柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置的製作方法

2023-12-08 07:26:06 1

專利名稱：柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物細胞電融合的裝置。具體地，本發明涉及提供細胞電融合的晶片，提供 並產生細胞排隊、電致穿孔、融合所需要的電場強度和電場梯度。本發明專利涉及細胞電融 合中細胞的精確控制、細胞的高效融合，適用於遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發育生物學、 藥物篩選、單克隆抗體製備、哺乳動物克隆等領域。
背景技術：
生物細胞通過融合可以形成新的細胞，在現代生物醫學工程基礎領域有著重要的意義。 細胞融合技術經歷了生物、化學和物理誘導等幾個發展階段。到了20世紀80年代，隨著電 子信息技術的發展，細胞電融合技術得到了迅速發展，相對於傳統的細胞電融合手段，該方 法具有效率較高，操作簡便、對細胞無毒害，便於觀察，適於儀器應用和規範操作等優點， 該技術近年來也得到了廣泛的應用。
生物細胞處於非均勻電場中時，被電場激化形成偶極子，該偶極子在非均勻電場作用力 下發生運動，即介電電泳(dielectrophoresis)，利用電介質電泳可以控制細胞的運動，在細 胞電融合過程中，利用電介質電泳現象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細胞電 融合過程所需的排隊和融合後壓緊。
細胞在強電場作用下，會導致細胞膜穿孔，這種效應稱為細胞膜電致穿孔效應 (electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應，使兩接觸的細胞膜穿孔，細胞 間進行膜內物質交換，使細胞質、膜融合，在一定強度的電場作用下的電穿孔是一種可逆穿 孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復原狀，致使細胞電融合過程的膜融合。
傳統的細胞電融合儀，它多採用融合槽的方式進行融合，電極間的間距較大，要達到足 夠強度的細胞排隊、融合及壓緊信號，需要很高的外界驅動電壓，往往高達幾百上千伏，對 系統的電氣安全性要求高，系統的成本也因此而大為提高。
為解決這一問題，促進細胞電融合技術向集成化、可攜式等方向發展，根據經典物理方 程E=V/d，可知在外界電壓V恆定的情況下通過縮短電極的間距即d的大小以得到更高的 電場強度E。在柔性細胞電融合微電極陣列晶片結構的設計中，微電極陣列和平板電極間的 間距可以低至50μm，僅需要l00或101級的外界電壓即可實現細胞融合，大大降低了外圍電 路的設計、製造難度，降低了系統成本，提高了系統的電氣安全性和細胞電融合後細胞的成
活率，可以促進細胞電融合技術向集成化、可攜式等方向發展。同時，傳統的平行板電極在 兩電極板間產生的是均勻電場，不利於獲得較高的電場梯度，故在本發明中，柔性高通量細 胞電融合微電極陣列晶片選用了以下三種電極排布方式對稱型電極、交錯型電極和電極一
平板型電極。
目前國內在柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片領域研究開發基本上空白，中國專利
200610054121.x是基於晶片概念的細胞融合裝置，國外在次領域的專利相對較多，如Pohl 在1982年申請的美國專利(4326934)、 Chang在1994年的美國專利(5304486)等。但是 上述專利普遍存在微電極數量上較少，不能實現高通量融合，另一方面，微電極產生的電場 強度和電場梯度比較弱，在細胞的精確控制方面顯得比較弱。中國專利200610054121.x基於 晶片的概念提出了一種細胞融合裝置，在一定程度上解決了高通量融合，但是該晶片加工材 料選擇方面上抗腐蝕、抗氧化能力考慮較少，存在己被腐蝕、氧化的缺點，另外，矽基底芯 片帶來的封裝較為不便，晶片系統不利於細胞的進樣、出樣，進而影響細胞的篩選、分離和 培養等後期工作。另外，矽基底晶片的加工成本較高，能夠開展相關加工的服務商較少，加 工條件也受到限制，細胞電融合晶片的推廣收到影響，本發明能夠解決上述問題。
國內外相關專利如下
200610054121.x， 2006年，重慶大學，趙志強等；
CN1482234， 2003年，中國科學院上海技術物理研究所，張濤等；
CN86210174， 1995年，遼寧腫瘤研究所，梁偉；
4326934, April 27， 1982, Pohl;
441972, April 10， 1982， Pohl;
4578168， March 25, 1986， Hofman;
4695547, September 22， 1987， Hillard;
4699881， October 13,1987, Matschke;
5007995, April 16, 1991, Takahizuki.

發明內容
本發明針對現有技術的不足和細胞電融合技術的發展需要，提出了一種柔性高通量細胞 電融合微電極陣列晶片裝置，其陣列晶片採用透明柔性聚醯亞胺薄膜作為基底材料，通過刻 蝕聚醯亞胺薄膜上沉積的銅箔層形成微電極陣列，陣列中的微通道為細胞電融合工作通道， 通過導線將柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片與外圍電刺激裝置相連，引入電刺激信號
促進微通道內部的細胞發生細胞排隊和細胞融合。該陣列晶片的採用降低了晶片的設計難 度，特別是後期封裝難度，實現了細胞的自動進樣、自動出樣及後期培養的難度。
本發明的技術方案如下
一種柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置，它由陣列晶片和融合池組成；所述陣 列晶片以柔性透明聚醯亞胺薄膜為基底，在柔性透明聚醯亞胺薄膜基底上採用柔性印刷電路 板加工技術(Flexible Printed Circuit board, FPC)，形成從上至下以鍍金層一銅箔層一聚醯 亞胺薄膜一銅箔層一鍍金層構成的縱向層狀結構；在該結構的下表面通過蝕刻聚醯亞胺薄膜 上的銅箔層形成交叉梳狀陣列化微電極組，交叉梳狀陣列化微電極組由兩個相互交叉、互不 接觸、電氣結構上互不連接的梳狀微電極陣列電極構成，梳狀微電極陣列電極經過孔與晶片 上表面蝕刻銅箔層形成的引線層相連，經引線層上的焊盤焊接引線引入外界電刺激信號，電 極組內部微電極之間的微通道為工作通道。
所述融合池是在玻璃或有機玻璃硬質透明材料中央區域加工矩形凹槽而形成細胞電融 合池，細胞電融合池的四周池壁加工有與外界連通的進、出樣孔，柔性細胞電融合微電極陣 列晶片倒扣於融合池上，其上的交叉梳狀陣列化微電極組與細胞電融合池相對應，置於落於 細胞電融合池中，使交叉梳狀陣列化微電極組浸入樣品液中，當施加外界電刺激信號，即在 微電極陣列與融合池中的平板電極間的微小間距中產生高強度的非均勻梯度電場，細胞在電 場中被極化，在介電力的作用下被吸附到微電極上，並連接成串狀，並在電場作用下發生電 融合，實現細胞電融合過程，提高細胞電融合效率，融合後樣品經底部出樣孔流出，以進行 後期的融合細胞的篩選、培養。
該晶片裝置可實現每平方釐米最高104的集成度，根據實驗需要可選擇不同面積的晶片， 以達到高通量細胞融合的要求。
所述晶片的梳狀微電極陣列電極上包含多個梳脊，微電極分布於梳脊上，相鄰梳脊上微 電極排布方式可以分為對稱型，即齒狀微電極呈現水平對稱的排布方式，或者平板一電極型， 即一邊為齒狀微電極， 一邊為平板電極的排隊方式，或者交錯型，即齒狀微電極呈現水平交 錯的排布方式。
所述晶片的微通道的深度由銅箔層厚度決定，在加工過程中，可根據實驗對象細胞尺寸 進行調整，調整範圍在35-140 μm。
所述晶片的梳狀微電極陣列電極上的齒狀微電極長度為50~100 μm，寬度為50~100 μm， 相對微電極之間的間距設定在50~500 μm，同一梳脊上相鄰齒狀微電極間距設定在50~200
本發明提出的柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置具有以下優點 本發明採用現代柔性印刷電路板加工技術，可以實現在透明柔性聚醯亞胺薄膜上精密加 工微電極，保證細胞電融合過程的精確實施與控制；同時，由於精密加工工藝可實現每平方 釐米最高104的集成度，利用聚醯亞胺薄膜面積可根據需要擴大的優勢，通過增大聚醯亞胺 薄膜面積的方式可以實現任意集成度的陣列化電極結構，可以提供大量的微電極，提高細胞 電融合的通量；柔性透明薄膜選用聚醯亞胺薄膜具有柔軟、透明、耐高溫消毒、具備良好生 物相融合性和能夠兼容柔性等特點，能夠通過精密加工工藝，針對對象細胞的多樣化，設計、 加工多樣化的微電極結構；實現高通量的精確電融合控制能力，以獲取更好的融合效果；微 電極上通過電鍍沉積金膜，可以提高微電極的電氣性能，改善內部電場分布，金的惰性也可 以改善晶片的抗氧化能力和抗腐蝕性能；同時，聚醯亞胺和金良好的生物相融性和抗腐蝕能 力改善了微電極陣列的生物相容性，保證了融合細胞的安全性和細胞活力，進一步提高了細 胞電融合效率。另外，柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片良好的柔性降低了晶片系統的 整體設計難度，特別是後期封裝難度，可以實現融合池及各種自動進樣及出樣裝置的無縫連 接，晶片裝置達到的全封閉、無菌水平；融合池的使用可以實現自動進樣和自動出樣；整個 裝置能夠實現細胞液保存、細胞環境液體置換、細胞電融合和融合後細胞培養的整個過程， 減小對融合後細胞的物理損傷，提高其存活能力；另外，較矽基晶片而言，其通透性更好， 觀察效果佳。
柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置中的柔性高通量細胞電融合微電極陣列芯 片採用通用的柔性印刷電路板加工技術進行加工，融合池採用工具機或者雷射即可進行加工， 兩種加工方法都已經相當成熟，便於批量化生產，有利於細胞電融合技術的推廣。


圖l柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置示意圖2柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝配示意圖
圖3融合池示意圖
圖4柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片示意圖，圖4A是下表面，圖4B是上表面
圖5柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片剖面結構圖
圖6柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片三種微電極結構的示意圖，其中圖6A平 板一電極型，圖6B是交錯型，圖6C是對稱型；
具體實施例方式
以下結合附圖詳細說明本發明的結構
參見圖l、圖2、圖3和圖4，融合池2由玻璃或有機玻璃等硬質透明材料加工而成， 通過在片狀硬質透明材料中央區域加工一固定深度的矩形凹槽5形成融合池。將導線焊在柔 性高通量細胞電融合微電極陣列晶片1的焊盤8上(圖4B),隨後將其倒扣於融合池2上， 交叉梳狀陣列化微電極組9與中央矩形凹槽5相對應，使用黏合劑進行粘合，形成密閉空腔。 試驗中將柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置反置，形成柔性高通量細胞電融合微電 極陣列晶片1在下的形勢。含有待融合細胞的緩衝液經頂部的進樣孔3注入凹槽5內，當施 加外界電剌激信號的過程中，首先施加交流信號，即在微電極陣列7 (圖4A)之間的微通道 9中產生高強度的非均勻梯度電場，細胞在電場中被極化，在介電力的作用下被吸附到微電 極上，並連接成串狀，並在直流電形成的高強度電場作用下發生電融合，隨後再施加交流電 信號60s左右，促進細胞的進一步融合，實現細胞電融合過程，提高細胞電融合效率。整個 實驗過程可在顯微鏡下觀測錄像，完成融和後的細胞在晶片中靜置5~10 min後，再次施加 交流信號，使密閉空腔內部的細胞都吸附到微電極上，此時通過側面的出樣口 4吸出緩衝液， 從頂部進樣口3注入細胞培養液，融合後細胞可在此密閉空腔內部進行後期培養；當然在融 合完成後也可以直接從側面的出樣口 4吸出含有細胞的緩衝液，在柔性細胞電融合晶片裝置 外進行後期的篩選和培養工作。
柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片1的尺寸為3 cm x 3.6 cm，見圖5，晶片"鍍金 層10-銅箔層11-聚醯亞胺薄膜6-銅箔層11-鍍金層10"結構中聚醯亞胺薄膜6厚度可根據 需要在12.5 |im至50 nm之間進行調節，銅箔層11的厚度在35 pm至140 pm之間調節，鍍 金層10的厚度為1 pm，以保證晶片具有較強的抗腐蝕、抗氧化能力，並獲得儘可能好的生 物相容性，提高細胞的存活能力，焊盤8直徑為200nm，柔性細胞電融合晶片上集成了 104 組微電極，微電極結構分為平板一電極型12，即一邊為齒狀微電極， 一邊為平板電極的排隊 方式(見圖6A)，或者對稱型13,即齒狀微電極呈現水平對稱的排布方式(見圖6B)，或者 交錯型14，即齒狀微電極呈現水平交錯的排布方式(見圖6C)。上述電極結構中，齒狀微電 極長度為50~100 寬度為50-100 pm，相對微電極之間的間距設定在50~500 pm，同一 梳脊上相鄰齒狀微電極間距設定在50~200 pm。
融合池2尺寸為8 cm x 10 cm，中央凹槽深度5可根據融合量在為200 nm~1000 jim範 圍內調節，頂部進樣口尺寸3為內徑500pm，外徑1000nm,側面出樣口 4尺寸為內徑500 pm，外徑1000^m，以充分保證細胞能夠順利的進入通道內部。
上述柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片1的加工採用柔性印刷電路板加工工藝，選 用聚醯亞胺薄膜作為基板加工材料，加工步驟如下
1、 聚醯亞胺薄膜裁切將聚醯亞胺薄膜裁切成需要尺寸；
2、 烤板；
3、 清洗材料，以獲得更好的光面平整度和光潔度
4、 鑽孔在聚醯亞胺薄膜上過孔所在位置進行鑽孔，得到所需要的過孔；
5、 磨板對聚醯亞胺薄膜表面進行打磨處理以滿足銅沉積；
6、 沉積銅在聚醯亞胺薄膜表面沉積銅箔，厚度範圍35 14(Him;
7、 層壓、露光利用感光幹膜層壓在銅箔上，通過UV線照射下在千膜上形成微電 極陣列、引線等圖形；
8、 顯影將己經曝光過的感光幹膜利用顯影液進行處理，除去未感光的感光幹膜， 使圖形基本成型；
9、 蝕刻在銅箔表面均勻噴淋蝕刻藥液，腐蝕銅箔，在銅箔上形成所需圖形，隨後 剝離感光幹膜，得到微電極陣列、引線和焊盤等微結構；
10、 鍍金在微電極陣列、引線等圖形上鍍金，以獲得較好的生物相容性及抗腐蝕、 抗氧化能力；
11、 噴錫在焊盤位置噴錫；
12、 外圍成形剪裁晶片，得到最終的外形；
13、 等離子清洗使用等離子機對晶片進行清洗；
14、 防氧阻焊處理；
加工完成柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片後，通過焊接的方式實現外圍電刺激 信號的引入，將完成焊接後的晶片反扣在融合池上，並使用黏合劑固定，形成密閉的空間，
邊獲得了完整的晶片裝置。
權利要求
1.一種柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置，其特徵在於晶片裝置由陣列晶片和細胞電融合池組成；所述陣列晶片以柔性透明聚醯亞胺薄膜為基底，在柔性透明聚醯亞胺薄膜基底上採用柔性印刷電路板加工技術，形成從上至下以鍍金層-銅箔層-聚醯亞胺薄膜-銅箔層-鍍金層構成的縱向層狀結構；在所述結構的下表面通過蝕刻聚醯亞胺薄膜上的銅箔層形成交叉梳狀陣列化微電極組，交叉梳狀陣列化微電極組由兩個相互交叉、互不接觸、電氣結構上互不連接的梳狀微電極陣列電極構成，梳狀微電極陣列電極經過孔與晶片上表面蝕刻銅箔層形成的引線相連，經引線上的焊盤焊接引線引入外界電刺激信號；電極組內部微電極之間的微通道為工作通道；所述細胞電融合池是在玻璃或有機玻璃硬質透明材料中央區域加工矩形凹槽而形成，細胞電融合池的四周池壁加工有與外界連通的進、出樣孔，陣列晶片倒扣於細胞電融合池上，其上的交叉梳狀陣列化微電極組與細胞電融合池相對應，落於細胞電融合池中。
2. 根據權利要求1所述的柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置，其特徵在於 所述交叉梳狀陣列化微電極的每個梳狀微電極陣列電極上包含多個梳脊，梳脊上分布微電 極，相鄰梳脊上的微電極排布方式採用對稱型，即相鄰梳脊上有齒狀微電極，並呈現水平對 稱的排布方式；或者採用平板一電極型，即一邊梳脊上為齒狀微電極，另一邊梳脊上為平板 電極的排隊方式；或者採用交錯型，即相鄰梳脊上為齒狀微電極，並呈現水平交錯的排布方 式。
3. 根據權利要求1或2所述的柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置，其特徵在 於所述陣列晶片的微通道的深度根據細胞尺寸和試驗需要設定在35~140 pm。
4. 根據權利要求1或2所述的柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置，其特徵在 於齒狀微電極長度為50~100nm，寬度為50~100 pm，相對齒狀微電極之間的間距設定在 50~500 pm，同一梳脊上相鄰齒狀微電極間距設定在50~200 jmi。
5. 權利要求1或2所述的柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置的加工工藝，其 特徵在於-(1)加工柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片採用柔性印刷電路板加工工藝，選 用聚醯亞胺薄膜作為基板加工材料，加工步驟如下-A、 聚醯亞胺薄膜裁切將聚醯亞胺薄膜裁切成需要尺寸；B、 烤板； C、 清洗材料，以獲得更好的光面平整度和光潔度D、 鑽孔在聚醯亞胺薄膜上過孔所在位置進行鑽孔，得到所需要的過孔；E、 磨板對聚醯亞胺薄膜表面進行打磨處理以滿足銅沉積；F、 沉積銅在聚醯亞胺薄膜表面沉積銅箔，厚度範圍35~140nm;G、 層壓、露光利用感光幹膜層壓在銅箔上，通過UV線照射下在幹膜上形成微電 極陣列、引線等圖形；H、 顯影將已經曝光過的感光幹膜利用顯影液進行處理，除去未感光的感光幹膜， 使圖形基本成型；I、 蝕刻在銅箔表面均勻噴淋蝕刻藥液，腐蝕銅箔，在銅箔上形成所需圖形，隨後 剝離感光幹膜，得到微電極陣列、引線和焊盤等微結構；J、鍍金在微電極陣列、引線等圖形上鍍金，以獲得較好的生物相容性及抗腐蝕、抗氧化能力； K、噴錫在焊盤位置噴錫； L、外圍成形剪裁晶片，得到最終的外形； M、等離子清洗使用等離子機對晶片進行清洗； N、防氧阻焊處理；(2)加工完成的柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片片，通過焊接的方式實現外圍 電刺激信號的引入，將完成焊接後的晶片反扣在融合池上，並使用黏合劑固定，形成密閉的空間。。
全文摘要
本發明提出了一種柔性高通量細胞電融合微電極陣列晶片裝置，由陣列晶片和融合池組成。陣列晶片以柔性透明聚醯亞胺薄膜為基底，下表面通過蝕刻形成交叉梳狀陣列化微電極組，電極組由兩個相互交叉、互不接觸、電氣結構上互不連接的梳狀微電極陣列電極構成，電極組內部微電極之間的微通道為工作通道；陣列晶片倒扣於融合池上，其上的交叉梳狀陣列化微電極組與細胞電融合池相對應，落於細胞電融合池中。該晶片裝置具備使用方便，加工方法簡單，成本極為低廉，對操作人員及細胞無傷害等特點，可廣泛應用於遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發育生物學、藥物篩選、單克隆抗體製備、哺乳動物克隆等領域。
文檔編號C12M1/42GK101343613SQ200810070159
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月22日 優先權日2008年8月22日
發明者侯文生, 斌 夏, 廖彥劍, 毅 曹, 軍 楊, 寧 胡, 鄭小林 申請人:重慶大學