黑猩猩腺病毒疫苗載運體的製作方法

2023-12-10 04:23:06 1

專利名稱：黑猩猩腺病毒疫苗載運體的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組載體領域，更具體地涉及重組複製缺陷性黑猩猩腺病毒載體的產生和用途，來在哺乳動物宿主中引發免疫反應。
背景技術：
腺病毒(Ads)包含在兩棲動物、禽類和哺乳動物中發現的、具有無包被的二十面體衣殼結構的雙鏈DNA病毒的大家族(Straus，Adenovirus infections in humans.In The Adenoviruses.451-498，1984；Hierholzer et al.，J.Infect.Dis.，158804-813，1988；Schnurr andDondero，Intervirology.，3679-83，1993；Jong et al.，J Clin Microbiol.，373940-39451999)。與逆轉錄病毒相比，腺病毒可以轉導幾個哺乳動物物種的許多細胞類型，包括分裂和非分裂細胞，而不整合到宿主細胞的基因組中。
一般而言，腺病毒DNA一般是非常穩定的並保持游離(例如，染色體外)，除非發生了轉化或腫瘤發生。此外，在容易進行臨床級組合物的製藥規模生產的良好定義的生產系統中，腺病毒載體可以繁殖到高產量。這些特徵和它們被良好表徵的分子遺傳學，使得重組腺病毒載體成為用作疫苗載運體(carrier)的好的候選者。一般地，重組腺病毒載體的生產依靠使用能夠補足腺病毒基因產物的功能的包裝細胞系，所述功能已經被刪除或被工程化為無功能的。
目前，兩種良好表徵的人類C亞群腺病毒血清型(即，hAd2和hAd5)被廣泛地用作大多數用於基因治療的腺病毒載體的病毒主幹的來源。也已經測試了複製缺陷性人類腺病毒載體作為用於遞送各種免疫原的疫苗載體，所述免疫原來源於各種傳染原(例如，病毒、寄生蟲或細菌性病原體)和腫瘤細胞，包括腫瘤相關抗原(TAA)。在實驗動物(例如，齧齒動物、犬和非人靈長類)中進行的研究表明，攜帶轉基因的重組複製缺陷性人類腺病毒載體引發了針對轉基因產物的體液和細胞介導的免疫反應，所述轉基因編碼來源於人類乳頭狀瘤病毒(HPV-16)的E6和E7癌蛋白(He，Z et al.，(2001)Virology，2703583-3590)、狂犬病病毒糖蛋白(Xiang，Z.et al(1996)Virolgy，219220-227)、Plasmodium falciparum的環子孢子蛋白Rodriguez E.etal.(1997)J.Immunol.1581268-1274)以及其他異源抗原的免疫原。一般而言，研究人員已經報導了，通過使用利用預計可引發免疫反應的高劑量重組腺病毒載體的免疫方案；或通過使用採用腺病毒載體的連續施用的免疫方案，所述腺病毒載體來源於不同血清型但攜帶相同的轉基因產物用作強化免疫，在非人類實驗系統中成功地使用人類腺病毒載體作為疫苗載運體(Mastrangeli，et al.，Human Gene Therapy，779-87(1996)。
然而，預計的是，來源於遍在的人類血清型，例如2和5型的疫苗載運體將在人類群體中遇到先存的(pre-existing)體液和細胞免疫。因而，儘管已經在採用齧齒動物、犬和非人靈長類宿主的實驗系統中成功地使用複製缺陷性重組人類腺病毒作為疫苗載運體，預計人類的先天和適應性免疫會顯著地限制這些血清型作為疫苗載運體的實用性。這種預期是基於這一事實，包括2型和5型的C亞群腺病毒感染在人類群體中是地方性的。結果，作為自然感染的結果，大多數人類在生命的頭五年內血清轉變。因而，來源於在人類中天然感染並複製的病毒的載體，可能不是用作疫苗載運體的最優候選者。
與使用人類腺病毒衍生載體相關的另一個問題是，用於繁殖重組病毒的生產方法產生被有複製能力的腺病毒(RCA)汙染的載體成品的風險。這是起因於，來自重組載體和存在於E1補足輔助細胞系，例如人類293(Graham，F.L.et al，(1977)J.Gen.Virol.3659-72.)細胞中的腺病毒基因的重疊序列之間的同源重組。在為用於臨床試驗製備的載體成品中RCA的存在構成了安全風險，因為它可能促進複製缺陷性病毒的流動和傳播。缺陷病毒的傳播可能加重宿主免疫應答，並引起其他有害的免疫病理後果。(Fallux，F.J.，et al.HumanGene Therapy 91909-1917(1998)。因此，食品和藥品管理局(FDA)和其他管理機構已經頒布了指導原則，其建立了對可能存在於用於臨床用途的載體製品中的RCA水平的限制。加以RCA限制的意圖是確保患者有限地暴露於用於臨床試驗的組合物中的複製性腺病毒。
因而，存在著開發適用於哺乳動物宿主的腺病毒疫苗載運體的持續的需求，其是易於操作、可經受製藥規模的生產和長期儲存、在人類補足細胞系中能以高水平複製、高度的免疫原性、沒有與人類腺病毒的常見血清型交叉反應的中和B細胞表位、符合管理機構頒布的安全RCA標準、並且其符合在適合人類使用的激發/強化(prime/boost)方案中使用。
發明概述本發明涉及來源於黑猩猩腺病毒的重組複製缺陷性腺病毒載體和用於在人類E1表達細胞系中產生黑猩猩腺病毒載體的方法。本發明還提供了產生適用於人類的臨床級載體成品的方法，和使用所公開的載體作為疫苗載運體來引發保護性和/或治療性免疫反應的方法。本發明進一步提供了使用本發明的重組腺病毒來製備疫苗組合物的方法，所述疫苗組合物被設計以遞送編碼免疫原的轉基因和指導編碼免疫原的轉基因的表達。在一個實施方式中，本發明考慮使用所公開載體作為疫苗載運體用於疫苗的施用，所述疫苗包含編碼來源於傳染原的免疫原的轉基因。在第二種實施方式中，本發明考慮使用所公開的載體來製備和施用癌症疫苗。在特定的實施方式中，本發明考慮製備和施用包含編碼TAA的轉基因的癌症疫苗。
在一個方面，本發明公開了五種黑猩猩腺病毒(ChAds)的完整基因組序列，在此稱為ChAd3(SEQ ID NO1)(附圖5A-5K)、ChAd6(SEQ ID NO2)(附圖6A-6K)、CV32(SEQ ID NO3)(附圖7A-7K)、CV33(SEQ ID NO4)(附圖8A-8K)和CV23(SEQ ID NO5)(附圖9A-9J)。
ChAd3和ChAd6是根據在此公開的方法分離的新的腺病毒。ChAd3和ChAd6的基因組長度分別是37741和36648個鹼基對。ChAd3六鄰體基因(SEQ ID NO41)包含SEQ ID NO1的核苷酸(nt)19086-21965(不包括終止密碼子)，ChAd3纖維基因(SEQ IDNO42)包含SEQ ID NO1的nt 32805-34487(不包括終止密碼子)。ChAd6六鄰體(hexon)基因包含SEQ ID NO2的nt 18266-21124(SEQID NO43)(不包括終止密碼子)，它的纖維基因(SEQ ID NO44)包含SEQ ID NO2的nt 32218-33552(不包括終止密碼子)。根據從全長六鄰體肽的多重序列比對得出的序列同源性，ChAd3被分類入人類C亞群，ChAd6被分類入人類E亞群。
CV32、CV33和CV23腺病毒的基因組的長度分別是36,606、36,535和32,020個鹼基對。CV32(Pan 6)(ATCC N.VR-592)、CV33(Pan7)(ATCC N.VR-593)和CV23(Pan 5)(Esoterix Inc.，)全都被確定為與人類Ad4(hAd4)(E亞群)相關(Wigand，R et al.Intervirilogy1989，301-9)。然而，根據六鄰體序列比對，隨後將CV32表徵為與類似於hAd4相比更接近地類似於人類D亞群成員。
在第二個方面，本發明提供了根據在此公開的方法分離的21種其他黑猩猩腺病毒(ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82)的纖維基因和六鄰體基因的核苷酸序列。
ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19的纖維基因核苷酸序列分別在附

圖10-19中列出，在此稱為SEQ ID NO6-15(SEQ ID NO6，ChAd20)；(SEQ ID NO7，ChAd4)；(SEQ ID NO8，ChAd5)；(SEQ ID NO9，ChAd7)；(SEQ ID NO10，ChAd9)；(SEQ ID NO11，ChAd10)；(SEQ ID NO12，ChAd11)；(SEQ ID NO13，ChAd16)(SEQ IDNO14，ChAd17)和(SEQ ID NO15，ChAd19)ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的纖維基因核苷酸序列在此稱為(SEQ ID NO58，ChAd8)、(SEQ ID NO60，ChAd22)、(SEQID NO62，ChAd24)、(SEQ ID NO64，ChAd26)、(SEQ ID NO66，ChAd30)、(SEQ ID NO68，ChAd31)、(SEQ ID NO70，ChAd37)、(SEQ ID NO72，ChAd38)、(SEQ BD NO74，ChAd44)、(SEQ ID NO76，ChAd63)和(SEQ ID NO78，ChAd82)，並在序列表中列出。
ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19的六鄰體基因核苷酸序列分別在附圖21-30中列出，在此稱為SEQ ID NO16-25(SEQ ID NO16，ChAd20)；(SEQ ID NO17，ChAd4)；(SEQ ID NO18，ChAd5)；(SEQ ID NO19，ChAd7)；(SEQ ID NO20，ChAd9)；(SEQ IDNO21，ChAd10)；(SEQ ID NO22，ChAd11)；(SEQ ID NO23，ChAd16)；(SEQ ID NO24，ChAd17)和(SEQ ID NO25，ChAd19)。
ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的六鄰體基因核苷酸序列在此稱為(SEQ ID NO97，ChAd8)、(SEQ ID NO99，ChAd22)、(SEQ ID NO101，ChAd24)、(SEQ ID NO103，ChAd26)、(SEQID NO105，ChAd30)、(SEQ ID NO107，ChAd31)、(SEQ ID NO109，ChAd37)、(SEQ ID NO111，ChAd38)、(SEQ ID NO113，ChAd44)、(SEQ ID NO115，ChAd63)和(SEQ ID NO117，ChAd82)，並在序列表中列出。
在第三個方面，本發明提供了根據在此公開的方法分離的21種其他黑猩猩腺病毒(ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82)的纖維蛋白和六鄰體蛋白的胺基酸序列。
在此公開和要求權利的纖維蛋白稱為(SEQ ID NO83，ChAd3)、(SEQ ID NO84，ChAd6)、(SEQ ID NO48，ChAd20)、(SEQ ID NO49，ChAd4)、(SEQ ID NO50，ChAd5)、(SEQ IDNO51，ChAd7)、(SEQ ID NO52，ChAd9)、(SEQ ID NO53，ChAd10)、(SEQ ID NO54，ChAd11)、(SEQ ID NO55，ChAd16)、(SEQ ID NO56，ChAd17)、(SEQ ID NO57，ChAd19)、(SEQ IDNO59，ChAd8)、(SEQ ID NO61，ChAd22)、(SEQ ID NO63，ChAd24)、(SEQ ID NO65，ChAd26)、(SEQ ID NO67，ChAd30)、(SEQ ID NO69，ChAd31)、(SEQID NO71，ChAd37)、(SEQ IDNO73，ChAd38)、(SEQ ID NO75，ChAd44)、(SEQ ID NO77，ChAd63)和(SEQ ID NO79，ChAd82)。附圖20A-20G提供了比較在此公開和要求權利的纖維蛋白的胺基酸序列與以下纖維蛋白的胺基酸序列的比對C1(SEQ ID NO85)、CV68(SEQ ID NO86)、Pan5(作為選擇稱為CV23)(SEQ ID NO80)、Pan6(作為選擇稱為CV32)(SEQ ID NO81)和Pan7(作為選擇稱為CV33)(SEQ IDNO82)。
在此公開和要求權利的六鄰體蛋白稱為(SEQ ID NO122，ChAd3)、(SEQ ID NO123，ChAd6)、(SEQ ID NO87，ChAd20)、(SEQ ID NO88，ChAd4)、(SEQ ID NO89，ChAd5)、(SEQ IDNO90，ChAd7)、(SEQ ID NO91，ChAd9)、(SEQ ID NO92，ChAd10)、(SEQ ID NO93，ChAd11)、(SEQ ID NO94，ChAd16)、(SEQ ID NO95，ChAd17)、(SEQ ID NO96，ChAd19)、(SEQ IDNO98，ChAd8)、(SEQ ID NO100，ChAd22)、(SEQ ID NO102，ChAd24)、(SEQ ID NO104，ChAd26)、(SEQ ID NO106，ChAd30)、(SEQ ID NO108，ChAd31)、(SEQ ID NO110，ChAd37)、(SEQ ID NO112，ChAd38)、(SEQ ID NO114，ChAd44)、(SEQ ID NO116，ChAd63)和(SEQ ID NO118，ChAd82)。附圖31A-31J提供了在此公開和要求權利的六鄰體蛋白的胺基酸序列與以下六鄰體蛋白的胺基酸序列的比較C1(SEQ ID NO124)、CV68(SEQ ID NO125)、Pan5(做為選擇稱為CV23)(SEQID NO119)、Pan6(做為選擇稱為CV32)(SEQ ID NO120)和Pan7(做為選擇稱為CV33)(SEQ ID NO121)。六鄰體蛋白的多重序列比對容許技術人員進行與人類腺病毒血清型的建議分類一致的系統發生分析(Rux，J.J.，et al(2003)J.Virol.779553-9566)。
在可選擇的方面，本發明進一步提供了21種其他的黑猩猩腺病毒分離物。包含ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17和ChAd19的樣品根據布達佩斯條約作為原始保藏物於2003年12月12日保藏在歐洲細胞培養物保藏所(ECACC，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，UnitedKingdom)。指定了保藏物的登記號碼03121201(ChAd4)、03121202(ChAd5)、03121203(ChAd7)、03121204(ChAd9)、03121205(ChAdl0)、03121206(ChAd11)、03121207(ChAd16)、03121208(ChAd17)、03121209(ChAd19)和03121210(ChAd20)。
包含ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的樣品根據布達佩斯條約作為原始保藏物於2005年1月12日保藏在歐洲細胞培養物保藏所(ECACC，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，United Kingdom)。指定了這些保藏物的登記號碼05011201(ChAd8)、05011202(ChAd22)、05011203(ChAd24)、05011204(ChAd26)、05011205(ChAd30)、05011206(ChAd31)、05011207(ChAd37)、05011208(ChAd38)、05011209(ChAd44)、05011210(ChAd63)和05011211(ChAd82)。
這些保藏物將根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的條款進行維持。這些保藏僅為了方便本領域技術人員而進行，而不是認可保藏是35 U.S.C.§112所需的。在授予專利之時，除了37 C.F.R.§1.808(b)規定的要求之外，對保藏的材料的公眾可獲得性的所有限制將被不可撤銷地除去。
在其他方面，本發明還提供了複製缺陷性重組腺病毒載體，其能夠感染哺乳動物細胞，優選的人類細胞，並指導編碼的轉基因產物的表達。如在此展示的，所公開的載體(vector)適合用做疫苗載運體(carrier)用於遞送包含免疫原的轉基因，針對所述免疫原的免疫反應是期望的。在特定實施方式中，本發明提供了能夠在人類E1表達(即，包裝)細胞系中高水平複製的重組複製缺陷性黑猩猩腺病毒載體。在一個實施方式中，本發明提供了能夠在PER.C6TM細胞中複製的重組腺病毒。
一般而言，本發明包括的重組載體提供了能避開對腺病毒血清型的先存免疫的疫苗載運體，所述先存免疫是在人類群體中一般遇到的。更具體地說，本發明的重組載體包含載體主幹序列，在此顯示了其缺少與人類腺病毒衍生載體的常見血清型交叉反應的中和B表位。
本發明進一步提供了包括腺病毒部分和質粒部分的類群特異性的穿梭載體，其中所述腺病毒部分一般地包含a)病毒左末端(ITR和包裝信號)、pIX基因的部分和病毒基因組右末端；和b)基因表達盒。採用了在指定為相同血清型亞群(即，A、B、C、D或E亞群)的腺病毒之間觀察到的核苷酸序列同一性設計類群特異性的穿梭載體，並可用於操作在此公開的核苷酸序列，和/或用於克隆屬於相同亞群的其他黑猩猩腺病毒，產生含有刪除了E1區域的黑猩猩腺病毒基因組的腺病毒前質粒(pre-plasmid)。
本發明的其他方面包括包含腺病毒疫苗載體和/或腺病毒前質粒載體的宿主細胞、生產所述載體的方法，包括將所述腺病毒疫苗載體導入表達腺病毒E1蛋白的宿主細胞中，並收穫產生的腺病毒疫苗載體。在特定的實施方式中，本發明提供了生產複製缺陷性黑猩猩腺病毒載體的方法，包括將所公開的腺病毒載體之一導入表達腺病毒E-1的人類細胞，並收穫產生的重組腺病毒。
本發明的另一個方面還提供了包含本發明的腺病毒載體的疫苗組合物。包含重組黑猩猩腺病毒載體的組合物可以單獨施用或與其他基於病毒或非基於病毒的DNA/蛋白疫苗組合施用。它們也可以作為更廣闊的治療方式的部分來施用。這些組合物可以以預防性或治療性的設置施用給哺乳動物宿主，優選人類宿主。如在此所示，單獨地或以組合形式施用所公開的疫苗組合物，例如激發強化方式或不同血清型Ad載體的多次注射，引起哺乳動物中能夠特異性識別由轉基因編碼的免疫原的免疫反應的誘導。
在此公開和要求權利的方法之一，包括向哺乳動物(是幼稚的(naive)或被激發以對目標抗原有免疫活性的)施用足夠量的重組黑猩猩腺病毒載體，所述載體含有它的野生型E1基因的至少一個功能刪除，帶有包含啟動子的序列，所述啟動子能指導編碼至少一個目標抗原的核苷酸序列的表達，其中施用所述重組抗體引發(或激發)抗原特異性免疫反應。
在一個實施方式中，本發明提供了設計以誘導針對傳染原(例如，病毒或細菌性病原體或哺乳動物寄生蟲)的免疫反應(預防性或治療性的)的方法。在第二實施方式中，本發明提供了設計以在哺乳動物中誘導免疫反應的方法，所述免疫反應將破壞對自體抗原，例如TAA的耐受性。本發明的這個方面考慮使用所公開的載體作為疫苗載運體用於製備和施用癌症疫苗。
根據以下對發明的詳細說明，本發明的其他實施方式和益處將顯而易見。
附圖的簡要說明附圖1是概括了用於構建ChAd6穿梭載體(pARS ChAd6-3)的克隆策略的示意圖。
附圖2是說明用於在E.coli菌株BJ5183中通過同源重組克隆ChAd6病毒基因組的克隆策略的示意圖。
附圖3是說明各種ChAd6穿梭質粒的元件的示意圖，包括pARSChAd6-3 GAG；pARS ChAd6-3 SEAP；pARS ChAd6-3 EGFP；和pARS ChAd6-3 NS MUT。
附圖4是說明用於克隆ChAd6ΔE1表達載體的同源重組方案的示意圖。
附圖5A-5K提供了ChAd3的基因組核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
附圖6A-6K提供了ChAd6的基因組核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
附圖7A-7K提供了CV32的基因組核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
附圖8A-8K提供了CV33的基因組核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
附圖9A-9J提供了CV23的基因組核苷酸序列(SEQ ID NO5)。
附圖10提供了ChAd20的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO6)。
附圖11提供了ChAd4的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO7)。
附圖12提供了ChAd5的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO8)。
附圖13提供了ChAd7的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO9)。
附圖14提供了ChAd9的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO10)。
附圖15提供了ChAd10的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO11)。
附圖16提供了ChAd11的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO12)。
附圖17提供了ChAd16的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO13)。
附圖18提供了ChAd17的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO14)。
附圖19提供了ChAd19的纖維基因的核苷酸序列(SEQ ID NO15)。
附圖20A-20G提供了以下的纖維蛋白的胺基酸序列ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82，與來自C1(SEQ ID NO85)、CV68(SEQ ID NO86)、PAN5(也稱為CV23)(SEQ ID NO80)、PAN6(也稱為CV32)(SEQ ID NO81)和Pan7(也稱為CV33)(SEQ ID NO82)的參考纖維蛋白序列的比較。
附圖21提供了ChAd20的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ IDNO16)。
附圖22提供了ChAd4的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ ID NO17)。
附圖23提供了ChAd5的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ ID NO18)。
附圖24提供了ChAd7的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ ID NO19)。
附圖25提供了ChAd9的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ ID NO20)。
附圖26提供了ChAd10的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ IDNO21)。
附圖27提供了ChAd11的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ IDNO22)。
附圖28提供了ChAd16的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ IDNO23)。
附圖29提供了ChAd17的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ IDNO24)。
附圖30提供了ChAd19的六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ IDNO25)。
附圖31A-31J提供了ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的六鄰體蛋白的胺基酸序列，與來自C1(SEQ ID NO124)、CV68(SEQ ID NO125)、PAN5(也稱為CV23)(SEQ ID NO119)、PAN6(也稱為CV32)(SEQ IDNO120)和Pan7(也稱為CV33)(SEQ ID NO121)的參考纖維蛋白序列的比較。
附圖32提供在此公開的人工序列SEQ ID NO26-40和SEQ IDNO45和46，包括寡聚物和引物的列表。
附圖33是屬於不同血清型亞群(即，C、E和D亞群)的ChAd載體的免疫斷點(break-point)的圖示。通過在用表達gag的ChAd3、ChAd11、ChAd20、CV33、CV68、ChAd6、ChAd9、ChAd10、CV32、ChAd4、ChAd7和ChAd16載體免疫的小鼠中進行滴定實驗，測定引發可測量免疫反應的最低劑量。
附圖34提供了在恆河猴中引發的CEA特異性T細胞反應的圖示，所述恆河猴次序地用人類腺病毒載體(MRKAd5 RhCEA)、12周間隔後用黑猩猩腺病毒載體(CV33 RhCEA)免疫。通過IFN-γELISPOT分析評估免疫反應，數據說明了在不存在(DMSO)和存在恆河猴CEA C和D肽庫的情況下孵化之後每百萬個外周血單核細胞(PBMC)中斑點形成細胞(SFC)的數目。
附圖35提供了用PAUPSEARCH(Wisconsin Package Version10.3，Accelrys Inc.)進行全長六鄰體肽序列的多重序列比對和用TREEVIEW進行可視化和操作得出的人類和黑猩猩腺病毒的系統樹。
附圖36是響應於向預先暴露於hAd5的小鼠施用ChAd3和hAd5gag載體獲得的免疫結果的圖示。免疫後3周通過IFN-γELISPOT使用純化的脾細胞評估細胞介導的免疫。
附圖37是在用ChAd3hCEA和Ad5hCEA免疫的人類CEA轉基因小鼠中引發的抗CEA CMI的動力學的圖示。通過用CEA肽庫刺激的PBMC的ICS評估CMI。結果表示為IFNγ+CD8+/總PBMC的％。
附圖38 A-D是暴露於moi 50、250和1250的不同ChAd載體的不同人類初級細胞的感染效率的圖示，所述ChAd載體表達EGFP並屬於不同的亞群(B、C、D、E)。結果表示為螢光細胞/總細胞的％。
發明的詳細說明如在整個說明書和附隨的權利要求書中使用的，採用以下定義和縮寫術語「盒」是指核酸分子，其包含至少一個要表達的核酸序列以及它的轉錄和翻譯控制序列。改變所述盒，將使摻入了所述盒的載體指導不同序列或序列的組合的表達。在本發明的範圍中，盒中存在的核酸序列通常編碼免疫原。由於工程化的限制性位點存在於5′和3′末端，所述盒可以容易地插入、除去或用另一個盒替換。
術語「順式作用元件」是指調節與它們連接的基因的核苷酸序列。存在於DNA中的順式作用元件調節轉錄，轉錄成mRNA的那些能夠調節RNA加工、轉換(turnover)和蛋白質合成。
術語「載體」是指一些工具，通過它們能將DNA片段導入到宿主有機體或宿主組織中。存在著各種型式的載體，包括質粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌體和粘粒。
術語「啟動子」是指在DNA鏈上、RNA聚合酶能與之結合的識別位點。啟動子與RNA聚合酶形成起始複合物來啟動和驅動轉錄活性。通過活化序列例如增強子，或抑制序列例如沉默子，可以修飾所述複合物。
術語「藥學有效量」是指重組腺病毒的數量，在特定施用途徑中有效轉導宿主細胞並提供足夠的轉基因表達水平以引發免疫反應。
術語「有複製能力的」重組腺病毒(AdV)是指具有完整的或功能上必需的早期基因(即，E1A、E1B、E2A、E2B和E4)的腺病毒。野生型腺病毒是有複製能力的。
術語「複製缺陷性」重組AdV是指一種腺病毒，由於已經被工程化以具有病毒複製所必需的基因產物的至少一種功能刪除或完全刪除，而變得不能複製。本發明的重組黑猩猩腺病毒載體是複製缺陷性的。
術語「哺乳動物」是指任何哺乳動物，包括人類。
術語「序列同一性百分比」或「同一性」在核酸序列的上下文中是指當進行最大相關性比對時兩個序列中的相同的殘基。序列同一性比較的長度可以是在基因組的全長上(例如，約36kbp)，基因的開放閱讀框的全長上，蛋白、亞基或酶上[參見，例如，提供腺病毒編碼區域的框]，或至少約500到5000個核苷酸的片段上，是期望的。然而，在例如，至少約九個核苷酸、通常至少約20到24個核苷酸、至少約28到32個核苷酸、至少約36個或更多核苷酸的較小片段之間的同一性也是期望的。類似地，可以對胺基酸序列，在蛋白的全長上或其片段，容易地確定「序列同一性百分比」。適當地，片段長度至少約8個胺基酸，並可以達到約700個胺基酸。在此描述了適合的片段的實例。
在默認設置下使用在此定義的這種算法和電腦程式，容易地確定同一性。優選的，這種同一性是在蛋白、酶、亞基的全長上，或在長度至少約8個胺基酸的片段上進行的。然而，同一性可以基於更短的區域，在所述區域上適合於放入同一的基因產物的用途。
一般地，腺病毒構建體、基因構建體通過參考其中含有的基因來命名。例如，「pChAd3 ΔE1gag」是指包含刪除了E1區域的ChAd3黑猩猩腺病毒基因組的質粒構建體。在這個質粒中，E1區域被免疫原表達盒替代，所述免疫原表達盒包含處在人類CMV啟動子控制下之後是牛生長激素多聚腺苷酸信號的HIV gag基因。類似地，pCV33DE1-E3 NSmut是指在此公開的第二種質粒構建體，其包含刪除了E1和E3區域的CV33黑猩猩腺病毒基因組，所述E1和E3區域被免疫原表達盒替代，所述免疫原表達盒包含處在人類CMV啟動子控制下之後是牛生長激素多聚腺苷酸信號的HCV非結構基因。
縮寫「Ag」是指抗原。
在整個說明書中和在附隨的權利要求中使用的，單數形式「a」、「an」和「the」包括複數的引用，除非上下文中明顯地另外指示了。
腺病毒(Ads)是已經在幾種禽類和哺乳動物宿主中鑑定的無包被的二十面體病毒。人類Ads(hAd)屬於Mastadenovirus屬，包括所有已知的人類和動物(例如，牛、豬、犬、鼠、馬、猿和綿羊)來源的許多Ads。根據許多生物學、化學、免疫學和結構標準，包括大鼠和恆河猴紅血球的血細胞凝集性質、DNA同源性、限制性內切酶裂解模式、G+C含量百分比和致癌性，將人類腺病毒分成六個亞群(A-F)(Straus，1984，In The Adenoviruses，ed.H.Ginsberg，pps.451-498，New YorkPlenus Press，and Horwitz，1990 In Virology，eds.B.N.Fields and D.M.Knipe，pps.1679-1721)。迄今為止，已經鑑定了51種不同的血清型，並根據它們的血細胞凝集性質和生物物理和生物化學標準分類成亞群。
腺病毒顆粒是二十面對稱性的，取決於血清型，直徑為60-90nm。二十面體衣殼由三種主要蛋白，六鄰體(II)、五鄰體基部(III)和隆突纖維(IV)以及許多微小蛋白(即，VI、VIII、IX、IIIa和IVa2)組成(W.C.Russel，J.Gen.Virol.，812573-2604(2000))。在人體中觀察到的先存免疫性的一個方面是體液免疫，其可以引起特異於病毒蛋白的抗體的產生和存留。由腺病毒引發的體液反應主要地針對主要結構蛋白質六鄰體、五鄰體和纖維。
公開的報導已經證實了，包含針對多種血清型的抗體的滴度是常見的(Dambrosio，E.(1982)J.Hyg.(London)89209-219)，先存滴度的重要部分具有中和活性。對腺病毒的中和免疫性是型特異性的(type-specific)，特定血清型的腺病毒的感染僅賦予對該血清型的免疫性。一些報導已經表明，針對六鄰體的抗體是最強烈的和最具中和性的(Toogood，C.I.A.，Crompton，J.and Hay R.T.(1992)J.Gen.Virol.73，1429-1435)。因此，合理的假定是，對型特異性中和作用負責的表位位於七個高變區內，所述高變區是通過對從不同血清型得出的六鄰體序列進行比對來鑑定的。(Crawford-Miksza，L and D.P.Schnurr.(1996)J.Virol.701836-1844)。
已經通過不同的方法，包括免疫血清從處理的動物到幼稚動物的被動轉移，證實了型特異性中和抗體的存在與用基於相同血清型的載體不能引發免疫反應之間的直接相關性。一般而言，對特定病毒血清型的先存體液免疫降低了載體施用的治療效力。此外，施用基於特定病毒血清型的載體引發了針對該載體的、阻止相同血清型的重複施用的免疫反應。
在特定的實施方式中，本發明提供了一種繞過所述不利影響的方法，所述不利影響與對hAd的常見血清型的先存免疫性的後果有關。更具體地，本發明考慮使用以不在人類中傳播的血清型為特徵的黑猩猩腺病毒載體。因此，本發明提供了缺少與常見人類血清型的表位發生交叉反應的中和B細胞表位的腺病毒(Chad)載體作為疫苗載運體。
雖然已經報導了腺病毒特異性細胞介導的免疫性(CMI)可能是交叉反應性的，基於多種血清型的重複注射的疫苗接種研究表現了比基於單個載體的免疫程序更高的效率。這些實驗進一步證明了疫苗目的的載體施用的主要局限是針對該載體的體液性先存免疫性。對使用人類腺病毒作為疫苗載運體有關的難題的可能解決方案包括，施用更高劑量的預測會遭遇先存免疫反應的腺病毒(例如，C亞群血清型)，和使用基於稀有人類血清型的載體。然而，使用更高劑量的疫苗增加了疫苗的成本和不希望的副作用的風險，臨床前測試的結果表明人類的另外的血清型比hAd5和hAd6有更低的免疫原性。
在避免針對載體的腺病毒主幹元件的宿主體液和細胞免疫反應的問題和最小化使用可能被有複製能力的腺病毒(RCA)汙染的人類腺病毒衍生載體成品的風險的嘗試中，已經表徵和開發了幾種非人類腺病毒作為疫苗載運體(Soudois，C.et al(2000)J.Virology，7410639-10649；Farina，S.F.et al(2001)J.Virology，7511603-11613；Cohen，C.J.et al(2002)J.Gen.Virology，83151-155.)。使用非人類腺病毒序列來繞過與先存免疫性有關的難題的前提基於這種觀察結果，即針對常見人類腺病毒血清型的中和抗體不太可能交叉中和非人類病毒。然而，病毒和細胞因素的不相容性給大多數可選擇的載體系統(牛、綿羊、犬)帶來了實際的局限性，其特徵在於必須在非人類細胞系中繁殖的缺點。
Wilson等已經公開了一報告，描述了基於黑猩猩腺病毒68型(CV68)C68的複製缺陷性載體的鑑定，所述腺病毒最初是從黑猩猩的腸繫膜淋巴結分離的(Basnight，M.，et.al.(1971)Am.J.Epidemiol.94166-171.)，CV68被完全測序並發現在整體結構上類似於人類腺病毒(Farina，S.F.et al，J.Virol.75(23)11603-11613(2001))。病毒的基因組長度是36,521鹼基對，已經描述為最類似人類腺病毒的E亞群，與大多數已經測序的人類Ad4開放閱讀框有90％的同一性。CV68 ITRs的長度是130鹼基對，存在所有主要的腺病毒早期和晚期基因。CV68的特徵在於不在人類中傳播(circulate)的血清型，其缺少與常見的人類血清型的表位交叉反應的中和B細胞表位。雖然黑猩猩腺病毒類似於人類腺病毒，但在人類中沒有記錄到針對黑猩猩血清型的交叉反應性中和免疫。(Farina，S.F.et al.J.Virol.(2001)75(23)11603-13)。
來源於CV68的重組載體被描述為足夠類似於人類血清型以支持表達柯薩奇病毒(coxsackievirus)和腺病毒受體的細胞的轉導(Cohen，C.et al.，J.Gen.Virol.83151-155(2002)。重要地，CV68的特徵是與人類腺病毒足夠的相似性水平以支持它在攜帶來自人類腺病毒5型的E1的293細胞中複製(Farina，S.F.et al.，J.Virol.75(23)11603-11613(2001)。此外，根據人類血清型5 E1的側翼序列與CV68衍生載體序列的側翼序列是非同源的這一觀察結果，預計不會發生同源重組。因而，預計CV68衍生的疫苗成品(vaccine stocks)被RCA汙染的可能性很低。
同一組研究者隨後報導了，使用CV68衍生的腺病毒序列作為疫苗載運體用於在小鼠中誘導針對狂犬病病毒糖蛋白的抗體。通過用迷你基因(minigene)盒替換E1A和E1B基因產生了複製缺陷型的CV68。用含有E1刪除、包含編碼狂犬病病毒糖蛋白的轉基因產物的腺病毒重組體(AdC68rab.gp)免疫的小鼠，發展出對狂犬病病毒的保護性免疫，並且對不然就是致死劑量的狂犬病病毒的攻擊保持了抗性(Xiang，Z et al.，J.Virol.76(5)2667-2675(2002)。近來已經報導了表達密碼子優化的、截短形式的HIV-1的gag的第二種CV68構建體在小鼠中誘導強有力的gag特異性CD8+T細胞反應。疫苗誘導反應顯示了能提供對牛痘gag重組病毒攻擊的保護(Fitzgerald，J.C.et al.，J.Immunol.1701416-1422(2003)。對用人類腺病毒血清型5預先免疫的小鼠使用CV68gag或Ad5gag載體進行實驗性疫苗接種展現出，與通過CV68疫苗引發的相比，通過Ad5引發的更顯著的gag特異性T細胞的降低和對病毒攻擊的保護。C68gag疫苗效力的降低是由於Ad5特異性CD8+T細胞的交叉反應性(同上)。
一同考慮這個數據表明，猿衍生的複製缺陷性腺病毒載體與基於常見的人類血清型的載體相比更適合用作人類疫苗載運體。如在此所示，用人類Ad5強烈免疫的小鼠(附圖36)可以用ChAd3-gag腺病毒載體進行免疫的實驗結果表明，先存的抗人類Ad5免疫性不會降低ChAd載體引發的gag特異性CMI反應。這些結果與人類Ad5交叉反應性B和T細胞表位不存在於ChAd3或ChAd6載體中的結論相一致。
一般而言，非常好地表徵了腺病毒基因組，儘管存在幾種不同的血清型，在類似地安置了特定功能的腺病毒基因組的整體結構上存在某些普遍的保守性。在美國專利No.6,083,716(黑猩猩腺病毒載體)和PCT公開的申請WO 03/000851(快速篩選細菌轉化體和新的猿腺病毒蛋白的方法)中提供了Wilson等公開的黑猩猩腺病毒C1和CV68的核苷酸序列，以及每個病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因的位置，通過引用將其中的教導合併在此。
腺病毒基因組的每個末端都包含稱為反向末端重複(ITR)的序列，其是病毒複製必需的。病毒還包含病毒編碼的蛋白酶，其是加工某些結構蛋白所需的，所述結構蛋白是產生傳染性病毒顆粒所需的。根據宿主細胞轉導後病毒基因的表達順序，描述了腺病毒基因組的結構。更具體地，根據轉錄是在DNA複製開始之前還是之後發生，將病毒基因稱為早期(E)或晚期(L)基因。在轉導的早期階段，腺病毒的E1、E2、E3和E4基因被表達以使宿主細胞作好病毒複製的準備。通過刪除病毒基因組的必需的早期區域1(E1)，病毒可以變為複製缺陷性的。Brody et al，1994 Ann N Y Acad Sci.，71690-101。在晚期階段期間，接通了晚期基因L1-L5的表達，它們編碼病毒粒子的結構元件。所有晚期基因都處在單個啟動子的控制之下，編碼的蛋白包括五鄰體(L2)、六鄰體(L3)、100 kDa支架蛋白(L4)和纖維蛋白(L5)，它們形成了新的病毒粒子，腺病毒DNA將被包裹在其中。取決於病毒的血清型，在單個宿主細胞中可以產生10,000-100,000個子代腺病毒粒子。最終，腺病毒複製過程引起細胞的裂解。
通過從公開的黑猩猩核酸序列中刪除特定的核苷酸序列並插入來自其他DNA序列、對轉基因的插入、表達和其他遺傳操作有用的序列，構建了在此公開的複製缺陷性腺病毒載體。因此，在此描述的重組黑猩猩腺病毒可以含有來源於一種或多種黑猩猩腺病毒的腺病毒序列，或來自黑猩猩腺病毒和來自人類腺病毒的序列。可以重組地、合成地產生適合的多核苷酸序列，或可以從天然來源分離。適用於本發明的特定方面的腺病毒序列包括缺少與常見的人類血清型交叉反應的中和B細胞表位的序列。
至少，本發明的重組黑猩猩腺病毒(例如，載體)含有複製和病毒顆粒封裝所需的黑猩猩腺病毒順式作用元件，與至少一個免疫原表達盒組合。一般地，順式作用元件側翼於包含編碼至少一個抗原的轉基因的表達盒。更具體地，本發明的載體含有必需的腺病毒的順式作用5′反向末端重複(ITR)序列(其起到複製起點的作用)、3′ITR序列、包裝/增強子結構域和編碼異源分子的核苷酸序列。無論所述重組載體是僅包含最小的腺病毒序列還是包含僅具有特定基因(例如，E1和/或E3或E4區域)的功能性刪除的完整腺病毒基因組，本發明的載體包含黑猩猩腺病毒衣殼。
一般而言，在此公開的腺病毒載體包含複製缺陷性腺病毒基因組，其中所述腺病毒基因組不具有功能性E1基因，並包含免疫原表達盒，其包含a)編碼至少一個免疫原的核酸，針對該免疫原的免疫反應是期望的；和b)與編碼所述免疫原的核酸序列可操作連接的異源(即，對於所述腺病毒序列而言)啟動子；和轉錄終止子。
更具體地，本發明提供了由重組腺病毒基因組組成的複製缺陷性載體，所述重組腺病毒基因組缺少選自由E1、E2、E3和E4構成的組的至少一個早期基因。在一個實施方式中，通過用免疫原表達盒替換、或破壞在此公開的腺病毒分離物(例如，ChAd3、ChAd6、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAdl9、ChAd20、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63或ChAd82)之一的E1基因來製備複製缺陷性載體。例如，可以通過刪除/破壞ChAd3(SEQ ID NO1)或ChA6(SEQ ID NO2)的E1基因來製備載體。做為選擇，複製缺陷性載體可以從在此公開的其他腺病毒分離物的任何一個來製備，包括ChAd3、ChAd6、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82或ChAd20。在其他實施方式中，本發明的複製缺陷性載體包含來源於已經被任選的工程化而缺少功能性E3基因的、在此公開的ChAds之一的腺病毒基因組。要理解的是，在此公開的黑猩猩腺病毒序列可以通過完全除去早期基因或通過使基因失效或無功能來變成複製缺陷性的。
要理解的是，本發明包括了特徵為具有修飾的載體，所述修飾例如破壞腺病毒表達一種或多種選定基因產物的能力的「功能性刪除」。如在此使用的術語「功能性刪除」寬泛地涵蓋具有使特定基因產物無功能的效果的修飾。一般而言，功能性刪除採取部分或全部刪除腺病毒基因的形式。然而，技術人員將容易認識到，其他操作，包括但不限於進行引入移碼突變的修飾也能實現功能性刪除。例如，本發明的重組黑猩猩腺病毒載體可以通過導入一種修飾來成為複製缺陷性的，所述修飾被設計以幹擾、或功能性刪除所述病毒表達腺病毒E1A和/或E1B的能力。
公知的是，可以通過導入一種修飾來獲得複製缺陷性腺病毒載體，所述修飾被設計以幹擾、或功能性刪除E2基因的組中一個或多個基因的表達。更詳細地，可以通過鈍化聚合酶基因、或前末期蛋白基因或DNA結合蛋白基因來構建複製缺陷性載體。此外，刪除或鈍化E4區域表達的基因是構建複製缺陷性黑猩猩Ad載體的可選擇的策略。可以組合早期基因的刪除或鈍化來產生更為減毒的載體。做為選擇，複製缺陷性ChAd載體也可以包含在其他病毒基因中的另外的修飾，例如晚期基因L1到L5。此外，可以通過組合獲自不同血清型的六鄰體和纖維基因來產生新的腺病毒疫苗載運體。六鄰體和纖維基因混移(shuffling)策略的使用也將容許研究者改變ChAd的生物學性質和促進具有不同的趨性或具有新的血清學特徵的載體的產生。
要理解的是本發明涵蓋重組腺病毒載體，其包含了完整基因或其部分的刪除，所述刪除單獨地或任意組合地有效破壞所修飾的基因的生物學活性。例如，儘管在此所示希望的是與E1基因的功能性刪除相組合向載體中導入異源Ad5 E4序列，還是可以構建重組猿腺病毒，其具有E4區域表達的基因的功能性刪除。做為選擇，可以消除腺病毒延遲早期E3基因的功能；然而由於E3的功能不是重組腺病毒粒子的產生所必需的，不必將該基因產物重新放回以產生能夠包裝在本發明中有用的病毒的重組體。
在本發明的一個實施方式中，使用的複製缺陷性腺病毒載體是含有E1以及任選的E3的刪除的黑猩猩C亞群腺病毒。例如，對於ChAd3，可以將適合的E1刪除/破壞導入從bp 460到bp 3542的區域(參考SEQ ID NO1)。對於ChAd6，可以將適合的E1刪除/破壞導入從bp 457到bp 3425的區域(參考SEQ ID NO2)。對於CV32，E1刪除優選的從bp 456到bp 3416(參考SEQ ID NO3)；對於CV33，E1刪除優選的從bp 456到bp 3425(參考SEQ ID NO4)和對於CV23，E1刪除優選的從bp 456到bp 3415(參考SEQ ID NO5)。對於CV32和CV33，E3刪除優選的分別為從bp 27446到bp 31911(參考SEQ ID NO3)；從bp 27146到bp 31609(參考SEQ ID NO4)。本領域技術人員可以根據序列同源性和多重序列比對容易地確定對於其他黑猩猩分離物的等同序列。
本領域技術人員將容易地認識到，為了構建刪除E1的腺病毒載體，必需考慮載體主幹的結構和包含轉基因的核酸序列的組成來進行許多決定。例如，研究者必需確定E1刪除的大小是否適應轉基因的大小。如果不適應，則必需向載體的主幹中導入另外的刪除。
包含轉基因的核酸序列可以是基因、或基因的功能部分，一般將以表達盒的形式存在。一般地，基因表達盒包括(a)編碼感興趣的蛋白或抗原的核酸；(b)與編碼所述蛋白的核酸可操作連接的異源啟動子；和(c)轉錄終止信號。所述核酸可以是DNA和/或RNA，可以是雙鏈或單鏈的。為了在期望的宿主(例如，哺乳動物宿主)中表達可以對核酸進行密碼子優化。
還必須考慮主幹內要導入轉基因的部位和轉基因的方向來作出決定。更具體地，可以按E1平行(5′到3′轉錄)或反平行(相對於載體主幹在3′到5′方向上轉錄)方向插入轉基因。此外，需要鑑定合適的轉錄調節元件並與所述轉基因可操作地連接，所述轉錄調節元件能夠指導轉基因在哺乳動物宿主細胞中的表達，載體是為所述哺乳動物宿主細胞準備用作疫苗載運體的。「可操作連接的」序列包括與被調節的核酸序列鄰接的表達控制序列，和反式作用的、或在一定距離上來控制所調節的核酸序列的調節序列。
調節序列包括合適的表達控制序列，例如轉錄起始、終止、增強子和啟動子序列；有效的RNA加工信號，例如剪接和多聚腺苷酸信號；增強翻譯效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列和任選的促進蛋白質分泌的序列。這些和其他常見的載體元件的選擇是常規的，許多適合的序列對於本領域技術人員而言是公知的。(參見，例如，Sambrook et al.和其中引用的參考文獻，例如，第3.18-3.26和第16.17-16.27頁，和Ausubel et al.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley Sons，New York，1989)。
在特定的實施方式中，所述啟動子是由真核RNA聚合酶識別的異源啟動子(即，對於腺病毒序列而言)。在優選的實施方式中，所述啟動子是「強」或「高效」啟動子。強啟動子的實例是即時早期人類巨細胞病毒啟動子(Chapman et al，1991 Nucl.Acids Res 193979-3986，通過引用將其合併)。可以使用沒有(CMV)或含有內含子A序列(CMV-intA)的人類CMV啟動子，儘管本領域技術人員公認的是可以使用許多其他已知的啟動子，例如強免疫球蛋白或其他真核基因啟動子，包括EF1α啟動子、鼠CMV啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、SV40早期/晚期啟動子和β-肌動蛋白啟動子。
可以用於本發明的啟動子的進一步實例是強免疫球蛋白啟動子、EF1α啟動子、鼠CMV啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子、SV40早期/晚期啟動子和β肌動蛋白啟動子，雖然本領域技術人員可以理解的是根據本發明的方法可以使用能實現預定宿主中的表達的任何啟動子。啟動子可以包含可調節序列，例如Tet操縱子序列。在試圖抑制基因轉錄的情況中，例如提供了調節轉錄和表達的可能性的序列是有用的。
適合的基因表達盒還包含轉錄終止序列。優選的轉錄終止子是牛生長激素終止子。CMVintA-BGH終止子的啟動子/轉錄終止組合是特別優選的，雖然也可以使用其他的啟動子/終止子組合。如在此所示，50個核苷酸長度的牛生長激素終止/多聚腺苷酸信號(bGHpA)或短的合成多聚A信號(SPA)定義如下AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTGTGTG(SEQ ID NO26)。一般而言，例示了適合的終止序列。多聚A信號被插入到包含轉基因的核酸序列之後和3′腺病毒ITR序列之前。
在此描述的重組腺病毒載體可以含有來源於一種或多種腺病毒株的腺病毒序列。適合的序列可以從天然的來源獲得，或重組地、合成地、或通過其他遺傳工程或化學方法產生。在特定的實施方式中，重組黑猩猩腺病毒是包含非黑猩猩腺病毒多核苷酸序列的嵌合重組體。適合的非黑猩猩腺病毒序列可以從人類腺病毒株獲得。例如，可以用hAd5 E4(Ad5 nt 32816到nt 35619)或Ad5E4orf6(Ad5 nt 33193到nt 34077)(Ad5 GenBank登記NoM73260)替換天然的E4區域。
一般而言，由本發明的重組腺病毒載體遞送的免疫原(抗原性分子)包括多肽、蛋白或酶產物，其由與一核苷酸序列組合的轉基因編碼，所述核苷酸序列提供了必需的調節序列來指導所述編碼的產物在宿主細胞中的轉錄和/或翻譯。轉基因的組成取決於載體的預定用途。例如，如果免疫原性組合物是被設計以在哺乳動物宿主中引發特異於傳染原的抗體反應或細胞介導免疫反應，則合適的是使用編碼至少一個免疫原性產物的核酸序列，所述免疫原性產物預計為接受者賦予病原體特異性免疫。做為選擇，如果所述組合物是製備用作癌症疫苗的，適合的轉基因可以包含自體抗原例如TAA的免疫原性部分，其是根據引發足夠效力的保護性免疫反應的目標來選擇的，來破壞對特定TAA的宿主耐受性，和引發足以預防癌症的起始或預防腫瘤發展的、長期的(例如，記憶性)反應。因此，適合的免疫原性基因產物可以從感染哺乳動物宿主的多種病原體(例如，但不限於，病毒、寄生蟲、細菌和真菌)獲得，或從癌症或腫瘤細胞獲得。雖然在此用特定集合的測試免疫原舉例說明了本發明，要理解的是本發明不限於使用在此例示的抗原。更具體地，本發明考慮使用異源的和自體的抗原作為免疫原，包括但不限於TAA。
在一個實施方式中，本發明提供了免疫原性組合物(例如，疫苗)，用於誘導針對由傳染原表達的抗原(即，免疫原)的免疫反應。例如，希望的是引發針對感染人類和/或非人類動物物種的病毒的免疫反應。病毒家族的實例包括小RNA病毒科(Picornaviridae)，其包括六個不同的屬，例如口蹄病毒(Aphtovirus)、心臟病毒(Cardiovirus)、腸道病毒(Enterovirus)、肝病毒(Hepatovirus)、Parechovirus、鼻病毒(Rhinovirus)，針對所述病毒家族的預防性和/或治療性免疫反應是希望的。小RNA病毒的實例是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseaseviruses)、腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis viruses)、脊髓灰質炎病毒(Polioviruses)、Coxackieviruses、人類肝炎A病毒、人類parechoviruses、鼻病毒，針對所述小RNA病毒的免疫反應是希望的。杯狀病毒科(Caliciviridae)包括與人類中由病毒的Norwalk群引起的流行性胃腸炎和在動物中的其他綜合症有關的不同的屬，所述其他綜合症如在兔中與兔出血病病毒有關的出血性疾病，或在貓中由貓杯狀病毒引起的呼吸道疾病。
另一個病毒家族是星狀病毒科(Astroviridae)，其包含從人類以及許多不同的動物物種分離的病毒，引發針對該病毒家族的免疫反應是希望的。人類星狀病毒與胃腸炎和幼兒的腹瀉有關。做為選擇，給哺乳動物宿主賦予對病毒的披膜病毒科(Togaviridae)的成員的免疫性是希望的，其包括兩個屬甲病毒屬(alphavirus)和rubivirus。甲病毒屬與人類和獸類疾病有關，例如關節炎(即切昆貢亞熱病毒(Chikungunya virus)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus))或腦炎(東方馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus)、西方馬腦炎病毒(Western Equine EncephalitisVirus))。
風疹病毒提供了可選擇的病毒目標，其是Rubivirus屬的唯一成員，是與發燒和淋巴腺病有關的輕度皮疹疾病暴發的原因。當母親在早期妊娠期間獲得時，風疹病毒感染還與胎兒異常有關。黃病毒科(Flaviviridae)是另一個病毒家族，由三個屬組成黃病毒屬、pestiviruses和肝病毒屬，包括重要的人類以及動物病原體。黃病毒屬成員中的許多是節肢動物傳播的人類病原體，引起各種疾病包括發燒、腦炎和出血熱。登革熱病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河熱病毒、蜱傳播的腦炎病毒是主要的全球性或地域性(地方性)的病原體。Pestivirus屬包括有主要是經濟上的重要性的動物病原體，例如牛病毒性腹瀉病毒、標準豬瘟病毒(Classical Swine FeverVirus)、邊界疾病病毒(Border Disease Virus)。肝炎C病毒是肝病毒屬的唯一成員，與急性和慢性肝炎有關。重組腺病毒表達的HCV蛋白可以引發保護性的和治療性的免疫反應，限制在世界範圍內影響17000萬人的病毒感染的後果。
做為選擇，來源於冠狀病毒科(Coronaviridae)的成員的抗原可以由重組腺病毒載體表達以獲得對感染的保護。通過用選自包括ChAd3、4、5、6、7、9、10、11、16、17、19、20、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的組的、表達一種或多種SARS-CoV蛋白的一種或多種黑猩猩腺病毒進行免疫，可以獲得對嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒(SARS-Co病毒)的保護，所述SARS-CoV蛋白無限制地包括核殼(N)蛋白、聚合酶(P)蛋白、膜(M)糖蛋白、刺突(S)糖蛋白、小包膜(E)蛋白或由該病毒表達的任何其他的多肽。包括狂犬病病毒的棒狀病毒科(Rhabdoviridae)成員可以是表達病毒蛋白的重組疫苗的目標。
其他可能的目標包括Filoviridae家族，包含Ebola樣病毒和Marburg樣病毒屬，與嚴重的出血熱暴發有關；副粘病毒科(Paramyxoviridae)包含在人類中已知的最流行的某些病毒，如麻疹、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒和獸醫感興趣的病毒如新城疫和牛瘟病毒；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)包括流感A、B、C病毒；布尼安病毒科(Bunyaviridae)主要由節肢動物傳染到脊椎動物宿主，包含重要的人類病原體，如裡夫特山谷熱(Rift valley fever)、SinNombre、Hantaan、Puumala病毒；沙粒病毒科(Arenaviridae)包含淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎、拉沙熱、阿根廷出血熱(ArgentineHemorragic fever)、玻利維亞出血熱(Bolivian Hemorragic fever)病毒；Bornaviridae科包含主要在馬和綿羊中引起中樞神經系統疾病的病毒；呼腸孤病毒科(Reoviridae)包括輪狀病毒，世界範圍內的嬰兒和幼兒中嚴重痢疾性疾病的最重要原因，可以感染人類和其他哺乳動物的環狀病毒(藍舌病、獸疫流行性出血病病毒)；逆轉錄病毒科(Retroviridae)，病毒的一個大組，包含重要的人類病原體如人類免疫缺陷性病毒1和2(HIV-1和HIV-2)和人類T細胞白血病毒1型和2型(HTLV1和2)，以及非人類慢病毒，例如感染綿羊和山羊的Maedi/Visna viruses，感染馬的馬傳染性貧血病毒，感染牛的牛免疫缺陷病毒，感染貓的貓免疫缺陷病毒；多瘤病毒科(Polyomaviridae)包括小的DNA致癌病毒，典型病毒是分別感染小鼠和恆河猴的多形瘤和SV40(從人類患者分離了與SV40近相關的BK和JC病毒)；乳頭狀瘤病毒科(Papillomaviridae)由一組DNA病毒組成，所述病毒感染高等脊椎動物包括人類，產生疣和溼疣。乳頭狀瘤病毒感染與人類和動物中的癌症發展有關。人類乳頭狀瘤病毒與子宮頸癌、陰道癌和皮膚癌有關。皰疹病毒科(herpesviridae)包括一些亞科，在其中分類了許多人類和其他哺乳動物的重要病原體。抗原的適合的來源可以是但不限於單純性皰疹病毒1和2，水痘-帶狀皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、細胞巨化病毒、人類皰疹病毒6A、6B和7、卡波西肉瘤相關皰疹病毒。抗原的進一步適合的來源是痘病毒科的成員，如猴痘病毒、Molluscum contagiusum病毒、天花病毒；肝炎B病毒，肝病毒科的典型成員，以及引起急性和/或慢性肝炎的其他病毒如肝炎delta病毒、肝炎E病毒。
本發明的腺病毒載體還適合於製備免疫原性組合物，所述免疫原性組合物被設計以在人類或動物中刺激針對非病毒病原體表達的蛋白的免疫反應，所述病原體包括細菌、真菌、寄生蟲病原體。例如在此公開的載體可以用於製備針對，但不限於Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、破傷風桿菌(Clostridium tetani)、Neisseria meningitis、Corynebacterium diphteriae、結核分枝桿菌(Mycobacteriatuberculosis)和麻風桿菌(leprae)，Listeria monocytogenes和Legionellapneumofila的疫苗。希望製備預防性或治療性疫苗的真菌和哺乳動物寄生蟲的實例包括白色念珠菌(Candida albicans)、煙曲菌(Aspergillus fumigatus)、Histoplasma capsulatum、Plasmodiummalariae、Leishmania major、Trypanosome cruzi和brucei、Schistosomahaematobium、mansoni和japonicum；Entamoeba histolytica，和已知與人類絲蟲病有關的Filaria的許多種類。
癌症一般涉及編碼多肽的基因的失調，所述多肽有助於維持細胞周期或控制細胞增殖(例如，生長因子、致癌基因、受體和腫瘤抑制物)。涉及癌症的許多基因的產物在各種各樣的腫瘤細胞表面表達。在人類和動物癌症中已經鑑定了可被T和B淋巴細胞識別的多種腫瘤抗原。適用於抗癌疫苗試驗的極大多數腫瘤相關抗原(TAA)被描述為「自體抗原」，因為除了在腫瘤細胞上表達之外，它們還在正常的組織上和/或在胎兒發育期間表達。目標人群對TAA的免疫耐受可以解釋為什麼許多癌症疫苗被證實是無效的。
腫瘤抗原可以通過正常細胞基因的致癌突變體來產生，改變的原癌基因或腫瘤抑制物基因例如，Ras、p53或Bcr-Abl蛋白是可以刺激T/B細胞反應的改變的細胞蛋白的實例。腫瘤抗原可以是在腫瘤細胞中過量表達的正常細胞蛋白(酪氨酸酶、GP100、MART通常在黑素細胞中以低水平表達，在黑素瘤中過量表達)，或在腫瘤細胞中異常表達的正常細胞蛋白(MAGE、BAGE、GAGE在黑素瘤和許多癌中表達，但是在睪丸和胎盤中正常表達)。腫瘤抗原可以是致癌病毒的產物由宮頸癌表達的乳頭狀瘤病毒E6和E7蛋白；由EBV+淋巴瘤和鼻咽癌產生的EBV EBNA-1蛋白；在SV40誘導的實驗腫瘤中的SV40 T抗原。癌胎抗原(oncofetal antigens)在癌細胞和正常發育的(胎兒)組織中高水平表達，但不在成年人組織中表達。癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)是良好表徵的癌胎抗原的實例。
新近的證據支持了能引發免疫反應的TAA的存在，因而使這類抗原成為疫苗療法的適合的免疫原。然而，作為一類抗原，TAA是非常不好的免疫原，在T細胞發育期間高度特異於TAA的T細胞不是被刪除了就是被無反應化了。因此，預期的是，攜帶腫瘤的宿主對特定TAA的免疫反應是極其微弱的。由於破壞對目標TAA的宿主耐受性的內在需要，實驗性的臨床疫苗研究特別集中於開發能增強TAA特異性T細胞反應的免疫策略。一般地而言，有效的癌症疫苗必須克服免疫耐受性並且增強宿主的免疫反應到預防性和/或保護性的水平。在許多實驗性疫苗研究中已經將抗腫瘤效果與對TAA的T細胞反應相關聯。
在可選擇的實施方式中，本發明考慮能用於誘導針對腫瘤抗原的免疫反應的免疫原性組合物(例如，癌症疫苗)。適合的組合物將含有包含編碼腫瘤抗原的核酸序列的重組黑猩猩腺病毒，和生理學上可接受的載運體。在特定的實施方式中，盒的編碼序列元件可以編碼單個免疫原，例如，來源於自體抗原的免疫原性肽序列，例如腫瘤相關抗原。在某些實施方式中，編碼免疫原的核酸序列(例如，轉基因)可以是為在特定哺乳動物物種中的表達優化了的密碼子。在其他實施方式中，編碼序列可以編碼超過一個免疫原，例如一種或多種密碼子優化的腫瘤抗原。例如，利用所公開的腺病毒載體的癌症疫苗可以編碼自體抗原的組合，自體抗原例如HER2/neu、CEA、Hepcam、PSA，PSMA、端粒酶、gap100、Melan-A/MART-1、Muc-1、NY-ESO-1、存活蛋白、溶基質蛋白酶3、酪氨酸酶、MAGE3、CML68、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NY-CO-58、NY-BR-62、hKLP2、VEGF。
有效的癌症疫苗的開發需要鑑定能在接種的患者中引發抗原特異性免疫的策略和產生在主動免疫結束後能夠留存的免疫反應。策略的成功將取決於針對目標抗原的可測量免疫反應是否與針對癌症的發生或復發的保護作用相關。已經顯示了細胞介導的免疫和體液免疫的效應機制都能殺死腫瘤細胞。然而，來自實驗系統的數據表明，抗原特異性T細胞是消除腫瘤細胞的最強大的免疫機制。效應T細胞對腫瘤特異性抗原(例如，TAAs)的識別預計可容許TAA象腫瘤排斥抗原一樣起作用。公開的研究表明，刺激CD8+和CD4+輔助T細胞反應對於達到最優的腫瘤清除是重要的((Greenberg，P.D.(1991)Adv.Immunol.49281-355；Pardoll，D.M.et al.(1998)Curr.Opin.Immunol.10588-94)。臨床反應(即，效力)已經與分泌幹擾素γ的細胞毒性T細胞的增加相關聯。分析方法的出現，例如在此使用的ELISPOT分析，以展現當前疫苗載運體的效力，容許研究者測量對免疫接種方式的T細胞反應，從而便於癌症疫苗的開發。
癌症疫苗可以是預防性或治療性的。癌症疫苗的預防性用途的一般假定是，在攜帶腫瘤的受試者中TAA是極其弱的免疫原或功能上無免疫原性的。更具體地，在癌症免疫學領域，在患有癌症的患者中疫苗可以用作免疫療法。因此，可以設計癌症疫苗來引發針對TAA的免疫反應，所述TAA由先存的腫瘤或惡性腫瘤表達。因而，在特定的實施方式中，治療性癌症疫苗意圖用於攜帶腫瘤的患者，其發展了對常規治療方式的抗性，或在常規治療後有發展出復發的高可能性。
腺病毒的高免疫原性使得腺病毒載體對用於疫苗載運體的情況是特別好的候選者，所述疫苗載運體被設計以破壞宿主對自體抗原的耐受性。在自體免疫疾病中首先描述的表位或決定簇傳播的現象，已經與MHC I類和MHC II類限制性反應相關聯，並與HER-2/neu蛋白特異性T細胞免疫的發展相關聯。表位傳播代表了對免疫原性蛋白的特定部分的免疫反應的產生，隨後是免疫天然傳播到存在於同一蛋白上的其他抗原決定簇。例如，Disis等在84％的患有過量表達HER-2/neu的惡性腫瘤的患者中觀察到表位傳播，所述患者被施用了疫苗，所述疫苗包含與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子混合的、來源於HER-2蛋白的可能的T輔助表位的肽(J.Clin.Oncol.(2002)20(11)2624-2632)。重要地，表位傳播與HER-2/neu蛋白結構域反應的產生有關，並提示了有效地繞過了免疫耐受性的免疫。
適用於在此公開的腺病毒載體和方法作為癌症疫苗的目標的TAA應當具有許多特徵。例如，目標TAA必須具有有利的表達分布型，意味著與正常組織相比，在腫瘤或惡性組織中它應當優先地表達或過量表達。此外，因為在腫瘤發生中起作用的TAA更有可能在癌症發展的不同階段期間保留，適合的目標TAA還應當在腫瘤發展和轉移的整個階段保持。適合的目標TAA還應當在腫瘤內同質地表達。第三，適合的目標TAA必需不經受絕對的免疫耐受性。更具體地，必須有某些證據，可以識別感興趣的TAA並對其進行應答的T細胞沒有從宿主的T細胞庫中完全地刪除(Berinstein，N.L.，J.Clin.Oncol．29(8)2197(2002)。
癌胚抗原(CEA)具有許多特徵，使它成為用作抗癌疫苗的目標抗原的吸引人的TAA。它是Ig超家族的成員，所述Ig超家族的特點在於有利的表達模式。它在超過50％的所有人類癌症中表達，並與腫瘤發生過程有關，這表明它的表達在整個癌症發展過程中可能是被選擇的和保守的。此外，已經證明對CEA的免疫耐受性不是絕對的。公開的研究確定了，人類T細胞可以識別表達CEA的癌細胞，成為對表達CEA的癌細胞有活性的，並裂解表達CEA的癌細胞(Berinstein，N.L.，J.Clin.Oncol.29(8)2197(2002)。例如，用表達CEA的重組牛痘病毒免疫患者，結合隨後的基於肽的體外刺激，產生了能裂解自體腫瘤的CD8+MHC限制性CTL(Tsang，K.Y.et al.J.Natl.Cancer Inst.，(1995)87982-990)。另外地，報導了手術後用重組CEA免疫結腸直腸癌患者誘導了針對CEA的弱的抗體和細胞反應(Samanci，A.，et al.(1998)Cancer Immunol.Immunother.47131-142.)。進一步的，向診斷患有結腸直腸癌的患者施用抗CEA抗獨特型抗體，產生了抗CEA抗體和獨特型特異性T細胞增殖(Foon，L，A.et al.(1995)J.Clin.Invest.，96334-342)。文獻還表明，可以用幾種不同的疫苗接種方法克服癌症患者中對CEA的耐受性(即，用重組CEA或重組正痘或禽痘-CEA病毒疫苗接種，施用抗獨特型抗體，用CEA激動劑表位脈衝樹突狀細胞)。
CEA是癌胎糖蛋白(oncofetal glycoprotein)，其在正常胎兒結腸中表達，在正常的結腸黏膜中以小得多的程度表達。它還在大多數腺癌，特別是結腸、胰腺、乳房、肺、直腸和胃的腺癌中過量表達。許多結腸直腸癌症和一些癌瘤產生在血清中可測量的高水平的CEA，這使之成為最廣泛使用的惡性腫瘤的血清學標記，特別是在患有結腸直腸癌的患者中。
提供了用於本發明的組合物和方法的適合的免疫原的第二種TAA是HER2/erb-2(也稱為neu)原癌基因的產物。象CEA一樣，HER2/neu具有有利的表達模式，並且不經受絕對耐受性。更具體地，在正常成年人各種組織，包括皮膚和乳房，和胃腸道、生殖道、和泌尿道的組織的上皮細胞中，檢測到低水平的HER2/neu轉錄產物表達和185 kD的多肽產物；在胚胎發育期間在相應的胎兒組織中檢測到更高水平的表達(Press et al.，Oncogene 5953-962(1990)。幾個系列的證據暗示了在人類乳房、肺、前列腺、卵巢、子宮內膜和結腸直腸腫瘤中HER-2的擴增與致瘤性轉化之間的聯繫(Disis and Cheever，Adv.CancerResearch 71343-371(1997)。一般而言，HER2/neu的過量表達與癌症患者的不良預後和較高的復發率有關(Slamon et al.，Science 244707-712(1989)。因而，特異於HER-2/neu蛋白的疫苗在許多不同人類惡性腫瘤的疾病復發預防方面具有廣泛的應用和實用性。
HER2/neu編碼具有內在的酪氨酸激酶活性並顯示了與表皮生長因子(EGF)受體的廣泛同源性的跨膜糖蛋白(Akiyama，T et al.，(1986)Science 2321644-1646)。使用HER2作為癌症免疫療法的靶點的最初的臨床研究之一，採用了HER-2特異性單克隆抗體Herceptin用於乳腺癌的治療(Goldenberg MM(1999)Clin.Ther.21309-318)。這引起了隨後的努力，其集中於使用HER-2作為免疫系統的T細胞支路(arm)的靶點來引發有效的抗瘤反應，包括使用包含HER-2結構域的重組融合蛋白來激活自體抗原遞呈細胞。公開的報導確定了，患有表達neu的乳腺和卵巢癌症的許多癌症患者產生了針對HER2/neu癌基因的蛋白產物的免疫反應(例如，產生抗原特異性抗體和T細胞)。
重組腺病毒序列、轉基因和其他載體元件裝配到各種中間質粒和穿梭載體中，使用所述質粒和載體來產生重組病毒粒子，都可以使用本領域技術人員公知的標準教科書中描述的常規技術來實現(Sambrook et al，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)。這種技術包括但不限於，常規的cDNA克隆技術、使用來源於腺病毒基因組的重疊寡核苷酸序列、同源重組、聚合酶鏈式反應、標準轉染技術、瓊脂覆層中的病毒斑塊，和其他相關的方法。
為了幫助在原核細胞中製備多核苷酸，常常製備腺病毒載體的質粒型式(腺病毒前質粒)。腺病毒前質粒含有腺病毒部分和質粒部分。腺病毒部分與本發明的腺病毒載體(含有無功能的或刪除的E1和任選的E3區域的腺病毒序列)中包含的腺病毒部分和側翼是方便的限制性位點的免疫原表達盒基本上相同。
腺病毒前質粒的質粒部分常常含有處在原核啟動子的轉錄控制下的抗生素抗性標記，從而抗生素的表達不會在真核細胞中出現。可以使用氨苄青黴素抗性基因、新黴素抗性基因和其他藥學上可接受的抗生素抗性標記。為了有助於在原核生物中通過發酵高水平產生多核苷酸，有益的是腺病毒前質粒含有原核複製起點並且是高拷貝數的。許多商業上可獲得的原核克隆載體提供了這些益處。希望的是除去非必需的DNA序列。同樣希望的是所述載體不能在真核細胞中複製。這將多核苷酸疫苗序列整合到接受者的基因組中的風險最小化。當希望將多核苷酸的表達限制到特定的組織類型時，可以使用組織特異性啟動子或增強子。
可以通過使用腺病毒主幹DNA和合適的穿梭載體(被設計以靶向特定的刪除並將期望的限制性位點摻入產生的質粒中)進行同源重組產生腺病毒前質粒(包含具有期望的刪除和插入的複製缺陷性腺病毒的基因組的質粒)。在這個過程中使用的穿梭載體可以使用本領域廣泛了解和理解的一般方法來產生，例如，考慮期望的刪除來對腺病毒末端進行PCR，將各個片段順序克隆到合適的克隆質粒中。然後可以消化腺病毒前質粒並通過磷酸鈣共同沉澱或其他合適的方法轉染入補足細胞系。然後發生病毒複製和擴增，一種由於顯著的細胞病變效果而變明顯的現象。然後在病毒複製完成之後收穫感染的細胞和培養基(一般地，轉染後7-10天)。
一般而言，在構建和裝配期望的腺病毒前質粒之後，通過轉染表達腺病毒E1的人類細胞系將腺病毒前質粒營救為病毒。在包裝細胞系和載體的病毒基因之間的補充性允許載體中的腺病毒-轉基因序列被複製並包裝到病毒顆粒衣殼中，引起重組腺病毒的生產。可以通過本領域技術人員已知的各種方法的任何一種，來分離和純化產生的病毒，用於本發明的方法。
對本領域技術人員顯而易見的是，當向病毒載體中導入一個或多個選定的黑猩猩腺病毒基因的刪除時，可以在生產過程期間通過在生產細胞系中存在的序列來提供被刪除的基因產物的功能。因而，可以通過永久轉化的細胞系來提供所操作的基因的功能，所述細胞系的特徵是某些或全部腺病毒功能，所述功能是包裝所需的但在載體中是無功能的(例如，E1A、E1B、E2A、E2B、E4的任何一個)。做為選擇，可以用包含必需基因的構建體來感染或短暫地轉染適合的細胞以提供所述功能，來將必需的腺病毒功能提供給適合的包裝細胞系。
因此，本發明還提供了在表達E1的人類細胞系中生產黑猩猩腺病毒載體的方法。更具體地，所公開的載體可以在E1補足細胞系中增殖，包括已知的細胞系293和PER.C6TM。這些細胞系都表達腺病毒E1基因產物。在1997年1月3日公開的WO 97/00326中描述了PER.C6TM，通過引用將其合併在此。它是用E1基因片段轉導的原代人類成視網膜細胞系，所述E1基因片段補足複製缺陷性第一代腺病毒的產生，但被設計以防止通過同源重組產生有複製能力的腺病毒。在Graham et al(1977)J.Gen.Virol 3659-72中描述了293細胞，也通過引用將其合併在此。本領域技術人員將認識到術語「第一代腺病毒」是指複製缺陷性腺病毒，其是E1區域無功能的或刪除了E1區域的，並任選的是E3區域無功能的或刪除了E3區域。
意圖用作臨床試驗中的疫苗組合物的複製缺陷性腺病毒載體的批次應當經證明是無RCA的(Fallaux，F.J.et al(1998)Human GeneTherapy，91909-1917)。實際上，這是勞動密集的過程，需要建立和使用昂貴的篩選程序。本領域技術人員將認識到，高頻率的RCA產生不僅引起生產的批次的高失敗率，還嚴重地限制了規模擴大的努力。消除載體的核苷酸序列和存在於輔助生產/包裝細胞系的基因組中的腺病毒序列之間的同源性，將消除生產的載體批次被同源重組產生的RCA汙染的可能性。
一般地，重組複製缺陷性腺病毒載體在提供E1基因產物in trans的細胞系中增殖。當載體來自相同的或非常相似的血清型時，提供必需的E1基因產物in trans是非常有效的。例如，公知的是刪除了E1(即，ΔE1)的C群血清型(Ad2和Ad5)載體，可以在含有並表達Ad5 E1區域的293或PER.C6細胞中增殖。然而，已經觀察到，存在於293和PER.C6生產細胞中的Ad5 E1序列可能不總是完全地補足非C群血清型的複製。因此，C亞群以外的刪除E1的血清型，例如，來自A、B、D、E和F亞群的那些，在293或PER.C6細胞中可能以比相應wt病毒更低的效率複製，或可能根本不複製。這可能是由於Ad5(C亞群)E1 B 55K基因產物不能夠建立與非C群血清型的E4 orf6基因產物的功能性相互作用。
在表達Ad5 E1的細胞中複製效率的降低根據不同亞群的載體而變化。雖然來自D和E亞群腺病毒的ΔE1載體可以以可變的效率在293和Per.C6TM細胞中被營救(rescue)和增殖，B亞群ΔE1載體的增殖被完全地削弱了(Vogels R，et al.(2003)Aug.Replication-deficienthuman adenovirus type 35 vectors for gene transfer and vaccinationefficient human cell infection and bypass of preexisting adenovirusimmunity.J Virol.77(15)8263-71).
儘管Ad5 E1b 55k和載體表達的E4 orf6蛋白之間的相互作用在相同亞群的成員內是保守的，當表達非C血清型的E4 orr6蛋白時它可能不是足夠穩定的。E1B-55K/E4-orf6複合物的這種低效或不穩定形成引起了ΔE1載體的降低的增殖的缺乏。因此，已經經驗性確定的是，為了成功地和有效地營救B群血清型的重組腺病毒，需要產生表達感興趣血清型的E1區域的細胞系。在表達Ad5E1的細胞如293或Per.C6TM中，表達可以限於E1b 55K蛋白。做為選擇，可以修飾適合的Ad5E1表達細胞系以便除了Ad5E1之外還表達完整的Ad5 E4區域(或僅E4 orf6)。表達Ad5 E1和orf6的細胞系的產生，在補足可選擇的腺病毒血清型方面是有用的；參見，例如，Abrahamsen et al.，1997 J.Virol.8946-8951。E4(orf6)摻入到Ad5補足細胞系是已知的，產生in trans提供血清型特異性E1基因產物的血清型特異性細胞系也是已知的。做為選擇，非C群載體增殖的效率可以通過用Ad5 orf6取代天然的E4區域修飾病毒主幹來改善。用來自Ad5或其他C亞群病毒(Ad1、Ad2、Ad6)的orf6僅替換天然的orf6也可以得到類似的結果。美國專利No.5,849,561公開了在還表達Ad5-E4基因的部分的Ad5-E1補足細胞系中補足刪除E1的非C群腺病毒載體。
授權給Vigne等的美國專利No.6,127,175公開了穩定轉染的哺乳動物細胞系，其表達腺病毒的E4區域的一部分，優選的是orf6/orf6/7。這種細胞系對於補足E4區域中的重組Ad基因組缺陷是有用的。
包含所公開的腺病毒載體的組合物，包括疫苗組合物，是本發明的重要的方面。這些組合物可以以預防性或治療性的設置施用給哺乳動物宿主，優選的人類宿主。可能的宿主/接種者包括但不限於靈長類和特別是人類和非人靈長類，並包括有商業或馴養的獸醫學重要性的任何非人哺乳動物。包含重組黑猩猩腺病毒載體的組合物可以單獨施用或與其他基於病毒或非基於病毒的DNA/蛋白疫苗組合施用。它們也可以作為更廣闊的治療方式的部分來施用。
在本發明的特定實施方式中，所公開的載體可以用於被設計以破壞宿主對自體抗原或腫瘤相關抗原的耐受性的免疫方案。許多TAA的鑑定已經允許了開發用於癌症治療的主動疫苗接種方法。被加工和呈遞的細胞表面抗原和細胞內抗原都提供了有用的靶點。一般而言，所公開的破壞宿主對自體抗原的耐受性的方法包括(a)通過施用包含第一ChAd載體或質粒載體的第一疫苗組合物來刺激對自體抗原的抗原特異性反應，所述第一ChAd載體或質粒載體攜帶編碼自體抗原的核苷酸序列，針對所述自體抗原的抗原特異性免疫反應是期望的，和(b)通過施用包含不同的血清型的重組ChAd載體的第二疫苗組合物來維持和擴展(a)的免疫反應，所述重組ChAd載體含有其基因組E1基因的至少一個功能性刪除，並且在E1基因的位置上含有包含啟動子的序列，所述啟動子能指導編碼在激發步驟中釋放的相同自體抗原的DNA的表達，從而宿主產生具有破壞對自體抗原的耐受性的效果的免疫反應。
因此，技術人員可以使用這種公開內容來設計可能適用於破壞宿主耐受性的幾種不同的免疫方案。例如，可能的是使用一種方案，其中第一或激發免疫包含質粒DNA，所述質粒DNA編碼特定的自體抗原，例如TAA，任何隨後的免疫包含ChAd載體。包含編碼自體抗原的核苷酸序列的質粒DNA序列可以在一次或多次注射中，有或者沒有電刺激地、肌肉內地遞送。例如，基於通過電穿孔多次(例如，3或4或5次)肌肉注射編碼TAA的質粒DNA，隨後一次或多次肌肉注射包含編碼相同TAA的轉基因的ChAd載體的免疫方案，被在此公開和要求權利的一般方法包括。
做為選擇，破壞耐受性的適合的方案可以包括用包含編碼自體抗原的轉基因的ChAd或hAd載體進行一次或多次激發免疫，隨後用相同的ChAd載體或已知與用於激發免疫的載體不是交叉反應性的、不同的ChAd載體進行一次或多次強化免疫。例如，使用ChAd3激發和用ChAd6進行強化，或用ChAd3激發隨後用ChAd6和ChAd9進行強化的免疫方案可以用於破壞宿主耐受性。在特定的實施方式中，本發明考慮使用包含選自以下構成的組的至少一個腫瘤相關抗原的自體抗原HER2/neu、CEA、EpCAM、PSA、PSMA、端粒酶、gap100、Melan-A/MART-l、Muc-1、NY-ESO-1、存活蛋白、溶基質蛋白酶3、酪氨酸酶、MAGE3、CML68、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NY-CO-58、NY-BR-62、hKLP2、VEGF。在特定的實施方式中，本發明提供了通過向患有癌症的哺乳動物遞送編碼TAA的重組黑猩猩腺病毒、誘導針對特異於選定惡性腫瘤的腫瘤相關抗原的免疫反應(例如，體液或細胞介導的)的方法。在本發明的這個方面的優選實施方式中，引發的免疫反應構成了以抗原特異性CD4+和CD8+T細胞的產生為特徵的免疫反應。
本發明的免疫原性組合物可以以預防性或治療性的設置(setting)施用給哺乳動物宿主，優選的人類宿主。可能的宿主/接種者包括但不限於靈長類和特別是人類和非人靈長類，並包括有商業或馴養的獸醫學重要性的任何非人哺乳動物。包含重組黑猩猩腺病毒載體的組合物可以單獨施用或與其他基於病毒或非基於病毒的DNA/蛋白疫苗組合施用。它們也可以作為更廣闊的治療方式的部分來施用。用於本發明的方法的適合的組合物可以包含本發明的重組病毒載體，結合生理學上可接受的成分，例如緩衝液、生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水、蔗糖、其他鹽和聚山梨酸酯。在肌肉注射時它不引起組織刺激。優選的是冷凍待用的。任選的，本發明的疫苗組合物可以配製為含有其他成分，例如但不限於，佐劑、穩定劑、pH值調節試劑，或防腐劑。這些成分是本領域技術人員公知的。
預想的是，本發明的重組黑猩猩腺病毒以「有效量」施用給人類或獸醫學上的宿主，所述「有效量」是重組病毒的數量，其是有效的以在選定的施用途徑下轉導宿主細胞並提供轉基因的足夠表達水平來引發給接受者/疫苗接種者(vaccine)賦予治療效益或保護性免疫的免疫反應。
導入疫苗接受者的疫苗組合物中病毒粒子的數量取決於使用的轉錄和翻譯啟動子的強度和表達的基因產物的免疫原性。一般地，免疫或預防有效劑量的1×107到1×1012個粒子(即，1×107、2×107、3×107、5×107、1×108、2×108、3×108、5×108或1×109、2×109、3×109、5×109)，和優選的約1×1010到1×1011個粒子直接施用到肌肉組織中。皮下注射、皮內導入、壓過皮膚，和其他施用模式，例如腹膜內的、靜脈內的或吸入遞送也是考慮的。
本發明的重組黑猩猩腺病毒載體可以單獨地、作為混合形式的激發/強化疫苗接種方式的部分、或在基於不同載體血清型的多次注射的組合的接種方式中來施用。一般地，將包含至少一個免疫原的激發劑量施用給哺乳動物宿主，所述哺乳動物宿主需要針對特定病原體或自體抗原的有效免疫反應。這種劑量有效地激發免疫反應，從而在隨後的抗原鑑定中，宿主能夠立即產生針對該免疫原的增強的或強化的免疫反應。利用用於激發和強化的可選擇製劑的混合形式疫苗接種方案可以引起增強的免疫反應。激發-強化施用一般包括激發(通過病毒載體、質粒、蛋白，等)受試者至少一次，容許經過預定長度的時間，然後強化(通過病毒載體、質粒、蛋白，等)。通常採用多次免疫，一般1-4次，儘管可以使用更多次數。激發和強化之間的時長一般可從約四個月到一年，雖然本領域技術人員理解的是可以使用其他的時間範圍。在中和免疫性變得明顯之前，每種載體的多次注射可以在約2周的時間範圍(time frame)內施用。
在本發明的某些實施方式中，給予疫苗超過一次的腺病毒疫苗載體施用，可以以伴有質粒疫苗的施用的方式來給予。與在此公開的載體組合使用的適合的質粒疫苗包括編碼至少一個免疫原的質粒，針對所述免疫原的激發的或強化的免疫反應是期望的，和異源啟動子，其能夠指導編碼免疫原的核酸序列的表達，可操作地與免疫原編碼序列連接，和轉錄終止序列。
例如，可以使用一種劑量給藥方式，其利用不同血清型的重組複製缺陷性黑猩猩腺病毒載體的多次注射。做為選擇，可以給予個體第一劑量(即，激發劑量)的質粒疫苗，和第二劑量(即，強化劑量)，其包含複製缺陷性重組黑猩猩腺病毒載體，所述載體包含在質粒疫苗中遞送的相同免疫原的編碼序列。做為選擇，可以給予個體第一劑量編碼至少一個免疫原的人類腺病毒疫苗載體，隨後是第二劑量，其包含在此公開的複製缺陷性重組黑猩猩腺病毒載體，所述載體包含與在激發劑量中遞送的相同的免疫原的編碼序列。在第二個可選擇的實施方式中，可以首先施用包含本發明的載體的疫苗組合物，隨後施用質粒疫苗。在這些實施方式的任何一個中，可以以病毒載體或質粒形式給予個體多劑量的相同免疫原。可以有預定的最小時間量，來分隔施用。
除了通過本發明的重組複製缺陷性黑猩猩腺病毒載體遞送感興趣的單個蛋白或抗原之外，可以通過獨立的運載體(vehicle)或通過相同的運載體來遞送兩種或多種蛋白或抗原。可以將多個基因/功能等同物連接到適當的穿梭質粒，來產生包含多個開放閱讀框的腺病毒前質粒。多個基因/功能等同物的開放閱讀框可以可操作地連接到不相同的啟動子和轉錄終止序列。
如在此所示，適合的免疫方式可以採用不同的腺病毒血清型。這種方案的一個實例是包含第一血清型，例如ChAd3或ChAd6的重組腺病毒載體的激發劑量，隨後是包含第二血清型的重組黑猩猩腺病毒載體的強化劑量。在可選擇的實施方式中，激發劑量可以包含獨立的腺病毒運載體的混合物，每種腺病毒運載體包含編碼不同蛋白/抗原的基因。在這種情況下，強化劑量也可以包含載體的混合物，每種載體包含編碼獨立的蛋白/抗原的基因，條件是強化劑量施用重組病毒載體，所述重組病毒載體包含編碼與激發劑量中所遞送的相同或相似組的抗原的遺傳物質。可以進一步組合這些多基因/載體的施用形式。進一步處在本發明的範圍內的在於，組合的用藥方式，其包括來自特定抗原的多個但各不相同的成分。
使用不被針對人類載體的病毒元件的先存免疫性中和的、來源於黑猩猩腺病毒的重組載體，提供了對於使用人類Ad載體作為疫苗載運體的替代性選擇。由於腺病毒是高度免疫原性的，腺病毒載體對用於疫苗載運體的情況是特別好的候選者，所述疫苗載運體被設計以破壞宿主對自體抗原的耐受性。此外，以能夠與人類病毒相比較的效率、在人類細胞中，特別是在Per.C6TM細胞系中增殖黑猩猩病毒的能力，從調節的角度和從治療劑或疫苗的大規模產生的角度都提供了相當大的益處。因此，本發明提供了一組黑猩猩腺病毒序列、載體和質粒，容許製備重組病毒，所述重組病毒可單獨地或組合地用作遺傳疫苗接種的疫苗載運體。
為了描述和公開可能與本發明相聯繫使用的方法和材料，在此提及的所有出版物通過引用合併。在此的任何內容都不能解釋為承認本發明沒有資格根據在先的發明在日期上早於這種公開。
參考附圖描述了本發明的優選的實施方式，要理解的是本發明不限於這些明確的實施方式，由本領域的技術人員可以實行各種改變和修改而不背離如附隨的權利要求中所定義的本發明的範圍和精神。
以下實施例說明、但不限制本發明。
實施例1ChAds黑猩猩腺病毒分離物的分離、克隆、測序和表徵在NIRC(New Iberia Research Center 4401 W.Admiral DoyleDrive New Iberia，LA′70560)，在病毒轉運培養基(VTM；MicrotestM4-R Multi Microbe Transport Medium，Remel Inc.)中收集大便樣本，然後冷凍，或直接在-70℃冷凍。樣本保持冷凍在＜-70℃，直到對它們進行處理用於接種到細胞培養物中。在那時，將樣本解凍，然後在過量的冷卻的病毒轉運培養基中渦旋。在樣本分離成懸浮液之後，在1500-1800rpm將它們離心10分鐘。將上清液連續過濾通過0.8和0.2μm針筒過濾器，然後將過濾了的材料接種到細胞培養物中(200-250μL進入殼瓶(shell vial)，200-300μL進入試管培養物)。將每種處理過的樣本接種到播種了293細胞或A549細胞的試管培養物和殼瓶培養物中。
每次接種一組樣品時製備對照(陽性和陰性)培養物。一旦已經接種了set-up中的所有殼瓶，將它們在室溫下以2000rpm(900×g)離心60±10分鐘。在轉子停止旋轉後立即從離心機取下小瓶以防止培養物中的熱破壞。離心之後，從殼瓶中吸出接種物，在每個小瓶中使用新鮮的無菌Pasteur吸管以防止交叉汙染。每次用1.0mL新鮮培養基洗滌培養物三次。洗滌三次之後將新鮮培養基(1.0mL)移液到每個小瓶中，將殼瓶置於孵化器中35-37℃三到四天(約96hr)。
在培養期結束時，從培養物吸出上清液，用免疫螢光分析(IFA)緩衝液每次使用約1.0mL緩衝液洗滌每個小瓶中的細胞層兩次。通過向每個小瓶添加1.0mL冷卻的丙酮(2-8℃ 10分鐘)來固定細胞。用與殼瓶蓋片相關的樣本標識數字標記清除了丙酮的載玻片。使用初級小鼠抗腺病毒抗體[MAB8052，Chemicon]處理殼瓶蓋片進行腺病毒感染的細胞的螢光標記。藉助於螢光顯微鏡評估載玻片。使用10×物鏡掃描每個製備物，記錄免疫螢光覆蓋加樣孔的程度(1+到4+)。使用40×物鏡證實特異性免疫螢光的存在或不存在。如對殼瓶所描述的按相同的順序對試管培養物進行接種(例如，首先是陰性對照、隨後是臨床樣本和陽性對照)。容許接種物在36-38℃吸附60-120分鐘。在吸附期之後，從試管中吸出樣本/對照，用新鮮培養基替代。
接種後三到四天，和此後的一周一次，從培養試管中吸出培養基，用1.5mL新鮮培養基替換。接種後的至少21天內至少每隔一天視覺上監視培養試管的CPE。用黑猩猩樣本接種的培養物與對照進行比較，並通過觀察CPE程度評級。14天後沒有顯示CPE的培養物轉移到新鮮的試管培養物；21天後CPE陰性的培養試管考慮為陰性的。具有3-4+CPE的培養試管進行渦旋10秒。使用無菌的1.0mL血清學吸管從試管的壁上刮下細胞，懸浮在培養物上清液中。之後用樣本標識數字和日期標記5mL扣帽試管(snap cap tube)，保存在-70℃。將500μL細胞懸液從培養試管轉移到扣帽試管中，在2-8℃保存至多一天，直到使用間接免疫螢光抗體技術進行處理來檢測腺病毒(相當於染色殼瓶的步驟)。
黑猩猩腺病毒擴增野生型黑猩猩腺病毒CV32、CV33、CV23和CV68購自ATCC(ATCC登記號CV32，VR-592；CV-33，VR-593；)，或購自EsoterixInc.Austin，Texas，原始分離物如下通過使用表達E1的人類細胞系PER.C6TM或293來增殖。簡要地，將細胞培養在Dulbecco′s ModifiedEagles培養基(DMEM；GibcoBRL，Life Technologies)中，其補充有10％胎牛血清(FBS GibcoBRL，life Technologies)、1％青黴素-鏈黴素、2mM穀氨醯胺和10mM MgCl2(Per.C6TM)。在補充有5％馬血清(GibcoBRL，Life Technologies)的DMEM中進行腺病毒感染。當100％的細胞展現出病毒誘導的細胞病變效應(CPE)時，收集感染的細胞和培養基，通過三個循環的冷凍和解凍來裂解。
在擴增的第一次傳代之後，通過感染播種在96孔平板中的293細胞來克隆所有野生型黑猩猩腺病毒(CV)成品(stocks)。通過對在病毒擴增的第一次傳代獲得的細胞溶胞產物進行限制稀釋，來進行病毒克隆。挑取五個分離的克隆並順序地增殖。在擴增的3-4次連續傳代之後，在種植在5個雙層細胞工廠(NUNC)(200百萬細胞/細胞工廠)的細胞上進行大規模的腺病毒製備。通過在氯化銫密度梯度上的兩個超離心步驟從細胞溶胞產物獲得純化的病毒粒子。
病毒基因組DNA的測序通過在1％SDS-TEN中用蛋白酶K(0.5mg/ml)消化(55℃ 2小時)，從3×1012pp的純化的病毒製品分離基因組DNA。在苯酚-氯仿萃取和乙醇沉澱之後，將基因組DNA重懸浮在水中，提供用於基因組測序。
為了全長Ad基因組測序，將純化的病毒DNA霧化以產生隨機剪切的片段。用E.coli DNA聚合酶和多核苷酸激酶的克列諾片段(klenow fragment)將DNA片段平端化。平端片段在低熔點瓊脂糖凝膠上跑動以純化大小範圍在1-3kb的片段，並克隆到pUCl9載體的SmaI位點以產生獵槍文庫(shotgun library)。連接物用於轉化感受態XL1-Blue MRF。通過在含X-gal和IPTG的LB瓊脂上的白色/藍色篩選鑑定陽性菌落。從文庫中分離出質粒DNA的三到四個96孔板(block)，用pUC正向和反向引物測序。使用Phred-Phrap軟體包篩選所有測序讀數的質量和載體序列。將通過了篩選的讀數裝配成鄰接物(contigs)。設計引物來直接測序腺病毒DNA用於封閉缺口，並確定兩個末端的DNA序列。
對選定的病毒獲得了完整的病毒基因組序列，包括ChAd3(SEQID NO1)、ChAd6(SEQ ID NO2)、CV32(SEQ ID NO3)、CV33(SEQ ID NO4)和CV23(SEQ ID NO5)。表1提供了數據，總結了ChAd3、ChAd6、Pan5(CV23)、Pan6(CV32)、Pan7(CV33)、C1和C68腺病毒基因組的核苷酸序列之間的同一性百分比。使用作為FASTA程序包版本2的部分的ALIGN程序計算比對(William R.Penson，University of Virginia；Myers Miller，CABIOS 1989，411-17)。
表1.黑猩猩腺病毒基因組之間的核苷酸序列同一性百分比ChAd3ChAd6Pan5Pan6Pan7C1 C68ChAd3100 68.1 68.568.268.364.2 68.0ChAd6 100 95.594.595.573.6 91.4Pan5 100 94.996.773.9 92.7Pan6 100 95.173.6 91.3Pan7 100 73.8 93.0C1 100 74.3C68 100為了表徵新的腺病毒分離物(例如，ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82)，也通過引物步進(primerwalking)確定了六鄰體和纖維基因的核苷酸序列。纖維基因SEQ IDNO6-15(SEQ ID NO6，ChAd20)；(SEQ ID NO7，ChAd4)；SEQ ID NO8，ChAd5)；SEQ ID NO9，ChAd7)；SEQ ID NO10，ChAd9)；SEQ ID NO11，ChAd10)；SEQ ID NO12，ChAd11)；SEQ ID NO13，ChAd16)SEQ ID NO14，ChAd17)，SEQ ID NO15，ChAd19)和(SEQ ID NO58，ChAd8)，(SEQ ID NO60，ChAd22)，(SEQ ID NO62，ChAd24)，(SEQ ID NO64，ChAd26)，(SEQ ID NO66，ChAd30)，(SEQ IDNO68，ChAd31)，(SEQ IDNO70，ChAd37)，(SEQ ID NO72，ChAd38)，(SEQ ID NO74，ChAd44)，(SEQ ID NO76，ChAd63)和(SEQ ID NO78，ChAd82)。
附圖20A-20G提供了在此公開和要求權利的ChAd分離物的纖維蛋白的胺基酸序列的比較。
在以下列出了六鄰體基因序列SEQ ID NOS16-25(SEQ IDNO16，ChAd20)；SEQ ID NO17，ChAd4)；SEQ ID NO18，ChAd5)；SEQ ID NO19，ChAd7)；SEQ ID NO20，ChAd9)；SEQID NO21，ChAd10)；SEQ ID NO22，ChAd11)；SEQ ID NO23，ChAd16)；SEQ ID NO24，ChAd17)SEQ ID NO25，ChAd19)，(SEQ ID NO97，ChAd8)，(SEQ ID NO99，ChAd22)，(SEQ IDNO101，ChAd24)，(SEQ ID NO103，ChAd26)，(SEQ ID NO105，ChAd30)，(SEQ ID NO107，ChAd31)，(SEQ ID NO109，ChAd37)，(SEQ ID NO111，ChAd38)，(SEQ ID NO113，ChAd44)，(SEQ ID NO115，ChAd63)和(SEQ ID NO117，ChAd82)。附圖31A-31J提供了在此公開和要求權利的ChAd分離物的六鄰體蛋白的胺基酸序列的比較。
黑猩猩腺病毒分類根據已經建議的人類腺病毒血清型(分為六個亞群)的分類(Horowitz，MS(1990)Adenoviridae and their replication.In VirologyB.N.Fields and D.M.Knipe，eds(Raven Press，New York)pp.1679-1740)將不同的黑猩猩腺病毒株分類，通過使用Align X程序(Informax，Inc)進行胺基酸和核苷酸序列比對來得出。
通過查看不同限制性內切酶的病毒基因組限制性圖譜和通過分析六鄰體基因的高變區7(HVR7)的序列，得到新的分離物的初步分類。為此，對側翼於HVR7的高度保守區域設計兩個引物，TGTCCTACCAR CTCTTGCTTGA (SEQ ID NO.45)和GTGGAARGGCACGTAGCG(SEQ ID NO.46)。使用純化的病毒DNA或粗的293溶胞產物作為模板通過PCR擴增HVR7，然後測序。根據HVR7序列分析，我們將新分離的病毒分類入對人類腺病毒所提出的亞群(A-F)(Horowitz，MS(1990)Adenoviridae and theirreplication.In Virology B.N.Fields and D.M.Knipe，eds(ravenPress，New York)pp.1679-1740)。
通過比對人類和黑猩猩腺病毒六鄰體胺基酸序列獲得附圖35中呈現的系統樹。該結果與根據使用Align X程序(Informax，Inc)限於六鄰體HVR7的核苷酸序列比對的初步分類相一致。由採用PAUPSEARCH(Wisconsin Package Version 10.3，Accelrys Inc.)進行的全長六鄰體肽序列的多重序列比對得出該樹，並用TREEVIEW進行可視化和操作。使用Wisconsin程序包中安裝的PAUPSEARCH程序進行Bootstrap置信度分析。對於每個比對，使用「HeuristicSearch」作為檢索條件和Maximum Parsimony作為最優條件將程序運行1000次重複，報告的置信度值取自50％majority-rule consensus。
實施例2ChAd穿梭載體和表達載體的構建以及營救載體的構建和營救使用適合的穿梭載體通過同源重組將基因組病毒DNA克隆到標準質粒載體中，所述穿梭載體含有來源於病毒基因組的左末端和右末端的病毒DNA序列(附圖2)。如以下更完整地描述的，採用在分類為相同血清型亞群的病毒之間觀察到的序列同源性來開發類群特異性穿梭載體。分類為D和E亞群的黑猩猩腺病毒的基因組病毒DNA結果是足夠同源的，容許構建通用穿梭載體來克隆屬於這兩個亞群的病毒。
D/E亞群穿梭載體的構建完全地測序了ChAd6病毒基因組(SEQ ID NO2)，獲得的信息用於構建穿梭載體以便於通過D和E亞群黑猩猩腺病毒的同源重組來進行克隆。
在附圖1中描述了構建ChAd6穿梭載體，在此稱為pARSChAd6-3。附圖32提供了用於在此描述的克隆實驗的寡核苷酸序列的列表(SEQ ID NO26-40和SEQ ID NO45-46)。簡要地，通過用寡核苷酸5′-ATGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTC-3(SEQ ID NO27) 和5′-CGCTGGCACTCAAGAGTGGCCTC-3』(SEQ ID NO28)通過PCR擴增來自ChAd6 DNA的左末端的457 bp，用EcoRI和SnaBI消化並克隆入EcoRI-SnaBI酶切的pNEBAd35-2，產生pNEBChAd6-LI。通過使用寡核苷酸5』-ATGAAGCTTGTTTAAACCCATCATCAATAATATACCT-3』(SEQ ID NO29)和5』-ATCTAGACAGCGTCCATAGCTTACCG-3』(SEQ ID NO30)通過PCR擴增右側ChAd6 ITR(bp 36222到bp36648)，用限制性內切酶HindIII和XbaI消化並克隆入HindIII-XbaI消化的pNEBChAd6-LI，產生pNEBChAd6-RLI。最後，與ChAd6基因組DNA序列的核苷酸3426-3813相應的DNA片段用寡核苷酸5′-ATGCTACGTAGCGATCGCGTGAGTAGTGTTTGGGGGTGGGTGGG-3』(SEQ ID NO31)和5′-TAGGCGCGCCGCTTCTCCTCGTTCAGGCTGGCG-3』(SEQ ID NO32)擴增，用SnaBI和AscI消化，然後與SnaBI-AscI消化的pNEBChAd6-RLI連接，從而產生pNEBChAd6-RLIdE1。
為了改善在DH5αE.coli菌株中的重組和質粒增殖的效率，通過PmeI消化從pNEBChAd6-RLIdEl切下含有ChAd6的左側和右側ITR以及pIX基因片段的1306 bp片段，並轉移到不同的質粒載體，所述質粒載體通過用寡核苷酸5′-GATCTAGTTAGTTTAAACGAATTCGGATCTGCGACGCG-3』(SEQ ID NO33)和5′TTCGATCATGTTTAAACGAAATTAAGAATTCGGATCC-3』(SEQ ID NO34)通過PCR擴增從pMRKAd5SEAP獲得。這個最終的連接步驟產生ChAd6穿梭載體pARSChAd6-3。
C亞群穿梭載體的構建完全地測序了ChAd3病毒基因組(SEQ ID NO1)，獲得的信息用於構建穿梭載體以便於通過C亞群黑猩猩腺病毒的同源重組來進行克隆。
簡要地，用於克隆C亞群黑猩猩腺病毒的穿梭載體，在此稱為pChAd3EGFP，如下構建用寡核苷酸5′-TATTCTGCGATCGCTGAGGTGGGTGAGTGGGCG-3』(SEQ ID NO35)和5′TAGGCGCGCCCTTAAACGGCATTTGTGGGAG-3』(SEQ ID NO36)通過PCR擴增含有pIX編碼區的ChAd3 DNA片段(nt 3542-4105)，用SgfI-AscI消化，然後克隆到用SgfI-AscI消化的pARSCV32-3中，產生pARS-ChAd3D。用寡核苷酸5′CGTCTAGAAGACCCGAGTCTTACCAGT-3』(SEQ ID NO37)和5′-CGGGATCCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATT-3』(SEQ ID NO38)通過PCR擴增ChAd3右末端(nt 37320-37441)，用XbaI和BamHI消化，然後連接到用XbaI和BamHI限制的pARS-ChAd3D，產生pARS-ChAd3RD。用寡核苷酸5′-ATGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTT-3』(SEQ ID NO39)和5′-ATGACGCGATCGCTGATATCCTATAATAATAAAACGCAGACTTTG-3』，(SEQ ID NO40)通過PCR擴增ChAd3病毒DNA左末端(nt 1-460)，用EcoRI和SgfI消化，然後克隆到用EcoRI和SgfI消化的pARS-ChAd3RD，從而產生pARS-ChAd3RLD。還設計病毒DNA盒以含有位於兩個ITR的末端的限制性內切酶位點(Pmel)，從而消化將從質粒DNA釋放病毒DNA。
B亞群穿梭載體的構建根據已經描述的C和D/E亞群穿梭體構建的策略，構建B亞群穿梭體。簡言之，通過用ChAd30的相應片段取代左側末端、pIX區域、右側末端來修飾pARS-ChAd3RLD。此外，用克隆在ChAd30 E4啟動子的控制下的Ad5 E4orf6替代ChAd30的E4區域。該穿梭質粒命名為pChAd30 EGFP穿梭載體。
ΔE1黑猩猩腺病毒載體的構建B亞群通過在E.coli菌株BJ5183中進行同源重組來構建B亞群黑猩猩腺病毒載體。用BstEII和Bstl107I消化的pChAd30EGFP穿梭載體與ChAd8和ChAd30，純化的病毒DNA，共轉化BJ5183細胞。在pIX基因、存在於線性化pChAd30EGFP穿梭體和病毒基因組DNA末端的右側ITR DNA序列之間的同源重組，容許它插入到質粒載體中，同時刪除被EGFP表達盒替換的E1區域。構建根據人類細胞巨化病毒(HCMV)啟動子和牛生長激素多聚腺苷酸信號(BghpolyA)的表達盒，來表達分泌的鹼性磷酸酶(SEAP)、EGFP、HIV gag、HCV NS區域(如附圖3中對ChAd6穿梭載體所描述的)以及腫瘤相關抗原如來自人類和恆河猴來源的CEA和HER2/neu。所有表達盒都通過同源重組插入到ChAd30載體中。
C亞群通過在E.coli菌株BJ5183中進行同源重組來構建C亞群黑猩猩腺病毒載體。用BstEII和Bstl107I消化的pChAd3EGFP穿梭載體與ChAd3、ChAd11、ChAd19和ChAd20純化的病毒DNA共轉化BJ5183細胞。在pIX基因、存在於線性化pChAd3EGFP和病毒基因組DNA末端的右側ITR DNA序列之間的同源重組，容許它插入到質粒載體中，同時刪除被EGFP表達盒替換的E1區域。構建根據人類細胞巨化病毒(HCMV)啟動子和牛生長激素多聚腺苷酸信號(Bgh polyA)的表達盒，來表達分泌的鹼性磷酸酶(SEAP)、EGFP、HIV gag、HCV NS區域(如附圖3中對ChAd6穿梭載體所描述的)以及腫瘤相關抗原如來自人類和恆河猴來源的CEA和HER2/neu。
D和E亞群為了根據D和E亞群黑猩猩腺病毒構建ΔE1載體，用AscI消化穿梭載體pARS ChAd6-3，與CV32、CV33、CV68、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd9、ChAd10、和ChAd16純化的病毒DNA共轉染入E.coli菌株BJ5183。在來自pIX基因的DNA序列和存在於線性化pARS ChAd6-3和病毒基因組DNA末端的右側ITR DNA序列之間的同源重組，容許它插入到質粒載體中，同時刪除E1區域(附圖2和4)。
構建根據人類細胞巨化病毒(HCMV)啟動子和牛生長激素多聚腺苷酸信號(Bgh polyA)的表達盒，來表達分泌的鹼性磷酸酶(SEAP)、EGFP、HIV gag、HCV NS基因(附圖3)以及腫瘤相關抗原如人類和恆河猴來源的CEA和HER2/neu。所有的表達盒都插入到pARS ChAd6-3載體的單個SnaBI位點，以通過同源重組轉移到如附圖4描述的ΔE1腺病毒前質粒中。
ΔE1載體的營救和擴增種植在6cm細胞培養平皿上的5×106個PER.C6TM細胞用通過核酸內切酶消化從質粒序列釋放的10微克克隆病毒載體轉染。使用Lipofectamine(Invitrogen)進行DNA轉染。轉染後5-10天收集轉染的細胞和培養基，通過冷凍和解凍裂解。然後通過在293或PER.C6TM細胞上連續傳代來擴增營救的載體。通過感染種植在5-10個細胞工廠(NUNC，Inc.)上總共1-2×109個細胞來進行大規模的擴增。通過兩次運行超速離心機，在氯化銫梯度上獲得純化的載體製品，相對含10％甘油的PBS進行透析，以等分量保存在-70℃。
實施例3中和研究為了評估針對在此公開的黑猩猩腺病毒的中和抗體在人類血清中的流行度，進行中和分析。該分析評估了血清預孵化對攜帶分泌鹼性磷酸酶(SEAP)基因的黑猩猩腺病毒轉導人類293細胞的能力的影響。中和滴度被定義為給出在有單獨的病毒的陽性對照中觀察到的SEAP活性的50％降低的血清稀釋度。
將CV33-SEAP、CV32-SEAP和ChAd3-SEAP載體的2×106到1.5×107個物理粒子稀釋在100μl完全培養基中，添加到稀釋於完全培養基中的等體積的人類或黑猩猩血清中。在各種稀釋度測試每種血清樣品(從1/18稀釋度開始的五個4倍的增加，到1∶4608)。將樣品在37℃預孵化一小時，然後添加到播種於96孔平板(3×104細胞/孔)中的293細胞。孵化一小時後除去接種物，用新鮮培養基重新餵養細胞，24小時後，移出50μl的培養基，通過化學發光分析測量SEAP活性。中和滴度被定義為給出在有單獨的病毒的陽性對照中觀察到的SEAP活性的50％降低的血清稀釋度。測試一組100個人類血清的ChAd中和活性。並行的用Ad5 SEAP載體測試相同的組。
表2.針對黑猩猩腺病毒的中和抗體的流行度
表2中提供的結果表明了針對來源於黑猩猩腺病毒的載體的中和抗體在人類血清中的極低的流行度。僅四份血清顯示了對於CV32載體的超過閾值200的滴度，而8份顯示了對於ChAd3 SEAP載體的超過200的滴度。相反地，檢查的黑猩猩血清的組顯示了抗黑猩猩Ad免疫性的非常高的流行度。這些發現證實了如所預期的，基於黑猩猩Ad的載體具有非常小的機會在人類中被中和。因此它們是對先存的抗人類Ad免疫性難題的理想解決方案，所述免疫性限制了基於常見人類Ad血清型例如Ad5的病毒載體的施用。
實施例4ChAd載體向性(tropism)通過在不同組織來源的人類初級細胞的組上的EGFP表達，來評定Ad5和ChAd載體介導的基因轉移效力。根據廠家的指示培養人類軟骨細胞、成骨細胞、角質形成細胞、黑素細胞、骨骼肌細胞和黑素細胞。如所描述的獲得人類單核細胞、不成熟的和成熟的樹突狀細胞(DC)(Romani，N.et al.1996，J.Immunol.Methods，196，137.)。通過FACS分析檢測轉導的螢光細胞。測試的人類初級細胞的組(panel)包括在心血管疾病、類風溼性關節炎、組織工程(骨骼、皮膚和軟骨)和疫苗接種領域對基於體內以及體外基因轉移的不同治療策略很重要的靶細胞。附圖38A-D中呈現的結果表明，如不同細胞類型感染的不同效率所展現的，不同的黑猩猩腺病毒可以識別除CAR以外的受體。
鼠免疫研究方法和材料免疫方案和脾細胞/PBMC製備免疫用在0.1ml緩衝液中稀釋的選定腺病毒免疫小鼠。每個載體劑量分成兩個50μl的等分量，注射到小鼠的兩個四頭肌中。
脾細胞製備注射後3周處死小鼠，切除它們的脾臟，轉移到10mlR10中(10％FCS、55mM 2-巰基乙醇、1M HEPES緩衝液、2mM L-穀氨醯胺、RPMI培養基1640中的1X青黴素-鏈黴素溶液)。通過鋼篩切碎脾臟，用2ml R10洗滌篩子之後，將脾細胞轉移到50ml Falcon試管中，在室溫(rt)以1200rpm離心10分鐘。除去上清液，添加3mlACK裂解緩衝液(Gibco BRL Formulation#79-0422DG)。室溫下孵化細胞5分鐘。添加45ml 1X PBS，如上述對試管進行離心。用30ml R10洗滌之後，將細胞重懸浮在5ml R10中，通過70m尼龍細胞過濾器(Falcon 2350)過濾。用990μl Turk′s溶液(Merck 040417345)稀釋10μl的細胞，進行計數。最後將細胞稀釋到R10中的107細胞/ml。
外周血單核細胞(PBMC)製備將小鼠血液樣品(150μl)轉移到含50μl PBS/2％EDTA的2ml eppendorf試管。向每個試管添加1mlACK緩衝液。輕輕地混合併在RT孵化5分鐘。樣品在微離心機中以1500rpm離心5分鐘。棄去上清液，組合來自相同的免疫群(immunizedcohorts)的白血球沉澱。重複ACK緩衝液孵化，然後將PBMC的沉澱重懸浮在1ml R10培養基中。
IFN-γELISPOT分析用以2.5μg/ml的濃度在PBS中稀釋的純化的大鼠抗小鼠IFN-γ單克隆抗體(Pharmingen，cat.551216)以100μl/孔包被Millipore MAIP45平板，在4℃孵化過夜(o/n)。用無菌的PBS洗滌平板兩次，通過在CO2孵化器中與200μl/孔的R10孵化2小時來封閉非特異性結合位點。在表達HIV gag的Ad載體的免疫實驗中，將9-mer的肽(AMQMLKETI，Balb/C小鼠中定位的CD8 HIV gag表位)(SEQ IDNO47)在R10中稀釋到2μg/ml，以50μl/孔的數量添加到孔中。在用HCV-NS表達載體進行的免疫實驗中，使用了一肽庫，其覆蓋了NS3解旋酶結構域和代表解旋酶結構域中包含的定位的CD8表位的9-mer肽。通過覆蓋完整胺基酸序列的重疊的15-mer肽的庫，來評估表達人類CEA抗原的ChAds的免疫試驗。作為對照使用DMSO和伴刀豆球蛋白A。以5×105和2.5×105的數量向每個孔中添加細胞。在CO2孵化器中o/n孵化之後，用0.05％Tween 20/PBS洗滌平板，添加在分析緩衝液(5％FBS、0.005％Tween20、PBS)中稀釋1/250的50μl/孔的生物素化大鼠抗小鼠IFN-γ單克隆抗體(PharMingen cat.554410)。在4℃孵化平板o/n，如上進行洗滌。在分析緩衝液中將鏈黴抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶結合物(BD554065)稀釋1/2500，以50μl/孔的數量添加，室溫2小時。洗滌之後，向平板添加50μl/孔的BCIP/NBT1-step溶液(Pierce 34042)進行顯影。通過用去離子水洗滌孔停止反應。通過ELISPOT讀數器自動地對斑點計數。
鼠IFN-γ細胞內染色(ICS)將脾細胞稀釋為2×106細胞每1ml R10，用如上所述相同的抗原以2μg/ml的濃度刺激。作為對照，使用DMSO和葡萄球菌腸毒素B(SEB)。在CO2孵化器中過夜孵化之後，用FACS緩衝液(1％FCS、0.01％NaN3、PBS)洗滌細胞，將純化的抗小鼠CD16/CD32 Fc片段(克隆2.4G2，Pharmingen cat.553142)稀釋1/25，以100μl/樣品的數量添加，在4℃孵化15分鐘。在FACS緩衝液中洗滌細胞，以100μl/樣品的數量添加在FACS緩衝液中1∶50稀釋的結合APC的抗小鼠CD3e(克隆145-2C11，Pharmingen#553066)、結合PE的抗小鼠CD4(克隆L3T4，BD Pharmingen cat.553142)和結合PerCP的抗小鼠CD8a(克隆53-6.7，Pharmingen cat.553036)。將細胞室溫孵化30分鐘，洗滌，固定並滲透化(permeabilized)(Becton Dickinson，FACSPerm 2)，與在PermWash(100μl/樣品)中1∶50稀釋的結合FITC的抗小鼠IFN-γ(Pharmingen cat.554411)在室溫孵化30分鐘。洗滌後的細胞重懸浮在500μl 1％甲醛/PBS中，使用CellQuest軟體(BectonDickinson)在FACS-Calibur流動細胞計數器上，進行細胞內細胞因子染色(ICS)分析。
實施例5ChAd載體在小鼠中引發強烈的CMI反應使用表達HIV gag轉基因的載體在小鼠中評估在此公開的ChAd載體引發細胞介導的免疫反應(CMI)的能力。簡要地，用從105直到1010vp/小鼠的成十倍增加劑量的不同載體注射5隻Balb/C小鼠的各組。
注射後三周通過對脾細胞中gag特異性CD8+T細胞進行定量來確定免疫反應的強度。在體外用產生Balb/C小鼠中定位的gag CD8+T細胞表位的肽進行刺激之後，通過ELISPOT分析或通過IFN-γ細胞內染色和FACS分析來測定分泌INF-γ的CD8+T細胞的數量。
從5個免疫的動物獲得結果，在表3中報告，表示為每106個脾細胞中的斑點形成細胞。顯示的是，在與9-mer CD8+gag表位或與gag肽庫孵化之後每百萬個脾細胞的斑點形成細胞的數量。gag肽庫由重疊10aa、涵蓋完整的gag序列的20aa的肽組成。陽性值以粗體報告。
表3中提供的數據表明，施用在此公開和要求權利的ChAd載體引發了強烈的細胞介導的免疫反應，其是能夠與hAd5引發的反應相比較的。通過察看引起陽性免疫結果的最低載體劑量(免疫斷點)，我們對不同載體的效力進行了評分，C亞群ChAd3gag是最有效的，斷點在106pp載體劑量。免疫斷點的評分在附圖33中示出。
表3.用黑猩猩Ad載體免疫的Balbc小鼠中的gag特異性T細胞反應
實施例6ChAd3和CV33 GAG載體引發以GAG特異性CD8+T細胞為特徵的CMI反應為了表徵響應於包含HIV gag轉基因的ChAd載體而引發的CMI反應，來自用不同劑量的載體免疫的五隻小鼠的群組(cohorts)的脾細胞庫通過細胞內IFN-γ染色進行分析。表3和表4中顯示的數據是在獨立的實驗中採集的。
將脾細胞稀釋為2×106細胞每1ml R10，用如上所述相同的抗原以2μg/ml的濃度刺激。作為對照，使用DMSO和SEB(葡萄球菌腸毒素B)。在CO2孵化器中o/n孵化之後，用FACS緩衝液(1％FCS、0.01％NaN3、PBS)洗滌細胞，將純化的抗小鼠CD16/CD32 Fc片段(克隆2.4G2，Pharmingen cat.553142)稀釋1/25，以100μl/樣品的數量添加，在4℃孵化15分鐘。在FACS緩衝液中洗滌細胞，以100μl/樣品的數量添加在FACS緩衝液中1∶50稀釋的結合APC的抗小鼠CD3e(克隆145-2C11，Pharmingen#553066)、結合PE的抗小鼠CD4(克隆L3T4，BD Pharmingen cat.553142)和結合PerCP的抗小鼠CD8a(克隆53-6.7，Pharmingen cat.553036)。將細胞室溫孵化30分鐘，洗滌，固定並滲透化(permeabilized)(Becton Dickinson，FACSPerm 2)，與在PermWash(100μl/樣品)中1∶50稀釋的結合FITC的抗小鼠IFN-γ(Pharmingen cat.554411)在室溫孵化30分鐘。洗滌後的細胞重懸浮在500μl 1％甲醛/PBS中，使用CellQuest軟體(BectonDickinson)在FACS-Calibur流動細胞計數器上進行分析。
表4提供了數據，總結了作為gag特異性CD8+或CD4+T細胞的gag特異性CD3+T細胞的百分比。陽性結果以粗體報告。在此提供的數據表明，由來源於分類為不同血清型亞群(即，C、D和E亞群)的病毒的ChAd載體引發的免疫反應的細胞分布型是類似的，所有gag特異性反應都主要以CD8+T細胞為特徵。此外，注意到，在高的載體劑量下，在所有免疫實驗中gag特異性CD4+反應都變得明顯。ICS分析證實了ChAd3載體可以以106載體劑量刺激抗gag CD8+反應。
表4.用不同亞群的黑猩猩腺病毒載體免疫的小鼠中gag特異性T細胞的表徵
實施例7ChAd載體引發HCV NS特異性T細胞反應相對於MRKAd6NSmut的效力，在C57/Black6小鼠中評估了CV32-NSmut和CV33-NSmut載體的效力。動物注射了從107開始直到109vp/小鼠的成10倍增加的載體劑量。單次注射後3周，通過用再生NS3蛋白的解旋酶結構域中定位的CD8+T細胞表位的9-mer肽刺激T細胞，通過IFN-γELISPOT和IFN-γ細胞內染色來分析CMI。表5中提供的數據總結了不存在(模擬的(mock))或存在NS3 9-mer肽的孵化之後每百萬個脾細胞的斑點形成細胞的數目。
數據表明，表達HCV-NS的CV32和CV33載體都刺激強烈的T細胞反應。根據通過注射109vp/劑量獲得的對CV32載體的第一個陽性結果的觀察，CV32DE1E3 NSmut載體的免疫效力好像比人類C亞群Ad6DE1E3 NSmut載體低大約100倍。用MRKAd6NSmut的平行試驗表明，107vp/動物的劑量足夠刺激細胞介導的免疫。因此，這些結果證實了，在用表達gag的載體的實驗中也觀察到的(參見表3)、相對於人類C亞群載體(例如hAd5和hAd6)，CV32衍生的載體的更低的免疫效力。
表5.在用Mrkad6 Nsmut、CV32NSmut或CV33NSmut免疫的小鼠中的HCV NS特異性T細胞反應
實施例8抗Ad5的先存免疫性不取消ChAd3gag引發的抗gagCMI為了評估針對高血清型流行度的Ad5的先存免疫性對ChAd3免疫的影響，在0和2周在四頭肌中兩次注射1010vp的Ad5wt來預先免疫各5隻BalbC小鼠的4個群組。作為對照，各5隻小鼠的兩個群組在相同的時間點僅用緩衝液注射。然後用106和107vp/小鼠的Ad5gag或ChAd3gag載體免疫Ad5預免疫的小鼠的群組。用106和107vp/小鼠的Ad5gag或ChAd3gag載體免疫對照(幼稚)小鼠的群組。
在第4周通過如上所述的中和分析使用Ad5和ChAd3 SEAP載體評估抗Ad5和ChAd3中和免疫性。對用含有在BalbC小鼠中定位的gag表位的gag 9-mer肽刺激的純化脾細胞進行ELISPOT分析來評估抗gag免疫性。在附圖36中報告的結果證明，抗Ad5免疫性不取消ChAd3gag引發的抗gag CMI，而如所預料的，抗Ad5免疫性完全地阻斷了Ad5gag免疫。
實施例9ChAd3hCEA免疫在表達人類CEA的轉基因小鼠中引發強烈的CEA特異性免疫反應還在表達人類CEA的轉基因小鼠(Clarke，P et al.Cancer Res.(1998)58(7)1469-77.)中評估了在此公開和要求權利的ChAd載體引發針對自體抗原的免疫反應從而破壞耐受性的能力。
用已經描述的1010vp ChAd3hCEA或Ad5hCEA在四頭肌中注射各8隻小鼠的群組。在用包含從aa 497到末端(aa 703)的人類CEA胺基酸序列的15-mer肽的庫刺激的PBMC上，每周監視針對CEA的免疫反應，直到第75天。通過ICS確定響應於CEA肽庫孵化的分泌幹擾素-γ的CD4-CD8+T細胞，來評估抗CEA免疫性。
在附圖37中報告的結果表明，與表達相同轉基因的Ad5相比，ChAd3hCEA載體免疫刺激了針對人類CEA的更加持久的CD8+T細胞反應。
靈長類免疫研究方法和材料免疫方案還評估了在此公開和要求權利的ChAd載體在恆河猴(在此稱為猴)中引發CMI的能力。麻痺恆河猴(開他敏/甲苯噻嗪)，使用結核菌素注射器(Becton-Dickinson)以0.5mL等分量向兩個三角肌中肌肉內遞送疫苗。在所有情況中，恆河猴體重在3-10公斤之間，在1mL緩衝液中施用每個疫苗的總劑量。
從在免疫期間的幾個時間點收集的血液樣品製備血清和外周血單核細胞(PBMC)。所有動物照料和處理都根據動物照料和使用委員會機構(Institutional Animal Care and Use Committee)提供的標準，根據Guide for Care and Use of Laboratory Animals，Institute ofLaboratory Animal Resources，National Research Council中闡述的原則進行。
ELISPOT分析根據早先描述的方案(Allen et al.，2001 J.Virol.75(2)738-749)進行對恆河猴的IFN-γ ELISPOT分析，有某些修改。對於gag特異性刺激，從涵蓋完整HIV-1 gag序列具有10-aa重疊的20-aa的肽製備肽庫(Synpep Corp.，Dublin，CA)。對於HCV NS特異性刺激，從涵蓋NS3到NS5b的完整HCV-NS序列的具有10-aa重疊的15-aa肽製備6個肽庫。
用涵蓋完整蛋白序列的具有10-aa重疊的15-aa肽進行HER2/neu和CEA特異性刺激。
向每個加樣孔添加50μL 2-4×105個外周血單核細胞(PBMC)；使用Beckman Coulter Z2粒子分析儀以設置在80fL的較低的尺寸截止(cut-off)對細胞進行計數。將50μL培養基或每種肽的濃度為8μg/mL的gag肽庫添加到PBMC。樣品在37℃，5％CO2孵化20-24小時。相應地發展出斑點，用根據ImagePro平臺(Silver Spring，MD)定製的成像儀和自動計數子程序處理平板；將計數值標準化為106個細胞輸入。
細胞內細胞因子染色(ICS)向1ml的2×106pBMC/mL完全RPMI培養基(17×100mm圓底聚丙烯試管(Sarstedt，Newton，NC))中，添加抗hCD28(克隆L293，Becton-Dickinson)和抗hCD49d(克隆L25，Becton-Dickinson)單克隆抗體到1μg/mL的終濃度。對於gag特異性刺激，添加10μL的肽庫(每種肽0.4mg/mL)。對HCV NS特異性刺激使用類似的條件。在37℃孵化試管1小時，之後添加20μL的5mg/mL布雷菲德菌素A(brefeldin A)(Sigma)。在37℃、5％CO2、90％溼度孵化細胞16小時。向每個試管添加4mL PBS/2％FBS，在1200rmp 10分鐘將細胞團粒化。將細胞重懸浮在PBS/2％FBS中，使用幾種螢光標記的mAbs對表面標記進行染色(30分鐘，4℃)每試管20μL抗hCD3-APC，克隆FN-18(Biosource)；20μL抗hCD8-PerCP，克隆SKI(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)；和20μL抗hCD4-PE，克隆SK3(Becton Dickinson)。這個階段的樣品處理在黑暗中進行。洗滌細胞，在750μL 1×FACS Perm緩衝液(Becton Dickinson)中在室溫下孵化10分鐘。將細胞團粒化，重懸浮在PBS/2％FBS中，添加0.1μgFITC-抗hIFN-γ，克隆MD-1(Biosource)。孵化30分鐘後，洗滌細胞並重懸浮在PBS中。使用Becton Dickinson FACSCalibur儀器的所有四個彩色通道對樣品進行分析。為了分析數據，首先除去(gated)低的側向和前向分散的淋巴細胞群體；將用於細胞因子陽性事件的常用的螢光截止用於CD4+和CD8+群體，並用於樣品的模擬和gag肽反應試管。
實施例10在猴中使用ChAdΔE1-gag載體的同源激發-強化方式引發Gag特異性T細胞在第0周和第4周給予各3隻動物的群組肌肉注射任何一種以下構建體1010vp的CV-32ΔE1-gag；或1010vp CV33ΔE1-gag；或1010vp和108vp的MRKAd5ΔE1gag。以規律的4周間隔收集的PBMC在ELISPOT分析中進行分析。結果在表6中提供，其表明不存在(模擬)或存在Gag肽庫的情況下孵化之後每百萬個PBMC中斑點形成細胞的數目，確定了CV32ΔE1gag和CV33ΔE1gag能夠在非人靈長類中誘導顯著水平的gag特異性T細胞。有趣的是注意到，在單次劑量之後(第4周)，CV32ΔE1-gag反應與MRKAd5ΔE1-gag 108vp劑量相當，比MRKAd5-gag 1010vp/劑的更低。CV33ΔE1-gag 1010vp/劑誘導了與MRKAd5-gag 1010vp/劑的反應相當的反應。在第8周第二劑之後證實了這個結果。
表6.用Mrkad5ΔE1-Gag、CV32ΔE1-Gag、CV33ΔE1-Gag免疫的猴中的Gag特異性T細胞反應
實施例11在異源的激發-強化方案中ChAd載體引發HCV NS特異性T細胞反應在獨立的實驗中，在第0、4周以108或1010vp每隻動物向兩隻和三隻猴的組給予MRK Ad6NSoptmut載體的免疫接種。在第24周以相同的劑量用相同的病毒對動物進行強化，在第104周以1010vp每隻動物用CV33-NSmut再次強化。結果在表7和8中呈現，其總結了不存在(模擬的)或存在HCV NS肽庫的孵化之後每百萬個PBMC的斑點形成細胞的數目。
在第一劑之後第4周在注射了1010vp的動物中(表8)，和在第8周(第2劑以後)在注射了108的動物中(表7)，通過IFN-γELISPOT評定的T細胞免疫性顯示了峰值反應。第24周的注射沒有使反應強化(「同源強化」)而在注射CV33-NSmut之後觀察到強烈的強化效果(「異源強化」)。
表7.用108vp/動物的MRK Ad6NSoptmut免疫和用CV33-Nsmut強化的猴中的HCV NS特異性T細胞反應
表8.用1010vp/動物的MRK Ad6NSoptmut免疫和用CV33-Nsmut強化的猴中的HCV NS特異性T細胞反應
在第二實驗中評估用黑猩猩Ad載體異源強化的效率。在第0周和第4周用MRKAd5gag(1010vp/動物)、MRKAd6NSmut(1010vp/動物)或用兩種載體的組合(每個載體1010vp/動物)免疫各三隻猴的群組，然後在第24周用相同的免疫原強化(同源強化)。用相同的免疫原進行同源強化；用CV33gag、CV32 NSmut或用組合的這兩種載體進行異源強化。表9中提供的結果總結了不存在(模擬的)或存在HCV NS肽庫的孵化之後每百萬個PBMC的斑點形成細胞的數目。
在第51周用CV33gag(1010vp/動物)、CV32NSmut(1010vp/動物)和用兩種載體的組合(每種載體1010vp/動物)再次強化相同的群組。在表9中提供的結果進一步表明，由於反應低於注射第一劑疫苗後第4周觀察到的峰值，同源強化不是很有效。在用異源黑猩猩載體免疫接種後在第54周通過IFN-γELISPOT測量到強烈的強化效果。
表9.在用MRK Ad5gag或MRK Ad6NSoptmut以1010vp/動物免疫的猴中，黑猩猩Ad載體的免疫接種有效地強化Gag和HCV NS特異性T細胞反應
實施例12用包含TAA的ChAd載體進行疫苗接種在猴中破壞耐受性並引發TAA特異性T細胞反應在各四隻猴的群組中進行實驗，所述實驗被設計來確定黑猩猩腺病毒載體是否有足夠的免疫原性來破壞對自體抗原的耐受性，並記錄黑猩猩載體用於強化人類腺病毒載體激發的免疫反應的實用性。在第0、2和4周用包含腫瘤相關抗原CEA的Ad5DE1 RhCEA(1011vp)三次注射免疫動物，隨後在第16、18和20周用CV33DE1 RhCEA(1011vp)接種。用恆河猴CEA肽通過IFN-γ ELISPOT測量T細胞反應。
結果在附圖34中報告，其提供了在不存在(DMSO)或存在恆河猴CEA C和D肽庫的孵化之後每百萬PBMC中斑點形成細胞的數目，確定了基於用兩種不同的Ad血清型的接種的免疫方案在非人靈長類中引起針對CEA的持續的T細胞反應。
雖然已經參考本發明的某些優選的實施方式詳細描述了本發明，要理解的是，修改和變化都處在所描述的和要求權利的精神和範圍之內。
序 列 表110Merck Co.，Inc.
Instituto di Ricerche di Biologia Molecolare P.Angeletti S.p.A.
120黑猩猩腺病毒疫苗載運體130ITR004 8Y PCT15060/538,7991512004-01-23160125170FastSEQ for Windows Version 4.0210121137741212DNA213黑猩猩腺病毒-ChAd3基因組4001catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag atgggcggcg 60cgaggcgggg cgcggggcgg gaggcgggtt tgggggcggg ccggcgggcg gggcggtgtg 120gcggaagtgg actttgtaag tgtggcggat gtgacttgct agtgccgggc gcggtaaaag 180tgacgttttc cgtgcgcgac aacgcccccg ggaagtgaca tttttcccgc ggtttttacc 240ggatgttgta gtgaatttgg gcgtaaccaa gtaagatttg gccattttcg cgggaaaact 300gaaacgggga agtgaaatct gattaatttt gcgttagtca taccgcgtaa tatttgtcta 360gggccgaggg actttggccg attacgtgga ggactcgccc aggtgttttt tgaggtgaat 420ttccgcgttc cgggtcaaag tctccgtttt attattatag tcagctgacg cggagtgtat 480ttataccctc tgatctcgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc 540tctgccgctc tccgctccgc tccgctcggc tctgacaccg gggaaaaaat gagacatttc 600acctacgatg gcggtgtgct caccggccag ctggctgctg aggtcctgga caccctgatc 660gaggaggtat tggccgataa ttatcctccc tcgactcctt ttgagccacc tacacttcac 720
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