1(ⅳ)計算機可讀形式(A)傳導形式軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patemtln Release ＃1.0 Version ＃1.25(EPO)(ⅵ)先有申請資料(A)申請號US 07/919538(B)申請時間1992年7月27日(2)SEQ ID No.1資料(ⅰ)序列特徵(A)長度48個胺基酸(B)形式胺基酸
(C)鏈單鏈(D)拓樸學特徵線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)來源(A)生物Agelenopsis aperta(B)組織類型毒液(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO權利要求
1.一種大致純的多肽，包括其胺基酸序列SEQIDNO∶1，或一種與該多肽有大致相同的胺基酸順序和大致相同的鈣通道阻塞活性的多肽，或其藥學上可接受的鹽。
2.權利要求1的大致純的多肽，其胺基酸序列為SEQ ID NO1，其其藥學上可接受的鹽。
3.一種阻塞細胞鈣通道的方法，包括施用權利要求1的阻塞鈣通道量的多肽於所述細胞。
4.權利要求3的方法，其中所述細胞為哺乳動物神經系統的細胞。
全文摘要
一種由Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中分離出來的多肽，它能阻塞不同有機體細胞的鈣通道，可用於阻塞細胞的鈣通道。用來治療由鈣通道傳遞的疾病和控制無脊椎害蟲。
文檔編號A61K38/16GK1086824SQ9310915
公開日1994年5月18日 申請日期1993年7月26日 優先權日1992年7月27日
發明者R·A·福克曼, N·A·薩科曼諾, D·菲利普斯, M·E·凱利 申請人:美國輝瑞有限公司