預測血管緊張素ii受體拮抗劑類降壓藥作用的方法及應用的製作方法
2023-11-08 10:20:32
專利名稱：預測血管緊張素ii受體拮抗劑類降壓藥作用的方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種預測血管緊張素II受體拮抗劑類降壓藥藥物作用的方法及其應用，通過測定生物樣品特定位點基因型，預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的藥物作用。
背景技術：
高血壓病是最常見的慢性疾病之一，是腦卒中、冠心病、糖尿病等的重大危險因素，因此有效控制血壓具有重要臨床和公共衛生學意義。臨床用於治療高血壓的藥物有六類，包括血管緊張素II受體(AT1-R)拮抗劑、β-受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)、鈣拮抗劑、α腎上腺素受體阻滯劑和利尿劑等。但是至今高血壓的控制率較低，我國和美國的資料表明，控制率分別僅為8.1％和34％。這種低控制率不僅與降壓藥物本身效力有關，而且與臨床上缺乏有效的療效預測指導系統有關。
現有臨床用於預測降壓藥療效、合理選擇降壓藥物的方法，主要是醫生經驗性預測和血壓監測。這些方法過於粗略，醫生難以根據患者個體差異進行藥物的選擇、配伍和定量，以獲得更好療效、減少毒副作用，間接加重了患者的身心痛苦和經濟負擔。大量研究表明，藥物作用效應的個體差異與環境、遺傳因素及其交互作用有關。藥物基因組學是從基因組水平探究藥效的差異，揭示這些差異的遺傳特徵的前沿學科和高技術手段。其研究成果可為醫生擬定個體化用藥方案，精確預測和提高藥物療效，降低藥物毒副作用風險，從而降低醫療費用，提高患者生活質量做出重要貢獻。
據文獻報導，藥物基因組研究已經闡明了一些藥物靶向的基因多態性與特定藥物作用間的關聯關係，而這些成果導致的產品已經開始用於臨床。例如，已在美國加利福尼亞州批准上市的乳腺癌相關基因檢測試劑盒(Oncotype DXTM)。該產品是用於預測患者對化療藥物的反應性和耐藥性的試劑盒(Science 2004 3031754-1755)。由於該試劑盒的特異性和靈敏性較好，其檢測項目已列為轉移性乳腺癌化療前必檢項目，從而估計乳腺癌的復發率。
原發性高血壓相關基因至今已經發現超過70個，降壓藥物與基因多態性研究多數集中在兩者的交互效應對心血管事件發生的影響上[Drugs，2004；64(16)1801-1816]。例如已有報導，攜帶α-adducin基因460W等位子的高血壓患者，採用利尿劑治療比採用其他降壓治療，更有助於降低患者心肌梗死和中風的發生機率。再如ACE插入/缺失的多態性與血管緊張素酶原抑制劑(ACEI)存在交互作用，表現為不同基因型在血管緊張素受體蛋白(AT1)的mRNA表達、左心室肥大、動脈硬化等方面的差異。
但是，與降壓作用相關基因的研究十分有限[Drugs，2004；64(16)1801-1816]。僅有的報導包括，一氧化氮合酶(NOE)基因多態性與利尿劑、α-adducin基因多態性與利尿劑、G蛋白α-亞型基因多態性與β腎上腺素受體阻滯劑、以及ACE基因多態性與血管緊張素II受體(AT1-R)拮抗劑等存在基因多態性與降壓藥療效的關聯關係。
血管緊張素II受體1(AT1-R)拮抗劑(沙坦類藥物)是臨床最常用的一線降壓藥。該類藥物的作用機理是選擇性地與AT1-R結合，抑制血管緊張素II的縮血管作用而使血壓下降。沙坦類藥物除了用於高血壓病的治療，還因其保鉀利鈉作用特別適用於高血壓伴隨充血性心力衰竭和腎功能衰竭患者的治療。臨床上常用的AT1-R類藥物主要包括洛沙坦(Losartan)、纈沙坦(Valsartan)、依貝沙坦(Irbesartan)、康得沙坦(Candesartan)、依普沙坦(Eprosartan)、他索沙坦(Tasosartan)和替米沙坦(Telmisartan)等。
儘管沙坦類藥物作為臨床較新推出的一線降壓藥物產品，雖然降壓療效可靠和副作用較少，但也難以克服許多不足，如仍有部分患者對此類藥物不敏感，表現為降壓起效慢、療效差；少數病人出現了藥物副作用，包括咳嗽及血管性水腫(與血管緊張素轉化酶抑制劑類藥物相似，但發生率相對較低)、肝毒性和高血糖及貧血反應等。例如Reeves等對2955名成年高血壓患者依貝沙坦降壓治療的研究發現，約44％的患者未達到滿意的臨床降壓療效(Hypertension.1998；31(6)1311-6)。Guthrie R等的研究也表明，連續12周、150-300mg/d的依貝沙坦治療療程後，僅有約53％的患者降壓療效顯著。
已有針對依貝沙坦的藥物基因組學研究報導是一項瑞典的大型臨床研究，即SILVHIA試驗。該研究陸續發現，腎素-血管緊張素-醛固酮系統通路中有多個基因的單核苷酸多態性位點可能與依貝沙坦的降壓療效或左心室肥厚的改善作用有關聯。該研究已報導的基因包括，血管緊張素原基因、血管緊張素轉化酶基因、血管緊張素II受體1基因和醛固酮合成酶基因(Am J Hypertens.2004；17(1)8-13.J Hypertens.2001；19(10)1783-7.J Hypertens.2002；20(4)657-63.Am J Hypertens.2002；15(5)389-93.)。此外，與依貝沙坦的藥物反應可能有關的一些其他遺傳多態性包括，載脂蛋白B基因(APOB)、LDL受體基因(LDL-R)、轉移生長因子基因(TGFβ1)、前內皮素原基因(preproendothelin-1)和依貝沙坦的主要代謝酶-細胞色素P450-2C9基因(CYP2C9)〔BMC Cardiovasc Disord.200428；4(1)16.Clin Cardiol.2004；27(5)287-90.Clin Cardiol.2004；27(3)169-73.J Hypertens.2002；20(10)2089-93.〕。至今未見心房利鈉肽(ANP)基因與依貝沙坦降壓療效的關聯研究，也未見針對依貝沙坦藥物基因組學研究導致的試劑盒產品。
發明內容
解決的技術問題由於對藥物反應存在個體差異，臨床醫生在選擇藥物至今缺少足夠的個體化用藥依據，難以做到為病人提供「量體裁衣式」的藥物配伍和劑量，不能即時、有效地控制血壓和毒副作用發生的風險，甚至可能延誤治療時機，造成患者健康和經濟地雙重損失。
鑑於上述不足，本發明旨在克服臨床選擇血管緊張素II受體1(AT1-R)拮抗劑或者研製與之組合的新組合物時的盲目性，為個體化用藥提供一種預測血管緊張素II受體1(AT1-R)拮抗劑類藥物藥物作用的方法、試劑盒及其應用，便於指導臨床用藥。
技術方案為實現上述發明目的，採取以下技術方案一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的藥物作用的方法，該方法是通過測定生物樣品心房利鈉肽基因多態性位點基因型，預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的降壓作用，其中心房利鈉肽基因多態性位點為心房利鈉肽基因的Val7Met多態性a)心房利鈉肽基因基因型為7Val/Val純合野生型時，預測血管緊張素II受體1拮抗劑的降壓作用好；b)心房利鈉肽基因基因型為7Val/Met雜合子或7Met/Met純合突變型時，預測血管緊張素II受體1拮抗劑的降壓作用差；。
上述測定心房利鈉肽基因Val7Met多態性位點基因型採用的方法選自PCR、基因晶片、基因測序、基因掃描、Taqman等生物檢測方法中的一種。PCR、基因晶片、基因測序、基因掃描基因型檢測方法是本領域技術人員常規使用的方法，Taqman技術是一種運用螢光技術實時定量PCR的方法，具體操作過程見本發明實施例1。其中優選的檢測方法為PCR或Taqman技術。
上述生物樣品為血樣、口腔黏膜試子、唾液樣本、尿樣中的一種。其中，優選的生物樣本為外周全血或者血細胞樣本。
上述的血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥選自依貝沙坦(Irbesartan)、洛沙坦(Losartan)、纈沙坦(Valsartan)、替米沙坦(Telmisartan/Micardis，泰米沙坦)、坎地沙坦(Candesartan，康得沙坦)、依普沙坦(Eprosartan，依普羅沙坦)、奧美沙坦(OlmesartanMedoxomil，奧美沙坦酯)、他索沙坦(Tasosartan/Verdia)及它們的活性代謝產物、鹽類或酯類中的一種。其中優選依貝沙坦或洛沙坦，它們是血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥物中常用的、具有代表性的藥物。
一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用的方法，該方法通過測定生物樣品心房利鈉肽基因多態性位點基因型，預測原發性高血壓患者的靶器官功能狀態。
其中心房利鈉肽基因多態性位點為心房利鈉肽基因的Val7Met多態性。
其中靶器官包括腎臟或心臟。
其中預測血管緊張素II受體1拮抗劑類藥物靶器官影響的方法，是通過測定生物樣品心房利鈉肽基因的Val7Met多態性，預測原發性高血壓患者的腎臟功能狀態a)心房利鈉肽基因的Val7Met多態性為7Val/Val純合野生型時，預測原發性高血壓患者的，其腎臟功能差；b)心房利鈉肽基因的Val7Met多態性為7Val/Met雜合子或7Met/Met純合突變時，預測原發性高血壓患者的，其腎臟功能差。
上述測定心房利鈉肽基因Val7Met多態性位點基因型採用的方法選自PCR、基因晶片、基因測序、基因掃描、Taqman等生物檢測方法中的一種。PCR、基因晶片、基因測序、基因掃描基因型檢測方法是本領域技術人員常規使用的方法，Taqman技術是一種運用螢光技術實時定量PCR的方法，具體操作過程見本發明實施例1。其中優選的檢測方法為PCR或Taqman技術。
上述生物樣品為血樣、口腔黏膜試子、唾液樣本、尿樣中的一種。其中，優選的生物樣本為外周全血或者血細胞樣本。
上述的血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥選自依貝沙坦(Irbesartan)、洛沙坦(Losartan)、纈沙坦(Valsartan)、替米沙坦(Telmisartan/Micardis，泰米沙坦)、坎地沙坦(Candesartan，康得沙坦)、依普沙坦(Eprosartan，依普羅沙坦)、奧美沙坦(OlmesartanMedoxomil，奧美沙坦酯)、他索沙坦(Tasosartan/Verdia)及它們的活性代謝產物、鹽類或酯類中的一種。其中優選依貝沙坦或洛沙坦，它們是血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥物中常用的、具有代表性的藥物。
一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用的試劑盒，包括測定生物樣品的核酸模板的心房利鈉肽基因多態性位點基因型的試劑，其中有PCR反應試劑、限制性內切酶酶切反應試劑或Taqman反應試劑、特異性探針。
其中PCR反應試劑含有如下特定引物序列正向引物5』CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC3』反向引物5』GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG3』或正向引物5』GCCTGTAAGTCCTAGCTACTCC3』反向引物5』GAATATTTTAATTTCCCAGTGC3』其中特異性探針為檢測心房利鈉肽基因多態性位點的野生型探針和突變型探針，它們的序列分別為野生型探針5』ACAATGCCGTGTCCAA3』；突變型探針5』ATGTACAATGCCATGTCCAA3』。
其中生物樣品中核酸模板的試劑，PCR反應試劑，限制性內切酶酶切反應試劑或Taqman反應試劑中未特別指明的試劑是本領域技術人員常規使用的試劑。
其中所檢測的生物樣品種類為血樣、口腔黏膜試子、唾液樣本、尿樣中的一種或幾種。其中所述檢測的血樣本為外周全血或者血細胞樣本。
上述的血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥選自依貝沙坦、洛沙坦、纈沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奧美沙坦、他索沙坦及它們的活性代謝產物、鹽類或酯類中的一種。
上述預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用，為預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥降壓作用或/和預測原發性高血壓患者的靶器官功能狀態。
本發明提供的試劑盒預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用，其過程包括(a)從取自受檢外周微量血樣品中提取核酸模板；(b)用PCR方法擴增PRCP基因上的特異片斷；(c)用限制性內切酶對PCR產物進行酶切；(d)同時用陽性對照模板進行(b)(c)步驟；(e)電泳分離酶切產物，根據陽性模板的帶型特點鑑定並且判斷結果。
本發明提供的試劑盒預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用，其過程包括(a)從取自受檢外周微量血樣品中提取核酸模板；(b)用Taqman方法擴增PRCP基因上的特異片斷；(c)鑑定並判斷結果。
一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的藥物作用的方法，該方法是通過測定生物樣品心房利鈉肽基因多態性位點基因型，預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的降壓作用。本發明的方法還可在藥物研發中的應用。
上述應用是指根據利鈉肽基因的多態性基因型預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的降壓作用，設計出調節利鈉肽表達水平或其活性可增強血管緊張素II受體1拮抗劑類藥物降壓作用的複方藥，所述複方藥包括選擇性或非選擇性的血管緊張素II受體拮抗劑和利鈉肽、利鈉肽替代物或功能促進劑。其中功能促進劑包括利鈉肽轉錄激活因子、多肽功能激活劑、利鈉肽代謝通路的代謝酶、輔助因子。
一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用的方法，該方法通過測定生物樣品心房利鈉肽基因多態性位點基因型，預測原發性高血壓患者的靶器官功能狀態。本發明的方法還可在藥物研發中的應用。
上述應用是指根據利鈉肽基因多態性基因型預測原發性高血壓患者的靶器官功能狀態，設計出可增強靶器官功能有益影響、或降低靶器官功能不良影響的複方藥，所述複方藥包括選擇性或非選擇性的血管緊張素II受體拮抗劑和靶器官功能改善劑。
一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的藥物作用的方法，該方法是通過測定生物樣品心房利鈉肽基因多態性位點基因型，預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的降壓作用。本發明的方法還可在藥物研發中的應用。
上述應用是指根據利鈉肽基因的多態性基因型預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的降壓作用，設計出調節心房利鈉肽表達水平或其活性可增強血管緊張素II受體1拮抗劑類藥物降壓作用的複方藥，所述複方藥包括選擇性或非選擇性的血管緊張素II受體拮抗劑和心房利鈉肽、心房利鈉肽替代物或功能促進劑。其中功能促進劑包括心房利鈉肽轉錄激活因子、多肽功能激活劑、心房利鈉肽代謝通路的代謝酶、輔助因子。
本發明是以多年的藥物基因組學研究為基礎。通過給高血壓患者服用依貝沙坦進行降壓治療，考察遺傳因素和藥物療效的關係。依貝沙坦是血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥物中的一種，選擇性地與AT1-R結合，抑制Ang II的血管收縮作用從而使血壓下降，臨床用於降壓治療。依貝沙坦的半衰期較長(約為19小時)，因此適宜於每日服藥一次，常用劑量為150-300mg/天，臨床廣泛用於治療輕、中度高血壓病。
本發明中研究的基因多態性是心房利鈉肽基因多態性。心房利鈉肽(ANP)的舒血管活性肽，能通過影響-血管緊張素-醛固酮系統功能和鈉水平衡參與血壓的調節。ANP主要由心肌細胞合成。此外，腎臟和腦組織也有ANP的表達。心房利鈉肽基因的一個能導致心房利鈉肽原(ProANP)第7位胺基酸由纈氨酸替換成蛋氨酸的多態性改變，可能會引起ProANP和N端心房利鈉肽活性的改變。
本發明涉及的研究發現高血壓病人經血管緊張素II受體1拮抗劑類藥物治療後，在服藥後第28天，攜帶7Met等位子的原發性高血壓患者的降壓作用顯著差於Val7Val野生純合型基因型患者，而原發性高血壓患者的腎臟功能狀態亦較差。提示ANP基因的Val7Met遺傳多態性和血管緊張素II受體1拮抗劑類藥物的降壓作用及原發性高血壓患者的靶器官功能狀態有關聯關係。
ANP基因的基因型，作為預測血管緊張素II受體1拮抗劑類抗高血壓藥物作用的指示系統之一，可以指示並定性和定量地預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的藥物作用及原發性高血壓患者的靶器官功能狀態，指導臨床醫生個體化用藥。
ANP基因的基因型，作為預測血管緊張素II受體1拮抗劑類抗高血壓藥物效應的指示系統之一可以指示ANP基因多態性對應的活性肽活性/功能狀態或靶器官功能狀態，作為新藥研製通路和候選功能靶點，指導複方降壓藥物的研發；並可以指示選擇和研製的降壓藥物新組合物，更合理選擇血管緊張素II受體1拮抗劑類藥物方案、配置個體最適劑量和最適新組合藥物的配伍。
有益效果本發明創造性提供了利用功能基因預測血管緊張素II受體1拮抗劑類抗高血壓藥物療效的一種方法，可作為血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用的指示系統，通過測定ANP功能基因多態位點基因型，預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的藥物作用及原發性高血壓患者的靶器官功能狀態。根據ANP基因多態性基因型，設計出通過調節ANP活性或靶器官功能狀態，明顯增強血管緊張素II受體1拮抗劑類藥物有益藥物作用的藥物組合物。便於醫生在用藥時根據個體差異進行選擇，提高了臨床用藥和治療的效率與安全性，降低了發生毒副作用的風險和經濟負擔。應用這類功能基因多態性的發明成果，對今後更加經濟有效地指導抗高血壓藥物的臨床選藥、預測用藥療效和指導新藥研製具有產業與服務的應用價值。
具體實施例方式
實施例1測定ANP基因Val7Met多態性位點並預測血管緊張素II受體1拮抗劑類抗高血壓藥物依貝沙坦的降壓作用(一)測定ANP基因的Val7Met多態位點基因型(1)提取宿主細胞的基因組DNA(a)在全血中加入30ml紅細胞裂解液，緩慢搖勻，室溫靜置10分鐘，期間，搖動數次，徹底裂解紅細胞；(b)於4℃、2000轉離心/分，10分鐘，去上清，將沉澱之白細胞在旋轉震蕩器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，搖勻，加白細胞裂解液置15ml，混勻37℃水浴20分鐘後取出，置冷水中；(c)加冷的蛋白沉澱液4ml，混勻後放在-20℃冰箱5分鐘，取出於4℃、3000轉/分離心10分鐘。將上清液倒入已加好15ml異丙醇的50ml離心管中緩慢搖動數次，至DNA絮狀物析出；(d)將析出的DNA絮狀物移至另一1.5ml已裝入75％乙醇的濾紙上，使液體揮發乾。
(e)加DNA水化液1.5ml，置搖床，搖動過夜，備用；(f)DNA濃度的測定採用紫外分光光度法，分別測定260nm及280nm兩個波長下的OD值，以OD260nm×50所得值為DNA濃度。並以OD260nm/OD280nm比值估計DNA純度；
(2)使用Taqman方法檢測Val7Met多態位點基因型(a)用PCR儀擴增ANP功能基因多態位點及其側翼序列，在5ul PCR反應體系中含有基因組DNA 10ng，2.5ul的Taqman 2X Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG(組成成份包括AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，已優化的緩衝液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及兩段帶螢光報告集團的等位基因特異性探針各0.16uM。
引物序列為正向引物5』CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC3』反向引物5』GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG3』等位基因特異性探針的序列為VIC-5』ATGTACAATGCCATGTCCAA3』-NFQ，對應於「A(或Met)」等位基因，攜帶VIC螢光報告集團。
FAM-5』ACAATGCCGTGTCCAA3』-NFQ對應於「G(或Val)」等位基因，攜帶FAM螢光報告集團。
PCR反應條件95℃10min，1個循環；92℃15s，60℃1min，50個循環.
(b)在7900型螢光定量PCR儀上檢測螢光信息將完成PCR反應的PCR板放入7900型螢光定量PCR儀上，選用「AllelicDiscrimination」程序，進行掃描與結果的判斷發出FAM螢光者的基因型為Val/Val純合子；發出VIC螢光者的基因型為Met/Met純合子；發出兩種螢光者的基因型為Val/Met雜合子。
(二)預測藥物作用對原發性高血壓患者，基因型為7Val/Val純合野生型個體的收縮壓降壓療效顯著性好於7Val/Met雜合子或7Met/Met純合突變個體。
對原發性高血壓患者，基因型為7Val/Val純合野生型個體的舒張壓降壓療效顯著精濾袋進行過濾，去除雜質，冷凝析出物；五、罐裝物料經過濾後，進入等壓罐裝機在1～5℃條件下罐裝，瓶內壓力(表壓)0.4～0.65MPa，再經燈檢後，進入噴淋殺菌機；六、噴淋殺菌封罐的飲料進入噴淋殺菌機執行啤酒殺菌冷卻工藝；七、噴碼，貼標，裝箱易拉罐經噴碼機噴碼，裝箱。
活性肽果味啤酒的質量指標1.感官指標
2.理化指標1).無醇活性肽果味啤酒
2).活性肽果味啤酒
由此可見，在4℃下保存24月時，各實施例其活性保持不變，以上試驗結果說明上述實施例在4℃下，有效期兩年。
(2)影響因素試驗每批留樣20支，放置於4℃，並於4500LX強光照射，分別於5、10天取樣檢測，並與試驗開始時0天檢測的相應指標比較。
在4℃下，4500LX強光照射，神經生長因子注射液生物活性考察試驗
PCR產物 10ulF液 1.5ulE液 0.3ul雙蒸水 加至15ul(1×消化體積)(3)電泳檢測多態性位點基因型酶切後產物用瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE電泳緩衝液，DNA Marker使用50bp或100bpDNAladder，用量為1ug/孔，電壓為250V，電泳時間為20～50分鐘。電泳後的凝膠經溴化乙錠染色，在紫外分析儀下觀察結果。
電泳如只顯示131bp片段的為純合野生型；如顯示131bp和162bp兩片段的為雜合子；如只顯示162bp片段的為純合突變型。
實施例4試劑盒組成(Taqman方法)及應用1、試利盒組分包括A液Taqman 2X Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG(組成成份包括AmpliTaqGold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，已優化的緩衝液)；B液正向引物、反向引物；引物序列為正向引物5』CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC3』反向引物5』GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG3』C液兩段帶螢光報告集團的等位基因特異性探針，序列為VIC-5』ATGTACAATGCCATGTCCAA3』-NFQ，對應於「A(或Met)」等位基因，攜帶VIC螢光報告集團。
FAM-5』ACAATGCCGTGTCCAA3』-NFQ對應於「G(或Val)」等位基因，攜帶FAM螢光報告集團。
2、使用本試劑盒擴增功能基因多態位點及其側翼序列及檢測多態性位點基因型的步驟如下擴增目的基因片段在5ul PCR反應體系中含有基因組DNA 10ng，2.5ul的A液，及0.72uM B液及0.16uM C液，按如下條件進行PCR反應
在7900型螢光定量PCR儀上檢測螢光信息將完成PCR反應的PCR板放入7900型螢光定量PCR儀上，選用「AllelicDiscrimination」程序，進行掃描與結果的判斷發出FAM螢光者的基因型為Val/Val純合子；發出VIC螢光者的基因型為Met/Met純合子；發出兩種螢光者的基因型為Val/Met雜合子。
權利要求
1.一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的藥物作用的方法，該方法是通過測定生物樣品心房利鈉肽基因多態性位點基因型，預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的降壓作用。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，是通過測定生物樣品心房利鈉肽基因的Val7Met多態性，預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的降壓作用。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述測定心房利鈉肽基因Val7Met多態性位點基因型採用的方法選自PCR、基因晶片、基因測序、基因掃描、Taqman等生物檢測方法中的一種。
4.如權利要求1～3中任一所述的方法，其特徵在於，所述生物樣品為血樣、口腔黏膜試子、唾液樣本、尿樣中的一種。
5.如權利要求1～3中任一所述的方法，其特徵在於所述的血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥選自依貝沙坦、洛沙坦、纈沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奧美沙坦、他索沙坦及它們的活性代謝產物、鹽類或酯類中的一種。
6.一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用的方法，該方法通過測定生物樣品心房利鈉肽基因多態性位點基因型，預測原發性高血壓患者的靶器官功能狀態。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述靶器官包括腎臟或心臟。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，是通過測定生物樣品心房利鈉肽基因的Val7Met多態性，預測原發性高血壓患者的腎臟功能狀態。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述測定心房利鈉肽基因Val7Met多態性位點基因型採用的方法選自PCR、基因晶片、基因測序、基因掃描、Taqman等生物檢測方法中的一種。
10.如權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，所述生物樣品為血樣、口腔黏膜試子、唾液樣本、尿樣中的一種。
11.如權利要求6或7所述的方法，其特徵在於所述的血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥選自依貝沙坦、洛沙坦、纈沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奧美沙坦、他索沙坦及它們的活性代謝產物、鹽類或酯類中的一種。
12.一種預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用的試劑盒，包括測定生物樣品的核酸模板的心房利鈉肽基因多態性位點基因型的試劑，其中有PCR反應試劑、限制性內切酶酶切反應試劑或Taqman反應試劑、特異性探針。
13.如權利要求12所述的試劑盒，其中PCR反應試劑含有如下特定引物序列正向引物5』CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC 3』反向引物5』GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG 3』或正向引物5』GCCTGTAAGTCCTAGCTACTCC 3』反向引物5』GAATATTTTAATTTCCCAGTGC 3』
14.如權利要求12或13所述的試劑盒，其中特異性探針為檢測心房利鈉肽基因多態性位點的野生型探針和突變型探針。
15.如權利要求14所述的試劑盒，其中特異性探針序列分別為野生型探針5』ACAATGCCGTGTCCAA3』；突變型探針5』ATGTACAATGCCATGTCCAA3』。
16.如權利要求12所述的試劑盒，其中所檢測的生物樣品種類為血樣、口腔黏膜試子、唾液樣本、尿樣中的一種或幾種。
17.如權利要求16所述的試劑盒，其中所述檢測的血樣本為外周全血或者血細胞樣本。
18.如權利要求12所述的試劑盒，其特徵在於所述的血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥選自依貝沙坦、洛沙坦、纈沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奧美沙坦、他索沙坦及其活性代謝產物、鹽類或酯類中的一種。
19.如權利要求12所述的試劑盒，其特徵在於所述預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥藥物作用，為預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥降壓作用或/和預測原發性高血壓患者的靶器官功能狀態。
20.權利要求1所述的方法在藥物研發中的應用。
21.如權利要求20所述的應用，其特徵在於，所述的應用是指根據利鈉肽基因的多態性基因型預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥的降壓作用，設計出調節利鈉肽表達水平或其活性可增強血管緊張素II受體1拮抗劑類藥物降壓作用的複方藥，所述複方藥包括選擇性或非選擇性的血管緊張素II受體拮抗劑和利鈉肽、利鈉肽替代物或功能促進劑。
22.如權利要求21所述的應用，其特徵在於，所述功能促進劑包括利鈉肽轉錄激活因子、多肽功能激活劑、利鈉肽代謝通路的代謝酶、輔助因子。
23.權利要求6所述的方法在藥物研發中的應用。
24.如權利要求23所述的應用，其特徵在於，所述的應用是指根據利鈉肽基因多態性基因型預測原發性高血壓患者的靶器官功能狀態，設計出可增強靶器官功能有益影響、或降低靶器官功能不良影響的複方藥，所述複方藥包括選擇性或非選擇性的血管緊張素II受體拮抗劑和靶器官功能改善劑。
全文摘要
本發明提供一種預測試劑盒，包括測定受檢核酸模板的利鈉肽基因多態性位點基因型的試劑，利用PCR－RFLP方法或者Taqman方法，檢測快速、安全、方便、靈敏、結果可靠，可預測血管緊張素II受體1拮抗劑類降壓藥降壓作用，並預測原發性高血壓患者的靶器官功能狀態，便於醫生在用藥時根據個體差異進行選擇，提高了臨床用藥和治療的效率與安全性，降低了發生毒副作用的風險和經濟負擔。
文檔編號C12Q1/68GK1858241SQ200510011680
公開日2006年11月8日 申請日期2005年4月30日 優先權日2005年4月30日
發明者張善春, 蔣善群, 王琳琳, 洪秀梅, 毛廣運, 李志平, 劉學, 唐根富, 張巖, 邢厚恂, 戴成祥, 王濱燕, 徐希平 申請人:安徽省生物醫學研究所