一種含茶多酚的牛卵母細胞體外成熟培養液及其培養方法
2023-12-10 03:59:16
專利名稱：一種含茶多酚的牛卵母細胞體外成熟培養液及其培養方法
技術領域：
本發明涉及一種含茶多酚的牛卵母細胞體外成熟培養液及其培養方法，屬於家畜胚胎工程技術領域。
背景技術：
隨著現代繁殖生物技術的發展及胚胎體外生產技術的逐步完善，利用體外受精技術生產體外胚胎呈現出潛在的廣闊應用前景。家畜胚胎體外生產尤其是體細胞核移植是快速擴大優秀種群數量的有效途徑。足夠數量的成熟卵母細胞是胚胎體外生產的前提條件。從屠宰場獲取的卵巢中用注射器抽取卵母細胞並進行體外培養是獲取成熟卵母細胞最有效、最經濟的途徑。由於生殖道內氧的濃度為7％左右，但卵母細胞的體外成熟培養在約含20％氧氣的培養箱中完成，因此產生了比體內成熟更高的自由基濃度。自由基是細胞內正常代謝中產生的，在體內正常環境下，自由基的產生和消除處於平衡狀態。當自由基過量或持續產生時，平衡遭到破壞，過量的自由基會損害細胞內的脂質、核酸以及蛋白質，使卵母細胞體外培養時細胞質成熟不完全，有關早期胚胎發育的蛋白質沒有得到表達，因而早期胚胎體外發育率較低。體內，維持自由基平衡的抗氧化劑主要是一系列的酶類如抗氧化物歧化酶、過氧化氫酶等。但常規的卵母細胞體外培養液中，這些抗氧化的物質是缺乏的，因而不能有效的去除過多的自由基，導致卵母細胞受精後胚胎早期發育率較低。
茶是世界上最流行的飲料之一。茶多酚是茶葉中主要的多羥基酚類物質，約佔茶葉乾重的20～30％，主要包括兒茶素、黃酮甙類、花青甙類、酚酸類等三十多種多酚成分，它們具有較強的抗氧化和抗自由基的活性，是自由基如過氧化物陰離子、過氧化氫、羥基自由基的清除劑。對於茶多酚的研究已有文獻報導。CN1142481A、CN1071660A、CN1194966A、CN1094706A、CN1104621A、CN1386731A、CN1546484A等多種專利申請公開了茶多酚的提取方法。CN1153019A、CN1284275A、CN1365633A等多種專利公開了茶多酚用作保健品的用途。而CN1314148A、CN1314149A、CN1640393A等多種專利公開了茶多酚用作藥物的用途。但到目前為止，尚未見有關茶多酚用於家畜繁殖技術領域，特別是用於卵母細胞體外成熟培養的報導。
發明內容本發明即是為了解決現有技術中卵母細胞體外培養液中自由基過多、導致卵母細胞受精後胚胎早期發育率較低的不足，提供了一種具有及時清除卵母細胞胞體內及培養環境中過量自由基、提高卵母細胞體外受精後胚胎發育率的功能的含茶多酚的牛卵母細胞體外成熟培養液及其培養方法。
為達到發明目的本發明採用的技術方案是一種含茶多酚的牛卵母細胞體外成熟培養液，所述體外成熟培養液以常規培養液為基質，所述基質中還含有20～150μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青黴素、100μg/mL的鏈黴素及體積百分含量8％～20％的血清。
茶多酚(Green Tea Polyphenols，簡稱GTP)是茶葉溶劑浸提物中與亞鐵離子產生綜合反應的酚類化合物的總稱，包括兒茶素、黃酮類化合物、花青素、酚酸等四大類物質，有多種製取方法，屬於已知工藝和成熟技術，並已有商品出售，較為成熟的生產廠家有浙大茶葉科技有限公司、浙江紹興佳利保健製品有限公司、江西綠源生物有限公司、安徽茶多酚廠等。本發明中所用茶多酚由浙大茶葉科技有限公司提供，純度為99％。
具體的，所述體外成熟培養液每1000mL組成如下茶多酚20～150mg，青黴素100000IU，鏈黴素100000μg，血清80～200mL，常規培養液補足至1000mL。
所述常規培養液為常見用於牛卵母細胞培養的培養液，可下列之一或其中兩種或兩種以上的混合物①M199培養液、②DMEM培養液、③F12培養液、④MEM培養液。
所述血清為下列之一①小牛血清、②胎牛血清、③新生牛血清。
優選的，所述茶多酚含量為30～40μg/mL，血清體積百分含量為10％。
所述牛卵母細胞來自奶牛、或黃牛、或水牛中的一種。
一種應用所述體外成熟培養液的牛卵母細胞的體外成熟培養方法，所述方法是將所述體外成熟培養液置38～39℃環境中預熱1～3小時，用常規培養液衝洗牛卵母細胞後放入預熱的體外成熟培養液，在38～39℃、5％CO2的環境內成熟培養20～24小時，獲得成熟的牛卵母細胞。獲得的成熟卵母細胞再進行受精、胚胎培養等操作，進行胚胎體外生產。
所述用於培養的牛卵母細胞由屠宰場獲取的卵巢中用注射器抽取，其周圍至少包裹三層卵丘細胞，通常挑選細胞質比較均勻牛卵母細胞進行體外培養。
通常，所述方法是將所述體外成熟培養液在培養皿上做成體積為50～100μL的培養小滴，置38～39℃環境中預熱1～3小時，用常規培養液衝洗牛卵母細胞後放入預熱後的培養小滴，在38～39℃、5％CO2的環境內成熟培養20～24小時，獲得成熟的牛卵母細胞。
獲得的成熟卵母細胞再進行受精、胚胎培養等操作，獲得體外受精胚胎，具體方法如下受精用常規受精培養液在一次性塑料培養皿上做成體積為50～100μL的受精小滴置38～39℃環境中預熱1～3小時，將儲存在液氮罐中的凍精解凍，然後與培養後的卵母細胞一同放入受精小滴，在38～39℃、5％CO2的環境內培養15～18小時，進行受精；所述常規受精培養液為含5～10mg/mL肝素的BO液或Tyrode′s改良液。
胚胎培養用常規胚胎體外培養液在一次性塑料培養皿上做成體積為50～100μL的培養小滴置38～39℃環境中預熱1～3小時，將受精後的早期胚胎用常規胚胎體外培養液衝洗三次後，放入培養小滴中，在38～39℃、5％CO2的環境內培養，獲得牛體外受精胚胎。所述的常規胚胎體外培養液為含體積百分比10％血清的SOF培養液，所述的血清為小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中的一種。
本發明所述的牛卵母細胞體外成熟培養液，是根據卵母細胞體外成熟培養時抗氧化、抗自由基的需要，結合茶多酚的結構特點和功能研製而成。茶多酚結構中富含酚羥基，可提供活潑氫使自由基滅活，本身被氧化形成含有鄰苯二酚結構的自由基而具有較高穩定性，是優良的提供氫的自由基清除劑。茶多酚不僅可清除鏈引發階段的羥基自由基、過氧化物陰離子自由基，而且還是斷鏈型抗氧化劑，可清除鏈反應中間產物脂過氧化自由基和烷氧自由基，從而阻止脂自由基的傳播擴增。此外茶多酚能調動和激活細胞內的抗氧化防禦系統(超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、穀胱甘肽過氧化物酶、穀胱甘肽硫轉移酶等)的生理活性，在抗氧化作用上與以上物質具有協同作用，能夠更好地發揮防禦體統的作用，維持體內自由基的動態平衡。因此茶多酚應用於牛卵母細胞體外培養，可以有效地去除培養過程中產生的多餘自由基，促進卵母細胞的細胞質成熟，提高了牛體外成熟的卵母細胞受精後胚胎體外發育率。其經濟成本較低，便於在生產中推廣應用。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1製備含茶多酚的卵母細胞體外成熟培養液準確稱取茶多酚4毫克，先用20毫升的M199基礎培養液(購自美國GIBCO公司)溶解，然後向培養液中加入10毫升小牛血清和1萬國際單位的青黴素，1萬微克的鏈黴素，輕微攪拌均勻，再加入M199基礎培養液至100毫升體積，再次攪拌混勻。用0.22μM的微濾膜(Millipore Corporation，Bedford.Mass.USA)抽濾消毒後，在4℃下貯存，備用。
實施例2製備含茶多酚的卵母細胞體外成熟培養液準確稱取茶多酚3毫克，先用20毫升的DMEM基礎培養液(購自美國GIBCO公司)溶解，然後向培養液中加入10毫升胎牛血清和1萬國際單位的青黴素，1萬微克的鏈黴素，輕微攪拌均勻，加入DMEM基礎培養液至100毫升，攪拌混勻。用0.22μM的微濾膜(MilliporeCorporation，Bedford.Mass.USA)抽濾消毒後，在4℃下貯存，備用。
實施例3含茶多酚的培養液用於奶牛卵母細胞體外成熟培養奶牛卵母細胞分別在不含茶多酚的對照培養液和含有實施例1製備的含茶多酚的體外成熟培養液中成熟培養，然後進行體外受精。受精後的早期胚胎繼續培養8天。培養的第2天，在不含茶多酚的對照培養液中的卵母細胞受精後的分裂率為71.3％，在實施例1製備的含茶多酚的體外成熟培養液中的卵母細胞受精後的分裂率為79.5％，比對照組提高8.2％。培養的第8天，在不含茶多酚的對照培養液中的卵母細胞受精後的囊胚期發育率為19.3％，在實施例1製備的含茶多酚的體外成熟培養液中的卵母細胞受精後的囊胚期發育率為30.7％，比對照組提高11.4％。結果證實，含茶多酚的體外成熟培養液體外成熟培養奶牛卵母細胞可有效提高受精後的早期胚胎發育率。
實施例4含茶多酚的培養液用於黃牛卵母細胞體外成熟培養黃牛卵母細胞分別在不含茶多酚的對照培養液和含有實施例2製備的含茶多酚的體外成熟培養液中成熟培養，然後進行體外受精。受精後的早期胚胎繼續培養8天。培養的第2天，在不含茶多酚的對照培養液中的卵母細胞受精後的分裂率為72.7％，在實施例2製備的含茶多酚的體外成熟培養液中的卵母細胞受精後的分裂率為82.9％，比對照組提高10.2％。培養的第8天，在不含茶多酚的對照培養液中的卵母細胞受精後的囊胚期發育率為21.9％，在實施例2製備的含茶多酚的體外成熟培養液中的卵母細胞受精後的囊胚期發育率為32.4％，比對照組提高10.5％。結果證實，含茶多酚的體外成熟培養液體外成熟培養黃牛卵母細胞可有效提高受精後的早期胚胎發育率。
權利要求
1.一種含茶多酚的牛卵母細胞體外成熟培養液，其特徵在於所述體外成熟培養液以常規培養液為基質，所述基質中還含有20～150μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青黴素、100μg/mL的鏈黴素及體積百分含量8％～20％的血清。
2.如權利要求1所述的牛卵母細胞體外成熟培養液，其特徵在於所述體外成熟培養液每1000mL組成如下茶多酚20～150mg青黴素100000IU鏈黴素100000μg血清80～200mL常規培養液補足至1000mL。
3.如權利要求1或2所述的牛卵母細胞體外成熟培養液，其特徵在於所述常規培養液為下列之一或其中兩種或兩種以上的混合物①M199培養液、②DMEM培養液、③F12培養液、④MEM培養液。
4.如權利要求1或2所述的牛卵母細胞體外成熟培養液，其特徵在於所述血清為下列之一①小牛血清、②胎牛血清、③新生牛血清。
5.如權利要求1或2所述的牛卵母細胞體外成熟培養液，其特徵在於所述茶多酚含量為30～40μg/mL，血清體積百分含量為10％。
6.如權利要求1或2所述的牛卵母細胞體外成熟培養液，其特徵在於所述牛卵母細胞來自奶牛、或黃牛、或水牛中的一種。
7.一種應用如權利要求1或2所述體外成熟培養液的牛卵母細胞的體外成熟培養方法，其特徵在於所述方法是將所述體外成熟培養液置38～39℃環境中預熱1～3小時，用常規培養液衝洗牛卵母細胞後放入預熱的體外成熟培養液，在38～39℃、5％CO2的環境內成熟培養20～24小時，獲得成熟的牛卵母細胞。
8.如權利要求7所述的牛卵母細胞的體外成熟培養方法，其特徵在於所述方法是將所述體外成熟培養液在培養皿上做成體積為50～100μL的培養小滴，置38～39℃環境中預熱1～3小時，用常規培養液衝洗牛卵母細胞後放入預熱後的培養小滴，在38～39℃、5％CO2的環境內成熟培養20～24小時，獲得成熟的牛卵母細胞。
9.如權利要求7所述的牛卵母細胞的體外成熟培養方法，其特徵在於所述用於培養的牛卵母細胞由屠宰場獲取的卵巢中用注射器抽取，其周圍至少包裹三層卵丘細胞。
全文摘要
本發明提供了一種含茶多酚的牛卵母細胞體外成熟培養液及其培養方法，所述體外成熟培養液以常規培養液為基質，所述基質中還含有20～150μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青黴素、100μg/mL的鏈黴素及體積百分含量8％～20％的血清。本發明將茶多酚應用到牛卵母細胞體外成熟培養領域，提高了牛卵母細胞體外受精後早期胚胎體外發育率。其經濟成本較低，便於在生產中推廣應用。
文檔編號C12N5/06GK1904038SQ200610052700
公開日2007年1月31日 申請日期2006年7月28日 優先權日2006年7月28日
發明者俞頌東, 王爭光, 陳阿琴 申請人:浙江大學