檢測堆肥中毒莠定的免疫傳感器及其製作和使用方法

2023-12-06 13:23:26 1

專利名稱：：檢測堆肥中毒莠定的免疫傳感器及其製作和使用方法
技術領域：
：本發明涉及一種免疫傳感器及其製備方法，還涉及免疫電泳法在有機汙染物的檢測分析中的應用。
背景技術：
：持久性有機汙染物(POPs)是一類具有環境持久性、生物累積性、長距離遷移能力和高生物毒性的特殊汙染物，它們對全球的生態環境和人類健康危害巨大，正在隱性侵蝕人類，它們具有致癌性、致突變性、致畸性、神經毒性、生殖毒性、內分泌幹擾特性，致免疫功能減退特性等。2001年，在瑞典首都斯德哥爾摩籤署的《關於持久性有機汙染物的斯德哥爾摩公約》中，首批被列入公約控制的12類有機汙染物均屬於有機氯化合物。有機氯化合物這類被廣泛使用的有機物，能在環境中長時間存在並且具有廣譜毒性。毒莠定，是一種有機氯化合物除草劑，因其功能上可以模仿植物生長素或吲哚酸激素的作用而抑制植物蛋白的合成，被廣泛用於控制農田、牧場、果園及道路旁的雜草。達到一定濃度的毒莠定，可影響人類的中樞神經，損害生殖系統，並引起其他健康問題，很多國家已經限制毒莠定的使用。毒莠定在我國的使用比較廣泛，而城市生活垃圾堆肥系統的處理源也很廣泛，因此會涉及含有毒莠定的垃圾的處理。為了完善堆肥化的控制，有必要對堆肥過程中的毒莠定進行實時監測和分析。目前，對於毒莠定含量的測定採用較多的有液相色譜法、氣相色譜法等方法，這些方法一般要求檢測對象純度很高，且檢測前需要對樣品進行分離，分離過程通常需要預處理，比較繁瑣和耗時；此外檢測儀器比較昂貴，且不便攜帶，不能進行實時檢測。現在也有用放射性免疫分析法(RIA)和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定毒莠定含量，但是由於RIA需要放射性元素的標記，容易對環境產生汙染，並對操作人員的身體產生危害；而ELISA需要多次洗滌及試劑轉移過程，分析步驟多、誤差大，不便於分析系統集成化、微型化及信號適時的輸出。免疫分析技術是將抗原抗體高度特異性反應與示蹤物高靈敏性和精確性有機結合的一種分析技術。根據示蹤物的性質不同，可採用不同的檢測手段進行分析測定。酶聯免疫傳感器是應用免疫分析技術進行分析檢測的一種很好的手段和工具，具有靈敏高效的特點，常用於標記識別的酶有辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、鹼性磷酸酶等。而漆酶(laccase，EC1.10.3.2)，因為可以催化空氣中的氧氣直接氧化分解酚類以及它們的衍生物，無須加入其它的輔助劑激活酶聯免疫分析體系，因此如何結合漆酶與酶聯免疫傳感器各自的優勢，建立一種更加方便、快速的檢測方法，以實現對目標物質(例如堆肥過程中的毒莠定)的快速測定，便成為本領域改進檢測分析手段的一個新的進路。
發明內容本發明旨在克服現有技術手段的不足，提供一種能有效檢測堆肥中毒莠定的免疫傳感器及其製備方法，還提供一種快速、簡便、靈敏度高、選擇性好、成本低的利用該免疫傳感器對堆肥中毒莠定含量進行檢測的方法。為解決上述技術問題，本發明通過將毒莠定抗體與磁性納米顆粒交聯，並運用電化學原理，提供了一種檢測堆肥中毒莠定的免疫傳感器，其包括碳糊電極和塗覆在碳糊電極表面的敏感物質，其特徵在於所述碳糊電極包括碳棒和PVC管，碳棒內置於PVC管中，碳棒一端通過電線引出PVC管，碳棒另一端與磁體相接觸，磁體與PVC管管口間填充有碳糊，塗覆在碳糊電極表面的敏感物質為毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒交聯體。本發明還提供一種上述免疫傳感器的製備方法，包括以下步驟(1)製作碳糊電極在PVC管中放入碳棒，緊鄰碳棒一端且距PVC管管口8mm處置入磁體，形成磁性區域，再用碳糊將管口封閉，碳棒另一端通過電線引出PVC管，得到帶磁性的碳糊電極；(2)碳糊電極的表面處理將上述碳糊電極表面拋光，然後用水衝洗電極表面，再依次用硝酸、丙酮、水進行超聲清洗，最後再用緩衝液衝洗，自然晾乾；(3)毒莠定抗體-磁性納米顆粒交聯體的製備氮氣保護下，製備Fe304膠狀沉澱，然後加入聚乙二醇、正矽烷乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基矽烷、戊二醛完成矽垸化和功能化，再將毒莠定抗體交聯到Fe304磁性納米顆粒表面製得毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒交聯體；(4)毒莠定抗體-磁性納米顆粒交聯體的塗覆將上述毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒交聯體滴塗在電極表面，利用順磁性將毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒吸附在碳糊電極表面上，這樣便於分離和再生，而且操作簡單；滴塗後置於空氣中乾燥，再用緩衝液衝洗，低溫貯存備用。上述步驟(3)中用到的毒莠定抗體通過以下方法製備得到將毒莠定與牛血清蛋白交聯，合成人工抗原，注射入兔子體內，經2個月的培養，獲得高效價的毒莠定抗血清，經提純後得到毒莠定抗體。將毒莠定抗體與磁性納米粒子交聯固定在電極表面製得上述的免疫傳感器，再利用抗原抗體之間的特異反應，在電極表面上吸引毒莠定，然後利用免疫反應標記上漆酶-毒莠定抗體(即酶標抗體)，便可進行信號識別和定量分析(見圖2)。因為酶標抗體上標記的漆酶可以催化空氣中的氧氣直接氧化分解對苯二酚，當在電解池中加入對苯二酚後，漆酶使對苯二酚上的一個羥基失去H+，變成雙鍵的羰基，再由電極表面提供電子使其還原，這一過程會產生可檢測的響應信號達到識別目的，並根據所產生的信號的強弱對應毒莠定的含量，從而實現對毒莠定的快速測定。根據該工作原理，本發明還提供了一種利用上述免疫傳感器對堆肥中的毒莠定進行檢測的方法，其特徵在於首先將免疫傳感器用封閉液封閉30分鐘;接著在37'C下將免疫傳感器的感應部浸入含有毒莠定的堆肥浸出液中，使其反應30分鐘；然後在室溫下與漆酶-毒莠定抗體(毒莠定抗體與漆酶交聯後製得)反應60分鐘；最後以對苯二酚為底物，在接有三電極系統的電解池中進行檢測，所述免疫傳感器作為三電極系統的工作電極，利用檢測到的電流變化值和線性回歸方程計算毒莠定的含量；所述線性回歸方程為y=(1.571±0.1048)x+(12.2283±0.1139)其中，^為電流變化值，單位是pA;x為毒莠定濃度值，單位是嗎'mL";毒莠定濃度值的線性範圍為0.0110Hg'm1/1，檢測下限為lX10g'mL—1。本發明還考察了毒莠定的測定反應條件，發現在還原電位-0.139V下，在溶液pH值範圍為4.05.0,毒莠定濃度為1Xl(T82(Vg'mU1時，電流對毒莠定的響應比較顯著。最佳條件是在pH為4.6的磷酸鹽緩衝溶液中，通過電流變化測定毒莠定的含量。上述線性回歸方程即是在最佳測定反應條件下建立的，具體來說是用計時電流法測定出不同堆肥浸出液樣品中的電流變化(如圖3)，再根據電流變化曲線和各浸出液樣品中毒莠定濃度的實驗值，建立電流變化值與毒莠定濃度值之間的線性關係(如圖4)，該線性回歸方程便可作為以後毒莠定濃度計算的依據。上述三電極系統是以修飾了毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒交聯體的碳糊電極(即免疫傳感器，直徑8mm)作為工作電極(見圖1)，以飽和甘汞電極作為參比電極，以鉑片電極作為對電極，所有檢測工作均在室溫(25°C)下完成。與現有技術相比，本發明的優點在於將毒莠定抗體與Fe304磁性納米顆粒交聯，運用電化學原理，提供了一種測定毒莠定含量的電流型免疫傳感器，該免疫傳感器利用了抗原抗體高度特異性反應的特點，具有高效的抗幹擾能力和精確的目標物識別能力，是一種快速、簡便、有效的分析手段和工具。利用本發明的免疫傳感器和本發明的檢測方法對毒莠定、二氯喹啉酸、吡啶、二氯吡啶酸、綠草定等進行了檢測，發現對毒莠定的特異反應良好，能夠有效、簡便、快速地檢測堆肥中毒莠定含量，檢測下限達到lX10—^^mL—1，預，值與實驗值的擬合度R2達到0.9782。本發明提高了毒莠定測定的靈敏性和抗幹擾能力，—J以更好地應用到城市生活垃圾堆肥處理中，為城市生活垃圾堆肥控制系統中快速、低成本的毒莠定含量在線檢測提供了技術支持，解決了堆肥過程控制系統中的實時在線監測問題。圖1為本發明免疫傳感器的結構示意圖；圖2為毒莠定免疫檢測的機理流程圖3為用計時電流法檢測不同濃度的毒莠定得到的電流變化曲線圖4為毒莠定含量與電流變化的線性回歸圖。圖例說明1、電線2、PVC管3、碳棒4、磁體5、碳糊6、毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒層具體實施例方式實施例利用本發明的免疫傳感器和檢測方法對3組含毒莠定的堆肥浸出液待測樣品進行測定，其檢測步驟及檢測結果如下1、免疫傳感器的製備如圖1所示，首先製作碳糊電極，在PVC管2中放入碳棒3，緊鄰碳棒3—端且距PVC管2管口8mm處放入磁體4，形成磁性區域，再用碳糊5將管口封閉，碳棒3另一端通過電線1引出PVC管2，得到帶磁性的碳糊電極；將電極表面拋光，然後用水衝洗電極表面，再依次用HN03(質量分數為50%)、丙酮、水進行超聲清洗，最後再用磷酸鹽緩衝液衝洗，自然晾乾；然後在氮氣保護下，製備Fe304膠狀沉澱，加入聚乙二醇、正矽垸乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基矽垸、戊二醛完成矽垸化和功能化，再將毒莠定抗體交聯到Fe304磁性納米顆粒表面製得毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒交聯體；最後將毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒交聯體滴塗在電極表面，形成毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒層6(即感應部)，空氣中乾燥l小時，用磷酸鹽緩衝液衝洗，去掉未固定的毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒，置於4'C貯存備用。2、堆肥條件堆料中含以下組分取樣於嶽麓山東側表層以下lm處的土壤218g、稻草2600g、食堂殘餘物988g以及麩皮52g，堆料的碳氮比為30/1，含水率65%。對堆料混合後進行好氧堆肥40天。3、堆肥浸出液製備取上述堆肥樣10g置於錐形瓶中，加入200mL蒸餾水，在37'C下振蕩120min，速度200r/min，過濾後將濾液離心5min，10000r/min，上清液過濾即得到堆肥浸出液。取180ml的堆肥浸出液將其等分為三組，往每組堆肥浸出液中加入毒莠定，配製成濃度分別為0.032嗎'1111;1、0.29嗎'ml/1、1.22嗎'mL"的三組待測樣品。4、免疫反應將上述免疫傳感器用含1%牛血清蛋白的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)封閉30分鐘；然後在37'C下將免疫傳感器的感應部依次分別浸入含有毒莠定的上述三組待測樣品中，每組樣品反應時間為30分鐘；然後在室溫下將每組樣品與漆酶-毒莠定抗體(毒莠定抗體與漆酶交聯後製得)反應60分鐘。5、毒莠定的標定在pH值為4.6的磷酸鹽緩衝溶液中，並在還原電位為-0.139V的條件下，對毒莠定的標準曲線進行標定。標定過程是指將免疫傳感器感應部依次分別置於含有不同濃度毒莠定的實驗樣品溶液中，使其進行免疫反應(反應過程與步驟4相同)。經過酶標抗體標記後加入一定濃度的對苯二酚，根據響應電流變化分別繪出每一組實驗樣品的電流-時間變化曲線(見圖3)，並根據所有的電流-時間變化曲線和不同實驗樣品的毒莠定濃度，得到電流變化-毒莠定濃度關係曲線(即回歸方程，見圖4)。6、堆肥浸出液中毒莠定的測定經過酶標抗體標記後，往每組待測樣品中加入一定量(50pM)的對苯二酚。以對苯二酚為底物，以免疫傳感器(即修飾了毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒交聯體的碳糊電極)為基底電極，用磷酸鹽緩衝溶液調節含毒莠定的堆肥浸出液樣品的pH值至4.6，釆用計時電流的方法，根據免疫傳感器在還原電位-0.139V下的響應電流變化和步驟5中建立的回歸方程，測定堆肥浸出液待測樣品中毒莠定含量。所述的電化學測定是採用上海辰華儀器公司生產的CHI660B電化學系統與50ml電解池中的三電極系統相連接，進行控制與監測。上述3組含毒莠定的堆肥浸出液樣品在用生物傳感器測定後，其檢測結果見下表tableseeoriginaldocumentpage8從上述測定結果可以清楚地看出，本方法操作快速、簡便，靈敏度高，選擇性好，為城市生活垃圾堆肥控制系統中快速、低成本的毒莠定含量在線檢測提供了技術支持。權利要求1、一種檢測堆肥中毒莠定的免疫傳感器，包括碳糊電極和塗覆在碳糊電極表面的敏感物質，其特徵在於所述碳糊電極包括碳棒和PVC管，碳棒內置於PVC管中，碳棒一端通過電線引出PVC管，碳棒另一端與磁體相接觸，磁體與PVC管管口間填充有碳糊，塗覆在碳糊電極表面的敏感物質為毒莠定抗體-Fe3O4磁性納米顆粒交聯體。2、一種權利要求1所述免疫傳感器的製備方法，其特徵在於首先製作一碳糊電極，在碳糊電極內置的碳棒與碳糊電極表面間放有磁體，碳糊電極內用碳糊填充封閉；將碳糊電極拋光、清洗並晾乾；在氮氣保護下製備Fe304膠狀沉澱，然後依次加入聚乙二醇、正矽烷乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基矽垸、戊二醛完成矽烷化和功能化，再將毒莠定抗體交聯到Fe304磁性納米顆粒表面製得毒莠定抗體-磁性納米顆粒交聯體；將製得的毒莠定抗體-磁性納米顆粒交聯體滴塗在電極表面，乾燥後用緩衝液衝洗，製得免疫傳感器，低溫貯存備用。3、一種用權利要求l所述免疫傳感器對堆肥中的毒莠定進行檢測的方法，其特徵在於首先將免疫傳感器用封閉液封閉，時間不少於30分鐘；接著在37t下將免疫傳感器的感應部浸入含有毒莠定的堆肥浸出液中使其反應，反應時間不少於30分鐘；然後再在室溫下與漆酶-毒莠定抗體反應，反應時間不少於60分鐘；最後以對苯二酚為底物，在接有三電極系統的電解池中進行檢測，所述免疫傳感器作為三電極系統的工作電極，利用檢測到的電流變化值和線性回歸方程計算毒莠定的含量；所述線性回歸方程為y=(1.571±0.1048)x+(12.2283±0.1139)其中，^為電流變化值，單位是pA;x為毒莠定濃度值，單位是^^mL";毒莠定濃度值的線性範圍為0.0110嗎-mL"，檢測下限為1X10g-mL-'。4、根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述三電極系統是以修飾了毒莠定抗體-Fe304磁性納米顆粒交聯體的碳糊電極作為工作電極，以飽和甘汞電極作為參比電極，以鉑片電極作為對電極。5、根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述電解池中進行檢測的還原電位為-0.139V，電解池溶液為pH值4.0~5.0的磷酸鹽緩衝溶液。6、根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述電解池溶液為pH值4.6的磷酸鹽緩衝溶液。全文摘要本發明公開了一種檢測堆肥中毒莠定的免疫傳感器及其製作和使用方法，該免疫傳感器包括碳糊電極和塗覆在碳糊電極表面的毒莠定抗體-Fe3O4磁性納米顆粒交聯體，通過利用酶聯免疫技術和電化學分析手段，首先建立了電流變化與毒莠定含量的線性回歸方程，根據該回歸方程可以對堆肥中的毒莠定含量進行快速、靈敏地測定。本發明的方法應用到堆肥中毒莠定含量的測定，具有操作快速簡便、反應靈敏、選擇性好等優點，是一種能夠應用於城市生活垃圾堆肥控制系統的快速、低成本的毒莠定檢測技術。文檔編號G01N33/561GK101315380SQ20081003175公開日2008年12月3日申請日期2008年7月14日優先權日2008年7月14日發明者長張,曾光明,婕梁,琳湯,毅章,陳立娟,黃國和申請人:湖南大學