具有改進的洗滌性能的多肽－聚合物綴合物的製作方法

2023-11-01 01:35:57 2

專利名稱：具有改進的洗滌性能的多肽－聚合物綴合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及多肽-聚合物綴合物，其中聚合物是偶聯在多肽表面的均聚物、接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物、或無規共聚物。本發明還涉及包含本發明綴合物的工業組合物和產品、本發明多肽-聚合物綴合物用於改進工業組合物和產品的洗滌性能的用途，還涉及改進多肽的洗滌性能的方法。
背景技術：
在洗滌劑工業中，酶應用於清洗配方已經超過30年了。應用於這些配方中的酶包括蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶、纖維素酶、以及其它酶，或它們的混和物。商業上最重要的酶是蛋白酶。
與日俱增的商業使用的酶(如蛋白酶)是天然產生的野生型蛋白酶經蛋白質工程改造的變體，如DURAZYM(Novo Nordisk A/S)、RELASE(Novo Nordisk A/S)、MAXAPEM(Gist-BrocadesN.V.)、PURAFECT(Genencor International,Inc.)。
然而，雖然文獻中已經公開了許多有用的酶變體，仍然需要新的改進的酶或酶變體，用於許多工業用途。
由於多肽可能會引起非期望的免疫應答--由施用方式決定--通常是IgG和/或IgE應答，最近30年中已經發展了降低免疫應答的技術。
WO 97/24421和WO 97/24427公開了通過共價結合到激活的聚合物上而對酶進行固定化。使用激活的聚合物對一種或多種酶的固定化，尤其顯示出酶蛋白質的改進的抗原性特性。發明人聲稱，可以通過酶的結構性修飾實現改進，而不影響酶在洗滌劑溶液中的性能特性。
雖然固定化有可能避免形成空氣傳播物質，但是在固定化步驟的操作過程中，該方法仍然存在形成粉塵或氣溶膠的風險。
另一種技術是偶聯技術，其中許多聚合分子與目的多肽偶聯。當使用該技術時，免疫系統難以識別多肽表面上負責形成抗體的表位，由此降低免疫應答。
對於直接引入人體循環系統以產生特殊生理學效應的多肽(即藥物)，典型的潛在免疫應答是IgG和/或IgM應答，而通過呼吸系統吸入的多肽(即工業多肽)可能引起IgE應答(即變態反應)。
解釋免疫應答降低的一種理論是聚合分子可屏蔽多肽表面上負責導致抗體形成的免疫應答的表位。另一種理論(或至少是部分因素)是綴合物越巨大，產生的免疫應答降得越低。
通常用於與多肽偶聯以形成綴合物的聚合物是均聚物，即由一種重複單位組成，如環氧乙烷(EO)、聚乙二醇(PEG)、或環氧丙烷(PO)、聚丙二醇(PPG)。糖類，諸如葡聚糖，也已經使用。
美國專利號4,179,337涉及非免疫原性的多肽，諸如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶聯的酶和肽激素。
WO 96/17929(Novo Nordisk A/S)涉及與聚合分子(特別是聚乙二醇(PEG))偶聯的經修飾的多肽綴合物。
現在本發明的發明人已經令人驚訝的發現，與未修飾的多肽相比，聚合物-多肽綴合物具有改進的洗滌性能。
發明概述在第一個方面，本發明涉及具有改進的洗滌性能的多肽-聚合物綴合物。
本發明的發明人發現，如果將分子量0.1-60 kDa的均聚物與分子量4-100 kDa的親本多肽進行偶聯，則與親本多肽的洗滌性能相比，該多肽的洗滌性能可得到改進。
本發明的發明人還發現，如果將接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物、或無規共聚物(具有通式EOxPOy(Ⅰ)，其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％)與用於工業用途的親本多肽進行共價偶聯，則與親本多肽相比，其洗滌性能可得到改進。
在這兩種情況中，與親本酶相比，其呼吸變應性也可能降低。在後一種情況中，甚至與偶聯PEG或其它均聚物的相應綴合物相比，其呼吸變應性可能有降低。
在第二個方面，本發明涉及在包含本發明綴合物的工業產品中使用的組合物。
在第三個方面，本發明涉及使用綴合物改進洗滌性能。
在最後一個方面，本發明涉及改進多肽洗滌性能的方法。工業多肽用於工業應用的多肽通常具有酶促和/或抗微生物活性。工業多肽(與藥物多肽相反)並不旨在引入人體循環系統。
因此，作為工業組合物和/或產品(由下文定義)(諸如衣物和碗碟洗滌劑、用於處理紡織品的組合物、和個人護理產品(包括化妝品))中的活性成分使用的工業多肽(諸如酶)，不太可能與人或動物的循環系統直接接觸，因為並不將這些多肽(或包含這些多肽的產品)注射(或類似的)到血流中。
因此，在工業多肽的情況中，潛在風險是通過呼吸途徑吸入多肽引起的呼吸變態反應(即IgE應答)。
在本發明的內容中，「工業多肽」定義為並不旨在引入人和/或動物體循環系統的多肽，包括肽、蛋白質和/或酶。
這些多肽的實例包括具有下文定義的酶活性的多肽。
然而，如果將一種或多種聚合物與酶進行偶聯，則與親本酶相比，該酶的性能將保持大致相同或降低。
酶的催化性能取決於酶和底物在活性位點接觸等許多因素。如果將聚合物與酶進行偶聯，聚合物通常將以隨機方式分布於酶的表面。而且，聚合物將與酶在該酶的活性位點附近偶聯，導致空間位阻。因此預測酶的性能將受到不利影響。
本發明的發明人已經令人驚訝的發現，通過與聚合物的綴合，酶的性能可能增強。
發明詳述現在本發明的發明人已經令人驚訝的成功提供了多肽-聚合物綴合物，其中多肽的催化性能得到了改進。
本發明涉及適合工業應用和作為活性成分摻入工業產品中的多肽-聚合物綴合物。本發明的綴合物還可能具有降低的呼吸變應性。
術語「多肽-聚合物綴合物」，在本發明的內容中，指一種或多種聚合物已經與多肽共價結合。
術語「降低的變應性」，在本發明的內容中，指當吸入本發明的經修飾多肽後，與相應的親本多肽相比，其產生的可以導致變態狀態的IgE(在人體中，在特定動物中為具有可比性能的分子)的量降低了。也可以使用術語「呼吸變應性」。術語「改進的洗滌性能」，在本發明的內容中，指與用親本酶(非綴合物)清洗的測試物的Δ反射度值(delta reflectance)相比，用綴合物清洗的測試材料的Δ反射度值增加了。
當術語「改進的洗滌性能」與如皮膚護理產品一起使用(其中不能得到Δ反射值)時，該術語指與使用親本酶(非綴合物)時的清潔效果相比，其清潔效果得到了改進。
本發明的發明人已經發現，如果將親本未修飾多肽與均聚物、接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物、或無規共聚物進行偶聯，則洗滌性能可得到改進。與相應的親本未修飾多肽相比，吸入多肽引起的潛在的變應原性應答也可能降低。
在一個方面，本發明涉及綴合物，其中親本多肽可以與分子量100-10,000 Da，優選100-5,000 Da，更優選100-2,000 Da,特別是100-1,000 Da的聚合分子偶聯。
由於已知短/輕聚合分子抑制多肽功能活性的傾向較小，所以將短/輕聚合分子與目的多肽偶聯是有利的。例如，與偶聯了大/重聚合分子的相應酶相比，底物更容易到達與分子量範圍符合本發明實施方案的聚合分子偶聯的酶的活性位點，因為此時聚合分子的空間位阻較不顯著。而且，多肽結構的變形最小，與含有較大/較重聚合分子和多肽偶聯的綴合物相比，含有較小/較輕聚合分子的多肽-聚合物綴合物具有改進的穩定性，因為將多肽結構推向不同方向的重量較小。
使用小聚合分子的另一個好處是，它們更便宜，因為聚合物是論公斤賣的。這降低了生產本發明綴合物的成本。
此外，與固定化的酶(如酶與具有多個反應基團的活化聚合物的多價共價連接)相比，本發明的綴合物顯示單個聚合物分子共價連接到蛋白質表面上。這避免了酶的交聯，導致催化劑在應用介質中的分布更平均並增加。這可能導致本發明綴合物每單位蛋白質的性能比固定化的酶更好。
眾所周知，聚合物可以採用不同的構象/形態，這主要(但不只是)取決於分子結構、溶劑(此處是水)、溫度、和濃度(S.Forster和M.Antonietti,Adv.Mater.,1998,10(3),195-217)。那些構象/形態包括各種形狀的膠束、薄片、有序圓柱體、或雙連續結構。共聚物在水性介質中的分子構象，如溶劑化無規捲曲、外展捲曲、杆狀聚合物、超捲曲、和小泡是眾所周知的(Watersoluble polymers,M.J.Comstock編，ACS SymposiumSeries,1991)。
因此，不受任何理論的限制，我們相信多肽表面連接的接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物、或無規共聚物在水中採取的構象能使得表面比用更親水的均聚物時受到更好的屏蔽。而且形成超分子結構引起的協同效應可能降低多肽表面的可到達性。而且，更親脂的共聚物(與PEG均聚物相比)與抗體的排斥增強，可能也發揮作用。
此外，接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物、或無規共聚物更剛性的結構(與均聚物相比)可能使抗體更難以(通過更剛性的聚合物和採取的構象)到達多肽表面上負責形成導致變態應答的IgE的表位。
聚合物的疏水性也被認為對多肽-聚合物綴合物潛在的變應原性具有影響。
通過適當選擇聚合物和分子結構，可以更好地覆蓋，更理想地屏蔽多肽表面上的表位。而且，通過調整連接的聚合物的特性，可以優化不同配方(如洗滌劑)的特性。
在另一個方面，本發明涉及一種或多種聚合物與親本多肽進行了共價偶聯的多肽-聚合物綴合物，其中聚合物表徵為通式EOxPOy(Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。
所述聚合物優選表徵為通式(Ⅰ)，其中x=10-90％,y=10-90％,x+y=100％。
在本發明的優選實施方案中，聚合物由環氧乙烷單元和環氧丙烷單元組成，其比例(EO單元∶PO單元)為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20和90∶10。
在優選的實施方案中，所述的聚合物的分子量為100至100,000Da，優選100至50,000Da，特別是100至10,000Da。
在更優選的實施方案中，所述的聚合物的分子量為100至12,000Da，更優選300至3,000Da。
在本發明的實施方案中，聚合物為二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、多嵌段聚合物。通式(Ⅰ)應理解為包括其中EO單元和PO單元彼此獨立地放置的聚合物。變應原性評價可以通過吸入檢驗，並比較氣管內施用親本多肽的效果與施用本發明相應的修飾多肽的效果來評價變應原性。
現有幾種用於多肽變應原性評價的體內動物模型。某些這樣的模型為人類中的危險評價提供了合適的依據。適合的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。這些模型設法將呼吸性變應原表示為以前致敏的動物中所誘導的刺激反應的函數。按照這些模擬，將所宣稱的變應原通過氣管內引入動物。
豚鼠的一個適合品系(Dunkin Hartley品系)不會因變應性應答而產生IgE抗體，這一點與人類不同。然而，它們產生另一種類型的抗體IgG1A與IgG1B(參見，例如，Prentφ,ATLA,19,P.8-14,1991)，這些抗體造成了對所吸入的多肽(包括酶)產生變應原性應答。因此，當使用Dunkin Hartley動物模型時，IgG1A和IgG1B的相對量可以表示變應原性水平。
適合於氣管內接觸多肽如酶的大鼠品系是Brown Norway品系。Brown Norway大鼠產生IgE作為變應性應答。
在豚鼠和小鼠中評價呼吸性變應原的更多細節由Kimber等(1996)，基礎與應用毒理學，33,P.1-10描述。
其它動物(如兔子等)也可以用於類似研究中。聚合分子偶聯到多肽上的聚合分子可以是任何適合的分子量由本發明定義的聚合分子，包括天然和合成的均聚物[如多元醇(即聚-OH)、聚胺(即聚-NH2)以及聚羧酸(即聚-COOH)]以及雜聚物，即包含一種或多種不同偶聯基團(如羥基與胺基)的聚合物。
適合的聚合分子的例子包括選自含有下述各類分子的組中的聚合分子聚環氧烷(PAO)，如聚亞烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(mPEG)以及聚丙二醇、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支PEG、星型PEGs、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚D,L-胺基酸、乙烯-馬來酸酐共聚物、苯乙烯-蘋果酸酐共聚物，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源的白蛋白、纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素以及羥丙基纖維素，聚氨基葡糖的水解產物、澱粉(如羥乙基澱粉和羥丙基澱粉)、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、支鏈澱粉、菊粉、黃原膠(xanthangum)、角叉菜膠(carrageenan)、果膠、藻酸水解產物和生物聚合物，聚氧乙烯酯，包括硬脂酸酯，例如PEG8硬脂酸酯(Myrj 45)、PEG40硬脂酸酯(Myrj 52)、PEG50硬脂酸酯(Myrj 53)、PEG100硬脂酸酯(Myrj 59)和聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯，聚氧乙烯醚，包括2乙基醚、2戊基醚、2鯨蠟基醚、2硬脂基醚、2十八碳烯醚、3己基醚、3辛基醚、3癸基醚、3月桂基醚、3肉豆蔻基醚、3鯨蠟基醚、3硬脂基醚、4庚基醚、4辛基醚、4癸基醚、4月桂基醚、4肉豆蔻基醚、4鯨蠟基醚、4硬脂基醚、5己基醚、5辛基醚、5癸基醚、5月桂基醚、5肉豆蔻基醚、5鯨蠟基醚、5硬脂基醚、6癸基醚、6月桂基醚、6肉豆蔻基醚、6鯨蠟基醚、6硬脂基醚、7癸基醚、7月桂基醚、7肉豆蔻基醚、7硬脂基醚、8癸基醚、8月桂基醚、8肉豆蔻基醚、8鯨蠟基醚、8硬脂基醚、9月桂基醚、10月桂基醚、10十三烷基醚、10鯨蠟基醚、10硬脂基醚、10油基醚、20鯨蠟基醚、20異十六烷基醚、20硬脂基醚、20油基醚、21硬脂基醚、23月桂基醚、100硬脂基醚和聚氧乙烯山梨糖醇酐類，包括單月桂酸酯，單油酸酯，單棕櫚酸酯，單硬脂酸酯，三油酸酯，三硬脂酸酯。
優選的聚合分子是無毒性的聚合分子，如聚乙二醇(PEG)，還要求這些分子共價偶聯到酶表面連接基團上的化學方法相對比較簡單。
一般看來，聚環氧烷(PAO)(如聚環氧乙烷，如PEG)是優選的聚合分子，因為這些聚合分子與多糖(如葡聚糖、支鏈澱粉等)相比，它們所具有的能交聯的活性基團(並不合乎需要)很少。
與多肽偶聯的聚合物也可為具有下式的接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物或無規共聚物EOxPOy(Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。
在本發明優選的實施方案中，聚合物由環氧乙烷單元和環氧丙烷單元組成，其比例(EO單元∶PO單元)為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20或90∶10。
在優選的實施方案中，所述聚合物的分子量為100至100,000Da，優選100至50,000Da，特別是100至10,000Da。
在本發明的實施方案中，聚合物為二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、多嵌段聚合物。
可用於與多肽表面進行偶聯的具體共聚物例如有聚(乙二醇-共-丙二醇)；聚(乙二醇-共-丙二醇)單丁基醚；聚(乙二醇-共-丙二醇)單甲基醚。
優選的聚合物為例如由PEG和PPG共聚物組成的無毒聚合物。優選那些共價偶聯至酶表面上的連接基團需要相對簡單化學過程的聚合物。
可用於偶聯至多肽表面上的具體嵌段聚合物的實施例為聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)；聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)單丁基醚；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)單丁基醚；聚(丙二醇)嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)單甲基醚；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)單甲基醚。
優選的嵌段聚合物為具有以下通式的嵌段聚合物H(-OCH2CH2-)x[-OCH(CH3)CH2-]y(-OCH2CH2-)zOH，其平均分子量(Mn)為1,100，乙二醇含量為10wt％,Mn=1,900和50wt％,Mn=2,000和10wt％,Mn=2,800和10wt％,Mn=2,800和15wt％,Mn=2,900和40wt％,Mn=4,400和30wt％,Mn=5,800和30wt％,Mn=8,400和80wt％。
其它優選的嵌段聚合物為具有下述通式的嵌段聚合物H[-OCH(CH3)CH2-]x(-OCH2CH2-)y[-OCH(CH3)CH2-]zOH，其平均分子量(Mn)為2,000和乙二醇含量為50wt％,Mn=2,700和40wt％，以及Mn=3,300和10wt％。
具體的嵌段聚合物的實例為p7120:Pluronics，商購自BASF(德國)，Tergitol，商購自Union Carbide(USA),Synperonic，商購自Fluka(瑞士)。
可用於偶聯至多肽表面的具體共聚物的實例為聚(乙二醇-共--丙二醇)，特別是聚(乙二醇-共-丙二醇)，其平均分子量Mn為2,500且乙二醇含量為75wt％，平均分子量Mn為12,000且乙二醇含量為75wt％；聚(乙二醇-共-丙二醇)單丁基醚，特別是其Mn為970且有50wt％乙二醇、Mn為1,700且有50wt％乙二醇以及Mn為3,900且有50wt％乙二醇、Mn為1,700且有50wt％乙二醇以及Mn為3,900且有50wt％乙二醇的聚(乙二醇-共-丙二醇)單丁基醚；聚(乙二醇-共-丙二醇)單甲基醚。
優選的聚合物為例如由PEG和PPG共聚物組成的無毒聚合物。優選那些共價偶聯至酶表面上的連接基團需要相對簡單化學過程的聚合物。
具體的EO-低聚物的實例為二甘醇、二甘醇單甲基醚、三甘醇、三甘醇單甲基醚、四甘醇、四甘醇單甲基醚、五甘醇、五甘醇單甲基醚、六甘醇、六甘醇單甲基醚、七甘醇、七甘醇單甲基醚，或者乙二醇和乙二醇低聚物與2-7個環氧乙烷單元的線性未支化的C2-C14單烷基醚。
接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物或無規共聚物可為星型或支化形式。適宜聚合物的製備與親本多肽表面連接的聚合物可採用本領域技術人員公知的技術製備。進而，各種聚合物可從以下的各家公司商購BASF(德國)，Union Carbide(USA),Aldrich,Shearwater,Sigma(USA)等。聚合物的活化如果將與多肽結合的聚合物沒有活性，就必須使用適合方法使其活化。根據本發明，嵌段聚合物或共聚物也可通過接頭與多肽偶聯。適合的接頭對熟練技術人員是熟知的。
用於活化聚合分子以及用於綴合蛋白質的方法和化學原理在文獻中有詳細描述。
一般用於活化不溶性聚合物的方法包括用下列化合物活化官能團溴化氰、高碘酸、戊二醛、雙環氧化合物(biepoxides)、表氯醇、二乙烯基碸、碳二亞胺、磺醯基滷化物、三氯三嗪等(參見R.F.Taylor,(1991)，「蛋白質固定，基礎和應用」，Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992)，「蛋白質綴合和交聯的化學」，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，「固定的親和性配體技術」，學院出版社，N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但是也適用於可溶性聚合物(如高碘酸，三氯三嗪、磺醯基滷化物、二乙烯基碸、碳二亞胺等)的活化。在選擇活化與綴合化學方法中必須考慮聚合物上的官能團是氨基、羥基、巰基、羧基、醛或硫氫基以及蛋白質上選定的連接基團，活化與綴合化學方法通常包括ⅰ)聚合物的活化，ⅱ)綴合，ⅲ)剩餘活性基團的封閉。
下面簡要描述許多適合的聚合物活化方法。然而，應該理解也可以使用其它方法。
將聚合分子偶聯到多肽的游離酸基團上可以藉助於二醯亞胺和，例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976),J.Amr.Chem.Soc.,98,289-291)或重氮基乙酸酯/醯胺(Wong等，(1992)，「蛋白質綴合和交聯化學」，CRC出版社)進行。
將聚合分子偶聯到羥基通常是非常困難的，因為這必須在水中進行。而通常水解反應比與羥基的反應更佔優勢。
將聚合分子偶聯到游離硫氫基可以用特定基團(如馬來醯亞胺或正吡啶基二硫化物)達到。乙烯基碸(美國專利no.5,414,135,(1995)，Snow等)對於硫氫基也有偏好，但是不象提到的其它化合物那樣有選擇性。
可以通過包含兩個鄰近羰基的基團靶向多肽鏈中的可及精氨酸殘基。
涉及將親電子性地活化的PEG偶聯到賴氨酸的氨基上的技術也有用。醇的許多常規離去基團形成胺鍵。例如，可以使用烷基磺酸鹽，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶學方法，104卷，Jacoby W.B.編，學院出版社Orlando,P.56-66；Nilsson等，(1987)，酶學方法，135卷，Mosbach K.編，學院出版社Orlando,P.65-79；Scouten等，(1987)，酶學方法，135卷，Mosbach K.編，學院出版社Orlando,1987,P.79-84；Crossland等，(1971),J.Amr.Chem.Soc.1971,93,pp.4217-4219)、甲磺酸鹽(Harris,1985，同上；Harris等，(1984),J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22,pp 341-352)、芳基磺酸鹽(如甲苯磺酸鹽)以及對硝基苯磺酸鹽。
有機磺醯氯(例如Tresyl Chloride)可有效地將許多聚合物(例如PEG)中的羥基轉化成良好的離去基團(磺酸鹽)，當與多肽中的親核基團(如氨基)進行反應時，該離去基團使得可以在聚合物和多肽之間形成穩定的鍵。除了要有高的綴合產率之外，反應條件通常還要求比較溫和(中性或微鹼性pH值，以避免變性和活性極少或沒有破壞)，並且滿足多肽需要的非破壞性條件。
甲苯磺酸鹽比甲磺酸鹽反應性更強，而且更不穩定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky,(1995)，生物綴合物化學，6,150-165)。環氧化物也可以用於產生胺鍵，但是活性比上述基團弱得多。
用碳醯氯將PEG轉化成氯甲酸酯將產生與賴氨酸的氨基甲酸酯鍵。這一轉變可以多種變化形式進行，如用N-羥基琥珀醯亞胺(美國專利no.5,122,614,(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技術應用和生物化學，15,P.100-114；Monfardini等，(1995)，生物綴合物化學，6,62-69)、用咪唑(Allen等，(1991),Carbohydr.Res.,213,pp 309-319)、用對硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1,(1993),Looze,Y.)等替代氯。通常通過使氯甲酸酯與所需的離去基團反應來製備衍生物。所有這些基團均產生與肽的氨基甲酸酯鍵。
此外，可以分別使用異氰酸鹽和異硫氰酸鹽來產生脲和硫脲。
使用如上所述的相同的離去基團和cyclic imid thrones，可以從PEG酸獲得醯胺(美國專利no.5,349,001,(1994),Greenwald等)。這些化合物的反應活性十分高，但是可能會使水解變快。
也可以使用從與琥珀酸酐反應製備的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使綴合物對水解更加敏感得多(美國專利no.5,122,614,(1992),Zalipsky)。這一基團可以用N-羥基琥珀醯亞胺活化。
此外，可以引入一個特殊的接頭。最古老的是氰尿醯氯(Abuchowski等，(1977)，生物化學雜誌，252,3578-3581；美國專利no.4,179,337,(1979),Dayis等；Shafer等，(1986),J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.,24,375-378)。聚合物還可以通過嘧啶環與多肽偶聯(參見US 4,144,128、US4,195,128和US4,298,395)。
將PEG偶聯到芳香族胺上，隨後重氮化，將產生非常活躍的重氮鹽，其在原位可與肽反應。通過使PEG的二氫唑酮衍生物(美國專利no.5,321,095,(1994),Greenwald,R.B.)反應，因此引入又一個醯胺鍵，也可以形成醯胺鍵。
由於一些肽不包含許多賴氨酸，因此，將多於一個PEG連接到相同的賴氨酸上有可能是有利的。這可以通過例如使用1,3-二氨基-2-丙醇進行。
也可以將PEG通過氨基甲酸酯鍵連接到酶的氨基上(WO 95/11924,Greenwald等)。賴氨酸殘基也可以用作主鏈。
用於製備相關綴合物的聚合物活化和PEG官能化的一般性概述參見下述文獻Zaplisky,S.，生物綴合物化學，1995,6,150-165,Hermanson,G.T.,Academic Press,San Diego,1996，和S.Herman,G.Hooftman,E.Schacht，生物活化和相容聚合物雜誌(Journal of Bioactive and Compatible polymers)，第10卷，1995,145-187。偶聯的嵌段聚合物或共聚物的位置實際上，所有離子化基團(如賴氨酸殘基的氨基)均位於多肽分子的表面(參見例如Thomas E.Creighton,(1993)，「蛋白質」，W.H.Freeman and Company，紐約)。因此，在多肽的表面上容易達到的連接基團(即氨基)數目等於多肽一級結構中的賴氨酸殘基加N-末端氨基的數目。
根據本發明，可以有1-100個聚合分子、優選4-50個聚合分子、5-35個聚合分子偶聯到目的親本多肽上。親本多肽可以在親本多肽、通常是分子量為4-100kDa、優選15-60kDa的親本多肽基礎上，利用本領域已知的任何合適技術製備本發明的修飾多肽。
術語「親本」多肽是指任何未偶聯的多肽(即要修飾的多肽)。該多肽優選地可以是微生物來源的，如細菌、絲狀真菌或酵母來源的，或者其可來源於植物。
親本多肽可以是天然存在的(或野生型)多肽或其變體。
選擇親本多肽時，最好使用具有多個連接基團的多肽。
在本發明優選的實施方案中，聚合分子廣泛分布於親本多肽的表面上。對於酶，優選在活性位點附近的區域不偶聯嵌段聚合物或共聚物。
在本發明的上下文中，「廣泛分布於」是指其所處的位置能使得偶聯到多肽連接基團上的聚合分子遮蔽多肽表面的不同部分(優選地是整個表面或接近於整個表面)，以確保可識別的有關表位受到遮蔽，由此不被免疫系統的抗體識別，從而得到低變應原性的酶。人們相信多肽和抗體之間相互作用的表面積大約為5002(26×19)(參見Sheriff等，(1987)，美國國家科學院學報，84卷，p.8075)。
對於酶，為了確保酶促活性的損失最小，優選不將聚合物偶聯到活性位點的近距離範圍內。通常看來以距離活性位點5、優選地10的範圍內沒有聚合物偶聯為佳。
而且，按照本發明，在可由免疫系統識別的已知表位處或接近於所說的表位偶聯了聚合物的多肽也被視為很有好處。如果表位的位置是未知的，則將許多聚合物偶聯到多肽表面可及的連接基團上是頗為有利的。優選的是所說的連接基團以離活性位點適合的距離廣泛分布於多肽的表面。
按照本發明，優選的是符合上述有關偶聯聚合物在多肽表面上的分布要求的親本多肽。
對於酶，尤其優選沒有或只有極少數聚合物(即0-2個)偶聯到距離活性位點0-5範圍內、優選地0-10範圍內的酶。酶活性親本酶可以具有已知用於如下所述工業組合物和產品的任何活性。所涉及的酶活性包括氧化還原酶(E.C.1，「酶命名法，(1992)，學院出版公司)，如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶E.C.3，包括蛋白酶，特別是絲氨酸蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶，以及脂解酶；轉移酶，(E.C.2)，如轉穀氨醯胺酶(TG酶)；異構酶(E.C.5)，如蛋白質二硫鍵異構酶(Protein Disulfide Isomerase,PDI)。親本蛋白酶親本蛋白酶包括依照生物化學和分子生物學國際聯盟(International Union of Biochemistry and MolecularBiology,IUBMB)的推薦(Recommendations,1992)分類位於酶分類編號E.C.3.4組中的蛋白酶。
實例包括分類位於下列酶分類編號(E.C.)下的蛋白酶3.4.11(即所謂的氨肽酶)，包括3.4.11.5(脯氨醯氨肽酶)、3.4.11.9(X-pro氨肽酶)、3.4.11.10(細菌亮氨醯氨肽酶)、3.4.11.12(嗜熱氨肽酶)、3.4.11.15(賴氨醯氨肽酶)、3.4.11.17(色氨醯氨肽酶)、3.4.11.18(甲硫氨醯氨肽酶)；3.4.21(即所謂的絲氨酸內肽酶)，包括3.4.21.1(胰凝乳蛋白酶)、3.4.21.4(胰蛋白酶)、3.4.21.19(穀氨醯內肽酶)、3.4.21.25(黃瓜素(cucumisin))、3.4.21.32(brachyurin)、3.4.21.48(酵母素(cerevisin))、和3.4.21.62(枯草桿菌蛋白酶)；3.4.22(即所謂的半胱氨酸內肽酶)，包括3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、3.4.22.3(無花果蛋白酶(ficain))、3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、3.4.22.7(蘿藦蛋白酶)、3.4.22.14(獼猴桃蛋白酶(actinidain))、3.4.22.30(蕃木瓜蛋白酶(caricain))、和3.4.22.31(菠蘿蛋白酶(ananain))；3.4.23(即所謂的天冬氨酸內肽酶)，包括3.4.23.1(胃蛋白酶A)、3.4.23.18(麴黴天冬醯蛋白酶Ⅰ(aspergillopepsinⅠ))、3.4.23.20(青黴天冬醯蛋白酶(penicillopepsin))、和3.4.23.25(酵母天冬醯蛋白酶(saccharopepsin))；和3.4.24(即所謂的金屬內肽酶)，包括3.4.24.28(桿菌溶素(Bacillolysin))。
相關枯草桿菌蛋白酶的實例包括枯草桿菌蛋白酶BPN』、枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus、枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶mesentericopeptidase、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、thermitase、aqualysin、芽孢桿菌PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7、和蛋白酶TW3。
這些容易獲得的商業性蛋白酶的特殊實例包括Esperase、Alcalase、Neutrase、Durazym、Savinase、Pyrase、Pancreatic Trypsin NOVO(PTN)、Bio-Feed Pro、Clear-LensPro、Everlase、Kanase、Relase、V8Proteinase(所有的酶都可以由Novo Nordisk A/S獲得)。
其它商業性蛋白酶的實例包括Genencor International銷售的Maxatase、Maxacal、Maxapem、Opticlean、Properase、和Purafect。
可以理解，蛋白酶變體也視為親本蛋白酶。EP 130.756(Genentech)、EP 214.435(Henkel)、WO 87/04461(Amgen)、WO 87/05050(Genex)、EP 251.446(Genencor)、EP 260.105(Genencor)、Thomas等人，(1985),Nature,318,375-376、Thomas等人，(1987),J.Mol.Biol.,193,803-813、Russel等人，(1987),Nature,328,496-500、WO88/08028(Genex)、WO 88/08033(Amgen)、WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)、WO 91/00345(Novo Nordisk A/S)、EP525 610(Solvay)、和WO 94/02618(Gist-Brocades N.V.)中描述了這些蛋白酶變體的實例。
還應當提及EP 482,879 B1(Shionogi)中公開的C組分。
蛋白酶的活性可以如「Methods of Enzymatic Analysis」，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第5卷中描述的進行測定。
期望的蛋白水解酶包括選自下組的蛋白酶具有上述特性(即連接基團的數目、連接基團的位置、等等)的酸性天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶(諸如枯草桿菌蛋白酶)、或金屬蛋白酶。
含有合適數目連接基團的合適的親本蛋白酶的特殊實例列於下面的表1表1
枯草桿菌蛋白酶PD498分子量為29kDa，而且由SEQ ID NO:2可以看出，有12個位於酶表面可供聚合物連接的賴氨酸基團，和1個N末端氨基。如上所述，優選的酶具有在表面廣泛分布的賴氨酸。PD498在距活性位點0-10埃的距離內沒有賴氨酸殘基，使之特別適合於修飾形式。而且其中賴氨酸殘基廣泛分布於該酶的表面(即遠離活性位點)。
枯草桿菌蛋白酶DY分子量為27kDa，而且有12個位於酶表面的氨基(即賴氨酸殘基)和1個N末端氨基(見SEQ ID NO:3)。
親本蛋白酶Lion Y分子量為46kDa，而且有14個位於酶表面的氨基(即賴氨酸殘基)和1個N末端氨基(見SEQ ID NO:4)。
中性金屬蛋白酶嗜熱菌蛋白酶分子量為大約34kDa，而且有11個位於酶表面的氨基(即賴氨酸殘基)和1個N末端氨基(見SEQ IDNO:5)。親本脂肪酶親本脂肪酶包括依照生物化學和分子生物學國際聯盟(IUBMB)的推薦(1992)分類位於酶分類編號E.C.3.1.1(羧基酯水解酶)組中的脂肪酶。
實例包括分類位於下列酶分類編號下的脂肪酶3.1.1(即所謂的羧基酯水解酶)，包括(3.1.1.3)三醯基甘油脂肪酶和(3.1.1.4)磷脂酶A2。
脂肪酶的實例包括由下列微生物衍生的脂肪酶。所列的專利出版物此處引用作為參考文獻腐質黴屬，如H.brevispora、H.lanuginosa、H.brevisvar.thermoidea、和H.insolens(US4,810,414)；假單胞菌屬，如莓實假單胞菌、施氏假單胞菌、洋蔥假單胞菌、和螢光假單胞菌(WO 89/04361)、植物假單胞菌、唐菖蒲假單胞菌(美國專利號4,950,417(Solvay enzymes))、產鹼假單胞菌、類產鹼假單胞菌(EP 218 272)、或門多薩假單胞菌(WO 88/09367；US 5,389,536)；
鐮孢屬，如尖鐮孢(EP 130,064)或F.solani pisi(WO90/09446)；毛黴屬(也稱為根毛黴屬(Rhizomucor))，如米黑毛黴(EP238 023)；色桿菌屬(特別是粘稠色桿菌)；麴黴屬(特別是黑麴黴)；假絲酵母屬，如C.cylindracea(也稱為皺落假絲酵母)、C.antarctica(WO 88/02775)、或C.Antarctica脂肪酶A或B(WO94/01541和WO 89/02916)；地黴屬，如白地黴(Schimada等人，(1989),J.Biochem.,106,383-388)；青黴屬，如沙門柏乾酪青黴(Yamaguchi等人，(1991),Gene,103,61-67)；根黴屬，如R.delemar(Hass等人，(1991),Gene,109,107-113)、雪白根黴(Kugimiya等人，(1992),Biosci.Biotech.Biochem.,56,716-719)、或米根黴；芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌(Dartois等人，(1993),Biochemica et Biophysica acta,1131,253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/7744992)、或短小芽孢桿菌(WO 91/16422)。
容易獲得的商業性脂肪酶的特殊實例包括Lipolase、LipolaseUltra、Lipozyme、Palatase、Novozym435、Lecitase(都可以由Novo Nordisk A/S獲得)。
其它脂肪酶的實例是Lumafast,Genencor Int.Inc.的門多薩假單胞菌脂肪酶；Lipomax,Gist-Brocades/Genencor Int.Inc.的類產鹼假單胞菌脂肪酶；Unilever的腐皮鐮孢脂肪酶(角質酶)；Solvay enzymes的芽孢桿菌脂肪酶。可以由其它公司獲得其它脂肪酶。
可以理解，脂肪酶變體也可視為親本酶。如WO 93/01285和WO95/22615中描述了這些實例。
脂肪酶的活性可以如「Methods of Enzymatic Analysis」，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinhein，第4卷中描述的，或AF 95/5 GB(可以向Novo Nordisk A/S索取)中公開的進行測定。
期望的脂肪水解酶包括Humicola lanuginosa脂肪酶，如EP258 068和EP 305 216中公開的脂肪酶；米黑根毛黴脂肪酶，如EP238 023中公開的；犁頭黴脂肪水解酶(WO 96/13578)；假絲酵母脂肪酶，諸如C.antarctica脂肪酶，如EP 214 761中描述的C.antarctica脂肪酶A或B；假單胞菌脂肪酶，諸如EP 218 272中描述的產鹼假單胞菌和類產鹼假單胞菌脂肪酶、如EP331376中公開的洋蔥假單胞菌脂肪酶，WO 95/14783中公開的假單胞菌脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶，如枯草芽孢桿菌脂肪酶(Dartois等人，(1993)，Biochemica et Biophysica acta,1131,253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢桿菌脂肪酶(WO91/16422)。其它種類的脂肪水解酶包括角質酶，如由Humicolainsolens、門多薩假單胞菌(WO 88/09367)、或Fusariumsolani pisi(如WO 90/09446中描述的)衍生的角質酶。親本氧化還原酶親本氧化還原酶包括依照生物化學和分子生物學國際聯盟(IUBMB)的推薦(1992)分類位於酶分類編號E.C.1(氧化還原酶)組中的氧化還原酶。
實例包括分類位於下列酶分類編號下的氧化還原酶甘油3-磷酸脫氫酶NAD+(1.1.1.8)、甘油3-磷酸脫氫酶NAD(P)+(1.1.1.94)、磷酸3-甘油1-脫氫酶NADP(1.1.1.94)、葡萄糖氧化酶(1.1.3.4)、己糖氧化酶(1.1.3.5)、兒茶酚氧化酶(1.1.3.14)、膽紅素氧化酶(1.3.3.5)、丙氨酸脫氫酶(1.4.1.1)、穀氨酸脫氫酶(1.4.1.2)、穀氨酸脫氫酶NAD(P)+(1.4.1.3)、穀氨酸脫氫酶NADP+(1.4.1.4)、L-胺基酸脫氫酶(1.4.1.5)、絲氨酸脫氫酶(1.4.1.7)、纈氨酸脫氫酶NADP+(1.4.1.8)、亮氨酸脫氫酶(1.4.1.9)、甘氨酸脫氫酶(1.4.1.10)、L-胺基酸氧化酶(1.4.3.2)、D-胺基酸氧化酶(1.4.3.3)、L-穀氨酸氧化酶(1.4.3.11)、蛋白質-賴氨酸6-氧化酶(1.4.3.1 3)、L-賴氨酸氧化酶(1.4.3.14)、L-天冬氨酸氧化酶(1.4.3.16)、D-胺基酸脫氫酶(1.4.99.1)、蛋白質二硫鍵還原酶(1.6.4.4)、硫氧還蛋白還原酶(1.6.4.5)、蛋白質二硫鍵還原酶(穀胱甘肽)(1.8.4.2)、漆酶(1.10.3.2)、過氧化氫酶(1.11.1.6)、過氧化物酶(1.11.1.7)、脂氧化酶(1.13.11.12)、超氧化物歧化酶(1.15.1.1)。
所述葡萄糖氧化酶可以由黑麴黴衍生得到。
所述漆酶可以由Polyporus pinsitus、Myceliophtorathermophila、灰蓋鬼傘、立枯絲核菌、Rhizoctonia praticola、Scytalidium thermophilum、和Rhus vernicifera衍生得到。
膽紅素氧化酶可以由疣孢漆斑菌(Myrothechecium verrucaria)衍生得到。
過氧化物酶可以由(如)大豆、辣根或灰蓋鬼傘衍生得到。
蛋白質二硫鍵還原酶可以是DK專利申請號768/93、265/94、和264/94(Novo Nordisk A/S)(此處引用作為參考文獻)中任何提及的蛋白質二硫鍵還原酶，包括牛起源的蛋白質二硫鍵還原酶、由米麴黴或黑麴黴衍生的蛋白質二硫鍵還原酶、和大腸桿菌衍生的DsbA或DsbC。
容易獲得的商業性氧化還原酶的特殊實例包括Gluzyme(可以由Novo Nordisk A/S獲得)。然而，可以由其它公司獲得其它氧化還原酶。
可以理解，氧化還原酶變體也可視為親本酶。
氧化還原酶的活性可以如「Methods of EnzymaticAnalysis」，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第3卷中描述的進行測定。
期望的漆酶包括來自Novo Nordisk的WO 96/00290和WO95/33836中公開的漆酶。
其它氧化還原酶包括過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、滷過氧化物酶(haloperoxidase)、超氧化物歧化酶、和脂氧化酶。親本糖酶親本糖酶可以定義為所有能夠分解(特別是)五和六元環結構的糖鏈(如澱粉)的酶，即依照生物化學和分子生物學國際聯盟(IUBMB)的推薦(1992)分類位於酶分類編號E.C.3.2(糖苷酶)下的酶。本發明糖酶組中還包括能夠將糖類(如六元環結構，諸如D-葡萄糖)異構化成如五元環結構，如D-果糖的酶。
實例包括分類位於下列酶分類編號下的糖酶α-澱粉酶(3.2.1.1)、β-澱粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(3.2.1.3)、纖維素酶(3.2.1.4)、內切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、內切-1,4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、幾丁質酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、澱粉-1,6-葡糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1,4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖內切-1,3-β-D-葡糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精內切-1,6-葡糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖內切-1,3-α-葡糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖內切-1,6-β-葡糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖內切-1,5-α-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、殼聚糖酶(chitonanase,3.2.1.132)、和木糖異構酶(5.3.1.5)。
相關糖酶的實例包括由Trichoderma harzianum衍生的α-1,3-葡聚糖酶；由擬青黴屬菌株衍生的α-1,6-葡聚糖酶；由枯草芽孢桿菌衍生的β-葡聚糖酶；由Humicola insolens衍生的β-葡聚糖酶；由黑麴黴衍生的β-葡聚糖酶；由木黴屬菌株衍生的β-葡聚糖酶；由Oerskovia xanthineolytica的菌株衍生的β-葡聚糖酶；由黑麴黴衍生的外切-1,4-α-D-葡糖苷酶(葡糖澱粉酶)；由枯草芽孢桿菌衍生的α-澱粉酶；由解澱粉芽孢桿菌衍生的α-澱粉酶；由嗜熱脂肪芽孢桿菌衍生的α-澱粉酶；由米麴黴衍生的α-澱粉酶；由非致病微生物衍生的α-澱粉酶；由黑麴黴衍生的α-半乳糖苷酶；由Humicola insolens衍生的戊聚糖酶、木聚糖酶、纖維二糖酶、纖維素酶、半纖維素酶；由Trichoderma reesei衍生的纖維素酶；由非致病黴菌衍生的纖維素酶；由黑麴黴衍生的果膠酶、纖維素酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半纖維素酶；由薄青黴衍生的葡聚糖酶；由非致病黴菌衍生的內切葡聚糖酶；由Bacillus acidopullyticus衍生的支鏈澱粉酶；由脆壁克魯維酵母衍生的β-半乳糖苷酶；由Trichoderma reesei衍生的木聚糖酶。
容易獲得的商業性糖酶的特殊實例包括Alpha-Gal、Bio-FeedAlpha、Bio-FeedBeta、Bio-FeedPlus、Novozyme188、Carezyme、Celluclast、Cellusoft、Ceremyl、Citrozym、Denimax、Dezyme、Dextrozyme、Finizym、Fungamyl、Gamanase、Glucanex、Lactozym、Maltogenase、Pentopan、Pectinex、Promozyme、Pulpzyme、Novamyl、Termamyl、AMG(澱粉葡糖苷酶Novo)、Maltogenase、Sweetzyme、Aquazym、Natalase(都可以由Novo Nordi sk A/S獲得)。可以由其它公司獲得其它糖酶。
應當理解，糖酶變體也視為親本酶。
糖酶的活性可以如「Methods of Enzymatic Analysis」，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第4卷中描述的進行測定。親本轉移酶親本轉移酶包括依照生物化學和分子生物學國際聯盟(IUBMB)的推薦(1992)分類位於酶分類編號E.C.2下的轉移酶。
親本轉移酶可以是下列轉移酶亞組中的任何轉移酶轉移一碳基團的轉移酶(E.C.2.1)；轉移醛基的轉移酶(E.C.2.2)；醯基轉移酶(E.C.2.3)；葡糖基轉移酶(E.C.2.4)；轉移除甲基外的烷基或芳香基的轉移酶(E.C.2.5)；轉移含氮基團的轉移酶(E.C.2.6)。
在優選的實施方案中，親本轉移酶是轉穀氨醯胺酶(transglutaminase)E.C.2.3.2.13(蛋白質-穀氨醯胺m-穀氨醯轉移酶)。
轉穀氨醯胺酶是能夠催化醯基轉移反應的酶，其中肽結合的穀氨醯胺殘基的γ-羧基醯胺基團是醯基供體。多種化合物中的伯氨基團可以作為醯基受體發揮作用，隨後形成肽結合的穀氨酸的單取代γ-醯胺。如果肽鏈中的賴氨酸殘基的ε-氨基作為醯基受體，那麼轉移酶將形成分子內或分子間γ-穀氨醯-ε-賴氨醯交聯。
未決的DK專利申請號990/94(Novo Nordisk A/S)中描述了轉穀氨醯胺酶的實例。
親本轉穀氨醯胺酶可以是人、動物(如牛)、或微生物起源的。
這些親本轉穀氨醯胺酶的實例是由動物衍生的轉穀氨醯胺酶，FXⅢa；由多頭絨泡菌衍生的微生物轉穀氨醯胺酶(Klein等人，Journal of Bacteriology,174,2599-2605)；由鏈黴菌屬的種，包括淡紫灰鏈黴菌、利迪鏈黴菌(以前稱黎巴嫩鏈黴菌)和鏈輪絲菌屬的種，包括茂原鏈輪絲菌、肉桂鏈輪絲菌、灰肉色鏈輪絲菌衍生的轉穀氨醯胺酶(Motoki等人，US 5,156,956；Andou等人，US5,252,469；Kaempfer等人，Journal of GeneralMicrobiology,137,1831-1892；Ochi等人，InternationalJournal of Sytematic Bacteriology,44,285-292；Andou等人，US 5,252,469；Williams等人，Journal of GeneralMicrobiology,129,1743-1813)。
應當理解，轉移酶變體也視為親本酶。
轉穀氨醯胺酶的活性可以如「Methods of EnzymaticAnalysis」，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第1-10卷中描述的進行測定。
合適的轉移酶包括WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中公開的任何轉穀氨醯胺酶。親本植酸酶親本植酸酶包括依照生物化學和分子生物學國際聯盟(IUBMB)的推薦(1992)分類位於酶分類編號E.C.3.1.3(磷酸單酯水解酶)下的酶。
植酸酶是由催化肌醇六磷酸轉化成肌醇和無機磷的微生物產生的酶。
產生植酸酶的微生物包括細菌，諸如枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和假單胞菌；酵母，諸如釀酒酵母；和真菌，諸如黑麴黴、無花果麴黴、泡盛麴黴、米麴黴、土麴黴或構巢麴黴，和各麴黴屬的其它種。
親本植酸酶的實例包括分類位於下列酶分類編號下的植酸酶3-植酸酶(3.1.3.8)和6-植酸酶(3.1.3.26)。
植酸酶的活性可以如「Methods of Enzymatic Analysis」，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第1-10卷中描述的進行測定，或者可以根據EP-A1-0 420 358實施例2A中描述的方法進行測量。異構酶親本異構酶包括依照生物化學和分子生物學國際聯盟(IUBMB)的推薦(1992)分類位於酶分類編號E.C.5下的酶。
親本異構酶的實例是蛋白質二硫鍵異構酶。合適的蛋白質二硫鍵異構酶包括WO 95/01425(Novo Nordisk A/S)中描述的PDI，但不局限於這些。工業組合物本發明又一方面涉及含具有改善洗滌性能的修飾多肽的「工業組合物」。
在本發明上下文中，「工業組合物」指不打算導入循環系統的組合物。換句話說，指的是不打算經皮內、靜脈內或皮下施用的組合物。
如上所述，對於多肽，例如酶的工業應用來說，主要問題是可能會因呼吸系統吸入，如氣管內或鼻內接觸而導致呼吸性變應反應。
「工業組合物」的例子是組合物或產品如洗滌劑中所用的多肽，特別是酶和抗微生物的多肽，所述洗滌劑包括洗衣用和碗碟洗滌劑，家用清潔產品，農用化學品，個人護理產品如皮膚護理產品，包括美容和沐浴產品，口服和經皮藥物，處理/加工紡織品所用的組合物，硬表面清潔組合物等，特別包括在本發明中的是皮膚護理產品和洗滌劑。
皮膚護理產品本發明中，「皮膚護理產品」涵蓋機體皮膚清潔、護理和/或美容所用的所有個人護理產品，還包括其它產品，如毛髮護理產品，它們在使用中可能會接觸皮膚或呼吸系統。用於動物的相應產品也包括在本發明範圍之內。
所涉及的本發明皮膚護理產品的具體例子有肥皂、化妝品、清潔霜、潔膚洗液、潔膚奶、皂霜(cream soap)、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、指甲油清潔劑、香波、香脂、護髮素等。
適於皮膚護理的酶活性本發明的皮膚護理組合物包含本發明洗滌或清潔效果有所改進、變應原性有所降低的綴合物和已知用於皮膚護理組合物的諸成分。
已知許多酶活性可用於皮膚護理組合物。
蛋白酶蛋白酶是潔膚產品中的有效成分。蛋白酶能除去皮膚死亡角質細胞的上層，由此使皮膚看上去更有光澤、更為清新。而且，蛋白酶也能提高皮膚的光滑性。
蛋白酶可用於化妝用品、盆浴和淋浴產品，包括香波、調理劑、洗劑、乳膏、肥皂塊、香皂以及液態肥皂。
脂肪酶脂肪酶可作為潔膚產品和抗痤瘡產品中的有效成分用於化妝品用途中，以除去過多的皮膚脂類，也可作為皮膚護理有效成分用於盆浴和淋浴產品(如乳膏和洗劑)中。
脂肪酶也可以用於毛髮清潔產品(例如香波)中，以有效地從毛髮表面除去皮脂和其它脂肪物質。
氧化還原酶用於個人護理用途的最常用的氧化還原酶是與底物(如葡萄糖)一起能確保產生H2O2的氧化酶(通常是葡糖氧化酶)，然後H2O2可起始過氧化物酶(通常是乳過氧化物酶)對例如SCN-或I-的氧化，形成抗微生物試劑(SCNO-或I2)。已知這一酶促複合物天然存在於例如乳汁和唾液中。
商業上，過氧化物酶在口腔護理產品(漱口液、牙粉、口香糖)中一直用作抗微生物體系，在這些產品中，它也可以與澱粉葡糖苷酶結合使用，以產生葡萄糖。已知這些體系也用於化妝品產品中，以利於保存。
氧化還原酶另一個應用是使用氧化酶、過氧化物酶和漆酶進行氧化性染髮(參見例如Novo Nordisk的WO 96/00290或WO95/33836)。
已知在皮膚(和毛髮)表面形成的自由基與皮膚的老化過程(毛髮的損壞)相關。
自由基會激活能導致脂膜、膠原以及細胞破壞的鏈式反應。
自由基清除劑(如超氧化物歧化酶)在化妝品中的應用是眾所周知的(R.L.Goldemberg,DCI,Nov.93,P.48-52)。
蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)也是一種氧化還原酶。它可以用於燙髮(使毛髮中的二硫鍵還原和再氧化)和修復受損毛髮(其中損傷主要是原有二硫鍵發生了還原)。
轉谷氧醯胺酶用於皮膚、毛髮或指甲的皮膚護理組合物包含(a)氨基功能活性成分，(b)催化活性成分與皮膚、毛髮或指甲交聯的轉穀氨醯胺酶，以及(c)在美國專利NO.5,490,980中已知的載體。
適合用於哺乳動物皮膚、毛髮或指甲的化妝品組合物包含(a)量足以在所說的皮膚、毛髮或指甲上形成保護層的至少一種角質細胞(corneocyte)包膜蛋白；(b)量足以使得在角質細胞包膜蛋白和所說皮膚、毛髮或指甲角質層中的外部暴露的角質細胞蛋白質之間形成共價鍵的轉穀氨醯胺酶；(c)量足以激活轉穀氨醯胺酶的鈣離子；以及(d)化妝品中可接受的載體，其中所說的組合物包含具有兩相的乳化劑，其中所說的角質細胞包膜蛋白質包含在該兩相中的一相內，而轉穀氨醯胺酶包含在另一相內(參見美國專利NO.5,525,336)。
JP 3083908描述了一種皮膚化妝品材料，其中含有用水溶性物質修飾過的轉穀氨醯胺酶。該修飾物質是例如聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、海藻酸、羧甲基纖維素、澱粉以及羥丙基纖維素中的一種或多種。這種修飾是通過例如導入活性基團並與酶鍵合完成的。這樣提供了一種對皮膚比較溫和、隨時間褪色和變味的程度較小、並具有良好的醫治粗糙皮膚、保溼性以及美化調理皮膚性能的物質。
本發明的皮膚護理產品本發明的第三方面涉及皮膚護理產品，其包含本發明的皮膚護理組合物。術語「皮膚護理產品」如上定義。
本發明的皮膚護理產品可包含有效量的本發明的修飾酶。這種本領域技術人員公知的有效量通常為最終皮膚護理產品的大於0-5％。
本發明所涉及的皮膚護理產品包括但不限於下述產品肥皂、化妝品、清潔霜、潔膚洗液、潔膚奶、皂霜、皂粉、塊皂、透明皂、指甲油清潔劑、香波、香脂、護髮素等。常規皮膚護理產品配方術語「用於皮膚護理產品的成分」是指包括已知用於皮膚護理產品配方中的所有成分。這種成分的例子可參見「化妝品和化妝用品」(由Wilfried Umbach編輯，由Ellis Horwood有限公司出版，英國，(1991))以及「消費品中的表面活性劑」(由J.Falbe編輯，由Spring-Verlag出版，(1987))。
下面非窮盡性地列出了一些指導性配方。這些製劑概括了本發明所涉及的重要皮膚護理產品配方。
香皂成分 例子 ％表面活性劑皂(鈉鹽) 83-87螯合劑乙二胺四乙酸鹽0.1-0.3稠度調節劑氯化鈉大約0.5染料＜0.1光學增白劑 ＜0.1抗氧化劑 2,6-雙(1,1-二甲基乙基)-4-甲 0.1-0.3基苯酚(BHT)增白劑二氧化鈦 0.1-0.3香料1.0-2.0酶蛋白酶/脂肪酶 0-5水分差額合成洗滌劑成分 例子 ％表面活性劑月桂基硫酸鹽 30-50月桂基磺基琥珀酸鹽1-12加脂劑脂肪醇10-20成形劑甘油的單/二硬脂醯酯 0-10填料 澱粉 0-10活性劑水楊酸0-1染料 ＜0.2香料0-2酶蛋白酶/脂肪酶 0-5水分 差額泡沫浴和淋浴泡沫浴淋浴成分 例子 ％ ％表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 10-2010-12椰油醯胺丙基二甲基甜菜鹼2-4 2-4乙氧基化脂肪酸 0.5-2 -加脂劑 脂肪醇 0.5-3乙氧基化脂肪醇 0.5-50-4酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5 0-5泡沫浴 淋浴成分例子 ％ ％泡沫穩定劑 脂肪酸鏈烷醇醯胺0.2-20-4調理劑 季銨化羥丙基纖維素- 0-0.5增稠劑 氯化鈉 0-3 0-3珠光劑 乙二醇硬脂酸酯 0-2 -活性劑 植物提取物 0-1 0-1防腐劑 5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷 0.1 0.1染料 0.1-0.20.1香料 0.3-3 0.3-2酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5 0-5水分 差額 差額洗髮香波成分 例子 ％表面活性劑月桂基醚硫酸鹽 12-16椰油脂肪酸醯氨丙基二甲基甜菜鹼 2-5脂肪酸聚乙二醇酯 0-2增泡劑脂肪酸乙醇醯胺 0.5-2.5調理劑季銨化羥乙基纖維素 0.4-1蛋白質水解產物 0.2-1加脂劑乙氧基化的羊毛脂醇 0.2-1添加劑去頭屑劑 0-1防腐劑5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷 0.1-0.3珠光劑乙二醇硬脂酸酯 0-2染料＜0.1pH調節劑 酸/鹼 0.1-1香料 0.3-0.5酶蛋白酶/脂肪酶 0-5水分 差額護髮素和毛髮調理劑護髮素 毛髮調理劑成分例子 ％％表面活性劑 脂肪醇聚乙二醇醚 0.1-1.5-0.2 2.5十六烷基三甲基氯化銨 0.5-1-二甲基苄基硬脂基氯化銨 - 0.5-1加脂劑 甘油的單/二鯨蠟酸/硬脂酸酯 0.5-1.5-1.5 2.5稠度調節劑 脂肪醇 1-2.52.5-3.5增稠劑 甲基羥丙基纖維素 0.3- 0.4-0.6 0.8調理劑 季銨化羥乙基纖維素 0.1- 0.3-0.3 0.4防腐劑 對羥基苯甲酸酯 0.1- 0.1-0.3 0.3染料 ＜0.1＜0.1pH調節劑酸/鹼0.1-10.1-1香料 0.2- 0.2-0.5 0.5酶 蛋白酶/脂肪酶0-5 0-5水分 差額 差額洗滌劑公開內容本發明的洗滌劑組合物例如可以製成手洗和機洗衣物洗滌劑組合物，包括洗衣添加劑組合物和適於髒織物預處理的組合物，漂洗添加的織物柔順組合物，適於普通家用硬表面清洗操作(包括生物膜脫除)和碗碟洗滌操作的組合物。
在生物膜脫除中，應提及藻酸裂合酶為一種優選的酶(參見JPl012728 A K.K.GUNZE和TANABE SEIYAKU GO，其引入本文作為參考)。
本發明的洗滌劑組合物包含本發明的綴合物和表面活性劑。此外還可任選地包含助洗劑，其它酶，泡沫抑制劑，柔順劑，染料轉移抑制劑，以及洗滌劑中習慣上使用的其它成分，如汙垢懸浮劑、汙垢除去劑、螢光增白劑、磨料、殺菌劑、變色抑制劑、著色劑和/或包覆或未包覆的香料。
本發明的洗滌劑組合物可以是液體、膏狀、凝膠、條狀或粒狀形式。pH(在使用濃度的水溶液中測得的)通常是中性或者鹼性，如pH7-11範圍內。本發明的粒狀組合物也可以是「緻密形式」的，即它們具有比常規的粒狀洗滌劑相對更高的密度，即550-950g/l。
按組合物重量計，一般以0.00001-2％，優選0.0001-1％，更優選0.001-0.5％，最優選0.01-0.2％酶蛋白的量將本發明的酶綴合物或摻入洗滌劑組合物中的其它任選酶摻入到本發明的洗滌劑組合物中。但是，酶的劑量取決於酶的變應原性和改善的洗滌性能，即，低變應原性可採用高劑量，改善了洗滌性能則可採用低劑量。表面活性劑體系表面活性劑體系可包括非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑。表面活性劑體系優選由陰離子表面活性劑組成，或是陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑的混合物，如陰離子表面活性劑佔50-100％，非離子表面活性劑佔0-50％。衣物洗滌劑組合物中還可含有陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、兩性離子表面活性劑和半極性表面活性劑，以及非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑而非上述的那些。表面活性劑一般以0.1-60％重量的量存在。下面介紹表面活性劑的一些例子。非離子表面活性劑表面活性劑可包含烷基酚的聚環氧烷(如聚氧乙烯)縮合物。這些烷基可包含約6-14個碳原子，可以是直鏈或支鏈構型。環氧乙烷存在的量相當於每摩爾烷基酚約2-25摩爾。
表面活性劑也可包含伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環氧乙烷的縮合物。該脂族醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈，並且通常含有約8-22個碳原子。
此外，非離子表面活性劑可包括烷基酚的聚氧乙烯縮合物、伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環氧乙烷的縮合產物、烷基多糖和其混合物。最優選的是具有3-15個乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10個乙氧基的C8-C18(優選平均為C10)醇乙氧基化物和其混合物。陰離子表面活性劑合適的陰離子表面活性劑包括式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸這樣的烷基烷氧基化硫酸鹽，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羥基烷基，優選C12-C20烷基或羥基烷基，更優選C12-C18烷基或羥基烷基，A是乙氧基或丙氧基單元，m大於0，一般為約0.5-6，更優選約0.5-3,M是H或陽離子，該陽離子可以是例如金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)、銨或取代銨陽離子。本文中預計使用烷基乙氧基化硫酸鹽以及烷基丙氧基化硫酸鹽。取代銨陽離子的具體例子包括甲基、二甲基、三甲基銨陽離子和季銨陽離子如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子和從烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些陽離子等。
其它合適的陰離子表面活性劑包括式ROSO3M的水溶性鹽或酸這樣的烷基硫酸鹽表面活性劑，其中R優選是C10-C24烴基，優選具有C10-C20烷基部分的烷基或羥基烷基，更優選C12-C18烷基或羥基烷基，M是H或陽離子(如鈉、鉀、鋰離子)，或者銨或取代銨離子。
其它陰離子表面活性劑包括皂的鹽(包括，例如鈉、鉀、銨、和取代的銨如單、二和三乙醇胺鹽)、C8-C22伯或仲烷烴磺酸鹽、C8-C24烯烴磺酸鹽、通過鹼土金屬檸檬酸鹽熱解產物的磺化製備的磺化多羧酸。烷基苯磺酸鹽比較合適，特別是線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中該烷基優選含有10-18個碳原子。
衣物洗滌劑組合物中通常含有約1-40％、優選約3-20％的這類陰離子表面活性劑。助洗劑體系本發明的組合物還可包含助洗劑體系。任何常規助洗劑體系都適用於本文中，其包括矽鋁酸鹽材料、矽酸鹽、多羧酸鹽和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸鹽(EDTA)的材料、金屬離子螯合劑例如氨基多膦酸鹽。本文中也可以使用磷酸鹽助洗劑。
合適的助洗劑可以是無機離子交換材料，通常是無機水合的矽鋁酸鹽材料，更具體地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。
洗滌助洗劑鹽的量通常為組合物重量的5-80％。用於液體洗滌劑的助洗劑的優選量是5-30％。其它洗滌酶活性除了含有具特異活性的本發明綴合物之外，本發明洗滌劑組合物還可含有提供清洗性能和/或織物護理益處的其它酶活性(例如也是本發明上述酶綴合物的形式)，例如蛋白酶、脂肪酶、角質酶、澱粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、滷過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
具體考慮的酶實例為在上面「酶活性」一節中所列出的那些。漂白劑洗滌劑組合物(特別是粒狀洗滌劑的情況下)中也可含有漂白劑，如氧型漂白劑或滷素型漂白劑。氧漂白劑可以是過氧化氫釋放劑，例如過硼酸鹽(如PB1或PB4)或過碳酸鹽，或者可以是過羧酸，其粒徑可以是400-800微米。當存在氧型漂白化合物時，其存在的量一般是約1-25％。
可以將過氧化氫釋放劑與漂白活化劑一起使用，該漂白活化劑是例如四乙醯基乙二胺(TAED)、壬醯氧基苯磺酸鹽(NOBS)、3,5-三甲基己醯氧基苯磺酸鹽(ISONOBS)或五乙醯基葡萄糖(PAG)。
滷素型漂白劑可以是例如次滷酸鹽漂白劑，如三氯異氰脲酸，以及二氯異氰脲酸的鈉和鉀鹽，以及N-氯代和N-溴代烷烴磺醯胺。這樣的材料通常以最終產品重量的0.5-10wt％、優選1-5wt％的量加入。紡織品應用蛋白酶蛋白酶用於對絲綢進行脫膠和砂洗處理。脂肪酶在紡織品的整理過程中，脂肪酶被用來除去含疏水性酯(如三甘油酯)的脂類物質(參見例如Novo Nordisk A/S的WO93/13256)。氧化還原酶在紡織品的漂白清潔中，過氧化氫酶可以用來除去多餘的過氧化氫。糖酶在粗斜紋棉布服裝的整理中，纖維素分解酶被廣泛使用，以使織物色度局部改變(酶促進的「石洗」)。
纖維素分解酶也可用於生物拋光加工中。生物拋光是對砂洗表面所進行的一項特殊處理，可改善織物手感和外觀方面的性質，但不會使織物可溼性受到損失。可應用WO93/20278所述的方法進行生物拋光。
在紡織品的紡織過程中，絲線通常會受到不小的機械力。為避免斷裂，常常用凝膠類物質(漿料)對它們上漿。最普遍使用的上漿劑是天然或修飾形式的澱粉。只有在除去了織物上的漿料(即所謂的脫漿)後，才完成了特有和持久的整理。用含有澱粉或改性澱粉的漿料上漿過的織物的脫漿過程優選利用澱粉分解酶來促進。材料和方法材料酶PD498:WO 93/24623中所示的枯草桿菌蛋白酶類型的蛋白酶。PD498的序列在SEQ ID NO.1和2中顯示。枯草桿菌蛋白酶DY分離自芽孢桿菌變種、示於SEQ ID NO:3的枯草桿菌蛋白酶類型蛋白酶(Betzel等(1993)，生物物理學檔案(Archives of Biophysics),302卷，2,P.499-502)。SavinaseSavinase變體R247K(採用BPN編號方式，在位置247處的精氨酸被賴氨酸取代)。ELISA試劑辣根過氧化物酶標記的豬抗兔Ig(Dako,DK,P217，稀釋度1∶1000)。大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA419；稀釋度1∶100)。小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀釋度1∶200)。生物素標記的小鼠抗大鼠IgG1單克隆抗體(Zymed03-9140；稀釋度1∶1000)生物素標記的大鼠抗小鼠IgG1單克隆抗體(Serotec MCA336B；稀釋度1∶2000)鏈黴親和素-辣根過氧化物酶(Kirkegard和Perry14-30-00；稀釋度1∶1000)。緩衝液和溶液-PBS(pH7.2(1升))NaCl 8.00gKCl 0.20gK2HPO41.04gKH2PO40.32g-洗滌緩衝液PBS,0.05％(v/v)Tween20-封閉緩衝液PBS,2％(wt/v)脫脂奶粉-稀釋緩衝液PBS,0.05％(v/v)Tween20,0.5％(wt/v)脫脂奶粉-檸檬酸鹽緩衝液(0.1M,pH5.0-5.2(1升))檸檬酸鈉20.60g檸檬酸6.30g-終止溶液(DMG緩衝液)-硼酸鈉，硼砂(Sigma)-3,3-二甲基戊二酸(Sigma)-CaCl2(Sigma)-Tween20聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯(Merck目錄號822184)-N-羥基琥珀醯亞胺(Fluka art.56480)-碳醯氯(Fluka art.79380)-乳糖(Merck 7656)-PMSF(苯基甲基磺醯氟)Sigma-琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma NO.S-7388，分子量624.6g/摩爾。-mPEG(Fluka)蛋白酶模型洗滌劑95為家用洗滌劑配方25％ STP(Na5P3O10)25％ Na2SO410％ Na2CO320％ LAS(Nansa 80S)5％ NI(Dobanol 25-7)5％ Na2Si2O50.5％羧甲基纖維素(CMC)9.5％水EMPA116在棉布上的血液，奶，墨汁EMPA117在PE/BO上的血液，奶，墨汁著色底物OPD鄰苯二胺，(Kementec目錄號4260)試驗動物Brown Norway大鼠(得自Charles River,DE)裝備XCELⅡ(Novex)ELISA讀數儀(UVmax,Molecular Devices)HPLC(Waters)PFLC(Pharmacia)Superdex-75柱，Mono-Q,MonoS(購自Pharmacia,SW.)SLT購自SLT LabInstruments的Fotometer。大小排阻層析儀(Spherogel TSK-G2000 SW)。大小排阻層析儀(Superdex 200,Pharmacia,SW)Amicon小槽採用Omega 10K膜的Filtron UltrasetteMiniwash RobotJM Tidas MMS/16光度計，備有CLX 75X氙燈和纖維鏡片方法Brown Norway大鼠的氣管內(IT)刺激使用具有21/2英寸長度金屬探頭的一次性注射器進行氣管內施用分子。這一探頭插入進大鼠的氣管中大約在會厭下1cm，放置0.1ml的分子溶液。
試驗動物是每組10隻的Brown Norway大鼠(BN)。在實驗開始時重量大於200克，實驗結束時重量大約450克。確定Brown Norway大鼠中IgE抗體相對濃度的ELISA方法使用三層三明治ELISA(three layer sandwish ELISA)確定特異性IgE血清抗體的相對濃度。
1)用10mg小鼠抗大鼠IgE緩衝液1包被ELISA板。50μl/孔。在4℃下溫育過夜。
2)倒空板並以封閉緩衝液在室溫下封閉至少1/2小時。200μl/孔。輕微搖動。用洗滌緩衝液洗滌板3次。
3)與大鼠血清一起溫育，從未稀釋的血清開始，並以2倍稀釋度連續稀釋。留一些孔僅用緩衝液4處理(空白)。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
4)在稀釋緩衝液中將酶稀釋成適當的蛋白質濃度。50μl/孔在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
5)用稀釋緩衝液稀釋特異性多克隆抗酶抗血清血清(pIg)以用於檢測結合抗體。50μl/孔在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
6)用稀釋緩衝液稀釋辣根過氧化物酶綴合的抗pIg抗體。50μl/孔在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動。用洗滌緩衝液洗滌板3次。
7)於底物緩衝液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。製備好該溶液後立即使用。溫育10分鐘。50μl/孔。
8)終止反應加入終止溶液50μl/孔。
9)在492 nm對平板讀數，以620nm的讀數作為參照。數據用Lotus軟體計算並顯示。測定分子量使用4-20％梯度的SDS聚丙烯醯胺凝膠(Novex)，通過標準方法進行蛋白質的電泳分離。蛋白質通過銀染檢測。相對於Novex的Mark-12寬範圍分子量標準的遷移率測量分子量。蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析
蛋白酶切割肽和對硝基苯胺之間的鍵，產生在405nm吸收的可見黃色。緩衝液例如Britton和Robinson緩衝液pH 8.3底物將100mg suc-AAPF-pNa溶解在1ml二甲基亞碸(DMSO)中。將100ml的這種溶液用Britton和Robinson緩衝液稀釋成10ml。分析混合底物和蛋白酶溶液，在405nm下監測作為時間和ABS405nm/min的函數的吸光度。應該控制溫度(在20-50℃之間，取決於蛋白酶)。這測量的是樣品中的蛋白酶活性。
實施例實施例1用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)1.900(50wt％乙二醇)將聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)1.900(50wt％乙二醇)(來自ALDRICH)溶解於甲苯(5ml/g聚合物)。在常壓下蒸出約20％以共沸乾燥反應物。將溶液冷卻至20℃，加入甲苯中的碳醯氯(1.93M,7mol/mol聚合物)。然後，將混合物在室溫下攪拌過夜。真空除去溶劑和過量的碳醯氯，獲得一種油狀的中間體雙(氯代甲酸酯)。
將甲苯(無水4ml/g聚合物)加入以再將油溶解。加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)(2.4mol/mol聚合物)，將混合物用冰浴進行冷卻。再在0℃下滴加三乙胺(2.2mol/mol聚合物)。可立即觀察到出現三乙胺鹽酸鹽沉澱(Et3N.HCl)。將混合物在室溫下攪拌過夜。採用玻璃濾器(G5)將混合物過濾，除去Et3N.HCl。在減壓下將濾液蒸發至幹，得到97％(mol/mol)的油狀物。NMR表明大於90％被活化，並且有小於8o/o(mol/mol)的未結合NHS。聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)1.900雙(琥珀醯亞胺碳酸酯)(50wt％乙二醇)的1H-NMR(400MHz)(CDCl3)δ:1.15bs(I=330，在PPG的-CH3),2.69s(I=1.7未反應的NHS),2.83s(I=41，琥珀醯亞胺)，3.41m(I=110,PPG中的CH-CH2),3.55m(I=220,PPG中的CH-CH2),3.61m(I=440主峰)，4.46t(I=19,PEG中的CH2-O-CO-)。
實施例2用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化聚(乙二醇)-共-(丙二醇)-單丁基醚970(約50wt％乙二醇)將聚(乙二醇)-共-(丙二醇)單丁基醚970(約50wt％乙二醇)(來自ALDRICH)溶解於甲苯(4ml/g聚合物)中。在常壓下蒸餾除去約25％以共沸乾燥反應物。將溶液冷卻至0℃，加入甲苯中的碳醯氯(1.93M,5mol/mol聚合物)。然後，將混合物在室溫下攪拌21小時。真空除去溶劑和過量的碳醯氯，獲得一種油狀的中間體氯代甲酸酯。
將甲苯(無水2ml/g聚合物)加入以再將油溶解。在室溫下，加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)(1.2mol/mol聚合物)，再在0℃下滴加三乙胺(1.1mol/mol聚合物)。可立即觀察到出現三乙胺鹽酸鹽沉澱(Et3N.HCl)。將混合物在室溫下攪拌過夜。採用多孔玻璃濾器(G5)將混合物過濾，除去不溶解的Et3N.HCl。在減壓下將濾液蒸發至幹，得到89％(mol/mol)的油狀物。NMR表明＞72％活化，並且有＜50/0(mol/mol)的未結合NHS。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.91t(I=1000-CH3丁基)，1.15bs(I=8744，丙二醇中的-CH3)，1.39m(I=1320 CH3-CH2-CH2-丁基)，1.55m(I=656-CH2-O-丁基)，2.68s(I=60.8未反應的NHS),2.83 s(I=963.2，琥珀醯亞胺)，3.40m(I=3059，丙二醇中的CH-CH2),3.55m(I=2678,丙二醇中的CH-CH2),3.61m(I=1764主峰，乙二醇中的-CH2-CH2-)，4.46m(CH2-O-CO-)。
實施例3用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化mPEG 350將mPEG 350懸浮在甲苯中(4ml/g mPEG)，在常壓下蒸餾除去約20％以共沸乾燥反應物。當溶液冷卻到20℃時，加入甲苯中的碳醯氯(1.93M 1.5mol/mol mPEG)，混合物在室溫下攪拌過夜。混合物減壓蒸發，所得的中間產物氯甲酸酯為油狀。
在蒸發之後，添加二氯甲烷和甲苯(1∶2，無水4ml/g mPEG)以重新溶解該無色油。以固體形式加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)(1.5mol/mol mPEG)，然後加入0℃三乙胺(1.1mol/mol mPEG)，可觀察到三乙胺鹽酸鹽(Et3N.HCl)立即沉澱下來。將混合物室溫下攪拌過夜。用多孔玻璃濾器(G5)過濾混合物以除去Et3N.HCl。將濾液減壓蒸發至乾燥，得到98％(mol/mol)的油。NMR表明有85-95％被活化和小於10o/o(mol/mol)HNEt3Cl。mPEG 350琥珀醯亞胺碳酸酯(CDCl3)的1H-NMR(400MHz)(CDCl3)δ為1.42t(I=1.4,HNEt3Cl中的CH3)，2.68s(I=3.4未反應的NHS),2.84s(I=6.2琥珀醯亞胺)，3.10dq(I=1.0,HNEt3Cl中的CH2),3.38s(I=5.8,OMe中的CH3)，3.64bs(I=50主峰)，4.47t(I=3.0,PEG中的CH2)。
實施例4用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化PEG 300將PEG 300溶解於甲苯(13ml/g mPEG)中。在常壓下蒸餾除去約25％以共沸乾燥反應物。當溶液冷卻到20℃時，加入甲苯中的碳醯氯(1.93M 3.8mol/mol PEG)，混合物在室溫下攪拌20小時。將混合物減壓蒸發，所得的中間產物雙(氯甲酸酯)為油狀。
在蒸發之後，添加無水甲苯(10ml/g PEG)以重新溶解該無色油。以固體形式加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)(3.0mol/mol mPEG)，然後在0℃下加入三乙胺(2.4mol/mol mPEG)。可觀察到三乙胺鹽酸鹽(Et3N.HCl)立即沉澱下來。將混合物室溫下攪拌過夜。用多孔玻璃濾器(G5)過濾混合物以除去Et3N.HCl。將濾液減壓蒸發至乾燥，得到90％(mol/mol)的油。NMR表明有大於55％被活化和小於5o/o(mol/mol)HNEt3Cl。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.11t(I=1.8，在NEt3中的CH3),2.69s(I=1.39，未反應的NHS)，2.84s(I=20.0琥珀醯亞胺)，3.64bs(I=113主峰)，4.44m(I=10.0，在PEG中的CH2)。
實施例5用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化mPEG 550將mPEG 550溶解於甲苯(9ml/g mPEG)中。在常壓下蒸餾除去約10％以共沸乾燥反應物。當溶液冷卻到20℃時，加入甲苯中的碳醯氯(1.93M 1.5mol/mol mPEG)，混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物減壓蒸發，所得的中間產物氯甲酸酯為油狀。
在蒸發之後，添加無水甲苯(4ml/g PEG)和無水二氯甲烷(3ml/gPEG)以重新溶解該無色油。以固體形式加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)(1.2mol/mol mPEG)，然後在0℃下加入三乙胺(1.2mol/molmPEG)。可觀察到三乙胺鹽酸鹽(Et3N.HCl)立即沉澱下來。將混合物室溫下攪拌過夜。用多孔玻璃濾器(G5)過濾混合物以除去Et3N.HCl。將濾液減壓蒸發至乾燥，得到89％(mol/mol)的粘性油。NMR表明有大於77％被活化和小於2o/o(mol/mol)HNEt3Cl。mPEG 550琥珀醯亞胺碳酸酯的1H-NMR(400MHz)(CDCl3)δ:1.41t(I=4.2,HNEt3Cl中的CH3)，2.69s(I=24.4未反應的NHS),2.84s(I=81琥珀醯亞胺)，3.10dq(I=3.7,HNEt3Cl中的CH2),3.38s(I=97OMe中的CH3),3.64bs(I=1250主峰)，4.44m(I=41,in PEG中的CH2)。
實施例6PD498蛋白酶與活化的mPEG 350的綴合在6ml的終體積內，於50mM硼酸鈉(pH9.7)中，將62mg PD498與20mg(約200μl)用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的mPEG350(按照實施例1製備)一起溫育。通過磁性攪拌，在室溫下進行反應。反應時間是2小時。通過添加0.5M琥珀酸至終pH為6.0來終止反應。所得衍生物的分子量大約是33kDa，相當於每摩爾PD498連接了大約11摩爾mPEG。
與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例7枯草桿菌蛋白酶DY蛋白酶和活化的mPEG 350的綴合將枯草桿菌蛋白酶DY與使用與實施例2中所述相同的方法經N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的mPEG350進行綴合。
對本領域技術人員來說顯而易見的是，參照前述公開內容，在本發明的實施中可以作很多修改和變化而不偏離其精神和範圍，因此，本發明的範圍應理解為是下述權利要求所定義的內容。
實施例8Savinase變體R247K與活化的mPEG-350的綴合將21mg的Savinase變體在50mM的硼酸鈉(pH9.5)中用16mg的N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的mPEG 350進行溫育，最終體積大約為2ml。採用磁性攪拌在室溫下進行反應，並通過加入0.5M NaOH以保持pH值為9.0-9.5。反應時間為2小時。加入1M HCl至最終的pH值為6.0使反應停止。通過在用50mM硼酸鈉、5mM琥珀酸、1mM CaCl2,pH6.0平衡的Superdex 75 HiLoad柱(Pharmacia,SW)上進行尺寸排阻色譜法處理除去過量的試劑。與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例9Savinase變體R247K與活化的mPEG-550的綴合將21mg的Savinase變體在50mM的硼酸鈉(pH9.5)中用25mg的N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的mPEG 550進行溫育，最終體積大約為2ml。採用磁性攪拌在室溫下進行反應，並通過加入0.5M NaOH以保持pH值為9.0-9.5。反應時間為2小時。加入1M HCl至最終的pH值為6.0使反應停止。通過在用50mM硼酸鈉、5mM琥珀酸、1mM CaCl2,pH6.0平衡的Superdex 75 HiLoad柱(Pharmacia,SW)上進行尺寸排阻色譜法處理除去過量的試劑。與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例10Savinase變體R247K與活化的雙-PEG-300的綴合將21mg的Savinase變體在50mM的硼酸鈉(pH9.5)中用14mg的N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的雙-PEG 300進行溫育，最終體積大約為2ml。採用磁性攪拌在室溫下進行反應，並通過加入0.5M NaOH以保持pH值為9.0-9.5。反應時間為2小時。加入1M HCl至最終的pH值為6.0使反應停止。通過在用50mM硼酸鈉、5mM琥珀酸、1mM CaCl2,pH6.0平衡的Superdex 75 HiLoad柱(Pharmacia,SW)上進行尺寸排阻色譜法處理除去過量的試劑。與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例11Savinase與活化的雙-PEG-200的綴合將827mg的Savinase變體在50mM的硼酸鈉(pH9)中用420mg的N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的雙-PEG200進行溫育，最終體積大約為30ml。採用磁性攪拌在室溫下進行反應，並通過加入0.5M NaOH以保持pH值為8.5-9.0。反應時間為2小時。加入1M HCl至最終的pH值為6.0使反應停止。採用Filtron Ultrasette，截留值為10kD進行超濾以除去過量的試劑。與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例12Savinase與活化的雙-PEG-300的綴合將827mg的Savinase變體在50mM的硼酸鈉(pH9)中用610mg的N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的雙-PEG300進行溫育，最終體積大約為30ml。採用磁性攪拌在室溫下進行反應，並通過加入0.5M NaOH以保持pH值為8.5-9.0。反應時間為2小時。加入1M HCl至最終的pH值為6.0使反應停止。採用Filtron Ultrasette，截留值為10kD進行超濾以除去過量的試劑。與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例13Savinase與活化的雙-PEG-600的綴合將827mg的Savinase變體在50mM的硼酸鈉(pH9)中用1000mg的N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的雙-PEG600進行溫育，最終體積大約為100ml。採用磁性攪拌在室溫下進行反應，並通過加入0.5M NaOH以保持pH值為8.5-9.0。反應時間為2小時。加入1M HCl至最終的pH值為6.0使反應停止。採用Filtron Ultrasette，截留值為10kD進行超濾以除去過量的試劑。與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例14Savinase與活化的PEG 1000的綴合將2g的Savinase在50mM的硼酸鈉(pH9)中用2.8g的N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的PEG 1000進行溫育，最終體積大約為200ml。採用磁性攪拌在室溫下進行反應，並通過加入0.5M NaOH以保持pH值為8.5-9.0。反應時間為2小時。加入1M HCl至最終的pH值為6.0使反應停止。
採用Filtron Ultrasette進行超濾以除去過量的試劑。
與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例15Savinase與活化的PEG 2000的綴合將2g的Savinase在50 mM的硼酸鈉(pH9)中用7.8g的N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的PEG 2000進行溫育，最終體積大約為200ml。採用磁性攪拌在室溫下進行反應，並通過加入0.5M NaOH以保持pH值為8.5-9.0。反應時間為2小時。加入1M HCl至最終的pH值為6.0使反應停止。
採用Filtron Ultrasette進行超濾以除去過量的試劑。
與親本酶比較，對肽底物(琥珀醯-丙氨醯-丙氨醯-脯氨醯-苯丙氨醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例16Savinase與聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)1900雙(琥珀醯亞胺碳酸酯)(50wt％乙二醇)的綴合用0.5N NaOH將於3ml緩衝液中的148mg Savinase調節至pH9.0，向酶中加入450mg該活化的嵌段聚合物。然後，在磁性攪拌下將反應混合物在室溫下溫育，並用0.5N NaOH保持pH9.0。在2小時後，用0.5M琥珀酸將pH調節至6.0。將反應混合物在Superdex 200柱上經凝膠過濾進行純化。與親本酶比較，綴合物對DMC的剩餘活性為130％。
實施例17Savinase與聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)2900雙(琥珀醯亞胺碳酸酯)(40wt％乙二醇)的綴合用0.5N NaOH將於3ml緩衝液中的148mg Savinase調節至pH9.0，向酶中加入700mg該活化的嵌段聚合物。然後，在磁性攪拌下將反應混合物在室溫下溫育，並用0.5N NaOH保持pH9.0。在2小時後，用0.5M琥珀酸將pH調節至6.5。將反應混合物在Superdex 200柱上經凝膠過濾進行純化。與親本酶比較，綴合物對DMC的剩餘活性為84％。
實施例18Savinase與聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)8400雙(琥珀醯亞胺碳酸酯)(80wt％乙二醇)的綴合用0.5N NaOH將於4ml緩衝液中的148mg Savinase調節至pH9.0，將2000mg該活化的嵌段聚合物溶解於6ml 1mM HCl中，然後加至酶中。在磁性攪拌下將反應混合物在室溫下溫育，並用0.5N NaOH保持pH9.0。在2小時後，用0.5M琥珀酸將pH調節至6.5。將反應混合物在Superdex 200柱上經凝膠過濾進行純化。與親本酶比較，綴合物對DMC的剩餘活性為103％。
實施例19Savinase與聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-共-聚(乙二醇)12000雙(琥珀醯亞胺碳酸酯)(75wt％乙二醇)的綴合用0.5N NaOH將於4ml緩衝液中的148mg Savinase調節至pH9.0，將2800mg該活化的共聚物加至酶中。在磁性攪拌下將反應混合物在室溫下溫育，並用0.5N NaOH保持pH9.0。在2小時後，用0.5M琥珀酸將pH調節至6.0。反應混合物在Superdex 200柱上經凝膠過濾進行純化。與親本酶比較，綴合物對DMC的剩餘活性為140％。
實施例20Savinase與聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-共-聚(乙二醇)970雙(琥珀醯亞胺碳酸酯)(50wt％乙二醇)的綴合用0.5N NaOH將於4ml緩衝液中的148mg Savinase調節至pH9.0，將340mg該活化的共聚物加至酶中。在磁性攪拌下將反應混合物在室溫下溫育，並用0.5N NaOH保持pH9.0。在2小時後，用0.5M琥珀酸將pH調節至6.0。反應混合物在Superdex200柱上經凝膠過濾進行純化。與親本酶比較，綴合物對DMC的剩餘活性為124％。
實施例21小mPEG聚合物的PD498綴合物對Brown Norway大鼠的氣管內(IT)實驗將已知蛋白質濃度(由衍生物的光密度和胺基酸序列分析測定)的PD498樣品稀釋至0.75μg蛋白質/ml。
將稀釋樣品等分成1.5ml組分以用於各個免疫接種。將這些組分儲存於-20的穩定條件下備用。在研究開始和結束時進行分析。每次免疫和分析均取用一個新組分。
如上述實施例所述將酶綴合物綴合上N-琥珀醯亞胺活化的mPEG350、550、750。用相應的親本酶作對照。
檢測以下樣品組1:PD498(未偶聯的親本酶-對照)組2:PD498-SPEG 750組3:PD498-SPEG 550組4:PD498-SPEG 350用0.9％(wt/vol)NaCl溶液100μl(對照組)或者上述PD498蛋白質稀釋液100μl免疫大鼠，每周一次，共15次。
每組有10隻Brown Norway大鼠。每隔一次免疫之後一周、但在下次免疫之前從眼部取血樣(2ml)，通過凝血和離心得到血清。
用上述特異於大鼠IgE的ELISA試驗檢測特異IgE水平，測定血清未稀釋液的1/2稀釋度滴度，測定492/620nm的光密度。
IT實驗的結果示於下述表中，顯示研究結束時在用相應PD498衍生物處理的Brown Norway大鼠中觀察到的每100μl血清的總光密度值。
PD498綴合物實驗結果示於下表2中表2
括號中的值所測平均值的標準誤差。
從表2可以看出，與氣管內暴露於未修飾親本酶的大鼠相比，氣管內暴露於偶聯了小聚合物的PD498綴合物的大鼠其特異性IgE應答水平降低，因此變應原性有所降低。
實施例22枯草桿菌蛋白酶DY綴合物的Brown Norway大鼠氣管內(IT)實驗重複實施例5所述的Brown Norway大鼠IT研究，對枯草桿菌蛋白酶DY-SPEG750綴合物和相應的親本枯草桿菌蛋白酶DY(見SEQ IDNO:3)作一比較。
枯草桿菌蛋白酶DY-PEG750實驗結果示於下表3中表3
括號中的值所測平均值的標準誤差。
從表3可以看出，與氣管內暴露於未修飾親本酶的大鼠相比，氣管內暴露於偶聯了750Da聚合物的枯草桿菌蛋白酶DY綴合物的大鼠其特異性IgE應答水平降低，因此變應原性有所降低。
實施例23含有PD498-SPEG綴合物的護膚製劑製備含有本發明綴合物的下述護膚製劑護膚液(製成100g)油相液體石蠟 35g鯨蠟醇 5gTween80 7g水相單丙二醇(MPG)10g0.4％檸檬酸緩衝液*pH5.8 42.9gmethyl paraben 0.1gPD498-SPEG550**10mg(以酶蛋白計)分開混合油相和水相，並加熱至80℃。一邊攪拌一邊將油相緩慢倒入水相中，將混合物冷卻到約35℃，加入PD498-SPEG550綴合物，使護膚液快速冷卻。*0.4％檸檬酸一水合物，pH調至5.9**通常以添加有MPG的製劑提供。應根據酶製劑中MPG的量調節水相中的MPG。凝膠(製成100g)MPG 20g*H2O 約100g檸檬酸 0.4g**Carbapol 9401gPD498-SPEG350 10mg(以酶蛋白計)按以上順序混合各成分，在加入carbapol之前調節pH至5.6。加入carbapol之後再調節pH。*根據酶製劑中的量進行調節。**pH5.6實施例24PEG-Savinase和EOPO-Sayinase的洗滌性能表4實驗設置號1
表5實驗設置號2
表6實驗設置號3
表7實驗設置號4
表8實驗設置5
表9實驗設置6
表10實驗設置7
表11實驗設置8
洗滌劑溶液的pH值用HCl/NaOH調節至10.5。通過向去離子水中加入CaCl2和MgCl2調節水硬度(參見，消費品中的表面活性劑-理論、技術和應用，springer Verlag 1986)。洗滌劑溶液的pH值通常經加入HCl調節至10.5。
通過在微波爐中將洗滌劑溶液在85℃下加熱5分鐘而將市售粉末洗滌劑中存在的蛋白酶失活。
實驗材料的反射度(reflectance)測量在460nm下進行，採用JM Tidas MMS/16光度計，其備有CLX 75W氙燈和纖維光學鏡片。每一種織物片單獨地與作為背景的其它織物片(相同設置)一起進行測量。
利用SAS 6.12軟體對實驗數據進行方差分析和95％顯著性的t-檢驗比較(Student-Newman-Keuls)。
不同Savinase變體的洗滌性能通過比較Δ反射度(DeltaReflectance,DR)值進行評價DR=R蛋白酶-R空白DRΔ反射度R蛋白酶用綴合的蛋白酶洗滌的實驗材料的反射度。
R空白用未綴合的蛋白酶洗滌的實驗材料的反射度。結果大寫字母指明在基於t-檢驗(SNK,a=0.05)的欄內的統計學分組。如果兩個在相同的組內(相同的字母)，則它們不可能在統計學上分開。表12平均反射度值和統計信息
表13平均反射度值
表14平均反射度值
表15平均反射度值
從上表可以看出，與未綴合的Savinase相比，PEG-Savinase和EOPO-Savinase具有改善的洗滌性能。
序列表110NOVO NORDISK A/S120具有改進的洗滌性能的多肽-聚合物綴合物1305625,HkBk1401411605170PatentIn Ver.2.12101211840212DNA213Bacillus sp.PD498,NCIMB No.404844001tggtcaccga atgaccctta ctattctgct taccagtatg gaccacaaaa cacctcaacc 60cctgctgcct gggatgtaac ccgtggaagc agcactcaaa cggtggcggt ccttgattcc 120ggagtggatt ataaccaccc tgatcttgca agaaaagtaa taaaagggta cgactttatc 180gacagggaca ataacccaat ggatcttaac ggacatggta cccattgtgc cggtactgtt 240gctgctgata cgaacaatgg aattggcgta gccggtatgg caccagatac gaagatcctt 300gccgtacggg tccttgatgc caatggaagt ggctcacttg acagcattgc ctcaggtatc 360cgctatgctg ctgatcaagg ggcaaaggta ctcaacctct cccttggttg cgaatgcaac 420tccacaactc ttaagagtgc cgtcgactat gcatggaaca aaggagctgt agtcgttgct 480gctgcaggga atgacaatgt atcccgtaca ttccaaccag cttcttaccc taatgccatt 540gcagtaggtg ccattgactc caatgatcga aaagcatcat tctccaatta cggaacgtgg 600gtggatgtca ctgctccagg tgtgaacata gcatcaaccg ttccgaataa tggctactcc 660tacatgtctg gtacgtccat ggcatcccct cacgtggccg gtttggctgc tttgttggca 720agtcaaggta agaataacgt acaaatccgc caggccattg agcaaaccgc cgataagatc 780tctggcactg gaacaaactt caagtatggt aaaatcaact caaacaaagc tgtaagatac 8402102211280212PRT213Bacillus sp.PD498,NCIMB No.404844002Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 2802103211274212PRT213Bacillus sp.variant4003Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp20 25 30Thr Gly Ile Ala (Ala/Ser) Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly Ala35 40 45Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asn85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp100 105 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His Tyr Gly Val Ser Val Val245 250 255Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr260 265 270Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala275 280 285Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala290 295 300Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys305 310 31權利要求
1．一種具有改善洗滌性能的多肽-聚合物綴合物。
2．根據權利要求1的綴合物，其中，所述綴合物具有降低的變應原性。
3．根據權利要求1或2的綴合物，其中，所述多肽為一種酶。
4．根據前述權利要求任一項的綴合物，其中，親本多肽的分子量為4 kDa至100 kDa，其綴合至均聚物上，所述均聚物的分子量為0.1 kDa至60 kDa，優選100 Da至10,000 Da，特別是100 Da至2,000 Da。
5．根據權利要求4的綴合物，其中，親本多肽，特別是酶，其分子量為15至60 kDa。
6．根據權利要求1至5任一項的綴合物，其中，1至100個聚合分子，優選4至50個，更優選5至35個聚合分子共價偶聯至親本酶上。
7．根據權利要求1至6任一項的綴合物，其中，聚合分子選自天然或合成的均聚物和雜聚物。
8．根據權利要求7的綴合物，其中，聚合分子選自包含合成聚合分子，包括分支PEG、星型PEG、PEG醚和PEG酯在內的組中。
9．根據前述任一項權利要求的綴合物，其中，聚合分子選自包含分子量為100至6,000 Da、優選100至2,000 Da的PEG的組中。
10．根據權利要求7的綴合物，其中，聚合分子選自含有包括下述的天然聚合分子的組中葡聚糖，包括羧甲基-葡聚糖，和纖維素，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和脫乙醯殼多糖的水解產物，澱粉，例如羥乙基-澱粉、羥丙基-澱粉，糖原、瓊脂糖、瓜爾膠、菊粉、支鏈澱粉、黃原膠、角叉菜膠、果膠和藻酸。
11．根據權利要求1至3的綴合物，其中，多肽-聚合物綴合物為該多肽表面上偶聯了接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物或無規共聚物。
12．根據權利要求11的綴合物，其中，多肽-聚合物綴合物有一個或多個聚合物共價偶聯至親本多肽上，其中，聚合物由以下的通式表徵EOxPOy(Ⅰ)其中，x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。
13．根據權利要求12的綴合物，其中，聚合物的分子量為100至100,000 Da，特別是100至50,000 Da，尤其是100至10,000 Da。
14．根據權利要求12或13的綴合物，其中，親本多肽的分子量為1至100 kDa，特別是一種酶，其分子量為15至60 kDa。
15．根據權利要求12至14任一項的綴合物，其中，嵌段聚合物或共聚物包含環氧乙烷單元(EO)和環氧丙烷單元(PO)，其摩爾比為10∶90或20∶80或30∶70或40∶60或50∶50或60∶40或70∶30或80∶20或90∶10。
16．根據權利要求12至15任一項的綴合物，其中，有1至100個聚合分子，優選4至50個，尤其是5至35個聚合分子共價偶聯至親本酶上。
17．根據權利要求4至10或11至16任一項的綴合物，其中，所述多肽為微生物來源的，如細菌、絲狀真菌或酵母來源的，或者來源於植物。
18．根據權利要求17的綴合物，其中，所述多肽為選自下組的一種酶水解酶，包括蛋白酶，包括絲氨酸蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶和金屬蛋白酶，或糖酶，或脂肪酶，或氧化還原酶，例如漆酶和滷過氧化物酶或超氧化物歧化酶。
19．根據權利要求18的綴合物18，其中，親本蛋白酶選自PD498、Sayinase、Sayinase變體R247K、蛋白酶K、蛋白酶R、Thermitase、枯草桿菌蛋白酶DY、Lion Y、Alcaiase、蛋白酶T和JA16。
20．根據權利要求18的綴合物，其中，親本糖酶選自Novamyl、Fungamyl、Natalase和Termamyl。
21．一種工業組合物，其包含權利要求1至20的綴合物。
22．根據權利要求21的工業組合物，其為一種洗滌劑，如衣物洗滌劑組合物、碗碟洗滌劑組合物或硬表面清潔組合物。
23．權利要求1至20任一項的綴合物在改善權利要求21或22任一項的工業組合物的洗滌性能中的用途。
24．根據權利要求23的用途，其用於降低呼吸變應原性。
25．一種改善多肽洗滌性能的方法，包括將權利要求4、6至10任一項所定義的均聚物偶聯至權利要求4、5、17至20任一項的親本多肽上，和/或將權利要求11、12、13、15、16任一項定義的嵌段聚合物或共聚物偶聯至權利要求14、17至20任一項的親本多肽上。
全文摘要
本發明涉及有一或多個聚合物共價偶聯至親本多肽上的多肽－聚合物綴合物,其中,聚合物為均聚物,接枝共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物或無規共聚物。本發明也涉及包含本發明綴合物的工業組合物和產品,還涉及所述綴合物在改善工業組合物和產品如洗滌劑組合物的洗滌性能中的用途。
文檔編號C08L89/00GK1315997SQ99810440
公開日2001年10月3日 申請日期1999年7月16日 優先權日1998年7月17日
發明者P·鮑迪茲, T·M·富特姆, A·A·奧爾森, H－J·德森, D·A·彼德森 申請人:諾沃奇梅茲有限公司