利用電化學檢測血紅素或血比容的方法及檢測試片的製作方法

2023-12-06 13:26:31 3

專利名稱：：利用電化學檢測血紅素或血比容的方法及檢測試片的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種利用電化學檢測血紅素濃度的方法及檢測試片，特別是有關於一種利用電化學檢測全血檢體的血紅素濃度的方法及檢測試片。
背景技術：
：血液檢測中，除了血糖與膽固醇之外，血紅素亦為一項重要的生化檢測標的。目前用於檢測血紅素的方法包括測量全血的比重的硫酸銅比重法；利用血紅素中的部分結構Heme具有過氧化酶活性，而進行氧化還原反應的化學法；利用HbAl的抗體偵側糞便中血紅素的免疫法；利用一氧化碳與血紅素結合進行檢測的氣測法；利用鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)將血紅素轉成變性血紅素，再與氰化鈉(NaCN)或氰化鉀(KCN)形成氰基變性血紅素，於特定波長條件下測量吸光質的氰化高鐵血紅素法等，上述方法仍有諸多缺點。例如，採用光學儀器設備進行檢測，由於需要大量檢體，且檢體樣品在進行檢測儀器檢測前還需經過預處理，以免後續分析受吸光值的幹擾等而影響檢測結果。上述檢測方法不僅費時、需要大量檢體或非血液檢體，另一方面，氰化高鐵血紅素的不穩定性，常影響準確性，而氰化鉀的劇毒性則會造成健康危害問題。電化學檢測，特別是電化學檢測片，由於其製造簡單、價格低廉、使用廣泛且攜帶方便等，已逐漸成為生化檢測的重要方法。美國第7,138,041專利揭示一種利用電化學進行檢測的感測試片，然而，該專利並未揭示如何改善電子傳遞物質的溶解特性，而直接用於血紅素檢測。因此，仍需要一種利用電化學，使用少量檢體即可快速且精確檢測血紅素的檢測方法與檢測試片
發明內容本發明的主要目的是提供一種利用電化學方法檢測血液或水溶液檢體中血紅素濃度的方法及檢測試片。本發明的另一目的是提供一種利用電化學方法快速地檢測血液或水溶液檢體中血紅素濃度的方法及檢測試片。本發明的另一目的是提供一種利用電流與血紅素濃度的反比關係檢測檢體中血紅素濃度或血比容的方法及檢測試片。本發明的又一目的是提供一種利用電流與時間積分的電量值與血紅素濃度的反比關係檢測檢體中血紅素濃度或血比容的方法及檢測試片。為達到上述及其他目的，本發明提供一種利用電化學檢測血紅素或血比容的方法，包括(i)使檢體與試劑接觸，該試劑包括緩衝溶液、介面活性劑、及經環狀糊精改質的四硫富瓦烯或二甲基二茂鐵等電子傳遞物；(ii)在定電位條件下，測量檢體中血紅素與電子傳遞物進行反應所產生的電流；以及(iii)根據所測量的電流換算檢體中的血紅素濃度。本發明的檢測方法是利用經環狀糊精改質的四硫富瓦烯或二甲基二茂鐵作為電子傳遞物，在定電位條件下直接與檢體中的血紅素進行反應，利用電流或電流與時間積分的電量值與血紅素濃度的反比關係，可以快速地檢測血液或水溶液檢體中的血紅素濃度，或進一步用於計算血液檢體的血比容。本發明還提供一種用於檢測血紅素的試片，包括具有第一表面與相對第二表面的絕緣基材；形成於該絕緣基材第一表面的電極組，該電極組包括形成於該絕緣基材第一表面與陰極接頭連接的工作電極，以及與陽極接頭連接的參考電極；局部覆蓋於該絕緣基材第一表面，且至少暴露出部分電極組形成電極反應區之間隔層；以及形成於該電極反應區的試劑層，該試劑層包括緩衝溶液、介面活性劑、及電子傳遞物質，其中，該電子傳遞物質是經環狀糊精改質的四硫富瓦烯或二甲基二茂鐵。圖1為顯示本發明檢測試片的第一具體實施例圖2為顯示本發明檢測試片的第二具體實施例圖3為顯示本發明檢測試片的第三具體實施例圖4為顯示本發明檢測試片的第四具體實施例圖5顯示測試例2的結果；以及圖6顯示測試例3的結果。主要元件符號說明100、200、300、400檢測試片101、201、301、401絕緣基材101a、401a第一表面101b、401b第—表面102、202、302、402電極組102a、202a、302a工作電極102a,、202a，陰極接頭102b、202b、302b參考電極102b，、202b，陽極接頭103、203、303、403間隔層103a開孔104、204、304、404反應區204，導電區105、205、305、405試劑層203a、303a、403a檢體導流槽206、306、406第二間隔層206，、306，、406'開孔207、307、407上蓋層302，導電層302c輔助電極303b、403b排氣溝槽402，銀膠導電層402"碳膠402，"銀/氯化銀膠403'絕緣膠404反應區405試劑層406第二間隔層406，開孔407上蓋層具體實施例方式本發明利用電化學檢測血紅素的方法，先使檢體與至少包括緩衝溶液、介面活性劑及電子傳遞物的試劑接觸。本發明的方法可使用血液檢體或水溶液檢體進行檢測，該血液檢體包括全血檢體、血漿檢體、或血清檢體。在一具體實施例中，使用全血檢體進行檢測，全血檢體與試劑接觸後，試劑中的介面活性劑會與紅血球作用，使紅血球中的血紅素釋放出來。接著，在定電位條件下，釋放出來的血紅素會氧化試劑中的電子傳遞物，直接與電子傳遞物進行反應。本發明方法所使用的試劑中，該緩衝溶液主要用於維持特定範圍的pH值，通常用於維持4至9的pH值，較佳維持6至8的pH值。該緩沖溶液的實施例包括，但非限於磷酸鹽緩衝溶液、醋酸鹽緩衝溶液、及檸檬酸鹽緩衝溶液等。一般而言，緩衝溶劑的濃度介於10至1000毫摩爾，較佳介於30至200毫摩爾。該試劑中的介面活性劑實施例包括，但非限於Tween-20、Tween-80、TritonX-IOO、Surfynol、及Mega8等。通常，該介面活性劑的濃度介於0.001。/o(w/v)至10。/。(w/v)，較佳介於0.1至5。/o(w/v)。本發明所使用的試劑中，可進一步含有溼潤劑，例如纖維素、羥乙基纖維素、聚乙醇、聚乙烯醇、乙烯聚合物、吡咯垸酮、或明膠等。本發明的方法是使用環狀糊精改質的四硫富瓦烯或二甲基二茂鐵作為電子傳遞物。該環狀糊精的實施例包括，但非限於經1至6個碳原子的烷基取代、經1至6個碳原子的羥垸基取代、及/或經麥芽糖基取代、或未經取代的a-環狀糊精、P-環狀糊精、，環狀糊精或其水溶性改質衍生物。由於經改質的四硫富瓦烯在常溫下亦具有優異的溶解性，在定電位條件下能直接與檢體中的血紅素進行氧化反應，通過測量反應所產生電流檢測血紅素。在該具體實施例中，在介於0至1.5伏特範圍內的定電位條件下，較佳介於0.3至1.2伏特範圍內的定電位條件下，測量檢體中血紅素與電子傳遞物進行反應所產生的電流。根據血紅素與改質的四硫富瓦烯電子傳遞物所產生的穩定態電流或電流與時間積分的電量值與檢體中的血紅素濃度之間的反比關係，通過測量改質四硫富瓦烯電子傳遞物的氧化反應穩定態電流或電流與時間積分的電量值即可換算檢體中的血紅素濃度或進一步計算血比容。圖1顯示本發明用於檢測血紅素試片的第一具體實施例。在該具體實施例中，該檢測試片100包括絕緣基材101，具有第一表面101a與相對第二表面101b;電極組102，包括形成於該絕緣基材第一表面101a與陰極接頭102a'連接的工作電極102a，以及與陽極接頭102b，連接的參考電極102b;局部覆蓋於該絕緣基材第一表面101a的第一間隔層103，該第一間隔層103暴露出部分電極組102，形成電極反應區104;以及形成於該電極反應區的試劑層105，該試劑層包括緩衝溶液、介面活性劑、及經環狀糊精改質的四硫富瓦烯或二甲基二茂鐵電子傳遞物質。在該具體實施例中，使用絕緣基材作為檢測試片的底板。該絕緣基材可為軟性材料，例如絕緣性高分子材料；或剛性材料，例如陶瓷材料、玻璃、或玻璃纖維等。該絕緣基材的實例包括，但非限於聚碳酸酯、聚酯、聚醚、聚醯胺、聚胺酯、聚亞胺、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、玻璃、玻璃纖維、二氧化矽、二氧化鋁等。一般而言，該絕緣基材底板的寬度通常介於3至15毫米的範圍內，較佳介於5至10毫米的範圍內；該基材底板的厚度通常介於50至800微米的範圍內，較佳介於200至400微米的範圍內；該基材底板的長度通常介於1至8釐米的範圍內，較佳介於2至5釐米的範圍內。本發明的件測試片100中，該導電性材料，例如銀膠，是利用網版印刷的方式形成於該絕緣基材的第一表面，形成導線區，用以連接電極與基材底板，刷上碳膠以及銀/氯化銀膠形成包括工作電極與參考電極的電極組。接著，在該形成有電極的絕緣基材第一表面粘設間隔層103，該間隔層具有一開孔103a，暴露出部分電極組，形成電極反應區104。含有緩衝溶液、介面活性劑、及經環狀糊精改質的四硫富瓦烯電子傳遞物質的試劑層105，則被設置於該電極反應區104，與檢體接觸後會使紅血球中的血紅素釋放出來。在定電位條件下，釋放出來的血紅素會氧化試劑中的電子傳遞物，直接與試劑中的電子傳遞物進行氧化反應，產生電流。在該具體實施例中，在介於0至1.5伏特範圍內的定電位條件下，較佳介於0.3至1.2伏特範圍內的定電位條件下，測量檢體中血紅素與電子傳遞物進行反應所產生的電流。根據血紅素與改質的四硫富瓦烯電子傳遞物所產生的穩定態電流或電流與時間積分的電量值與檢體中的血紅素濃度之間的反比關係，通過測量改質四硫富瓦烯電子傳遞物與血紅素進行氧化反應的穩定態電流或電流與時間積分的電量值，即可換算檢體中的血紅素濃度或進一步計算血比容。圖2為顯示本發明用於檢測血紅素試片的第二具體實施例。在此具體實施例中，該檢測試片200包括具有第一表面與相對第二表面的絕緣基材201;通過導電層202'形成於該絕緣基材第一表面的電極組202，該電極組包括與陰極接頭202a'連接的工作電極202a以及與陽極接頭202b'連接的參考電極202b;局部覆蓋於該絕緣基材第一表面的間隔層203，該間隔層203除露出部分電極組202形成電極反應區204之外，同時暴露出陰極接頭202a'與陽極接頭202b'形成導電區204';試劑層205設置於該電極反應區204，該試劑層205含有緩衝溶液、介面活性劑、及經環狀糊精改質的四硫富瓦烯電子傳遞物質；第二間隔層206設置於試劑層上；以及用以覆蓋試片200的上蓋層207。於此具體實例中，該間隔層203對應反應區204部分形成有檢體導流槽203a，允許檢體通過毛細與虹吸作用填滿電極反應區204，與試劑層205中的電子傳遞物質進行反應。該第二間隔層206對應反應區204部分則形成有開孔206'與上蓋層207以及電極反應區204形成內部體積0.5至5微升的封閉空間，較佳形成內部體積0.5至4微升的封閉空間，更佳形成內部體積約1至2微升的封閉空間，該封閉空間可用以控制檢體體積，具有檢體填充定位以及防止汙染的功能。此外，根據檢體流動方向設計電極分布，使檢體在進入反應區時，工作電極最先與檢體接觸，輔助電極則最後與檢體接觸，當檢體尚未填滿兩個電極時阻抗值無限大，檢體填滿兩個電極時阻抗值急劇減小，運用電流、電位、或電阻值的監控，確認檢體是否填滿反應區的封閉空間。確定檢體已確實填滿反應區的封閉空間後，再進行分析。圖3為顯示本發明用於檢測血紅素試片的第三具體實施例。在此具體實施例中，該檢測試片300包括具有第一表面與相對第二表面的絕緣基材301;通過導電層302'形成於該絕緣基材第一表面的電極組302，包括工作電極302a、參考電極302b、與輔助電極302c;局部覆蓋於該絕緣基材第一表面的間隔層303，該間隔層303露出部分電極組302形成電極反應區304;位於該電極反應區304的試劑層305，該試劑層305含有緩衝溶液、介面活性劑、及經環狀糊精改質的四硫富瓦烯電子傳遞物質；設置於試劑層305上的第二間隔層306;以及用以覆蓋試片300的上蓋層307。在此具體實施例中，該間隔層303對應反應區304部分形成有檢體導流槽303a以及排氣溝槽303b，允許檢體通過毛細與虹吸作用填滿電極反應區304，與試劑層305中的電子傳遞物質進行反應。該第二間隔層306對應反應區304部分則形成有開孔306，與上蓋層307以及電極反應區304形成封閉空間，該封閉空間可用以控制檢體體積，具有檢體填充定位以及防止汙染的功能。圖4為顯示本發明用於檢測血紅素試片的第四具體實施例。在此具體實施例中，該檢測試片400系包括絕緣基材401，具有第一表面401a與相對第二表面401b;電極組402，該電極組包括依序形成於該絕緣基材第一表面401a的銀膠導電層402'、碳膠402"與銀/氯化銀膠402"'所組成的工作電極與參考電極；通過絕緣膠403'局部覆蓋於該絕緣基材第一表面的間隔層403，該間隔層403露出部分電極組402形成電極反應區404;位於該電極反應區404的試劑層405，該試劑層405含有緩衝溶液、介面活性劑、及經環狀糊精改質的四硫富瓦烯電子傳遞物質；設置於試劑層405上的第二間隔層406;以及用以覆蓋試片400的上蓋層407。在此具體實例中，該間隔層403對應反應區404部分系形成有檢體導流槽403a以及排氣溝槽403b，允許檢體通過毛細與虹吸作用填滿電極反應區404，與試劑層405中的電子傳遞物質進行反應。該第二間隔層406對應反應區404部分則形成有開孔406，與上蓋層407以及電極反應區404形成封閉空間，該封閉空間可用以控制檢體體積，具有檢體填充定位以及防止汙染的功能。本發明的檢測試片僅需使用至少約0.5微升的少量檢體，5至10秒的反應時間，即可快速且準確地檢測血紅素，或進一步計算血比容。以下通過具體實施例進一步說明本發明的特點與功效，但並非用於限制本發明的範疇。實施例製備例1將0.102克(0.5毫摩爾)的四硫富瓦烯(tetrathiafiilvalene，TTF)、2.555克(1.75毫摩爾)的羥丙基甲基-P-環狀糊精、及10毫升的去離子水加入避光的深色容器內，在室溫下攪拌過夜。然後，以6000轉的轉速離心10分鐘，取上清液，獲得包括50mM的TTF以及175mM的羥丙基甲基-P-環狀糊精的電子傳遞物溶液。製備例2使用聚對苯二甲酸酯底板基材，利用網板印刷將導電銀膠印製於基材表面，在6(TC條件下乾燥5分鐘，形成導電銀膠層。接著，利用網板印刷方式刷上碳膠，在6(TC條件下乾燥5分鐘，形成工作電極；再利用網板印刷方式刷上銀/氯化銀膠，在6(TC條件下乾燥5分鐘，形成參考電極。然後，刷上絕緣膠，在105-C條件下乾燥5分鐘，再貼上具有檢體導流槽以及排氣溝槽的間隔薄片。將5微升的反應試劑塗覆於檢體導流槽，該反應試劑含有10mM的電子傳遞物溶液(製備例1)、2%的聚乙烯基吡咯垸酮、50mM的磷酸鉀緩衝溶液(pH8.0)、10-100mM的氯化鉀、1%的TritonX-IOO、及0.5%的碳酸甲基纖維，在50°C的條件下乾燥15分鐘後，貼上第二間隔薄片，再用透明上蓋片壓合固著即為試片樣品1。製備例3重複製備例2，將反應試劑中的電子傳遞物溶液改為5mM，即為試片樣品2。製備例4重複製備例2，將反應試劑中的10mM電子傳遞物溶液(製備例1)改為5mM的四硫富瓦烯溶液，即為試片樣品3。測試例1取新鮮靜脈血，經離心重新調整為0至26.6g/dL不同血紅素的檢體樣品，分別使用試片樣品1進行測試。每次測試時，注入2微升的檢體，使用電化學分析儀(CHInstrumentCo.,Model620A)在測試電位900毫伏的條件下進行試片樣品測試，測試時間5秒鐘，同時以參考儀器SysmexK-800分析結果，結果如表1所示。表1tableseeoriginaldocumentpage12測試例2取新鮮靜脈血，經離心重新調整為0至26.6g/dL不同血紅素的檢體樣品，分別使用試片樣品2與試片樣品3(比較例)進行測試。每次測試時，注入2微升的檢體，使用電化學分析儀(CHInstrumentCo.，Model620A)在測試電位900毫伏的條件下進行試片樣品測試，測試時間5秒鐘，同時以參考儀器SysmexK-800分析結果，結果如圖5所示。根據圖5結果顯示，使用未經羥丙基甲基-P-環狀糊精改質的四硫富瓦烯作為電子傳遞物的血紅素試片無法順利區別6.6至27g/dL的血紅素濃度，而使用經羥丙基甲基-P-環狀糊精改質的四硫富瓦烯作為電子傳遞物的血紅素試片則有很高的電流信號與良好的檢量性，顯示使用環狀糊精改質的四硫富瓦烯作為電子傳遞物，在血紅素檢測方面具有無法預期的增進功效。測試例3使用實施例1的試片樣品，以虹吸的原理吸入不同體積靜脈血檢體，重複測試例1的步驟進行檢測。如圖6所示，本發明的試片確實具有控制檢體體積的功效，注入2微升的大量檢體進行檢測，仍可測出正確血紅素濃度。權利要求1、一種利用電化學檢測血紅素或血比容的方法，包括下列步驟使檢體與試劑接觸，該試劑包括緩衝溶液、介面活性劑、及經環狀糊精改質的四硫富瓦烯或二甲基二茂鐵電子傳遞物；在定電位條件下，測量檢體中血紅素與電子傳遞物進行反應所產生的電流；以及根據所測量的電流換算檢體中的血紅素濃度。2、根據權利要求1所述的方法，其中，該緩衝溶液用於使pH值維持在4至9的範圍。3、根據權利要求1所述的方法，其中，該環狀糊精選自經過具有l至6個碳原子的垸基取代、經過具有1至6個碳原子的羥烷基取代、及/或經過麥芽糖基取代或未經取代的a-環狀糊精、P-環狀糊精、Y-環狀糊精及其改質衍生物所構成的組群。4、根據權利要求1所述的方法，其中，該檢體中血紅素與電子傳遞物在介於0至1.5伏特的定電位條件下進行反應。5、一種用於檢測血紅素的試片，包括絕緣基材，具有第一表面與相對第二表面；電極組，包括形成於該絕緣基材第一表面與陰極接頭連接的工作電極，以及與陽極接頭連接的參考電極；間隔層，局部覆蓋於該絕緣基材第一表面，至少暴露出部分電極組，形成電極反應區；以及試劑層，設置於該電極反應區，該試劑層包括緩衝溶液、介面活性劑、及電子傳遞物質，其中，該電子傳遞物質系經環狀糊精改質的四硫富瓦烯或二甲基二茂鐵。6、根據權利要求5所述的試片，其中，該電極組還包括輔助電極。7、根據權利要求5所述的方法，其中，該緩衝溶液用於使pH值維持在4至9的範圍。8、根據權利要求5所述的試片，其中，該環狀糊精選自經過具有l至6個碳原子的垸基取代、經過具有1至6個碳原子的羥烷基取代、及/或經過麥芽糖基取代或未經取代的a-環狀糊精、(3-環狀糊精、Y-環狀糊精及其改質衍生物所構成的組群。9、根據權利要求5所述的試片，還包括設置於試劑層上的第二間隔層以及用以覆蓋試片的上蓋層，其中，該第二間隔層對應反應區部分形成有開孔與上蓋層以及電極反應區形成內部體積0.5至5微升的封閉空間。10、根據權利要求5所述的試片，其中，該第二間隔層形成有檢體導流槽。11、根據權利要求5所述的試片，其中，該第二間隔層形成有排氣溝全文摘要一種利用電化學檢測血紅素或血比容的方法及檢測試片，該檢測方法包括(i)使檢體與試劑接觸，該試劑包括緩衝溶液、介面活性劑、及經環狀糊精改質的四硫富瓦烯電子傳遞物；(ii)在定電位條件下，測量檢體中血紅素與電子傳遞物進行反應所產生的電流；以及(iii)根據所測量的電流換算檢體中的血紅素濃度。該方法是利用經環狀糊精改質的四硫富瓦烯作為電子傳遞物，在定電位條件下直接與檢體中的血紅素進行反應，利用電流或電流與時間積分的電量值與血紅素濃度的反比關係，可以快速地檢測全血檢體中的血紅素濃度，或進一步用於計算血液檢體的血比容。文檔編號G01N27/26GK101430336SQ20071016585公開日2009年5月13日申請日期2007年11月5日優先權日2007年11月5日發明者吳太光,蘇建雄申請人:勤立生物科技股份有限公司