在甲醇酵母中高表達的耐高溫植酸酶基因的製作方法

2023-11-11 19:12:32 1

專利名稱：在甲醇酵母中高表達的耐高溫植酸酶基因的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物基因工程領域，更具體地說是通過基因工程方法改變植酸酶基因，使表達的蛋白質能夠在高溫下保持長時間活性。
植酸酶能將植酸水解成肌醇和磷酸，在飼料中添加植酸酶不僅可以提高植物性飼料中磷的利用率，減少糞便中排出的磷對環境汙染(Nelson 1968，畜牧科學)，而且能夠通過降低植酸鹽的抗營養作用，增加動物對蛋白質和一些金屬離子的吸收能力(Wyss 1999，應用環境微生物科學)。
開發植酸酶的直接原因來源於植酸帶來的磷汙染。一方面，植酸中螯合的磷無法吸收利用，另一方面則是必須在飼料和食品中添加大量無機磷，造成磷源浪費和環境汙染。自80年代中期，歐洲就致力於尋找全面解決無機磷汙染的方案。其直接的動因來源於原歐共體成員國議會對環境保護的關注，在他們實施的環保指南(CouncilDirective91/676/EEC)中，著重強調限制養殖業的磷排洩量。植酸酶是目前所有使用的添加劑中，具有最直接、最顯著環保社會效益的酶製劑。植酸酶也是目前所有飼料酶製劑產品中功能研究最清楚的產品。使用植酸酶最大的好處在於減少飼料中磷酸氫鈣等無機磷的使用量，幅度至少50％-70％。在中國，很多養殖區可以將磷酸氫鈣的用量減少70％以上，尤其在雜粕用量較大的蛋雞養殖區，可以全部替代磷酸氫鈣。使用植酸酶的飼料，向環境排洩的磷相應減少30％以上。據最保守的估計，從開始引入植酸酶以來，我國的養殖業已經少向環境排放了7200噸磷。折合磷酸氫鈣42000噸。加上磷礦開採的汙染和費用，以及節約的儲運成本。植酸酶創造的綜合效益遠遠不止在養殖和飼料方面估計的9200多萬元。
事實上，植酸酶的最大受益者是人類自身。在賴以生存的環境中，植酸酶能從汙染的源頭輕而易舉地消滅磷汙染，比常規使用的後期治理的方法更為經濟有效。可以預期，植酸酶將以顯著的經濟效益和社會效益對整個行業的可持續發展產生巨大促進作用。
最新的研究結果還發現了植酸酶的潛在營養價值。能夠提高飼料中蛋白質的消化利用率。應用植酸酶，加大了非常規原料資源的使用比例，為節約蛋白質飼料提供了方便。使用植酸酶能直接降低了飼料的原料成本，從而提高產品的價格競爭力。在中國，每生產1噸全價飼料，至少可以因此增加5-10元的淨收益。每生產1噸5％的預混料，則可以增加收益百元以上。使用植酸酶在減少飼料中無機磷添加量的同時，大幅度地減輕甚至完全杜絕了磷酸氫鈣導致的氟和其它重金屬中毒問題。
植酸酶廣泛存在於植物、動物和微生物中。許多微生物都能產生植酸酶，尤其在麴黴屬中。1968年Shien等從68個土樣中對2000個菌株進行考察發現，在所用的22株黑黴菌中有21株能產生植酸酶。第一個被分離純化的植酸酶來源於Aspergillus terreusNO.9A-1，它的最適pH為4.5，最適反應溫度為70℃，此酶在pH1.2～9.0均能穩定維持活性。此後，陸續從十幾種微生物中分離得到植酸酶，其中來源於A.ficcum NR-RL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶phyA在酸性條件下有較高酶活性，被認為是目前最具應用前景的飼用植酸梅，其酶學性質的研究也較為深入。植酸酶phyA，是一種糖基化蛋白，分子量為85KD。它的最適pH為2.5和5.5，最適反應溫度為55℃。在37℃、pH2.5的條件下，以植酸為底物的Km值為50mmol，Ca2+、Fe2+對酶活性無影響，Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分別提高30％和13％。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cu+對酶活性有抑制作用，其中前兩種為非競爭性抑制，後兩種為競爭性抑制。對酸性磷酸酶有抑制作用的抑制劑如L(+)-酒石酸對它卻沒有抑制作用。
目前生產上採用的植酸酶均來自黑麴黴(Aspergillus niger)。黑麴黴中的植酸酶(PhyA)具有比活高、結構穩定等優點。在植酸酶發展初期，均採用原始菌株發酵生產，然而，原始菌株表達量低，使生產成本較高，通過化學誘變可以獲得產酶量提高的菌株，然而所需時間很長，誘變菌株容易退化，利用生物反應器高效表達植酸酶基因，大幅度提高了植酸酶產量，克服了野生型菌株含量低的缺點[6，7]。中國農業科學院飼料所和生物技術研究所從1996年開始合作，從黑曲酶中克隆了適合在飼料中使用的植酸酶基因，並共同開發了利用生物反應器大規模、低成本生產飼料添加劑植酸酶的工藝。但是，該植酸酶存在一個很大的缺陷不能耐受較高的溫度，在加工過程中酶活力單位大量喪失(Kim 1998，酶和微生物技術)。因此，從自然界尋找或者通過隨機突變篩選熱穩定植酸酶成為目前飼料行業研究的熱點。
從煙燻麴黴(Aspergillus fumigatus)中分離的植酸酶能夠耐受90-100℃高溫，而且能在較寬的pH範圍內降解植酸，因此具有很大的市場潛力(van Loon 1998，應用環境微生物學)。然而，在野生型菌株中，植酸酶的表達量很低，難以在生產上推廣。
本發明試圖通過改變基因的偏愛密碼，使基因適合在酵母中表達，通過電擊轉化將耐熱的植酸酶基因整合到畢赤酵母中，實現高效表達。
為了提高植酸酶基因的耐熱性和比活，對合成的植酸酶基因進行DNA改組(DNAShuffling)、在原核表達質粒上構建突變植酸酶基因的文庫，通過突變植酸酶活性篩選，最終獲得了高比活的耐高溫植酸酶基因。新的植酸酶Fphy的比活為原先Fphy1的5倍左右。Fphy和Fphy1的胺基酸數相同，但有9個胺基酸發生了改變。其中包括72V＞I，86F＞Y，87A＞T，194Q＞E，200A＞E，236S＞P，292T＞A，338V＞I，396A＞V等。
耐熱性植酸酶基因合成採用重疊延伸PCR方法，結合高保真的PWO DNA聚合酶，將引物片段按順序連接。合成基因長度為1320 bp。
突變耐熱植酸酶基因的核苷酸序列及其編碼的胺基酸序列如下，從蛋白質一級結構分析，該植酸酶含有6個糖激化位點。
本發明耐熱性植酸酶基因的核苷酸序列和編碼的胺基酸序列如下TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGGGGACAATACS K S C D T V D L G Y Q C S P A T S H L W G Q YTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGS P F F S L E D E L S V S S K L P K D C R I T LGTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGATCV Q V L S R H G A R Y P T S S K S K K Y K K LIACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAGGAAAATACACTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTGT A I Q A A T D F K G KY TF L K T Y Y T LGGAGCTGACGACTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCT GAATCAAATTCTACCAAAGATACG A D D L T P F G E Q Q L V N S G I K F Y Q R YAAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAAK A L A R S V V P F I R A S G S D R V I A S G EAAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCK F I E G F Q Q A K L A D P G A T N R A A P A ITCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTS V I I P E S E T F N T L D H G V C T K F E 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MCAATGCAAATCCGAAAAAGAACCATTGGTTAGAGTCTTGATTAACGACAGAGTTGTTCCATTGCACGGATGCQ C K S E K E P L V RVL I N D R V V P L H G CGACGTTGACAAATTGGGAAGATGCAAATTGAACGACTTCGTTAAAGGATTGTCTTGGGCTAGATCCGGTGGTD V D K L G R C K L N D F V K G L S W A R S G GAACTGGGGTGAATGCTTCTCCTAAN W G E C F S -突變耐熱植酸酶基因與原始基因相比，352個核苷酸發生變化，核苷酸的同源性為73％，核苷酸密碼在合成過程中全部採用酵母偏愛密碼，其中精氨酸採用AGA，賴氨酸採用AAA，半胱氨酸採用TGC，天冬氨酸採用AAC。另外，為了提高表達量，合成基因切除了5』端26個胺基酸的信號肽編碼序列和信號肽內的內含子序列，以便植酸酶基因編碼框能正確插入帶有高表達的啟動子和分泌信號肽之後，穩定高效表達。新的植酸酶基因Fphy與原植酸酶基因Fphy1相比較FPHY1 -TCCAAGTCCTGCGATACGGTAGACCTCGGGTACCAGTGCTCCCCTGCGAC -50||||| |||||||| || || ||| | || ||||| ||||||||||| ||FPHY -TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTAC -50FPHY1 -TTCTCATCTATGGGGCCAGTACTCGCCATTCTTTTCGCTCGAGGACGAGC -100|| || || ||||| || ||||| |||||||| || | |||||||| |FPHY -CTCCCACCTTTGGGGACAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAAC -100FPHY1 -TGTCCGTGTCGAGTAAGCTTCCCAAGGATTGCCGGATCACCTTGGTACAG -150| ||||| |||| | || || |||||| |||||||||||| ||FPHY -TTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGGTTCAA 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本發明的有益效果1、本發明的植酸酶具有明顯高的耐熱性，90℃處理80分鐘。酶的活性仍有40％。而一般產品在90℃下處理30分鐘，酶活性破壞80％。
2、本發明的植酸酶基因更適合在甲醇酵母中轉錄表達，將兩個基因同時轉化到酵母中，表達量是野生型基因的13倍。經高密度發酵，蛋白表達量為每升5.6g。
3、突變的植酸酶基因在酵母中表達後，酶活性pH值範圍大，pH2.5-6.5。pH值為5.5-6.5時，植酸酶活性達到最高。


圖1是構建成的酵母表達植酸酶載體。
圖2是植酸酶菌株發酵後，受甲醇誘導不同時間，植酸酶的分泌表達。
圖3表示不同PH條件下，植酸酶的相對活力。
圖4表示在90℃高溫不同時間處理下，植酸酶的相對活力。
具體實施例方式
實施例1耐高溫植酸酶基因的化學合成1.利用連續延伸PCR合成耐高溫植酸酶基因。引物長度為70-90bp，合成21個寡核苷酸引物，引物與引物之間連接通過20-30bp重疊序列，Tm值為60-66。將所有引物加入反應體系，中間引物量為10-20ng，兩側的引物量為100-200ng。PCR反應體系為100μL。PCR擴增條件為94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共進行35個循環。
耐高溫植酸酶基因引物為phy1TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGGGGACAATACphy2ACCTCCCACCTTTGGGGACAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCPhy3CAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGGTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACPhy4CAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGGTCACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAGGAAAATTCGCTTTCTTGPhy5GACTTCAAAGGAAAATTCGCTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTGGGAGCTGACGACTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGPhy6GACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTACCAAAGATACAAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTCPhy7CACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAAAAATTCATCGAAGGATTCCAACPhy8CTGGAGAAAAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCTCCGPhy9CCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCTCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCPhy10GGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTTCTCAACTTGGAGACGAGGTCGCTGCTAACTTCACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATCPhy11CAAGGAAACAACGTCTTCGTCGGTCAAGGTGACACCAGGCAAGTGTTTTTCAGCTCTAGCTCTGATGTCAGGAGCGAACAAAGCGGTGPhy12GCAGAATGGGGAAAGTTGGGAAGCGTCGGAGGTTCTAGCAACGGTGTCGAAGGAGCACATATCCATCAAGGAAACAACGTCTTCGTCPhy13CCGTAGTATTTTTCCCAAGGACTGCAGGTAGTTGTATTTTTTCCATTCGTTGTGGGTGAAAAGTTGGCAGAATGGGGAAAGTTGGGAAGPhy14CAATCTAGCGATCAATTCGTTGGTGAATCCGATTCCTTGAGCTGGTCCCAATGGGTTTCCAGCTCCGTATCCGTAGTATTTTTCCCAAGGACTGPhy15GTAGCTGGGTTGGAAACCAAGGTGGAGTTAGTGGAGGTGTGGTCTTGAACTGGGGATCTGGTCAATCTAGCGATCAATTCGTTGGTG
Phy16GAAGAAGATGGAGACCATAGAGTTGTCGTGGGAGAAGTCAACGTACTAGGTAGCGTTCAATGGGAAGGTAGCTGGGTTGGAAACCAAGGTGGPhy17GTTCTTTAGCGGATTCAACGGAAGTTCTGGACAATGGTTCAGTTCCGTTGTAAAGTCCCAAAGCGAAGAAGATGGAGACCATAGAGTTGPhy18CATTGCATAGTTTCAAAGTAAGCTGTAGCACCGAATGGAACAACCCAGGAAGCGGAGTATCCGTCAAGTTCTTTAGCGGATTCAACGGAAGTTCPhy19GCATCCGTGCAATGGAACAACTCTGTCGTTAATCAAGGCTCTAACCAATGGTTCTTTTCTTATTTGCATTGCATAGTTTCAAAGTAAGCPhy20ACCACCGGATCTAGCCCAAGACAATCCTTTAACGAAGTCGTTCAATTTGCATCTTCCCAATTTGTCAACGTCGCATCCGTGCAATGGAACAACTCPhy21TTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTACCACCGGATCTAGCCCAAGACAATC實施例2耐高溫植酸酶基因的DNA分子重排(DNA Shuffling)2.1 PCR擴增酸性植酸酶基因及回收以合成植酸酶基因為模板，FphyZ1，FphyF1為引物擴增植酸酶基因，FphyZ1(5』-TTGGATCCTCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTG-3』)；FphyF1(5』-CGAGCTCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTACCAC-3』)反應條件為94℃10min預變性，94℃變性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30個循環，1％Agrose電泳，透吸袋法回收1.4kp的基因片段。2.2 DNase I降解DNA及回收小片段回收Fphy 基因片段以DNase I緩衝液(50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/LMgCl2)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃處理15分鐘。70℃處理10分鐘。10％丙烯醯胺電泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl10×無引物PCR緩衝液(Primerless PCRBuffer)(50mmol/L KCl+10mmol/L Tris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉澱。2.3無引物PCR(Primerless PCR)進行Primerless PCR擴增。反應體系5μl小片段DNA+4μl 2.5mmol/L dNTPs+4.5μl25mmol/L MgCl2+Taq2U+ddH2O to 50μl；反應程序為94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45個循環)，2％Agrose電泳檢測PCR擴增結果。2.4有引物PCR(Primer PCR)進行PrimerPCR擴增反應。反應體系5μlPrimerless PCR產物+FphyZ10.2ng+FphyF1 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH2O to 50μl。反應程序為94℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35個循環，1％Agrose電泳檢測，回收1.4kp基因片段。2.5高活性植酸酶篩選回收1.4kb的重排植酸酶基因片段，經BamH I和Sac I雙酶切後，構建入原核表達載體pG251(CN1338515)啟動子和t1t2終止子之間，該載體帶有氨苄青黴素抗性基因。電擊法轉化大腸桿菌菌株DH5α獲得突變體表達文庫，庫容達到107，進行高比活植酸酶的篩選。
取1μl細菌稀釋96倍，等量加入96孔細菌培養板(12×8)，在每一個孔中加入150μl的LB培養液至OD600＝0.4-0.6，從培養板的孔中取出10μl菌液轉移到試管中培養，同一行的12個孔和同一列的8個孔中的細菌放置同一根試管中培養，共20根試管，每管加入帶氨苄青黴素的LB培養液3mL，培養8-12小時後，離心回收菌體，超聲破碎細胞，離心取上清100μl，加入植酸鉀鈉底物，37℃反應30分鐘，加入鉬藍顯色劑(鉬酸胺，硫酸亞鐵，濃硫酸)顯色。
取每行中活性最高和每列中活性最高的交接點，將10μl培養板交接點孔中的細菌稀釋96倍後，加入另一塊培養板培養，每孔150μl LB培養液，10μl菌液，進行新一輪篩選。3-5輪篩選後，取交接點中細菌稀釋10-100倍塗布在含氨苄抗生素的LB固體培養板上，挑取單菌落進行活性比較，獲得高比活的植酸酶基因Fphy。實施例3酵母表達植酸酶載體構建按合成基因的兩端序列設計引物，在基因5』端加入Xho I切點和信號態切割序列，引物為FP1Z(5』-AACTC GAGAAAAGAGAGGCTGAGGCTTCCAAATCCTGCGAC ACCGTTGACTTG-3』)，在基因3』端加入Not I切點引物為FP1F(5』-AACGCGGCCGCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTAC-3』)。擴增片段克隆後，Xho I和Not I雙酶切，定向插入pPIC9載體(Invetrogen company)，構建成fphy的酵母表達載體pPfphy(圖1)。實施例4植酸酶高表達重組酵母篩選將活化的酵母菌株Pichia Pastoris於500ml YPD中30℃培養18hr，至OD600＝1.7，5000r/min離心收集菌體，先後用500，250ml預冷的無菌水洗菌體，離心去上清液，用20ml預冷的1mol/L山梨醇懸浮菌體。離心後菌體再用0.5ml預冷的山梨醇懸浮，用於電擊感受態。
大量抽提酵母表達載體pPfphy，BglII酶切回收小片段，取2μg線性化片段加入50μL感受態細胞，冰浴5min，用Bio-Red GenePulser電擊儀電擊，參數為2.5Kv，25μF。電擊結束後立即加入1.0ml預冷的1mol/L山梨醇，取200μL塗布於固體選擇培養基平板(18.6％山梨醇，2％葡萄糖，1.34％YNB，0.005％穀氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％賴氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％異亮氨酸，2％瓊脂糖)，30℃培養直至轉化子出現。用牙籤將轉化子對應點種到MM(1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，1.5％瓊脂糖)平板上，30℃培養2d，在MD上生長正常而在MM上生長不正常或不生長的轉化子為陽性克隆。
將重組酵母接種於20ml BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白腖，1.34％YNB 0.000004％Biotin，1％甘油)，30℃培養，離心收集菌體，加入20ml誘導培養基BMMY(用0.5％甲醇代替BMGY中的甘油)，30℃下繼續誘導培養36hr。
以甲醇為唯一碳源的MM培養基和以葡萄糖為碳源的MD培養基進行對應培養，進一步篩選定點整合的重組轉化子68個，命名為P.pastoris FPHY1、2、3.....68。
將所有的陽性克隆單獨接種三角瓶中，30℃培養至OD600＝4-5，利用甲醇誘導培養36hr，每個誘導菌株取5μl上清液進行SDS-PAGE檢測，另取10μl上清液稀釋100倍，以植酸鉀鈉為底物進行酶活性測定。植酸酶酶活性測定方法採取鉬黃法(BASF Company)。植酸酶酶活性單位(U)定義為在37℃下，每分鐘分解植酸鹽釋放出1nmol/L無機磷酸所需要的酶量為1U。結合電泳條帶和酶活力單位，篩選到3株高效表達植酸酶基因的重組子P.pastoris FPHY34，P.pastoris FPHY41、P.pastoris FPHY57。實施例5重組菌株的高密度發酵挑取植酸酶高表達重組酵母P.pastoris FPHY34菌株接種200ml YPED培養基，30℃培養至OD600＝3.0，轉入B.Braun 5L發酵罐中進行高密度發酵，以YPED培養重組酵母，利用氨水控制pH值為5.5，發酵過程中氧含量控制在20％，培養90hr，甘油耗盡，加入0.5％甲醇，30℃誘導培養。
30℃培養6hr後，重組酵母進入對數生長期，氧消耗加快，須充入純氧，氧含量控制在20％，在發酵過程中，持續加入氨水調節pH值恆定在5.5，發酵90hr後，OD600＝110，加入0.5％甲醇誘導培養，誘導不同時間後取3ul無菌體的誘導培養液進行SDS-PAGE檢測。結果(圖2)，隨著誘導時間的增加，植酸酶的表達量不斷提高，60h後，上清液中的表達量保持穩定。重組子P.pastoris FPHY34誘導60hr後，植酸酶表達量高達5.6mg/ml。表達的植酸酶分子量大小約為85kD。
在37℃pH5.5的條件下對含表達產物的培養液進行植酸酶活性測定，重組酵母P.pastoris FPHY34培養60hr後，酶活力為130,000u/ml，增加誘導表達時間，植酸酶的表達量僅緩慢增加。實施例6植酸酶性質測定將底物分別配製成pH＝1.5；2.5；3.5；4.5；5.5；6.5，以pH＝5.5時的酶活單位為100％，以高密度發酵上清液測定不同pH條件下植酸酶的相對活力。結果表明該植酸酶在pH2.5-6.5之間均有酶活力，pH值為5.5-6.5時，植酸酶活性達到最高，往中性範圍偏移酶活性沒有明顯變化(圖3)。
將上清液用90℃處理不同時間，放置冰上冷卻，加入酶反應底物，37℃反應30min，以未經高溫處理的發酵液為參比，測定上清液中的殘存酶活性。經過80min處理，植酸酶的活性仍保持40％。90℃高溫處理120min，仍有部分活性。(圖4)
權利要求
1.一種具有如下編碼的耐高溫植酸酶基因TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGGGGACAATACS K S C D T V D L G Y Q C S P A T S H L W G Q YTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGS P F F S L E D E L S V S S K L P K D C R I T LGTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGATCV Q V L S R H G A R Y P T S S K S K K Y K K LIACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAGGAAAATACACTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTGT A I Q A A T D F K G KY TF L K T Y Y T LGGAGCTGACGACTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTACCAAAGATACG A D D L T P F G E Q Q L V N S G I K F Y Q R YAAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAAK A L A R S V V P F I R A S G S D R V I A S G EAAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCK F I E G F Q Q A K L A D P G A T N R A A P A ITCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTS V I I P E S E T F N T L D H G V C T K F E ATCTGAACTTGGAGACGAGGTCGAGGCTAACTTCACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATCAGAGCTAGAGCTGAASEL G D E VEA N F T A L F A P D I R A R A EAAACACTTGCCTGGTGTCACCTTGACCGACGAAGACGTTGTTTCCTTGATGGATATGTGCCCCTTCGACACCK H L P G V T L T D E D V V S L M D M CPF D TGTTGCTAGAACCTCCGACGCTTCCCAACTTTCCCCATTCTGCCAACTTTTCACCCACAACGAATGGAAAAAAV A R T S D A S Q L S P F C Q L F T H N E W K KTACAACTACCTGCAGTCCTTGGGAAAATACTACGGATACGGAGCTGGAAACCCATTGGGACCAGCTCAAGGAY N Y L Q S L G K Y Y G Y G A G N P L G P A Q GATCGGATTCGCCAACGAATTGATCGCTAGATTGACCAGATCCCCAGTTCAAGACCACACCTCCACTAACTCCI G FAN E L I A R L T R S P V Q D H T S T SACCTTGGTTTCCAACCCAGCTACCTTCCCATTGAACGCTACCATGTACGTTGACTTCTCCCACGACAACTCTT L V S N P A T F P L A T M Y V D F S H D N SATGATCTCCATCTTCTTCGCTTTGGGACTTTACAACGGAACTGAACCATTGTCCAGAACTTCCGTTGAATCCMIS I F F A L G L Y G T E P L S R T S V E SGCTAAAGAACTTGACGGATACTCCGCTTCCTGGGTTGTTCCATTCGGTGCTAGAGCTTACTTTGAAACTATGA K E L D G Y S A S W V V P F G A R A Y F E T MCAATGCAAATCCGAAAAAGAACCATTGGTTAGAGTCTTGATTAACGACAGAGTTGTTCCATTGCACGGATGCQ C K S E K E P L V RVL I N D R V V P L H G CGACGTTGACAAATTGGGAAGATGCAAATTGAACGACTTCGTTAAAGGATTGTCTTGGGCTAGATCCGGTGGTD V D K L G R C K L N D F V K G L S W A R S G GAACTGGGGTGAATGCTTCTCCTAAN W G E C F S -
2.根據權利要求1所述耐高溫植酸酶基因，其特徵在於該植酸酶含有6個糖激化位點，基因長度為1320bp，核苷酸同源性為73％，核苷酸密碼全部為酵母偏愛密碼。
3.如權利要求1所述耐高溫植酸酶基因製備方法為如下步驟a、採用連續延伸PCR合成耐高溫植酸酶基因；b、以上合成的耐高溫植酸酶基因為模板，利用DNA分子重排技術對合成基因進行體外重組，FphyZ 1、FphyF 1為引物擴增重排的植酸酶基因，回收1.4Kb重排的植酸酶基因片段，構建到原核表達載體中，電擊法轉入大腸桿菌菌株DH5α，獲得突變體表達文庫進行高比活植酸酶篩選；c、按合成基因的兩端序列設計引物，在基因5』端加入Xho I切點和信號態切割序列，引物為FP1Z(5』-AACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAGGCTTCCAA ATCCTGCGACACCGTTGAC TTG-3』)，在基因3』端加入Not I切點引物為FP1F(5』-AACGCGGCCGCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTAC-3』)。擴增片段克隆後，Xho I和Not I雙酶切，定向插入pPIC9載體，構建成耐高溫植酸酶基因的酵母表達載體pPfphy。d、植酸酶高表達重組酵母篩選；e、將重組酵母菌菌株高密度發酵。
4.根據權利要求3所述具有酵母表達耐高溫植酸酶基因的製備方法，其特徵在於構建的酵母表達載體pPfphy含有權利要求1所述耐高溫植酸酶基因序列。
5.根據權利要求3所述的具有表達耐高溫植酸酶基因的製備方法，其特徵在於合成植酸酶基因通過體外分子重排後，採用引物為FphyZ 1和FphyF 1，擴增片段，BamHI和SacI雙酶切定向插入啟動子和t1+2終止子之間，構建成植酸酶基因原核表達載體庫。
全文摘要
本發明提供了一種在甲醇酵母中高表達的耐高溫植酸酶基因以及它的製備方法，本發明採用PCR擴增技術合成耐高溫植酸酶基因，並對其進行DNA改組，在原核表達質粒上構建突變植酸酶基因文庫，通過突變植酸酶篩選獲得耐高溫植酸酶基因，通過改變基因的偏愛密碼，使基因適合在酵母中表達，通過電擊轉化將耐高溫的植酸酶基因整合到畢赤酵母中實現高表達。
文檔編號C12N1/19GK1475572SQ0213653
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月16日 優先權日2002年8月16日
發明者姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 吳偉, 劉承訓 申請人:上海永業農科生物工程有限公司