A蛋白晶體和交聯晶體及其使用方法

2023-12-09 19:19:06 1

專利名稱：A蛋白晶體和交聯晶體及其使用方法
A蛋白晶體和交聯晶體及其使用方法相關申請的交叉參考
該申請要求於2009年9月15號提交的美國臨時申請第61/242，537號的權益，其公開內容通過引用以其整體結合於本文中。背景
A蛋白是最初在細菌金黃色葡萄球菌{Staphylococcus aureus)的細胞壁中發現的40-60 kDa表面蛋白。由於其結合免疫球蛋白的能力，所以其可用於生化研究。A蛋白結合來自許多哺乳動物物種的蛋白，最著名的是IgG。其通過與重鏈相互作用，與免疫球蛋白的Fe區結合。重組的葡萄球菌A蛋白往往在大腸肝菌(JL coif)中生產用於免疫學及其它的生物研究。A蛋白常與其它分子例如螢光染料、酶、生物素、膠體金或放射性碘偶聯而不影響抗體結合位點。其還廣泛用於與磁珠、膠乳珠粒和瓊脂糖珠粒偶聯。A蛋白常固定化於固相 支持體上並用作用於從粗製蛋白混合物例如血清或腹水液中純化總IgG的可靠方法，或與以上標記物中的一種偶聯以檢測抗體的存在情況。利用與珠粒綴合的A蛋白的免疫沉澱研究也常用於通過針對目的蛋白或蛋白複合體的抗體間接地純化蛋白或蛋白複合體。此外，其廣泛用於來自多種來源的單克隆抗體的純化。發明簡述
本發明部分涉及A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)的製備，例如生產以便開發用於抗體的純 化的革新A蛋白系統(例如色譜系統)。A蛋白CLPC提供了高度濃縮的A蛋白活性聯合高穩定性和耐化學性的優點。濃縮的A蛋白的濃度減小了柱的大小(若使用的話)、緩衝液體積和處理時間。此外，A蛋白晶體的交聯可防止或減少例如免疫球蛋白(例如抗體)的純化(例如，使用色譜)期間A蛋白的浸出(leaching)。總之,這可減少抗體生產時間和成本。本發明涉及A蛋白的晶體及其交聯形式(「A蛋白-CLPC或CLPC」)或其衍生物及其在純化免疫球蛋白/抗體或相應的Fab片段或Fe片段(例如來自細胞培養物的多克隆抗體、單克隆抗體；治療性抗體；來自細菌培養物、血清、血漿的抗體)中的用途，A蛋白的此類晶體用於免疫沉澱和體外裝置的用途。本文公開了包含A蛋白的結晶形式的組合物。該實施方案為包含A蛋白的交聯晶體(CLPC)形式的組合物。在另一個實施方案中，A蛋白晶體用戊二醛交聯。在一些實施方案中，A蛋白晶體用約0. 02%-約4% (重量體積比)的戊二醛交聯。在又另外的實施方案中，A蛋白晶體用約1.00% (重量體積比)的戊二醛交聯。本文公開的組合物比A蛋白的非結晶形式更有活性，因為其具有更高的結合容量。在該實施方案中，A蛋白的結晶形式的結合容量在pH 7下比可溶的固定化形式的結合容量聞至少約100%。在又一個實施方案中，交聯的A蛋白晶體具有A蛋白的非晶體固定化形式的結合容量的至少約150%。在本發明的實施方案中，本發明的A蛋白晶體在約pH 2-約pH 12是穩定的(保
持其結合容量)。在另一個實施方案中，本文公開的A蛋白晶體與固定化的非晶體A蛋白相比具有
0. 0%蛋白浸出。
本文還公開了晶體A蛋白組合物在預填充柱中作為柱材料或在膜(浸潰的)中或在體外裝置中的用途。在本發明的又一個實施方案中，本文公開了包含在此公開的晶體A蛋白組合物的試劑盒。此類試劑盒可包含其它試劑、純化裝置以及使用本文所述的晶體A蛋白組合物的說明書。在一個實施方案中，晶體A蛋白可預填充於柱中用作抗體和抗體片段的純化材料，例如從哺乳動物細胞培養物中純化單克隆抗體、純化表達於轉基因奶中的單克隆抗體或純化血清中產生的多克隆抗體。本文還公開了從重組的可溶性A蛋白中產生蛋白晶體的方法。本文還公開了包含A蛋白晶體及其交聯形式("CLPC")的組合物，例如藥物組合物。
在一個方面，本發明提供了交聯A蛋白晶體。交聯劑可為多功能的，並且在某些實施方案中，該試劑為雙功能試劑，例如戊二醛。在某些實施方案中，A蛋白晶體用基本不改變結合容量的濃度的戊二醛交聯，例如以至少約0.02%(重量體積比)的濃度。在一些實施方案中，A蛋白晶體的交聯水平等於通過用0. 02%(重量體積比)戊二醛進行的處理產生的交聯水平。交聯水平可通過本領域已知或本文公開的方法例如確定蛋白浸出的水平來確定。本發明還提供了 A蛋白晶體，例如與可溶性A蛋白相比具有較高結合容量例如高至少約100%、200%、300%、400%、500%或更多的A蛋白晶體。本發明還提供穩定化例如交聯的A蛋白晶體，其中所述穩定化晶體在酸性條件下保留的結合容量和/或穩定性為相似的酸性條件(例如在約2-3的酸性pH)下由可溶性A蛋白保留的結合容量和/或穩定性的至少2倍、3倍。在一些實施方案中，在酸性條件下穩定化A蛋白晶體具有比可溶性A蛋白多至少約200%、300%、400%的結合容量和/或穩定性。本發明還提供穩定化例如交聯的A蛋白晶體，其中在蛋白酶存在下所述穩定化晶體保留的結合容量和/或穩定性為相似條件下由可溶性A蛋白保留的結合容量和/或穩定性的至少2倍、3倍。在一些實施方案中，穩定化A蛋白晶體在蛋白酶存在下具有比可溶性A蛋白多至少約200%、300%、400%的結合容量和/或穩定性。所述蛋白酶可選自例如胃蛋白酶、糜蛋白酶或胰酶中的一種或多種。在其它的實施方案中，穩定化或可溶性A蛋白的結合容量在將穩定化晶體或可溶性A蛋白暴露至酸性條件和/或蛋白酶達預定時間長度(例如至少一、二、三、四或五小時)後檢測。在相關方面，本發明表徵了一種交聯的A蛋白晶體，其在可變的pH條件(例如約pH 2.0或3至約pH 7. 5或約pH 8. 5至約pH 10-14)下和/或蛋白酶(例如蛋白酶可選自以下的一種或多種胃蛋白酶、糜蛋白酶或胰酶)存在下基本穩定。在又另外的實施方案中，交聯晶體在酸性條件(例如約2-3的酸性pH)下和存在如本文所述的蛋白酶下保留其結合容量為由可溶性A蛋白保留的結合容量的至少約2倍、3倍。在另外的實施方案中，穩定化A蛋白晶體在酸性條件(例如約2-3的酸性pH)下和存在如本文所述的蛋白酶下比可溶性A蛋白更穩定至少200%、300%、400%。本文還公開了包含所述晶體和/或交聯的A蛋白晶體的組合物例如藥物組合物。在一些實施方案中，所述晶體包含具有與天然來源例如金黃色葡萄球菌或相關菌株中存在的A蛋白序列相同或基本相同的序列的A蛋白。在其它的實施方案中，A蛋白通過重組的方式產生。在另一個方面，本發明提供浸潰有交聯蛋白晶體的膜、生產及使用所述膜的裝置、系統和方法用於各種合適的應用，包括，例如抗體和抗體片段的純化以及透析治療期間免疫球蛋白的去除。在這點上，本發明的A蛋白浸潰膜可結合抗體和抗體片段。這可有效使純化所需的緩衝液的量最小化，從而最大限度降低成本。在另一個實施方案中，本發明提供了包含浸潰有約3. 25mg/cm2或更少交聯蛋白晶體的膜的材料。優選地，膜用交聯A蛋白晶體(「A蛋白CLPC」)浸潰。用A蛋白-CLPC浸潰的膜可用於分離和純化免疫球蛋白並可類似於固定化A蛋白重複使用。
在又一個實施方案中，本發明提供了生產浸潰有交聯蛋白晶體(優選A蛋白-CLPC)的膜的方法。該方法包括製備制膜液。所述制膜液包含含聚合物基質材料(例如聚氨酯)的溶劑例如I-甲基-2-吡咯烷酮(「NMP」)、二甲基甲醯胺(「DMF」)等或其組合。所述制膜液還可包含填充劑例如氧化鋯和試劑例如聚乙烯吡咯烷酮(「PVP)以使膜更親水。接著將制膜液與適量的A蛋白-CLPC混合，使得將所述膜用約3. 25mg/cm2的A蛋白-CLPC浸潰。然後可將該溶液散布於支持材料(例如合成的網狀材料)上，並在合適的條件下浸於含水介質中，從而形成膜沉澱物。隨後將所述膜沉澱物在甘油溶液(優選40:60比率的甘油和水的混合物)中乾燥。本發明的一個優點在於提供了改良的蛋白浸潰膜，其適用於各種不同的應用例如抗體純化和免疫沉澱。本發明的另一個優點在於提供了改良材料，其與固定化A蛋白不同，能夠結合抗體而無需任何惰性支持物。在又一個方面，本發明提供了一種通過給予包含如本文所公開的A蛋白晶體例如交聯A蛋白晶體的組合物例如藥物組合物來降低受試者中的免疫球蛋白濃度(與升高的免疫球蛋白濃度相關的病症)的方法。在該方面的一個實施方案中，A蛋白晶體通過交聯劑例如戊二醛來穩定。組合物的給予可導致免疫球蛋白濃度減少至少約10%、至少約20%、至少約30 %、或至少約40 %或更多。在一些實施方案中，所述組合物通過口服或經由體外裝置給予。在另一個實施方案中，體外裝置為導管，例如塗布有A蛋白晶體的導管。在又一個實施方案中，降低哺乳動物中的免疫球蛋白濃度的方法包括測定哺乳動物生物樣品(例如血液、血漿或血清樣品)中的免疫球蛋白濃度的步驟。在另一個方面，本發明提供了包含A蛋白晶體例如交聯A蛋白(例如如本文公開的晶體和/或交聯晶體)的組合物，例如藥物組合物。在又一個方面，本發明提供了一種治療哺乳動物的方法，所述方法通過給予有效量的包含A蛋白晶體例如交聯A蛋白晶體(例如如本文公開的晶體和/或交聯晶體)的藥物組合物/將有效量的所述藥物組合物作為在透析裝置(體外裝置)中的吸附劑來進行。在又一個實施方案中，結晶步驟包括濃縮純化的蛋白，接著加入沉澱試劑從而形成結晶蛋白。所述結晶步驟還可包括使結晶蛋白與交聯劑例如本文公開的交聯劑(例如戊二醛)接觸。所用交聯劑的濃度可為約0. 01%-20%重量體積比；典型地約0. 02%-10%重量體積比；更典型地約0. 02%、0. 5%或1%重量體積比。 在其它的實施方案中，製備中結晶蛋白的收率為可溶性A蛋白懸浮液中存在的特定蛋白的至少約50%、60%、70%、80%。在其它實施方案中，結晶蛋白的收率為可溶性製備物中存在的特定蛋白的至少約90%、95%或更高。在又另外的實施方案中，結晶蛋白的收率為可溶性製備物中存在的特定蛋白的至少約50%、60%、70%、80%。本發明還提供了由本文公開的方法產生的蛋白晶體(例如A蛋白晶體)。在一些方面，本公開內容表徵了 A蛋白晶體。在一些方面，本公開內容表徵了 A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)，例如，如本文所述交聯的A蛋白交聯蛋白晶體。在一些方面，本公開內容表徵了包含A蛋白晶體和另一種成分(例如緩衝液，例如Tris緩衝液)的組合物。在一些方面，本公開內容表徵了包含A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)和另一種成分 (例如緩衝液，例如Tris緩衝液)的組合物。在一些方面，本公開內容表徵了製備例如如本文所述的A蛋白晶體的方法。在一些方面，本公開內容表徵了包含製備例如如本文所述的A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)的方法。在一些方面，本公開內容表徵了包含A蛋白晶體和另一種組分(例如使用說明書)的試劑盒。在一些方面，本公開內容表徵了包含A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)和另一種組分(例如使用說明書)的試劑盒。在一些方面，本公開內容表徵了使用例如如本文所述的A蛋白晶體例如以純化免疫球蛋白例如抗體(例如治療性抗體)的方法。在一些實施方案中，防止或減少A蛋白的浸出(例如相比於相同條件下使用非晶體形式的A蛋白時的浸出量減少了約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%或減少至約1/2、約1/5或約1/10)。在一些方面，本公開內容表徵了使用例如如本文所述的A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)例如以純化免疫球蛋白例如抗體(例如治療性抗體)的方法。在一些實施方案中，防止或減少A蛋白的浸出(例如相比於相同條件下使用非晶體形式的A蛋白時或非交聯形式的A蛋白晶體時的浸出量減少了約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%或減少至約1/2、約1/5或約1/10)。在一些方面，本公開內容表徵了使用例如如本文所述的A蛋白晶體例如以純化免疫球蛋白例如抗體(例如治療性抗體)的方法。在一些實施方案中，每mL A蛋白的結合容量增加了(例如相比於固定化條件(例如使用支持物)下使用非晶體形式的A蛋白時的結合量增加了約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%或更多或者增加至約2倍、約5倍或約10倍或更多)。在一些方面，本公開內容表徵了使用例如如本文所述的A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)例如以純化免疫球蛋白例如抗體(例如治療性抗體)的方法。在一些實施方案中，A蛋白的結合容量增加了(例如相比於固定化條件(例如使用支持物)下使用非晶體形式的A蛋白時或非交聯形式的A蛋白晶體時的結合量增加了約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%或更多或增加至約2倍、約5倍或約10倍或更多)。
在一些方面，本公開內容表徵了包含A蛋白晶體的柱(例如層析柱)。在一些方面，本公開內容表徵了包含A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)的柱(例如層析柱)。在一些方面，本公開內容表徵了包含A蛋白晶體的膜(例如全纖維(holofiber)系統)。在一些方面，本公開內容表徵了包含A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)的膜(例如全纖維系統)。本文公開了使A蛋白結晶的方法，其中使A蛋白溶解或濃縮，和向溶解或濃縮的蛋白加入沉澱試劑以形成晶體。本文公開了純化免疫球蛋白的方法，其包括以下步驟(a)將包含免疫球蛋白的 介質與具有在約pH 7. 0-pH 10範圍內的pH並包含陽離子和陰離子的組合的緩衝溶液混合，以提供緩衝的免疫球蛋白介質；(b)將所述緩衝的免疫球蛋白介質與固定化A蛋白(A蛋白-CLPC :通過使A蛋白分子結晶和交聯來固定化A蛋白)吸附劑接觸以在所述固定化A蛋白吸附劑上吸附所述緩衝的免疫球蛋白介質中存在的免疫球蛋白；(c)用所述緩衝溶液洗滌其上吸附有免疫球蛋白的A蛋白-CLPC吸附劑；(d)將其上吸附有免疫球蛋白的所述A蛋白-CLPC吸附劑與具有約pH 2-pH 6範圍內的pH的緩衝溶液接觸以從A蛋白-CLPC吸附劑中移出被吸附的免疫球蛋白；和(e)以基本純的形式回收移出的免疫球蛋白。在該方法的另一個實施方案中，所述方法在包含本文所述的A蛋白的晶體組合物的柱中完成。在該方法的又一個實施方案中，緩衝的免疫球蛋白介質與A蛋白-CLPC吸附劑的接觸在包含A蛋白-CLPC吸附劑的柱中完成。在該方法的另一個實施方案中，包含免疫球蛋白的介質為正常的哺乳動物血清、或免疫哺乳動物血清，例如血漿或腹水液。在其它的實施方案中，免疫球蛋白介質獲自雜交瘤、組織培養液、細胞培養液、哺乳動物細胞培養液、細菌細胞培養液、轉基因來源的液體、植物提取物或酵母培養液。在純化方法的一些實施方案中，緩衝溶液具有在約pH 7.0-約pH 10範圍內的PH並且所述緩衝溶液為甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液、三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液或磷酸鹽緩衝液。在純化方法的又另外的實施方案中，緩衝溶液具有約0. OlM-約0. 25M或約0. 05M-約0. 5M的濃度範圍。在純化方法的又另外的實施方案中，緩衝溶液具有在約pH 2-約pH 6範圍內的pH並具有約0. OlM-約0. 25M的濃度。在純化方法的一些實施方案中，緩衝溶液為醋酸-醋酸鹽緩衝液並具有在約pH 2-約pH 6範圍內的pH。在純化方法的另一個實施方案中，緩衝溶液包含約I. OM-約I. 5M濃度的鉀離子和磷酸根離子。在純化方法的另一個實施方案中，緩衝溶液包含約I. OM-約I. 5M濃度的銨離子和磷酸根離子。在純化方法的又一個實施方案中，緩衝溶液包含約I. OM-約I. 5M濃度的銨離子和硫酸根離子。在純化方法的一些實施方案中，緩衝溶液包含約I. OM-約I. 25M濃度的鈉離子和硫酸根離子。在又另外的實施方案中，緩衝溶液包含約I. OM-約I. 25M濃度的鈉離子、磷酸根離子和氯離子。在該純化方法的又另外的實施方案中，固定化A蛋白吸附劑為不含任何支持物的結晶和交聯的A蛋白。在又另外的實施方案中，所述吸附劑為與磁性顆粒連接的不含任何支持物的結晶和交聯的A蛋白。本文公開了利用A蛋白層析法從汙染溶液中來純化蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a)將待純化的蛋白吸附至固定的固相結晶並交聯的A蛋白；(b)通過用具有約5-約7範圍內的pH並包含選自氯化四甲銨(TMAC)、氯化四乙銨(TEAC)、氯化四丙銨和氯化四丁銨的電解質的電解質溶劑洗滌固相，來移除與固相結合的汙染物；和(c)從固體中回收蛋白。在該方法的一些實施方案中，待純化的蛋白為免疫球蛋白、抗體或其片段。在該方法的又另外的實施方案中，待純化的蛋白為多克隆抗體、單克隆抗體或嵌合抗體或其片段。在該方法的另外的實施方案中，所述固相為在柱中的結晶A蛋白或在柱中的結晶交聯A蛋白。在從汙染溶液中純化蛋白的方法的一些實施方案中，所述電解質溶劑包含氯化四甲銨(TMAC)或氯化四乙銨(TEAC)。在該方法的又另外的實施方案中，電解質溶劑中電解質的濃度為約0. I-約I. 0 M或約0. 25-約0. 5 M0在從汙染溶液中純化蛋白的方法的另外實施方案中，汙染物為中國倉鼠卵巢蛋 白(CHOP)。在該方法的一些實施方案中，汙染溶液包含含重組抗體的收穫的細胞培養液(HCCF)。在從汙染溶液中純化蛋白的方法的實施方案中，步驟(C)的洗脫緩衝液涉及用具有約2. 0-約5. 0或約2. 5-約3. 5範圍內的pH的洗脫緩衝液來洗脫蛋白。本文公開了一種利用A蛋白層析法純化由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生的蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a)將蛋白吸附至通過使A蛋白結晶和交聯產生固相而完成固定化的A蛋白；(b)通過用包含選自氯化四甲銨(TMAC)、氯化四乙銨(TEAC)、氯化四丙銨和氯化四丁銨的電解質的電解質溶劑洗滌固相，來移除與固相結合的中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)汙染物；和(c)從固相中回收蛋白。本文還公開了一種利用A蛋白層析法純化由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生的蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a)將蛋白吸附至通過結晶和交聯產生固相而完成固定化的A蛋白；(b)通過用具有約5-約7範圍的pH並包含選自氯化四甲銨(TMAC)、氯化四乙銨(TEAC)、氯化四丙銨和氯化四丁銨的電解質溶劑的電解質溶劑洗滌固相，來移除與固相結合的中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)汙染物，其中所述電解質溶劑中電解質的濃度為約0. 25-約0. 5M;和(c)從固相中回收蛋白。本文公開了一種治療哺乳動物中與升高的免疫球蛋白濃度相關的病症的方法，所述方法包括以足以減少與所述病症相關的一種或多種症狀的量將A蛋白晶體給予哺乳動物。在該方法的一些實施方案中，所述病症與免疫功能相關。本文公開了一種生產膜的方法，所述方法包括以下步驟(a)製備由含聚合物基質材料的溶劑組成的制膜液；(b)向制膜液中加入足量的交聯蛋白晶體；(c)將制膜液施用於支持材料上；(d)將制膜液和支持材料浸入含水介質中；(e)形成膜複合材料；(f)用流體介質乾燥膜複合材料。在該方法的一些實施方案中，所述聚合物基質材料由合適的聚合物(包括聚氨酯)組成。在該方法的又另外的實施方案中，所述交聯蛋白晶體包含選自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其組合。在該方法的又另外的實施方案中，所述溶劑選自I-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基甲醯胺及其組合。在該方法的一些實施方案中，所述流體介質包含甘油。
公開了生產A蛋白浸潰的膜的方法，所述方法包括以下步驟(a)形成包含含聚氨酯和填充劑的溶劑的制膜液；(b)將A蛋白-CLPC加入制膜液中；(c)在含水介質中處理制膜液；(d)形成用A蛋白-CLPC浸潰的膜沉澱物。在該方法的一些實施方案中，填充劑選自氧化鋯、磷酸鋯、碳及其組合。在另一個實施方案中，生產浸潰膜的方法包括用甘油溶液乾燥膜沉澱物的另外的步驟。本文公開了能夠在透析治療期間從透析液或體液中移除免疫球蛋白的材料，所述材料包括浸潰有交聯蛋白晶體的膜，其中所述膜已用流體介質乾燥。在該方法的一個實施方案中，所述交聯蛋白晶體包含選自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其組合。在又另外的實施方案中，所述膜包含選自氧化鋯、磷酸鋯、碳及其組合的填充劑。在該方法的又另外的實施方案中，所述流體介質包含甘油。
本文公開了從在透析治療期間使用的透析液或體液中移除免疫球蛋白的裝置，其中所述裝置包含限定具有入口和出口的內部的機體，所述內部包含浸潰有交聯蛋白晶體的膜層，其中所述膜已用流體介質乾燥。在該裝置的一些實施方案中，交聯蛋白晶體包含選自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其組合。在該裝置的另外的實施方案中，所述流體介質包含甘油。本文公開了一種提供透析治療的系統，該系統包含能夠在透析期間移除免疫球蛋白的裝置，其中所述裝置包含限定具有入口和出口的內部的機體，所述內部包含浸潰有交聯蛋白晶體的膜層，其中所述膜已用流體介質乾燥。在該系統的實施方案中，交聯蛋白晶體包含選自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其組合。在另外的實施方案中流體介質包含甘油。本文公開了一種提供透析治療的方法，所述方法包括以下步驟(a)將透析液或體液通過包含浸潰有交聯蛋白晶體的膜層的裝置，其中所述膜已用甘油溶液乾燥，和(b)從透析液或體液中移除治療有效量的免疫球蛋白。在該方法的實施方案中，交聯蛋白晶體包含選自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其組合。本文公開了包含A蛋白的結晶形式的組合物。在一些實施方案中，A蛋白的來源是金黃色葡萄球菌菌株。在又另外的實施方案中，A蛋白通過重組的方法產生或為化學合成的。在一些實施方案中，A蛋白具有全長的天然蛋白序列。在又另外的實施方案中，A蛋白包含至少一個抗體結合域。在又另外的實施方案中，A蛋白是化學修飾的。在另外的實施方案中A蛋白具有突變或為天然A蛋白的功能性衍生物。本文公開了包含A蛋白的交聯結晶形式的組合物。在一些實施方案中，所述組合物用戊二醛交聯。本文公開了一種純化免疫球蛋白的方法，所述方法包括使所述免疫球蛋白與包含A蛋白的結晶形式和/或A蛋白的交聯結晶形式的組合物結合的步驟。在一些實施方案中，所述免疫球蛋白為抗體、單克隆抗體、Fab片段、Fe片段、單鏈抗體、嵌合抗體、完全人抗體或人源化抗體。在另外的實施方案中，所述免疫球蛋白屬於IgG類，在該方法的又另外的實施方案中，所述免疫球蛋白是化學修飾的。本文公開了一種利用懸滴蒸汽擴散結晶法或分批結晶法製備A蛋白的結晶形式的方法，所述方法包括以下步驟(a)以1:1蛋白試劑比將A蛋白置於去離子水中，其中所述試劑選自包含2M硫酸銨、0. I M 二甲胂酸鹽緩衝液pH 6. 5和0. 2 M氯化鈉的組合物；包含含2 M硫酸銨的檸檬酸鹽緩衝液pH 5. 5的組合物；包含I M檸檬酸鈉、0. I M Tris-HCl緩衝液PH 7和0. 2 M氯化鈉的組合物；包含含0. 8 M NaH2PO4/1. 2 M K2PO4的0. I M醋酸鹽緩衝液PH 4. 5的組合物；以及包含2M硫酸銨、Tris-HCl緩衝液pH 7和0. 2M硫酸鋰的組合物；和(b)溫育直至形成晶體。在該方法的一些實施方案中，步驟(a)的A蛋白在去離子水中的濃度為約10 mg/ml或約300 mg/ml A蛋白。在該方法的又另外的實施方案中，步驟(a)的A蛋白在去離子水中的濃度為約50 mg/ml或約120 mg/ml A蛋白。本文公開了一種製備A蛋白的交聯結晶形式的方法，所述方法包括將A蛋白的結晶形式與戊二醛混合。在該方法的一些實施方案中，戊二醛的終濃度為約0. 2-約4%。在該方法的另外的實施方案中，戊二醛的終濃度為約1%。本文提及的所有出版物、專利申請、專利及其它參考文獻通過引用以其整體結合。在衝突的情況下，以包括定義在內的本說明書為準。此外，材料、方法和實例僅為闡述性的而並非意指限制。本發明的一個或多個實施方案的細節陳述於附圖
及以下的說明書。 附圖簡述
圖I.懸滴中的A蛋白晶體。用Wizard II結晶篩選將重組A蛋白(120 mg/ml，在DIH2O中)以懸滴結晶。圖2.分批中的A蛋白晶體。用Wizard II結晶篩選將重組A蛋白(53 mg/ml，在H2O中)以I ml批量結晶。圖3.交聯的A蛋白晶體。A蛋白晶體用1%戊二醛交聯20分鐘和用0. 33%戊二醛交聯I小時。發明詳述
本發明涉及包含晶體A蛋白和交聯A蛋白的組合物，以及製備此類晶體組合物的方法和使用此類晶體組合物用於從微生物、血清、血漿、哺乳動物細胞培養物中分離免疫球蛋白/抗體或Fe-片段、Fab片段、單鏈抗體和單克隆抗體的方法。本文所述的晶體組合物具有從在其它物質的混合物中包含免疫球蛋白的液體中通過免疫球蛋白的Fe-部分結合至少一種免疫球蛋白的能力。在不希望受任何特定的理論限制的情況下，本發明特徵在於將包含所述免疫球蛋白/抗體的液體與由晶體交聯A蛋白物質組成的固相接觸，所述晶體交聯A蛋白物質在所述液體中不可溶並且具有至少一個或多個免疫球蛋白或其Fe-片段結合區。免疫球蛋白的Fe-部分或Fe-片段能夠結合A蛋白-CLPC以使所述A蛋白-CLPC與所述免疫球蛋白/抗體的Fe-部分或與Fe-片段結合但不與液體中的汙染物質結合，因此將含剩餘汙染物的液體與固相分離並任選還將被結合的抗體與所述固相分離。本發明的方法與用於相同目的的已知方法不同，因為其避免了，利用除其它之外的離子交換層析以及另外的固相支持體例如瓊脂糖等的複雜多級操作。通過新方法，討論中的免疫球蛋白/抗體/片段以出人意料地純的形式在便利條件下以非常簡單的方式和高收率獲得。討論中的A蛋白-CLPC是極其有價值的，因為其與常規的固定化A蛋白相比能夠以非常高的結合容量特異性地可逆結合免疫球蛋白，這是因為鍵合在免疫球蛋白的Fe-部分處實現。討論中的免疫球蛋白可來源於不同的動物物種，首選脊椎動物，優選哺乳動物。正如已知的，免疫球蛋白可屬於不同的免疫球蛋白類別，例如A類(IgA)、D類(IgD)、E類(IgE)、G類(IgG)和M類(IgM)。本發明的一個有價值的方面在於其可與能夠將其自身與屬於IgG類的免疫球蛋白結合的A蛋白-CLPC結合應用，因為該類別尤其在數量上在免疫球蛋白中佔主導。免疫球蛋白的Fe-部分可通過已知的酶方法從其中分裂出，從而獲得游離的Fe-部分。特定的免疫球蛋白的Fe-部分在不同的動物物種中常常結構相似。因為例如來自金黃色葡萄球菌的A蛋白與IgG的Fe-部分反應，本發明的方法常常能夠使不同動物物種的IgG彼此替換。依照本發明，多肽(A蛋白-CLPC)可為來自金黃色葡萄球菌的所謂A蛋白或所述蛋白的片段，所述片段具有多肽性質並且具有在免疫球蛋白的Fe-部分結合至少一種免疫球蛋白的能力。來源於金黃色葡萄球菌的所述多肽(A蛋白及片段)可在屬於IgG類的免疫球蛋白的Fe-部分結合所述免疫球蛋白。其它的實例為來自表皮葡萄球菌{Staphylococcus epidermidis)和來自其它細菌菌株的多妝。
依照本發明，當實施方法時應使用不可溶於液體的A蛋白-CLPC(聚合物質)，其中所述聚合物質具有至少一個免疫球蛋白或其Fe-片段結合區。因此所述A蛋白-CLPC在洗滌操作期間不能從固相中溶解出來或從其中移除。優選A蛋白-CLPC通過經由共價性質的鍵的方式交聯A蛋白晶體而形成。A蛋白-CLPC可用於由預填充於柱中的晶體微顆形式的交聯A蛋白組成的柱中，所述柱提供對來自不同來源的多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片段的簡易親和純化。晶體交聯A蛋白用交聯方法製備，這導致優良的蛋白穩定性和結合特性。所述柱預期用於傳統的重力流程序。或者，可通過使多肽例如蛋白與聚合物結合時常規使用的方法(例如通過滷化氰、異氰酸酯等)，將A蛋白-CLPC與聚合物(固體表面)或磁性顆粒結合。所用的不溶性聚合物可為通常可用於相似目的的那些，即具有當將蛋白與聚合物結合時可使用的官能團的聚合物。此類官能團的實例為羥基、巰基、伯氨基和仲氨基、羰基、醯肼基、重氮基和羧基。當通過常規方法形成從聚合物到蛋白的橋時可使用這些基團，在本情況中所述蛋白為A蛋白-CLPC然而，不溶於所用液體中的聚合物可在所述液體中溶脹。例如當使用含水液體時其可在水中溶脹。所述聚合物可由例如通過交聯聚合物(例如多糖)獲得的三維網絡組成。因此，可使用非常不同的聚合物，例如纖維素、瓊脂糖、聚氨基苯乙烯、交聯聚合物(例如交聯的多糖例如用環氧氯丙烷(Sephadex )或雙環氧化合物(例如用1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚)交聯的葡聚糖)或者澱粉或纖維素衍生物或者用環氧氯丙烷或雙環氧化合物交聯的聚乙烯醇。其它實例為通過將四亞乙基五胺或六亞甲基二胺與環氧氯丙烷或雙環氧化合物反應獲得的不溶聚合物。另一個實例為被對氨基苯基取代的交聯聚丙烯醯胺聚合物(Enzacryl )。所述固相可以晶體交聯A蛋白存在或包埋於聚合物或膜中。在許多情況下使用微粒形式的A蛋白可為合適的。其他實例包括結合有A蛋白-CLPC以純化免疫球蛋白或其Fe-片段(例如IgG或其Fe-片段)的聚合物試管壁。通過本文所述方法將相關免疫球蛋白/抗體/片段從其中分離的物質，可具有廣泛不同的特性。因此，此類免疫球蛋白可從來自產生相關抗體的微生物的多肽(例如蛋白)、多糖、核酸或低分子量物質中純化出。
本發明的方法在液體存在下進行。所用液體首選為含水液體，例如具有合適的pH例如接近中性點pH的含水緩衝的NaCl溶液。根據本發明與A蛋白-CLPC結合的相關抗體/其片段可在溫和條件下易於從CLPC中釋放出來，例如通過改變pH或離子強度。本文所述的A蛋白晶體(A蛋白-CLPC)可結合抗體或其Fab片段，並可在無需任何固相支持體的情況下用於自多種來源純化或用於多種來源的免疫學或免疫沉澱研究。A蛋白晶體(A蛋白-CLPC)還可在哺乳動物中通過體外裝置中的免疫吸附來減少血漿中的免疫循環複合體或IgG。本文描述了用A蛋白/CLPC晶體來純化抗體的方法。此外，提供了 A蛋白晶體和交聯晶體(CLPC)，以及包含和使用所述晶體的組合物。還公開了從A蛋白的可溶形式生產大量的蛋白晶體/CLPC的方法。
為了使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。另外的定義闡述於整個詳述中。本文所用「完全抗體或抗體片段」意指本發明的完全抗體或抗體片段例如單鏈Fv片段或Fab抗體片段，為功能性抗體或抗體片段，即在體外或體內能夠識別並結合其特異性抗原，並且可以起始與抗體結合相關的任何後續作用，例如直接的細胞毒性、補體依賴的細胞毒作用(CDC)、抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。術語「抗體」意指分子量約150kD的糖蛋白，其由脊椎動物的免疫系統的體液支臂應答於體內存在的外來分子而產生。抗體對於微生物(例如寄生蟲、細菌和病毒)的感染的預防和消退是必不可少的。抗體通過以高度特異的方式識別和結合蛋白(或有時，包括多糖、糖蛋白、脂質或核酸在內的其它有機分子)構型(被稱為抗原(或表位)，包括入侵的微生物及其產物上的那些)來行使該功能。抗體通過抗體上被稱為抗原結合位點的高變域與表位本身之間高度特異的相互作用來結合其靶抗原。在與抗原結合後，抗體激活免疫系統中一種或多種有助於中和、破壞和消除感染微生物或其它含抗原實體例如癌細胞的許多效應系統。抗體還通過其特異性結合和隨後中和涉及疾病狀態的細胞靶標，來用於癌症、炎症、心血管疾病和移植排斥的治療，例如，單克隆抗體英利昔單抗結合腫瘤壞死因子並通過阻斷其與細胞表面受體的相互作用中和其在炎症中的作用；而利妥昔單抗通過結合惡性B淋巴細胞的細胞表面的CD20抗原來靶向惡性B淋巴細胞。單個抗體分子具有由彼此共價結合的兩條完全相同的重鏈(各自分子量為約50kD)和各自共價結合一條重鏈的兩條完全相同的輕鏈(各自分子量為約25kD)構成的結構。四條鏈以經典的「Y」基序排列。「Y」底部的「腿」被稱作Fe區(「c」表示「可結晶的」或「結合補體的」)並用於錨定細胞膜內的抗體，並且還結合巨噬細胞和激活補體。「Y」頂部的兩條「臂」被稱作Fab區(「ab」表示「結合抗原的」)。Fab區各自包含恆定區(在Fab區與Fe區的連接處)和可變區(其延伸至「Y」的尖端)。可變區各自在「Y」的各尖端包含完全相同的抗原結合位點(可變區內被稱為「高變」區的區域處)。因此，Fab區各自具有一個抗原結合位點，因此完整的抗體分子有兩個抗原結合位點(即為「二價的」)。天然存在的抗體上的兩個抗原結合位點彼此完全相同，因此該抗體對一種抗原有特異性(即為「單價的」)。迄今已分離抗體分子的許多分子片段。這些天然並不存在，但工程改造自一種或多種完整的抗體分子。這些片段包括Fab片段(通過用酶木瓜蛋白酶進行的消化分離自完整抗體的單個Fab)以及F(ab』)2片段(彼此共價結合的兩個Fab，通過用酶胃蛋白酶消化抗體產生)。Fab片段是單特異性的，而F(ab』)2片段是雙特異性的。近來，已引入許多工程改造的抗體片段。這些包括雙鏈Fv(dSFv)片段和單鏈Fv(ScFv)片段(在兩種情況下「v」表示「可變的」)。dsFv片段由Fab片段減去恆定區組成，即僅由彼此共價結合的重鏈和輕鏈的可變區組成。scFv片段為單個多肽鏈，由經由肽接頭與輕鏈可變區連接的重鏈可變區組成。典型地，dsFv片段和scFv片段兩者均為單價的(因此單特異性的)。然而，兩個dsFv片段或兩個scFv片段它們自身可連接形成雙特異性片段(其與無恆定區的F(ab』)2片段類似)。此外，可連接具有不同抗原結合位點(即不同特異性)的兩個dsFv片段或scFv片段，以形成雙特異性片段。此類片段可用作研究工具或治療試劑或診斷試劑。人中有五類抗體(也被稱作免疫球蛋白):IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其各自具有 其自己獨特的特徵和功能。IgG、IgD和IgE全部由一個抗體分子組成，而IgA可由一個、兩個或三個此類分子組成，IgM由五個此類分子組成。此外，在人中，IgG有四個亞類(IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)，IgM和IgA各自有兩個亞類(分別為I和2)。例如，單克隆抗體利妥昔單抗(Rituxan )為IgGl抗體。儘管天然存在的抗體來源於單一物種，但工程改造的抗體及抗體片段可來源於多於一種動物物種，即可為嵌合的。迄今，已產生小鼠(鼠)/人嵌合抗體，但其它物種的組合是可能的。嵌合抗體已進一步被分為兩個亞型嵌合的和人源化的。嵌合的鼠/人抗體包含分別約75%人和25%小鼠的胺基酸序列。人的序列代表抗體的恆定區，而小鼠的序列代表抗體的可變區(因而包含抗原結合位點)。使用此類嵌合體的理論根據在於保留小鼠抗體的抗原特異性但減少小鼠抗體的免疫原性(鼠抗體可在除小鼠外的物種中引起針對其的免疫應答)，從而能夠在人類治療中採用該嵌合體。嵌合抗體還包括含有來自不同人抗體的CDR區的那些。CDR區，也被稱為高變區，為抗體分子可變區內產生抗原結合位點的序列。CDR區如此命名是因為結合位點在形狀和電荷分布上與抗原上識別的表位互補。或者，嵌合抗體包含來自一種抗體的框架區和來自另一種抗體的CDR區。嵌合抗體還包括含有來自至少兩種不同的人抗體的⑶R區的那些。人源化抗體包含約90% (或更多)的人的胺基酸序列。唯一存在的鼠序列為高變區的序列(其為可變區內包含的實際的抗原結合位點)。人源化抗體與嵌合抗體相比具有最小的小鼠的免疫原性。通常有兩種類型的抗體多克隆抗體和單克隆抗體，其可通過其特異性區分。多克隆抗體為作為血液的免疫球蛋白部分存在的抗體，基本上為對個體已暴露的不同抗原有特異性的許多不同類型的抗體的多克隆混合物(即其起源於B淋巴細胞(B細胞)(即產生抗體的細胞)的許多不同的克隆)。單克隆抗體為單一特異性的抗體，即其來源於B淋巴細胞(B細胞)的單一克隆。這些抗體對其靶抗原具有強烈的特異性並且還可高量(即高滴度)生產。它們可用作特異性抗原(例如，癌抗原)的標記物、診斷劑(例如，在檢測病毒如HLV-I的測定中)和治療齊U。完全的單克隆抗體為具有包含兩條完整重鏈和兩條完整輕鏈的典型分子結構的那些。這區別於抗體片段，例如Fab、F(ab』)2、Fc片段、dsFv片段和scFv片段。傳統上，單克隆抗體通過使產抗體的B細胞與永生化雜交瘤細胞融合以得到B細胞雜交瘤來產生，所述雜交瘤在細胞培養物中持續產生單克隆抗體。傳統上用於得到單克隆抗體的另一種方法涉及用噬菌體展示技術在細菌細胞培養物中表達單克隆抗體。然而，目前，單克隆抗體可在遺傳修飾的動物和植物中在體內大量產生，所述動物為例如牛和山羊(Genzyme Transgenics)、豬和兔(Medarex, PPL Therapeutic)以及雞(Tranxenogen),所述植物為例如菸草和玉米(Epicyte, Integrated Protein Technologies, MeristemCroptech,和其他)。例如，大量單克隆抗體可存在於遺傳修飾的山羊(GenzymeTransgenics)的奶中。根據本發明，A蛋白-CLPC可用於純化所有此類來源的抗體。此外，作為轉基因的結果，已修飾小鼠以包含並表達整個人B細胞基因組(其編碼人抗體)。因此，此類轉基因小鼠(Abgenix)為可用本發明的A蛋白-CLPC純化的人抗體的來源。應注意的是，糖基化對產抗體的動物是特異的。例如，非人來源的人抗體具有精細地不同的糖基化概況。因此，本發明的完全抗體或單鏈Fv抗體片段或Fab抗體片段可顯示修飾的糖基化或去糖基化。可用本發明A蛋白-CLPC純化的抗體也包括衍生化抗體。此類抗體包括用聚乙二醇或至少一個碳水化合物部分或至少一個甲基或乙基衍生的那些。臨床相關的抗體也可根據其待應用的治療領域將其分類。這樣的抗體包括例如，用於治療癌症(例如胰腺癌)、炎性疾病(如自身免疫性疾病、關節炎)、心血管疾病(例如 中風)、感染性疾病(例如HIV/AIDS)、呼吸系統疾病(例如哮喘)、組織移植排斥和器官移植排斥的抗體。此類抗體還包括用於放射免疫治療的抗體。可根據本發明純化的抗體包括例如阿昔單抗、帕利珠單抗、莫羅單抗-CD3、吉妥珠單抗、曲妥珠單抗、巴利昔單抗、達克珠單抗、依那西普和替伊莫單抗。本文所用「含水有機溶劑的混合物」意指包含n%有機溶劑和水的混合物，其中 n 為 1-99，m 為 100_n。本文所用「生物相容的聚合物」意指非抗原性(當不用作佐劑時)、無致癌性、無毒且不另外固有地與活生物體不相容的聚合物。實例包括聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(縮酚肽)、聚(酯)例如聚(乳酸)或PLA、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(￠-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)和聚(二噁虼S4 );聚乙二醇、聚((羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚[(有機)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、馬來酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycan)、硫酸化多糖、其混合物和共聚物。本文所用「生物可降解的聚合物」意指被水解或溶解降解的聚合物。降解可為不均質的(主要發生於顆粒表面)或為均質的(在聚合物基質各處均勻降解)。本文所用「生物樣品」是從細胞、組織、器官或生物體中收集例如以檢測分析物的生物材料。示例性生物樣品包括流體、細胞或組織樣品。生物流體包括例如血清、血液、血眾、唾液、尿液或汗液。細胞或組織樣品包括活組織檢查、組織、細胞懸浮液或其它樣本和樣品，例如臨床樣品。本文所用共聚物意指用多於一種單體物類製得的聚合物。本文所用乳化劑為減少聚合物塗布的晶體和溶液之間的界面張力的表面活性劑。「晶體」為物質固態的一種形式，包含以在三維中周期性重複的模式排列的原子(參見例如，Barret, Structure of Metals (金屬結構)，第二版，McGraw-Hill, New York(1952))。多肽的晶體形式例如有別於第二種形式無定形固態。晶體顯示特有的特徵，包括形狀、晶格結構、溶劑百分比和光學性質(例如，折射率)。本文所用「蛋白的交聯晶體形式」具有以下性質當加入溶液中時交聯蛋白晶體保持不溶性並呈固態。「體外裝置」為以下結構，其在個體治療中不在體內用於使體液與A蛋白晶體接觸。優選體外裝置為用於透析(包括腎透析)的裝置、用於連續動靜脈血液濾過的裝置、體外膜充氧器或用於從血流中過濾廢產物的其它裝置。類似地，過濾廢產物的裝置的組件包含於該術語內，例如包括管、多孔材料或膜。具體地，體外裝置可為透析裝置。其還可為透析裝置的膜。A蛋白的「功能性片段」為保留了 A蛋白的針對抗體或其Fab片段的一種或多種結合活性(例如用於抗體純化的能力)的A蛋白多肽的一部分。除另外說明之外，本文所用的功能性片段可包含一端或兩端的末端截短。例如，功能性片段可自A蛋白多肽的氨基端 和/或羧基端除去I個、2個、4個、5個、6個、8個、10個、12個、15個、或20個或更多個殘基。優選所述截短並不超過一端或兩端的20個胺基酸。功能性片段可任選與一個或多個異源序列或A蛋白的原始天然序列中任何胺基酸的突變物連接。術語「個體」或「受試者」是指任何的哺乳動物，包括但不限於如此分類的任何動物，包括人、非人靈長類、靈長類、狒狒、黑猩猩、猴、嚙齒類動物(例如，小鼠、大鼠)、兔、貓、狗、馬、牛、綿羊、山羊、豬等。蛋白的不可溶和穩定形式為不溶於含水溶劑、有機溶液或含水有機溶劑混合物並顯示出比蛋白的可溶形式更大的穩定性的蛋白形式。按照本發明的備選實施方案，短語「蛋白的不可溶和穩定形式」可為不溶於幹製劑和溼製劑的蛋白。在任一個實施方案中，不可溶形式的交聯蛋白晶體可為有活性的。術語「分離的」是指基本不含其天然環境的分子。例如，分離的蛋白基本不含其所來源的細胞或組織來源的細胞材料或者其它蛋白。該術語是指製備物，其中分離的蛋白足夠純以給予為治療組合物，或至少70% -80% (重量比)純，更優選至少80%90% (重量比)純，甚至更優選 90% -95% 純，和最優選至少 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%,99. 8% 或 100%
(重量比)純。本文所用術語「約」是指由該術語限定的值的至多±10%。例如約50 mM是指50mM土 5mM;約 4% 是指 4% 土 0.4%。本文所用「大分子底物」意指大的生物分子，例如具有至少600-700道爾頓的分子量的蛋白或碳水化合物，其還為被由交聯蛋白晶體組成的蛋白催化的反應的底物。術語「有機溶劑」意指非含水來源的任何溶劑。由本發明的交聯蛋白晶體製劑組成的蛋白可為天然的或合成修飾的。其可為糖蛋白、未修飾蛋白或包含其它的修飾。本文所用「蛋白活性」意指選自以下的活性結合、催化或在使用所述蛋白的環境中產生功能性反應的活性，例如結合免疫球蛋白、免疫沉澱或其組合。術語「蛋白的可溶形式」意指溶液中並從晶格中解離的單獨的蛋白分子。術語「治療有效的劑量」或「治療有效量」是指導致免疫相關病況(例如成年血小板減少性紫癜)的症狀發作的預防、推遲或該症狀的緩解的化合物的量。治療有效量例如足以治療、預防、與升高的免疫球蛋白/IgG或其亞類濃度相關的病症的一種或多種症狀、降低所述症狀的嚴重性、推遲所述症狀的發作和/或減少所述症狀出現的風險。有效量可通過本領域熟知的方法確定。術語「治療」、「治療方法」及其同源詞是指已存在的病症的治療和/或預防/防止措施。需要治療的那些可包括已患有特定醫學病症的個體以及處於病症風險中或患有病症的個體或者可最終獲得病症的個體。例如通過與病症的發展相關的一種或多種風險因子的存在情況、病症的存在情況或進展、或患有病症的受試者對治療的可能接受性，來評估治療需求。治療可包括減緩或逆轉病症的進展。術語「聚合物」意指通過小的、簡單的化學單元的重複建立的大分子。所述重複單元可為線性或帶支鏈的以形成互連網絡。所述重複單元通常等於或近似等於單體。本文所用聚合物載體意指用於包封A蛋白-CLPC以用於純化或遞送(包括生物遞送)此類A蛋白-CLPC的聚合物。此類聚合物包括生物相容和生物可降解的聚合物。所述聚合物載體可為單一聚合物類型或其可由聚合物類型的混合物組成。可用作聚合物載體的 聚合物包括例如聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(縮酚肽)、聚(酯)例如聚(乳酸)或PLA、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(@-羥基丁酸酯)、聚(己內酯))和聚(二Pf烷M );聚乙二醇、聚((羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚[(有機)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、馬來酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、天然及合成多肽、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、改性澱粉例如直鏈澱粉、支鏈澱粉、羥乙基澱粉、甲基丙烯酸酯澱粉和其它澱粉，以及包封蛋白晶體的任何常規材料。本文所用A蛋白是指來自金黃色葡萄球菌菌株的多肽。A蛋白為本領域已知的一群多肽，其能夠結合免疫球蛋白或其Fe-片段。A蛋白為由金黃色葡萄球菌的數種菌株產生的細胞壁組分，由分子量42000的單多肽鏈組成並包含很少或不含碳水化合物。其由六個區組成，其中五個區結合IgG。A蛋白特異性結合免疫球蛋白分子、特別是IgG的Fe區。A蛋白分子包含能夠與數個種類的Fe區相互作用的四個高親和力(Ka = 108/M)結合位點。該分子是熱穩定的並且當暴露於變性試劑(例如4 M尿素，4 M硫氰酸鹽和6 M鹽酸胍)時保持其天然構象。固定化A蛋白已廣泛用於從哺乳動物的數種物種中分離IgG。然而，A蛋白與IgG之間的相互作用對於所有物種並不相等。甚至在一個物種內，A蛋白與IgG的一些亞群相互作用，而不與其它亞群相互作用。例如人IgG1UgG2和IgG4強烈地結合A蛋白，而IgG3並不結合A蛋白，而小鼠IgG1與八蛋白結合很差。還有許多實例其中單克隆抗體並不結合A蛋白，例如大多數大鼠的免疫球蛋白。儘管其可變的結合特徵，但A蛋白具有IgG結合性質，這使得其對於IgG的親和純化是理想的。固定化A蛋白的一個分子可結合IgG的至少兩個分子。另一種蛋白G蛋白，為來自G類鏈球菌ifitr印tococcf)的細胞表面蛋白，為III型Fe受體並以與A蛋白類似的非免疫機制結合IgG。大腸桿菌中產生的該蛋白的重組形式(其中天然蛋白的白蛋白結合區已被遺傳缺失)，也可用於IgG的純化。重組G蛋白包含兩個Fe-結合區。 另一種抗體結合蛋白L蛋白為細菌菌種大消化鏈球菌(Peptostreptoccusmagnus)的細胞表面蛋白，並發現其通過L鏈相互作用結合Ig。其由719個胺基酸殘基組成。從大消化鏈球菌的細胞壁中純化的L蛋白的分子量最初在還原劑2-巰基乙醇存在下通過SDS-PAGE估計為95kD而在6 M鹽酸胍存在下所述分子量通過凝膠層析確定為76kD。與結合免疫球蛋白(抗體)的Fe區的A蛋白和G蛋白不同，L蛋白通過輕鏈相互作用結合抗體。由於重鏈中沒有一部分涉及結合相互作用，L蛋白與A蛋白或G蛋白相比結合更寬範圍的抗體類別。L蛋白結合所有抗體類別的代表，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。單鏈可變片段(ScFv)和Fab片段也結合L蛋白。L蛋白的結合限於包含k輕鏈的抗體。考慮到有效結合的特定需要，固定化L蛋白的主要應用為從已知具有K輕鏈的腹水或細胞培養上清液中純化單克隆抗體。
本發明適用於A蛋白的同種型以及那些同種型的糖形。A蛋白用於製備用於本文所述的方法的晶體。A蛋白可分離自例如天然來源或可來源於天然來源。本文所用術語「來源於」意指具有天然存在於來源中的胺基酸或核酸序列。例如來源於金黃色葡萄球菌的A蛋白包含金黃色葡萄球菌A蛋白多肽的基本序列，或由包含編碼A蛋白的金黃色葡萄球菌中存在的序列或其簡併物的核酸編碼。來源於來源的蛋白或核酸包含分離自該來源的分子，重組產生的分子和/或化學合成或修飾的分子。本文提供的晶體可由包含A蛋白或保留抗體結合區的A蛋白功能性片段的胺基酸序列的多肽形成。優選A蛋白保留天然存在的A蛋白的至少一個功能結合特性，例如保留一種或多種結合至少一種抗體的能力。之前已分離A蛋白，因此其可獲自金黃色葡萄球菌的許多菌株，包括Newman、Cowan等。A蛋白還可從商業供應商例如Sigma、Repligen和GE購買。從天然來源分離A蛋白的方法已描述於例如以下參考文獻中「Nucleotide sequence analysis of the genefor protein A from Staphylococcus aureus Cowan I (NCTC8530) and its enhancedexpression in Escherichia coli.(金黃色葡萄球菌 Cowan I (NCTC8530)的 A 蛋白基因的核苷酸序列分析及其在大腸桿菌中的增強表達)」 Shuttleworth H. L.，Dugglcby C. J.，Jones S. A., Atkinson T. , Minton N. P. Gene 58:283-295 (1987); 「Structural studieson the four repetitive Fe- binding regions in protein A from Staphylococcus
對金黃色葡萄球菌A蛋白的四個重複Fe-結合區的結構研究).」Sjoedahl J. Eur.J. Biochem. 78:471- 490 (1977);這些分離的A蛋白可用於形成晶體和本文所述的方法。或者，重組A蛋白可用於形成晶體和本文提供的方法。在一些情況下，重組A蛋白包含來自天然存在的A蛋白序列的序列或由所述序列編碼。此外，本文描述了包含與天然存在的序列同源或基本相同的胺基酸序列的A蛋白。同樣，提供了由與天然存在的編碼A蛋白的核酸同源或基本相同的核酸編碼的A蛋白，所述A蛋白可如本文所述結晶和/或給予。本文稱為「重組的」多肽為通過重組DNA方法產生的多肽，包括通過依賴人工重組方法的程序(例如聚合酶鏈式反應(PCR)和/或用限制性內切酶克隆至載體中)產生的那些。「重組」多肽還為具有改變的表達的多肽，例如在細胞(例如宿主細胞)中具有重組修飾表達的天然存在的多肽。在一個實施方案中，A蛋白從與金黃色葡萄球菌A蛋白的核酸序列同源的核酸重組產生，並且有時其被修飾，例如以增加或優化異源宿主中的重組產生。可用於形成A蛋白晶體的A蛋白多妝可表達於宿主細胞，例如包含含有A蛋白多肽或其功能性片段的編碼序列的核酸構建體的宿主細胞。用於表達A蛋白的合適的宿主細胞可為例如酵母細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞或者轉基因植物、轉基因動物或無細胞系統。優選宿主細胞能夠糖基化A蛋白多肽(若需要的話)、能夠二硫鍵合、能夠分泌A蛋白和/或能夠支持A蛋白多肽的多聚化。優選的宿主細胞包括但不限於大腸桿菌(包括大腸桿菌Origami B和大腸桿菌BL21)、巴斯德畢赤酵母{Pichiapastor is)、釀酒酵母{Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母{Schizosaccharomycespombe)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)、麴黴(Aspergillus)、Sf9細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)、293細胞(人胚腎)和其它人細胞。此外轉基因植物、包括豬、牛、山羊、馬、雞和兔在內的轉基因動物為產生A蛋白的合適的宿主。對於A蛋白的重組產生，宿主或宿主細胞應包含呈含有編碼A蛋白或其功能性片段的至少一種核酸的質粒、載體、噬菌粒或轉錄盒或表達盒形式的構建體。可利用各種構建體，包括保持單個拷貝或多個拷貝或變得整合至宿主細胞染色體中的構建體。用於重組表達的許多重組表達系統、組分和試劑為市售的，例如從Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA) ；U. S. Biological (Swampscott, MA) ；BD Biosciences Pharmingen (SanDiego, CA) ；Novagen (Madison, WI) ；Stratagene (La Jolla, CA)和Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), (Braunschweig, Germany)。A蛋白的重組表達任選受異源啟動子控制，所述啟動子包括組成型啟動子和/或誘導型啟動子。啟動子例如H、醇氧化酶(AOX)啟動子、二羥基丙酮合酶(DAS)啟動子、Gal1，10啟動子、磷酸甘油酸激酶啟動子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、醇脫氫酶啟動子、銅金屬硫蛋白(CUPl)啟動子、酸性磷酸酶啟動子、CMV和啟動子多角體蛋白也為合適的。具體的啟動子基於宿主或宿主細胞來選擇。此外，例如也可使用可被甲醇、硫酸銅、半乳糖、低磷酸鹽、被醇(例如乙醇)誘導的啟動子，其為本領域所熟知。編碼A蛋白的核酸可任選包含異源序列。例如，在一些實施方案中分泌序列包含在A蛋白多肽的N-端。可使用信號序列，例如來自a交配因子、BGL2、酵母酸性磷酸酶(PH0)、木聚糖酶、a澱粉酶、來自其它酵母分泌蛋白以及來源於其它物種的能夠指導自宿主細胞分泌的分泌信號肽的那些信號序列。類似地其它的異源序列例如接頭(例如，包含切割位點或限制性內切核酸酶位點)以及一種或多個表達控制元件、增強子、終止子、前導序列以及一種或多種翻譯信號在該描述的範圍之內。這些序列可任選包含於構建體內和/或與編碼A蛋白的核酸連接。除另外說明之外，「連接的」序列可直接或間接彼此相關。類似地，表位或親和標籤例如組氨酸、HA(血凝素肽)、麥芽糖結合蛋白、AviTag 、FLAG、或穀胱甘肽-S-轉移酶可任選與A蛋白多肽連接。標籤可任選在產生或純化A蛋白後從A蛋白中裂解。技術人員可容易地選擇合適的異源序列，例如，匹配的宿主細胞、構建體、啟動子和/或分泌信號序列。A蛋白同源物或變體因一個或多個殘基而不同於A蛋白參考序列。結構上相似的胺基酸可例如被一些指定的胺基酸取代。結構上相似的胺基酸包括(I、L和V) ; (F和Y);(K和R) ; (Q和N) ; (D和E)和(G和A)。胺基酸的缺失、添加或取代也包含於本文所述的A蛋白同源物中。此類同源物和變體包括(i)多態性變體和天然突變體或人工突變體，(ii)其中一個或多個殘基被修飾的修飾多肽，以及(iii)包含一個或多個修改殘基的突變體。若A蛋白多肽或核酸與參考序列為至少約40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一，則其為「同源的」(或為「同源物」)。若同源物與參考序列不同一，則其為「變體」。若同源物的核苷酸序列或胺基酸序列因不超過約1、2、3、4、5、8、10,20,50或更多個殘基而不同於參考序列(例如通過截短、缺失、取代或添加)，並保留結合免疫球蛋白/抗體或其Fab片段的能力(或編碼保留所述能力的多肽)，則所述同源物與參考A蛋白序列「基本同一」。A蛋白的片段可為包含變體和/或基本同一的序列的同源物。舉例來說，同源物可來源於A蛋白的不同來源，或者其可通過截短、缺失、取代或添加突變來源於參考序列或與參考序列相關。兩個核苷酸或胺基酸序列之間的同一性百分比可通過標準的比對算法來確定，所述算法為例如基本局部比對工具(Basic Local AlignmentTool, BLAST)，參見 Altschul 等，J. Mol Biol, 215:403 410 (1990) ;Needleman 等的算法，J. Mol. Biol, 48:444 453 (1970);或 Meyers 等的算法AppI. Biosci.4:11 17 (1988)。此類算法摻入 BLASTN,BLASTP 和「BLAST2 序列」程序(綜述於 McGinnis和Madden, Nucleic Acids Res. 32: W20-W25, 2004)。當運用此類程序時，可使用預設參數。例如，對於核苷酸序列可使用「BLAST2序列」的以下設置程序BLASTN，匹配賞分2，不匹配罰分2，開放空位罰分和延伸空位罰分分別為5和2，空位x_下降(dropoff) 50，期 望值10，字長11，過濾器開啟(filter ON)。對於胺基酸序列可使用「BLAST2序列」的以下設置程序BLASTP，矩陣BL0SUM62，開放空位罰分和延伸空位罰分分別為11和1，缺口x_下降50，期望值10，字長3，過濾器開啟。適於形成本文所述的晶體的A蛋白的胺基酸序列和核酸序列，可包括同源序列、變體序列或基本同一的序列。交聯蛋白晶體的製備——蛋白結晶
蛋白晶體通過蛋白的受控結晶從含水溶液或含有機溶劑的含水溶液中生長出。待控制的條件包括例如溶劑蒸發的速率、合適的共溶質和緩衝劑的存在情況、PH和溫度。影響蛋白結晶的各種因素的全面綜述已由McPherson, Methods EnzymoI. , 114,第112-20頁(1985)出版。McPherson 和 Gilliland, J. Crystal Growth, 90,第 51-59 頁(1988)已彙編了已結晶的蛋白和核酸的全面列表以及其結晶條件。晶體和結晶配方的概要以及已解決的蛋白和核酸結構的坐標的儲存庫由Brookhaven National Laboratory的Protein DataBank 保持[http//www. pdb.bnl.gov; Bernstein 等，J. Mol. Biol. , 112,第 535-42頁(1977)]。這些參考可用於確定蛋白結晶的必要條件，作為合適的交聯蛋白晶體形成的前序，並且可指導其它蛋白的結晶策略。或者，在大多數情況下智能試驗和錯誤搜索策略可產生許多蛋白的合適的結晶條件，前提是可對其達到可接受水平的純度[參見，例如C. W.Carter, Jr.和 C. W. Carter, J. Biol. Chem. , 254，第 12219-23 頁(1979)]。對用於本文所述的方法而言不需要X射線衍射分析所需的大的單晶。微晶簇(Microcrystalline shower)是合適的。例如，交聯蛋白晶體可具有約0.01 iim-約500 y m，或者0. I y m_約50 y m的
最長尺寸。其還可具有選自以下的形狀球形、針形、棒形、板形例如六邊形和正方形、菱形、立方體形、雙錐形和稜柱。通常，晶體通過將待結晶的蛋白與合適的含水溶劑或包含合適的結晶劑(例如鹽或有機溶劑)的含水溶劑混合來產生。所述溶劑與蛋白混合，並可經受在憑實驗確定適於結晶誘導和對保持蛋白活性和穩定性可接受的溫度下攪拌。所述溶劑可任選包含共溶質例如二價陽離子、輔因子或離液劑，以及控制pH的緩衝劑種類。對共溶質的需要及其濃度憑實驗確定以促進結晶。在工業規模的方法中，導致結晶的受控的沉澱可最佳地地通過在分批工藝中將蛋白、沉澱劑、共溶質和任選緩衝劑簡單組合來進行。作為另一種選擇，蛋白可通過用蛋白沉澱物作為起始材料來結晶。在這種情況下，將蛋白沉澱物加入結晶溶液中並孵育直至形成晶體。也可採用備選的實驗室結晶方法，例如透析或蒸汽擴散。McPherson(見上)和Gilliland(見上)在其關於結晶文獻的綜述中包括合適條件的綜合列表。交聯劑和結晶介質之間的不兼容有時可能需要將晶體更換至更合適的溶劑體系中。已描述結晶條件的很多蛋白可用於製備本發明的交聯蛋白晶體。然而，應指出的是，已優化大部分上述引用的參考文獻中所報導的條件以在大多數情況下得到一些大的、衍射質量的晶體。因此，本領域的技術人員應理解的是，可能需要對這些條件進行一定程度的調節，以提供用於大規模生產較小晶體的高產量方法，所述晶體用於製備交聯蛋白晶體。 交聯蛋白晶體的製備——蛋白晶體的交聯
穩定化晶體。一旦A蛋白晶體已生長於合適的介質中，其可任選穩定化，例如通過交聯。交聯通過在晶體的組成性蛋白分子之間引入共價鍵來引起晶格的穩定。這使蛋白有可能轉移至可另外與晶格的存在或甚至與完整蛋白的存在不兼容的替代環境中。A蛋白晶體可通過例如賴氨酸胺基團、硫醇(巰基)基團和碳水化合物部分來交聯。交聯晶體在此也被稱作「A蛋白-CLPC」、「CLPC-A蛋白」或「CLPC」。交聯晶體可改變穩定性(例如pH、溫度、機械和/或化學穩定性)、抗體結合的pH概況、溶解度、晶體大小或晶體體積的均一性，結合的抗體自晶體的釋放速率和/或基礎晶格中的單個分子之間的孔隙大小和形狀。有利的是，本發明的交聯或穩定以這樣的方式進行，所述方式使得晶體包含以下A蛋白，其顯示出與固定化A蛋白/ml凝膠相比至少約60%、80%、100%、150%、200%、250%、300%或更多的結合容量/ml晶體(抗體的結合)。與可溶性或固定化A蛋白相比，穩定性可增加至少約 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300% 或更多。例如可在儲存條件下測量穩定性，例如PH穩定性、溫度穩定性、針對蛋白酶的穩定性、溶解穩定性以及體外柱穩定性。在一些實施方案中，交聯減緩了呈晶體的A蛋白多肽在溶液中的溶解，有效地將蛋白分子固定於微晶顆粒中。在例如在使用條件而非儲存條件下於圍繞交聯蛋白晶體的環境中暴露於觸發劑後，該蛋白分子緩慢溶解，釋放活性A蛋白多肽和/或增加A蛋白的活性。溶出率通過例如下列因素中的一個或多個來控制交聯程度、蛋白晶體曝露於交聯劑的時間長度、交聯劑加入蛋白晶體的速度、交聯劑的性質、交聯劑的鏈長、pH、溫度、巰基試劑如半胱氨酸、穀胱甘肽的存在情況、交聯蛋白晶體的表面積、交聯蛋白晶體的大小以及交聯蛋白晶體的形狀。交聯可用一種交聯劑或多種交聯劑(包括多功能劑，同時(並行)或按順序)的組合來實現。在於周圍環境暴露於觸發劑，或經過既定時間段後，用此類多功能交聯劑交聯的蛋白晶體之間的交聯變少或變弱，導致蛋白溶解或活性的釋放。或者，交聯可在連接點打斷，導致蛋白溶解或活性的釋放。參見美國專利第5，976，529號和第6，140，475號。在一些實施方案中，交聯劑可為具有至少2、3、4、5或更多個活性部分的多功能交聯劑。在不同的實施方案中，該試劑可選自戊二醛、丁二醛、辛二醛、乙二醛、二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)、3，3』 二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)、3，3』 - 二硫代雙丙亞氨酸二甲酯鹽酸鹽、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、己二胺、二氨基辛烷、乙二胺、丁二酸酐、苯基戊二酸酐、水楊醛、亞胺基乙酸酯、甲醛、丙烯醛、丁二酸半醛、丁醛、十二醛、甘油醛、反式-辛-2-烯醛。另外的多功能交聯劑包括滷代三嗪，例如三聚氯氰；齒代嘧唆，例如2，4，6-三氯/溴嘧啶；脂肪族或芳香族單羧酸或二羧酸的酐或滷化物，例如馬來酸酐、(甲基)丙烯醯氯、氯乙基醯氯；N-羥甲基化合物，例如N-羥甲基氯乙醯胺；二異氰酸酯或二異硫氰酸酯，例如亞苯基-1，4- 二-異氰酸酯和氮雜環丙烷。其它交聯劑包括環氧化物，例如二環氧化物、三環氧化物和四環氧化物。在一個實施方案中，交聯劑是戊二醛雙功能劑，戊二醛單獨使用或與環氧化物按順序使用。還可將其它交聯劑(參見例如，Pierce Chemical Company的1996年目錄)與可逆交聯劑例如下文所述的那些同時(並行)或按順序使用。按照本發明的替代實施方案，交聯可並行或按順序利用可逆的交聯劑進行。所得 交聯蛋白晶體通過活性多功能接頭表徵，將觸發劑作為分隔基團摻入所述接頭中。活性官能團涉及將蛋白中的活性胺基酸側鏈連接在一起，觸發劑由可通過改變周圍環境的一個或多個條件(例如pH、還原劑的存在情況、溫度或熱力學水活度)來打斷的鍵組成。交聯劑可為同功能或異功能的。活性官能團(或部分)可例如選自以下官能團之一(其中R、R』、R」和R』』』可為烷基、芳基或氫基團)
I.活性醯基供體，例如羧酸酯RC00R』、醯胺RC0NHR』、醯基疊氮化物RC0N3、碳二亞胺R-N=C=N-Rj、N 羥基醯亞胺酯、RC0-0-NR』、亞氨酸酯 R_C=NH2+(NR』 )、酐 RC0-0-C0R』、碳酸酯R0-C0-0-R 、聚氨酯RNHC0NHR』、醯基滷RCOHal (其中Hal=滷素)、醯基醯肼RCONNR』R』 』和
0醯基異脲 RCO-O-C=NR』(-NR』 』 R』 』 』)
II.活性羰基，例如-MRCHO和酮RCORj、縮醛RCO(H2) R』和縮酮RR，C02 R，R，，(在蛋白固定化和交聯的領域中的技術人員已知的包含活性羰基的官能團描述於文獻中(PierceCatalog and Handbook, Pierce Chemical Company, Rockford, III. (1994); S. S.Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, BocaRaton, Fla. (1991);
III.烷基或芳基供體，例如烷基或芳基滷化物R-Hal、疊氮化物R-N3、硫酸酯
RS03R』、磷酸酯 RPO (0R，3)、烷基氧輸鹽 R30+、鋶 R3S+、硝酸酯 R0N02、Michael 受體 RCR』 =
CR』 』 』 C0R」、芳基氟化物ArF、異腈RN+=C_、滷代胺R2N_Hal、烯烴和炔烴；
IV.含硫基團，例如二硫化物RSSR』、硫醇基RSH和環氧化物R2C_°CR』 2 ;和
V.鹽，例如烷基或芳基銨鹽R4N+、碳酸鹽RC00-、硫酸鹽R0S03-、磷酸鹽R0P0/』和胺
R3N。可逆交聯劑例如包含觸發劑。觸發劑包含烷基、芳基或具有可與待交聯的蛋白反應的活性基團的其它鏈。那些活性基團可為任何多種基團，例如易於親核、游離基或親電置換的那些，包括滷化物、醛、碳酸酯、聚氨酯、蒼耳烷和環氧化物等。例如，活性基團可對酸、鹼、氟化物、酶、還原、氧化、硫醇、金屬、光解、輻射或熱不穩定。可逆交聯劑的另外的實例參見T. W. Green, Protective Groups in OrganicSynthesis, John Wiley和Sons (編輯)(1981)。用於可逆保護基團的任何多種策略可摻入適用於產生能夠可逆受控溶解的交聯蛋白晶體的交聯劑中。在關於該主題的Waldmann的綜述(載於Chemie InL Ed. EngL , 35:2056 (1996))中列出了不同的方法。其它類型的可逆交聯劑為含二硫鍵的交聯劑。打斷由此類交聯劑形成的交聯的觸發劑為添加還原劑例如半胱氨酸至交聯蛋白晶體的環境中。示例性的二硫化物交聯劑參見Pierce Catalog and Handbook (1994-1995)。此類交聯劑的實例和方法公開於美國專利第6，541, 606號,其相關部分通過引用結合於此。此外，還可使用在碳水化合物部分之間或在碳水化合物部分和胺基酸之間交聯的交聯劑。交聯劑在溶液中的濃度可為約0. 01%_20%、約0. 02%_10%、或約0. 05%_5%重量體積t匕。典型地，交聯劑為約0. 5%或約1%重量體積比。例如，交聯劑在溶液中的濃度可為例如約 0. 01%,0. 02%,0. 05%,0. 075%,0. 1%、0. 2%、0. 3%、0. 5%、1%、2%、3%、3. 5%、4%、5%、6%、7%、8 % 、9%、10%、15%或20%重量體積比。交聯前可能需要更換緩衝液。包括CLPC在內的晶體可任選凍幹或以其它方式配製。包括本文所述的交聯晶體在內的晶體可用於治療方法中和降低循環免疫複合體的IgG水平(例如在免疫血小板減少性紫癜中)的方法。A蛋白晶體還可以柱的形式或浸潰於膜或聚合物中或塗布或固定於支持物上用於涉及純化工藝的方法(例如，單克隆抗體的純化、多克隆抗體的純化、來自不同來源的免疫球蛋白、IgG及其亞型、Fab片段、單鏈抗體等的純化。基於上述的穩定化A蛋白晶體的一種或多種性質，本文所述的晶體可應用於這些用途。A蛋白的晶體/CLPC的乾燥。A蛋白的晶體通過經由乾燥方法移除水、有機溶劑或液體聚合物來乾燥，所述乾燥方法包括用氮氣、空氣或惰性氣體乾燥、真空烘箱乾燥、凍幹、用揮發性有機溶劑洗滌接著蒸發該溶劑、在通風櫃中蒸發、託盤乾燥、流化床乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥或滾筒乾燥。典型地，當晶體變為自由流動的粉末時實現乾燥。乾燥可通過將空氣流流過溼的晶體來進行。所述氣體可選自氮氣、氬氣、氦氣、二氧化碳、空氣或其組合。原則上，乾燥的晶體可通過凍幹製備。然而，該技術涉及物質的迅速冷卻，僅可應用於凍結穩定的產品。在一個實施方案中，首先將包含晶體/ CLPC A蛋白的含水溶液冷凍至-40至_50°C，接著在真空下移除。A蛋白晶體/CLPC或包含此類晶體的製劑或組合物的製備。在一個方面，公開了 A蛋白晶體/CLPC或包含此類晶體的製劑或組合物。此類組合物可依照以下方法製備
首先，使A蛋白結晶。接著，直接向母液中加入選自以下的賦形劑或成分糖、糖醇、增粘劑、潤溼劑或增溶劑、緩衝鹽、乳化劑、抗微生物劑、抗氧化劑或包衣材料。或者，移除母液，之後將晶體懸浮於賦形劑溶液中達最短I小時-最長24小時。所述賦形劑的濃度典型地為約0. 01-約10% (重量比)。所述成分的濃度為約0. 01-約90% (重量比)。所述晶體的濃度為約0.01-約99% (重量比)。然後通過過濾或離心從晶體漿液中移除母液。隨後，在室溫或約-20°C -約25°C的溫度下任選用約50%-100% (重量比)的一種以上有機溶劑的溶液洗滌晶體，所述有機溶劑為例如乙醇、甲醇、異丙醇或乙酸乙酯。接著，通過使氮氣、空氣或惰性空氣的氣流流過晶體來乾燥晶體。或者，通過空氣乾燥、噴霧乾燥、凍幹或真空乾燥來乾燥晶體。乾燥在洗滌後進行最短約I小時-最長約72小時，直至終產物的水分含量在約10%重量以下，最優選約5%重量以下。最後，若需要的話可進行晶體的微粉化(micromizing)(減小晶體的大小)。依照本發明的一個實施方案，在製備A蛋白晶體/CLPC或包含此類晶體的製劑或組合物時，結晶期間不添加增強劑(例如表面活性劑)。結晶後將賦形劑或成分以約I-約10%(重量比)的濃度、或者約0. I-約25%(重量比)的濃度、或者約0. I-約50%(重量比)的濃度加入母液中。將賦形劑或成分與晶體在母液中孵育約0. I-約3小時。或者該孵育進行約0. I-約12小時，或者該孵育進行約0. I-約24小時。在本發明的另一個實施方案中，將賦形劑或成分溶解於溶液而非母液中，並從母液中移出晶體並懸浮於賦形劑或成分溶液中。所述賦形劑或成分的濃度及孵育時間與上述的那些相同。
本發明的另一個優點在於A蛋白晶體/CLPC、或包封在聚合物載體內以形成包含微球的組合物的其製劑可通過凍乾乾燥。凍幹或冷凍乾燥允許水從組合物中分離。首先將A蛋白/CLPC晶體組合物冷凍，接著置於高真空下。在真空中，結晶水升華，留下僅包含緊密結合的水的A蛋白/CLPC晶體組合物。此類處理進一步使組合物穩定並允許在典型遇到的環境穩定下更易儲存和運輸。噴霧乾燥允許水從晶體製備物中分離。其非常適用於從液體原料(如溶液、乳液、和可泵送的懸浮液)中以粉末、顆粒或團聚物的形式連續產生乾燥的固體。噴霧乾燥涉及將液體原料霧化成液滴噴霧並在乾燥室內將液滴與熱空氣接觸。該噴霧由旋轉霧化器或噴嘴霧化器產生。在受控溫度和氣流條件下從液滴蒸發水分和形成乾燥顆粒。噴霧乾燥操作需要相對高的溫度。然而，產物的熱損傷通常只是輕微的，因為臨界乾燥期間的蒸發性冷卻效果和因為乾燥物質接觸高溫的後續時間可很短。粉末從乾燥室中不斷排出。根據產物的乾燥特性和粉末技術指標，選擇操作條件和乾燥機設計。噴霧乾燥是理想的過程，其中終產物必須符合粒度分布、殘留水分含量、堆積密度和顆粒形狀相關的精確的質量標準。可用於本發明的方法的A蛋白-CLPC可與賦形劑混合。根據本發明，「賦形劑」充當藥物組合物中使用的填充劑或填充劑的組合。賦形劑的實例參見由美國製藥協會(American Pharmaceutical Association)和英國藥學會(Pharmaceutical Society ofGreat Britain)聯合出版的 Handbook of Pharmaceutical Excipients (藥用賦形劑手冊)，以下列出另外的實例。包含於該類別的優選賦形劑為以下的鹽1)胺基酸例如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、脯氨酸；2)碳水化合物，例如，單糖例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖；3) 二糖，例如乳糖、海藻糖、麥芽糖、蔗糖；4)多糖，例如麥芽糊精、葡聚糖、澱粉、糖原；5)糖醇，例如甘露醇、木糖醇、乳糖醇、山梨醇；6)葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸；7)環糊精，例如甲基環糊精、羥丙基-￠-環糊精等；8)無機分子，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、鈉和鉀的磷酸鹽、硼酸、碳酸銨和磷酸銨；9)有機分子，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、乳酸鹽；10)乳化劑或增溶劑/穩定劑如阿拉伯樹膠、二乙醇胺、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、單乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸、脫水山梨醇單月桂酸酯、脫水山梨醇單硬脂酸和其它脫水山梨醇衍生物、聚氧基(polyoxyl)衍生物、蠟、聚氧乙烯衍生物、脫水山梨醇衍生物；和11)增粘劑如瓊脂、藻酸及其鹽、瓜爾膠、果膠、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、纖維素及其衍生物、碳酸丙烯酯、聚乙二醇、己二醇、泰洛沙泊。賦形劑的另一個優選組別包括蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨醇、乳糖醇、肌醇、鈉鹽和鉀鹽例如醋酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽；甘氨酸、精氨酸、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙二醇、己二醇、甲氧基聚乙二醇、明膠、羥丙基-￠-環糊精、聚賴氨酸、聚精氨酸。在本發明的一個實施方案中，所述賦形劑選自鹽、醇、碳水化合物、蛋白質、脂質、表面活性劑、聚合物和聚胺基酸。在另一個實施方案中，所述賦形劑選自魚精蛋白、聚乙烯醇、環糊精、葡聚糖、聚胺基酸(例如聚精氨酸、聚賴氨酸和聚穀氨酸)、聚乙二醇和樹狀大分子(dendrimer)、聚合物例如聚卡波非、藻酸鈉。組合物。將包括交聯晶體在內的A蛋白晶體提供為組合物，例如藥物組合物(參見例如美國專利第6，541，606號，描述蛋白晶體的製劑和組合物)。包含A蛋白晶體的藥物組合物包含A蛋白晶體和一種或多種成分或賦形劑，包括但不限於糖和生物相容的聚合物。 A蛋白-CLPC可作為在組合物中的晶體、作為任何多種生理學上可接受的鹽形式給予和/或與作為藥物組合物的一部分的可接受的藥用載體和/或添加劑一起給予。生理學上可接受的鹽的形式和標準的藥物配製技術和賦形劑為本領域的技術人員所熟知(參見，例如 Physician，s Desk Reference (PDR) 2003,第 57 版 ，Medical EconomicsCompany, 2002 以及Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennado等編輯，第20版，Lippincott, Williams和Wilkins, 2000)。為了該應用的目的，「製劑」包括「晶體製劑」。A蛋白晶體組合物的其它有用成分和賦形劑包括以下
生物相容的聚合物。生物相容的聚合物為非抗原性(當不用作佐劑時)、無致癌性、無毒且不另外固有地與活生物體不相容的聚合物，其可用於本文所述的A蛋白晶體組合物。實例包括聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(縮酚肽)、聚(酯)例如聚(乳酸)或PLA、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(@-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)和聚(二飄m);聚乙二醇、聚((羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚[(有機)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、馬來酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、Pluixmic多元醇、白蛋白、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其混合物和共聚物。生物可降解的聚合物，即被水解或溶解降解的聚合物。降解可為不均質的(主要發生於顆粒表面)或為均質的(在聚合物基質各處均勻降解)。成分例如一種或多種賦形劑或藥物成分或賦形劑可包含於A蛋白晶體組合物。成分可為惰性成分或活性成分。本發明一般可適用於IgG，不管來源。用於本發明目的的優選IgG為人和小鼠的IgG類。目標種類可與其分離的蛋白為其它免疫球蛋白，例如IgM和IgE，以及其它蛋白例如白蛋白。已知這些蛋白對A蛋白的結合親和力比IgG對A蛋白的結合親和力要小得多。可使用可溶於含水介質的任何無機鹽。實例包括鹼金屬和鹼土金屬滷化物和硫酸鹽。帶正電的離子例如銨可替代金屬離子。鹽還必須對免疫球蛋白、A蛋白或A蛋白所結合的任何支持物無反應。鹽的濃度可從約0. 5 M高至溶解度的極限，優選約I. 0 M-約4. 0M0溶液的精確pH並不重要並且可在約中性至弱鹼性的範圍內廣泛地變化。因此，pH可大於或等於約7. 0，優選約8. 5-約9. 5。
優選將鹽用作緩衝溶液的一部分，由所述鹽本身或由混合物的單獨組分產生緩衝效果。可使用常規緩衝液，適當選擇以實現所需pH。對於固定化的目的，將A蛋白結晶並交聯而無需任何固相支持體，例如親和層析柱中的填充材料。當本發明用於增加親和層析的分離時，優選通過用包含高鹽濃度的緩衝溶液反覆洗滌來使柱填充物平衡，並且在將樣品混合物加入柱前還將其於相同的緩衝溶液中稀釋。稀釋度也可廣泛地變化，但優選稀釋度為約1:1_約1:20。隨著緩衝溶液通過柱，未結合的蛋白將被緩衝溶液帶走，從而將它們與結合的免疫球蛋白分離。接著，免疫球蛋白的回收通過用酸性緩衝液，優選具有約2. 0-約5. 0，更優選約2. 5-約4. 0 pH的酸性緩衝液洗脫來實現。柱的性質並不重要，可在從開柱至加壓柱的範圍內廣泛地變化。本發明固有的強結合允許通過使用開柱實現有效的分離。 本說明書所用「包含靶蛋白的樣品」是指包含靶蛋白的任何樣品，無論是天然來源的還是人工製備的。所述樣品可包含不同液體、液體和固體或不同固體的混合物。包含靶蛋白的樣品的實例可包括血液、血清、腹水液、奶、組織樣品、細胞培養物、細胞裂解物或細胞培養物的上清液。本說明書所用「支持物」是指不管其形式或其製作材料，A蛋白可固定於其上以得到親和層析介質的任何東西。實例包括瓊脂糖，其常用於親和層析；纖維素和聚丙烯醯胺。本說明書所用「層析介質」是指用於層析純化的固定相，不管其構型(柱或平面)、狀態(液體或固體)或其製作材料。用於蛋白純化的層析介質的常見實例包括離子交換樹月旨、親和固定相和凝膠滲透固定相。本說明書所用「偶聯的」是指直接接觸以及兩種類型或更多種類型基因或蛋白之間的接頭基因或接頭蛋白的布置。其還包含通過共價鍵或非共價鍵的偶聯。本說明書所用「靶蛋白」是指待純化的任何蛋白。靶蛋白的實例可為抗體。「融合蛋白」在本文中是指兩個以上的分離多肽的任何組合。融合蛋白包括兩個以上的分離多肽的組合，其中所述兩個以上的多肽是共價連接的。融合蛋白包括兩個以上的分離多肽的組合，其中所述兩個以上的分離多肽是非共價連接的。所述兩個以上的分離多肽可在沒有任何介體的情況下直接彼此接觸。所述兩個以上的分離多肽可被介體例如接頭肽居中。本文公開的方法利用A蛋白和靶蛋白(例如抗體)之間的高度結合特異性。在一個實施方案中，該方法包括將含有靶蛋白的樣品與其上固定有晶體交聯A蛋白的支持物接觸，其中所述靶蛋白為抗體並且A蛋白-CLPC具有對所述抗體的特異的結合親和力，並且其中該接觸在使得A蛋白結合抗體的條件下進行；移除未結合的樣品組分；然後從支持物中移出靶蛋白/抗體。在一些實施方案中，樣品是細胞裂解物、細胞培養物、細胞培養物上清液或包含靶蛋白的生物流體。在一些實施方案中，將其上固定有交聯A蛋白的支持物配置為親和層析柱。在用於本文公開的蛋白純化的方法和柱中，可使用一次性柱。一次性柱可具有約0. I-約I. 0 mm、約0. 3-約0. 7 mm、或約0. 5 mm的直徑。柱可被置於約16x125 mm的玻璃試管中。在一個實施方案中，直徑為0. 5 mm的一次性柱被置於16x125 mm的玻璃試管中。層析介質例如A蛋白-CLPC可按照本領域已知的任何方法填充於柱中。在使用一次性柱的實施方案中，將充足體積的脫氣緩衝液/水加入柱中以使其裝滿至貯器(廣口)部分，然後從柱中消除任何氣泡。在此之後，凝膠(A蛋白-CLPC)可在室溫下填充至具有脫氣50%凝膠漿液和脫氣緩衝溶液(或水)的柱中。可加入充足體積的脫氣凝膠漿液以得到所需的設定的凝膠體積。可允許凝膠在柱中沉降至少30分鐘。填充柱可在4°C下儲存和使用。從支持物中移出靶蛋白可包括從支持物中洗脫靶蛋白。洗脫靶蛋白通過在以下pH下洗脫來進行，所述PH降低A蛋白-CLPC和抗體之間的結合親和力，使得靶蛋白/抗體從支持物(A蛋白-CLPC)中移出。在本發明的方法中的第一步驟，需要具有約pH 7. 0-pH 10的pH和濃度為約0. 01M-2M的一價陽離子和多鹼價陰離子的組合的緩衝液。任何緩衝液可用於提供所需的pH。可使用例如磷酸鹽緩衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝或Tris緩衝液。緩衝液的濃度應在約0. 01M-0. 25M。此外，氯化鈉、氯化鉀、氯化四甲銨(TMAC)、氯化四乙銨(TEAC)、氯化四丙銨和氯化四丁銨等鹽可以約0. 05M-2. OM的濃度範圍加至緩衝液。 在一價陽離子為鉀離子或鈉離子和多鹼價陰離子為磷酸根離子時，鉀離子和磷酸根離子可通過以磷酸三鉀K3PO4、磷酸氫二鉀K2HPO4或磷酸二氫鉀KH2 PO4的形式使用磷酸鉀來提供，由於介質的pH控制存在的各種磷酸根離子的比例。鉀離子和磷酸根離子存在的濃度應為約0. 6M-1. 75M。發現約I. 0M-1. 5M的濃度尤其令人滿意。在本發明使用的高濃度下具有足夠溶解度的一價陽離子和多鹼價陰離子的其它組合，包括約I. 0M-1. 5M濃度的銨磷酸鹽、約I. 0M-1. 5M濃度的銨硫酸鹽和約I. 0M-1. 25M濃度的鈉硫酸鹽。只要鹽不在使用的濃度下沉澱，則還可使用其它組合。正如上文指出，吸附劑(A蛋白-CLEC)優選在柱中使用以促進與待純化的免疫球蛋白接觸。在將包含不純的免疫球蛋白的介質上樣至柱之前，包含A蛋白-CLEC的柱用數個柱床體積的包含對柱的組合的緩衝液平衡，所述柱用數個柱床體積的包含濃度在約0. 01M-4M的一價陽離子和多鹼價陰離子的組合的緩衝液平衡。這確保了環境最優於免疫球蛋白與柱的結合。將包含待純化的免疫球蛋白的介質(例如免疫血清或免疫球蛋白的其它來源)與包含一價陽離子和多鹼價陰離子的組合的緩衝液混合。接著，將所得混合物上樣至柱，導致免疫球蛋白吸附至柱。接著用包含一價陽離子和多鹼價陰離子的組合的另外緩衝液洗滌柱，以便從柱中洗脫不強烈吸附至柱的雜質。另一方面，由於作為存在包含一價陽離子和多鹼價陰離子的組合的緩衝液的結果，吸附劑對免疫球蛋白增強的親和力，免疫球蛋白強烈地吸附至柱。在通過用相同的緩衝溶液洗滌來移除非所需的雜質後，通過具有酸性pH (即約pH 2.0- pH 6.0範圍內的pH)的緩衝液從柱中洗脫純化的免疫球蛋白。在pH 6. 0下部分免疫球蛋白主要是IgG1流分被洗脫。隨著pH降低，包括IgG2a部分和IgG2M流分在內的免疫球蛋白的剩餘物被洗脫。免疫球蛋白可利用pH 2. 0的緩衝液洗脫，該緩衝液對洗脫所有的免疫球蛋白有效。然而若需要的話，一小部分免疫球蛋白可在PH 6.0被洗脫。若需要的話，通過在PH 6.0和pH 2.0之間降低pH可洗脫不同的其它流分。通過逐步降低PH，有可能分離包含所需的特定免疫球蛋白的免疫球蛋白的純化流分。可使用任何緩衝液用於洗脫。例如醋酸-醋酸鹽緩衝液或甘氨酸.HCl緩衝液可用於該目的。可使用在約0. 01M-0. 25M的緩衝液濃度。特別優選約0. 1M-0. 2M的緩衝液濃度。與支持物例如瓊脂糖結合的固定化A蛋白相比，免疫球蛋白或其片段可結合A蛋白-CLEC的短柱。分離的免疫球蛋白或其片段可以多達百分之九十(90%)的收率回收。甚至將使用目前可用的最尖端技術所得到的結合提高多達2-10%。在某些實施方案中，使初級回收樣品經受親和層析以從HCP中進一步純化目標抗體。在某些實施方案中，層析材料能夠選擇性或特異性地結合目標抗體。此類層析材料的非限制性實例包括:A蛋白、G蛋白、L蛋白。在特定的實施方案中，親和層析步驟涉及使初級回收樣品經歷包含合適的A蛋白樹脂的柱。A蛋白樹脂可用於各種抗體亞型、特別是IgGpIgG2和IgG4的親和純化和分離。填充有A蛋白-CLPC的合適的柱的非限制性實例為約I. 0 cm直徑X約21. 6 cm長的柱(約17 ml柱床體積)。該大小的柱可用於小規模純化並可與用於放大的其它柱相比較。例如，其柱床體積為約6. 6 L的20 cmX 21 cm的柱可用於更大的純化。無論何種柱，所述柱可用A蛋白-CLPC填充。在某些實施方案中，有利的是，鑑定A蛋白樹脂的動態結合容量(DBC)以便針對特 定的目標抗體定製純化。例如但不以限制的方式，可通過單流速上樣或雙流速上樣策略確定A蛋白-CLPC柱的DBC。單流速上樣可在整個上樣期間以約300 cm/小時的速度評估。雙流速上樣策略可通過以下確定以300 cm/小時的線性速度上樣柱多至約35 mg蛋白/ml樹脂，然後減少一半線性速度以允許對於上樣的最後部分有更長的停留時間。在某些實施方案中，在樣品上樣前A蛋白柱可用合適的緩衝液平衡。合適的緩衝液的非限制性實例為PBS或Tris/NaCl緩衝液，約7. 2-7. 4的pH。合適的平衡條件的非限制性實例為PBS緩衝液pH 7. 4或25 mM TrisUOO mM NaCl、約7. 2的pH。在該平衡後，樣品可上樣至柱上。待柱上樣後，柱可用例如平衡緩衝液洗滌一次或多次。可在洗脫柱前應用其它的洗滌，包括應用不同緩衝液的洗滌。例如，柱可用一個或多個柱體積的約6.0的pH的20 mM檸檬酸/檸檬酸鈉，0.5 M NaCl洗滌。該洗滌可任選接著用平衡緩衝液的一次以上洗滌。接著可用合適的洗脫緩衝液洗脫A蛋白柱。合適的洗脫緩衝液的非限制性實例為醋酸/NaCl緩衝液，約3. 5的pH。合適的條件為例如0. I M醋酸，約3. 5的pH或0. 2M甘氨酸.HCl緩衝液，pH 2.0。洗脫液可用本領域的技術人員熟知的技術監控。例如可按照OD■處的吸光度。柱的洗脫液可以約0.5 AU的初始偏轉起始收集至洗脫峰後沿約0. 5AU的讀數。然後可準備目標洗脫流分用於進一步處理。例如收集的樣品可用約10的pH的Tris (例如I. 0 M)滴定至約5. 0的pH。任選可將該滴定的樣品過濾或處一步處理。本發明提供了適用於多種應用的蛋白浸潰材料以及生產和使用所述材料的方法，所述應用包括例如在純化或免疫沉澱期間從血液、血漿、血清、細胞培養物中移除免疫球蛋白。此類蛋白潰浸膜還可用於治療、診斷及其它工業應用。在一個實施方案中，本發明包括浸潰有交聯蛋白晶體的膜。所述交聯蛋白可包括由各種合適蛋白製備的任何合適的交聯蛋白。在一個實施方案中，所述交聯蛋白可包括能夠從血清、血漿、血液、細胞培養物中移除抗體等的蛋白例如A蛋白、G蛋白、L蛋白等蛋白或其組合。優選交聯蛋白晶體為如本文所述的A蛋白-CLPC。在一個實施方案中，本發明包括浸潰有單獨或與諸如G蛋白或L蛋白等其它交聯蛋白晶體組合的交聯蛋白晶體(優選A蛋白-CLPC)的聚合物膜。據認為使用A蛋白-CLPC浸潰膜會提供超越目前可用的固定化技術的多種益處，包括例如1)無任何浸出的更好的A蛋白保留；2)減少的筒/柱大小，這導致使用容易性增加；3)筒/柱製造期間的使用容易性 '及4)優於現有系統的增加的安全性(由於筒中A蛋白更好的保留)。本發明的交聯蛋白浸潰膜可以多種合適的方式製備。一般而言，首先製備基於聚合物的制膜液，接著與所需量和所需類型的交聯蛋白晶體混合。應理解的是，所述制膜液可制自任何合適的基於聚合物的材料。一旦形成並與交聯蛋白混合，則將制膜液通過例如塗布於支持材料上來施用於支持材料，或經受一種或多種沉澱和洗滌順序以形成可隨後在使用前乾燥的複合膜。在一個實施方案中，制膜液由包含聚合物基質材料例如聚氨酯等的任何合適的溶劑組成，所述溶劑包括例如I-甲基-2-吡咯烷酮(「NMP」)、二甲基甲醯胺(「DMF」)等或其組合。所述制膜液還可包含另外的其它組分，例如填充劑、親水劑(例如，可使膜更親水的試劑)等或其組合。在一個實施方案中，填充劑可包括氧化鋯、磷酸鋯、碳等或其組合。可足量加入填充劑以控制膜的孔隙率。填充劑可以高達膜的約80%總乾重，優選膜的約50%總乾重的量加入。在一個實施方案中，填充劑和交聯蛋白晶體以等量或至少約等量添加。 在一個實施方案中，親水劑為聚乙烯吡咯烷酮(「PVP」)等或其組合。可添加任何合適的量的親水劑以提高膜的親水性。然後將制膜液與適量的交聯A蛋白混合。在一個實施方案中，交聯A蛋白-CLPC以有效提供所需水平的結合活性的量加入膜中。在一個實施方案中，用約3. 25 mg/cm2或更少的交聯蛋白浸潰膜。在這點上，交聯蛋白晶體可佔膜重量的約80%或更少。然後將所得膜溶液施用於支持物例如合成的網狀材料，並浸入水中或其它合適的介質例如異丙醇和水的混合物，優選異丙醇(「IPA」)和水的比例為50 50的混合物中。然後可在合適的條件下沉澱聚合物膜複合材料。例如，在水沉澱期間可加入合適量的NMP以控制沉澱速度。在這點上，可降低沉澱速度，從而導致膜的更多孔的聚合物基質。本發明的A蛋白-CLPC可通過體外裝置或導管給予，例如用於將A蛋白-CLPC遞送至患者。導管例如導尿管可用包含A蛋白-CLPC晶體的組合物塗布。以下實施例提供了本發明的闡述性實施方案。本領域普通技術人員應認識到在不改變本發明的精神或範圍的情況下可進行許多修改和改變。此類修改和改變包括於本發明的範圍內。該實施例並不以任何方式限制本發明。
實施例實施例I.
引言
製備A蛋白交聯晶體(CLPC)以開發用於純化抗體的革新A蛋白層析系統。A蛋白CLPC將提供高度濃縮的A蛋白活性聯合高的穩定性和耐化學性的優點。濃縮的A蛋白濃度將減少柱的大小、緩衝液體積和處理時間。此外，A蛋白晶體的交聯將防止層析期間A蛋白的浸出。總之,這將減少抗體生產時間和成本。本文的實施例描述了重組A蛋白的結晶(懸滴和分批兩者)和交聯。目的
以開發用於抗體純化的交聯A蛋白晶體。儀器和材料
# 重組 A 蛋白，Repligen Corporation,目錄號 rPA50。
# 重組 A 蛋白，Fitzgerald International，目錄號 30-AP75。# Amicon Ultra-4 離心過濾單兀，Millipore，目錄號 UFC801008。# Nalgene MF75 系列一次性滅菌過濾單兀，0. 2 微米，Fisher Scientific,目錄號 09-740-36K。# pH 電導儀，Denver Instrument, Model 220。# 娃化圓蓋玻片Hampton Research,目錄號 HR3-233。# VDX 平板，Hampton Research,目錄號 H R3_ 140。
8453 紫外-可見光分光光度計，Agilent Technologies。
# 硫酸銨，Fisher Scientific,目錄號 BP212R-1。# 鹽酸溶液，Fisher Scientificsj 目錄號 A481-212。
二甲砷酸鈉三水合物，Sigma-Alctich，目錄號C0250。# 氯化鈉，Fisher Scientific,目錄號 S271-3。 三(輕甲基)氨基甲焼(Trizma 鹼)，Sigma-Aldrichj 目錄號 T- 4661。
DI (反滲透和去離子)H20。# 晶體篩選試劑盒(Crystal Screen Kit), Hampton Research,目錄號HR2-110o# 晶體篩選 2 試劑盒，Hampton Research,目錄號 HR2-112。# JBScreen Classic 1，Jena Bioscience,目錄號 CS-101L。# JBScreen Classic 2，Jena Bioscience,目錄號 CS-102L。# JBScreen Classic 3，Jena Bioscience,目錄號 CS-103L。# JBScreen Classic 4，Jena Bioscience,目錄號 CS-104L。# Wizard I 隨機稀疏矩陣結晶篩選，Emerald BioSystems。# Wizard II 隨機稀疏矩陣結晶篩選，Emerald BioSystems。步驟
重組A蛋白的結晶用懸滴蒸汽擴散結晶法進行。將A蛋白晶體按比例放大至I ml批量大小並交聯。溶液製備 3. 5 M硫酸銨
將46. 2g硫酸銨溶解於100 ml DI H2O中，並將溶液無菌過濾。I M 二甲砷酸鈉 pH 6. 5
將21. 4g 二甲砷酸鈉溶解於80 ml DI H2O中。pH用濃鹽酸溶液調節至6. 5。然後將緩衝溶液用DI H2O調節至100 ml，並用0. 2微米Nalgene過濾單元無菌過濾。5 M氯化鈉
將29. 2 g氯化鈉溶解於100 ml DI H2O中，並將溶液無菌過濾。Wizard II結晶篩選的內部配方4
Wizard II篩選試劑盒的內部配方#4通過將2. 86 ml 3.5 M硫酸銨與0.5 ml I M 二甲砷酸鈉pH 6. 5、0. 2 ml 5 M氯化鈉及I. 44 ml已過濾的DI H2O混合來製備。10 mM Tris-HCl 緩衝液 pH 7
將12.11 g Trizma鹼溶解於80 ml DI H2O中。pH用濃鹽酸溶液調節至7。將緩衝液用DI H2O調節至100 ml並無菌過濾。然後將I M Tris-HCl緩衝液在已過濾的DI H2O中稀釋100倍。A蛋白懸滴結晶
最初的結晶篩選用含50. 6 mg/ml Fitzgerald International的重組A蛋白的DI H2O進行。利用Hampton Research的懸滴蒸汽擴散結晶法(參見參考 文獻)，A蛋白樣品在室溫下在24孔板中以I: I蛋白/試劑比，用以下8種不同的篩選試劑盒篩選JBScreen ClassicUJBScreen Classic 2>JBScreen Classic 3>JBScreen Classic 4>ffizard I>ffizara II、Hampton晶體篩選和Hampton晶體篩選2。晶體篩選還用濃縮至120 mg/ml的A蛋白樣品和Amicon離心過濾單元來進行(蛋白濃度在280 nm處通過分光光度法確定)。A蛋白分批結晶
A蛋白結晶用Fitzgerald International的重組A蛋白並用最初懸滴結晶篩選中產生晶體的條件之一(即Wizard II矩陣結晶篩選配方#4，其包含2M硫酸銨、0. I M ニ甲胂酸鹽緩衝液pH 6. 5和0.2 M NaCl)分批建立。Fitzgerald的A蛋白樣品如「A蛋白懸滴結晶」部分所述濃縮至120 mg/ml,晶體篩選以30 μ I微小批量(microbatch)用上述結晶試劑進行。該批量在6-15天期間在室溫下無翻轉下孵育。分批結晶在相同的結晶條件下還用Repligen Corporation的重組A蛋白製備。然後將A蛋白結晶用Repligen的重組A蛋白(53 mg/ml或120 mg/ml)和Wizard II結晶篩選的內部配方#4按比例放大至0. 5 ml批量。將該批量在6天期間在室溫下孵育。A蛋白晶體用53 mg/ml的Repligen的A蛋白按比例放大至I ml批量。將A蛋白樣品與Wizard II結晶篩選的內部配方#4混合。將樣品在4周期間在室溫下翻轉鮮育。A蛋白晶體的交聯
將含15 mg/ml A蛋白晶體的500 μ I樣品(在Wizard II篩選試劑盒的配方#4中的50%漿液)用20 μ I 25%戊ニ醛(戊ニ醛的終濃度為1%)交聯。將樣品立即渦旋5秒並在室溫下無攪拌下孵育20分鐘。孵育後，將I ml Wizard II結晶篩選的配方#4加入樣品中(戊ニ醛的終濃度為0. 33%)，並將複合物渦旋5秒。然後將樣品在室溫下無攪拌下孵育I小吋。交聯後，將A蛋白樣品在I ml 10 mM Tris-HCl緩衝液pH 7中洗滌3次(以4500rpm進行離心5分鐘)，並將A蛋白交聯晶體(CLPC)重新懸浮於I ml 10 mM Tris-HCl緩衝液pH 7中。結果
A蛋白的懸滴晶體
利用懸滴結晶法，將來自Fitzgerald International的A蛋白晶體用50. 6 mg/ml或120 mg/ml蛋白樣品和用Wizard II結晶篩選的配方# 4製備(圖I)。晶體還用WizardI結晶篩選的配方# 8 (含2 M硫酸銨的檸檬酸鹽緩衝液pH 5.5)以及用以下Wizard II結晶篩選配方製備# 31 (I M檸檬酸鈉，0.1 M Tris-HCl緩衝液pH 7，0. 2 M NaCl)、# 35 (0. 8 M NaH2PO4/1. 2 M K2PO4 的 0. I M 醋酸鹽緩衝液 pH 4. 5)和# 41 (2 M硫酸銨、Tris-HCl緩衝液pH 7,0.2 M硫酸鋰)，數據未顯示。在所有條件中，晶體大小為約5微米，具有軟立方體形狀。A蛋白的分批晶體
如圖2所示,將Repligen Corporation的重組A蛋白用Wizard II結晶篩選的配方# 4以I ml批量結晶。分批結晶產生立方體狀和針狀晶體。立方體狀晶體大小為約10微米，而針狀晶體大小更小。相似的晶體用Repligen Corporation和Fitzgerald International的A蛋白以30 批量獲得，和用R印Iigen的A蛋白以500 批量獲得。交聯A蛋白晶體
Repligen Corporation的A蛋白晶體用交聯劑戍二醒交聯。A蛋白晶體的交聯並不改變晶體的形態或大小(圖3)。參考文獻
-Crystal Growth 101 Literature, Hanging Drop Vapor DiffusionCrystallization (懸滴蒸汽擴散結晶)(2001)，Hampton Research Corporation.
實施例2.
浸出交聯A蛋白晶體的pH控制的溶解度
不同交聯A蛋白晶體的溶解度按照pH從7.5減少至2.0來檢查。將交聯晶體以I mg/ml孵育於50 mM甘氨酸.HCl (pH 2.0)中。在37°C下攪拌孵育5小時後移出等分試樣。在通過2000 rpm離心分離未溶解的交聯晶體並將上清液通過0. 22 U m濾器過濾後，於OD28tlnm處測定可溶性蛋白的濃度。年施例3.
目的
本實驗的目的在於用人IgG確定交聯A蛋白晶體的結合容量。儀器與材料
儀器:
臺式離心機Eppendorf離心機5415D Eppendorf 管 I ml
真空泵
Whatman 濾紙片25mm 目錄號 1825025 天平Mettler Toledo AG285 錐形瓶材料
交聯A蛋白晶體自製
人 IgG :ICN Biomedical, Inc.目錄號 64145 磷酸緩衝鹽水(PBS)片:Sigma目錄號P- 4417 甘氨酸Fluka # 50046 0. IN NaOH: Acros 目錄號 12419-0010
步驟
緩衝液的製備 磷酸緩衝鹽水(PBS)
將I片溶解於200 ml蒸餾水，獲得磷酸緩衝鹽水。0. 2 M 甘氨酸 pH 2. 0
將7. 5 g甘氨酸溶解於90 ml水中。pH用IN鹽酸調節至2. O。體積用DI水補至100mlo隨後檢查pH，若需要的話再次調節至2. O。
實驗步驟:
用於該實驗的交聯A蛋白晶體(CLPC)在pH 7.0的10 mM Tris中。將50 u I CLPC離心以移除上清液。將沉澱重新懸浮於PBS中並用PBS洗滌3次以在PBS中平衡CLPC用於抗體結合。在反應管中向含50 U I CLPC的PBS中加入100 Ul體積的2mg IgG。輕輕混合管中的內容物並在室溫下孵育30分鐘。將管在4500 rpm下離心5分鐘。將上清液(流過液)移出並保留用於分析。將沉澱重新懸浮於100 U I PBS中並於4500 rpm下離心5分鐘。將上清液(洗滌液)移出並保留用於分析。再重複2次該步驟，總計3次洗滌液。將PBS的3次洗滌液(100 u IX3)合併於一管中，總洗漆體積為300 V- I。
將沉澱重新懸浮於83 U I 0. 2 M甘氨酸pH 2. 0中。將重懸液輕輕混合併孵育10分鐘。將重懸液在4500 rpm下離心5分鐘並保留上清液(洗脫液)用於分析。再重複該步驟2次並將3次的甘氨酸洗脫液合併於一管中(總洗脫體積為249 u I)。第三次洗脫後，將沉澱重新懸浮於250 ill 0. IN NaOH中以洗脫不被0. 2M甘氨酸pH 2. 0洗脫的任何殘留的蛋白。將重懸液孵育15分鐘，並在4500 rpm下離心5分鐘。保留上清液(NaOH再生液)用於分析。流過液、洗滌液、洗脫液和NaOH再生液的吸光度在280nm處讀取。然後將CLPC沉澱重新懸浮於100 U I PBS中以進行乾重分析用於確定該實驗中所用A蛋白的量。將Whatman濾紙片稱重並記錄該重量。將濾紙置於已連接到真空的錐形瓶上。在開啟真空時將含100 U I CLPC的PBS加於濾紙上，以將液體引流至燒瓶中。將CLPC用水洗滌5次。將濾紙靜置於真空上一段時間以使其乾燥，然後將其置於烘箱中過夜。次日將濾紙稱重並以毫克計算該實驗中所用的CLPC的量。結果
交聯A蛋白晶體的結合容量計算為每克CLPC結合和洗脫的人IgG的量。實驗各步中IgG的濃度見下表I。表I :不同流分中IgG的濃度
權利要求
1.一種組合物，所述組合物包含A蛋白的結晶形式。
2.一種組合物，所述組合物包含A蛋白的交聯結晶形式。
3.—種純化免疫球蛋白的方法，所述方法包括用權利要求I或權利要求2的組合物接觸所述免疫球蛋白。
4.權利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白為抗體。
5.權利要求4的方法，其中所述抗體為治療性抗體。
6.權利要求4的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
7.權利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白為Fab片段。
8.權利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白為Fe片段。
9.權利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白為單鏈抗體。
10.權利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白為嵌合抗體。
11.權利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白為完全人抗體。
12.權利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白為人源化抗體。
13.權利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白屬於IgG類。
14.權利要求2的組合物，其中所述組合物用戊二醛交聯。
15.一種試劑盒，所述試劑盒包含權利要求I或2的組合物。
16.權利要求15的試劑盒，其中所述試劑盒包含書面說明書，其描述了A蛋白的結晶形式和/或交聯結晶形式的用途。
17.一種柱，所述柱包含權利要求I或2的組合物。
18.權利要求2的組合物，其中所述晶體比A蛋白的固定化形式更有活性(結合容量)。
19.權利要求2的組合物，其中所述晶體在約pH2-約pH 12是有活性(結合容量)並穩定的。
20.權利要求2的組合物，其中所述晶體與固定化A蛋白相比具有0.0%蛋白浸出。
21.權利要求I或2的組合物，其中所述組合物作為柱材料用於預填充柱。
22.權利要求I或2的組合物，其中所述組合物用於膜(浸潰的)。
23.權利要求I或2的組合物，其中所述組合物用於體外裝置。
24.一種用於純化免疫球蛋白的方法，其包括 (a)將包含免疫球蛋白的介質與具有在約pH7.0-pH 10範圍內的pH並包含陽離子和陰離子的組合的緩衝溶液混合，以提供緩衝的免疫球蛋白介質； (b)將所述緩衝的免疫球蛋白介質與固定化A蛋白(A蛋白-CLPC:通過使A蛋白分子結晶和交聯來固定化A蛋白)吸附劑接觸以在所述固定化A蛋白吸附劑上吸附所述緩衝的免疫球蛋白介質中存在的免疫球蛋白； (c)用所述緩衝溶液洗滌其上吸附有免疫球蛋白的A蛋白-CLPC吸附劑； (d)將其上吸附有免疫球蛋白的所述A蛋白-CLPC吸附劑與pH在約pH2-pH 6範圍內的緩衝溶液接觸以從A蛋白-CLPC吸附劑中移出被吸附的免疫球蛋白；和 (e)以基本純的形式回收移出的免疫球蛋白。
25.權利要求24的方法，其中所述緩衝的免疫球蛋白介質與所述A蛋白-CLPC吸附劑的接觸在所述A蛋白-CLPC吸附劑的柱中完成。
26.權利要求24的方法，其中所述包含免疫球蛋白的介質為正常的哺乳動物血清。
27.權利要求24的方法，其中所述包含免疫球蛋白的介質為免疫哺乳動物血清。
28.權利要求24的方法，其中所述介質為哺乳動物血漿。
29.權利要求24的方法，其中所述介質為哺乳動物的腹水液。
30.權利要求24的方法，其中所述介質獲自雜交瘤。
31.權利要求24的方法，其中所述介質為組織培養液。
32.權利要求24的方法，其中所述介質為細胞培養液。
33.權利要求24的方法，其中所述介質為哺乳動物細胞培養液。
34.權利要求24的方法，其中所述介質為細菌細胞培養液。
35.權利要求24的方法，其中所述介質為轉基因來源的液體。
36.權利要求24的方法，其中所述介質為包含免疫球蛋白的植物提取物。
37.權利要求13的方法，其中所述介質為酵母培養液。
38.一種利用懸滴蒸汽擴散結晶法或分批結晶法製備A蛋白的結晶形式的方法，所述方法包括以下步驟 (a)以1:1蛋白試劑比將A蛋白置於去離子水中，其中所述試劑選自包含2M硫酸銨、0.I M 二甲胂酸鹽緩衝液pH 6. 5和0. 2 M氯化鈉的組合物；包含含2 M硫酸銨的檸檬酸鹽緩衝液PH 5. 5的組合物；包含I M檸檬酸鈉、0. I M Tris-HCl緩衝液pH 7和0. 2 M氯化鈉的組合物；包含含0. 8 M NaH2PO4/1. 2 M K2PO4的0. I M醋酸鹽緩衝液pH4. 5的組合物；以及包含2M硫酸銨、Tris-HCl緩衝液pH 7和0. 2M硫酸鋰的組合物；和 (b)溫育直至形成晶體。
39.權利要求38的方法，其中步驟(a)的A蛋白在去離子水中的濃度為約50.6 mg/ml或約120 mg/ml A蛋白。
40.一種製備A蛋白的交聯結晶形式的方法，所述方法包括將A蛋白的結晶形式與戊二醛混合。
41.權利要求40的方法，其中所述戊二醛的終濃度為約1%。
42.一種純化方法，所述方法包括將待純化的物質與權利要求I或2的組合物接觸。
全文摘要
本發明描述了A蛋白晶體和A蛋白交聯蛋白晶體(CLPC)。本文還公開了製備方法及使用方法。
文檔編號C07K1/14GK102753570SQ201080051667
公開日2012年10月24日 申請日期2010年9月13日 優先權日2009年9月15日
發明者巴米·謝諾伊, 瑪格麗特·麥格拉思, 納澤爾·卡拉夫, 西比爾·巴拉迪, 裡納·帕特爾, 錢査爾·蘭德哈瓦 申請人:阿爾泰亞科技公司