控制志賀菌分子傳播流行的方法
2023-11-05 00:20:57
專利名稱：控制志賀菌分子傳播流行的方法
技術領域：
本發明涉及一種控制方法，特別涉及一種控制志賀菌分子傳播流行的方法。
背景技術：
控制志賀菌爆發流行的一項重要措施是快速溯源，切斷傳播途徑，脈衝場凝膠電泳(PFGE)指紋圖譜分析分辨力高，重複性好被認為是對致病菌分型的″金標準″。美國由HHS/CDC、若干衛生部門及實驗室於1996基於PFGE技術，建立了PulseNet，在2001年達到全國共享。在標準的檢測技術和分析程序下對病原細菌進行分子分型監測、並交流信息的資料庫工作網絡，用於食源性病原體暴發流行的分型、追蹤、溯源和應對。顯著地提高了發現疾病大規模爆發的監控能力。
我國對志賀菌的分型主要是血清學方法PFGE未見報導，無法有效預防和監測菌痢的爆發流行。本發明所在實驗室具有PFGE相關設備，積累了一定的經驗，將對本省分離的志賀菌進行PFGE指紋圖譜分析闡明本省菌痢流行的分子特徵，建成我省志賀菌指紋圖譜資料庫，並爭取使本試驗室能成為PulseNet China的一個分支。
腸桿菌科細菌對三代頭孢菌素的耐藥機制主要是產生質粒介導的超廣譜β內醯胺酶(ESBLs)和AmpC酶，我國志賀菌對三代頭孢菌素耐藥機制的研究未見報導，本發明實驗室已建立了檢測臨床致病菌ESBLs、AmpC酶的表型和基因型的成熟技術，在國內率先報導了DHA-1質粒AmpC酶，通過這些技術我們將闡明我省志賀菌對三代頭孢菌素的耐藥機制。
我國是目前世界上細菌對喹諾酮耐藥性最高的國家，通過對質粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnr耐藥機制的深入研究，將使我們更加深入和全面的闡述細菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機制。在志賀菌中，國外對氟喹諾酮耐藥機制的研究很少，尤其是質粒介導的耐藥。我國質粒介導的耐藥也未見報導，本發明將充分利用我國豐富的耐藥菌基因資源對質粒介導的喹諾酮耐藥機制進行深入研究。
耐藥質粒的水平轉移是志賀菌耐藥性日益嚴重的主要原因。最近的研究顯示整合子在志賀菌的多重耐藥性方面起著重要作用。國外已發現了兩類整合子的存在，其可變區往往同時攜帶多個耐藥基因盒，但有關整合子與三代頭孢菌素和氟喹諾酮耐藥基因關係的研究則很少，國內也未見報導。
如何及時準確的識別菌痢爆發的流行株？某地區志賀菌的分子流行特徵及耐藥特點如何？他們對三代頭孢菌素及喹諾酮耐藥機制是什麼？上述耐藥性的播散由何種機制介導？通過本方法我們將全面系統的回答上述問題。
發明內容本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種將把多重耐藥志賀菌中的質粒、整合子及耐藥基因有機聯繫起來，系統研究其耐藥性轉移機制的控制志賀菌分子傳播流行的方法。
本發明是通過如下技術方案實現的一種控制志賀菌分子傳播流行的方法，其特殊之處在於包括如下步驟(1)對收集自某地區的志賀菌進行血清學分型，確定這一地區菌痢流行的主要血清型及不同地區是否存在差異；(2)嚴格按照美國疾病預防和控制中心分子分型網站PulseNetUSA提供的針對志賀菌的標準試驗方案對收集的志賀菌進行脈衝場凝膠電泳，通過BioNumerics軟體分析確定各地區菌痢流行的分子亞型及地區間的相關性，初步建立該地區志賀菌DNA指紋圖譜分型資料庫；(3)按照CLSI要求對所收集的志賀菌進行紙片擴散法藥敏試驗，了解這一地區志賀菌對不同抗菌藥物的表型耐藥特徵並篩選出對三代頭孢菌素和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株；(4)用雙紙片平行抑制試驗及三相水解試驗檢測耐三代頭孢菌素的志賀菌中的超廣譜β內醯胺酶和AmpC酶，通過等電聚焦電泳、特異PCR引物擴增及其產物的序列分析明確其基因型；(5)對氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株通過PCR擴增DNA促旋酶gyrA、拓撲異構酶IVparC喹諾酮耐藥決定區QRDRs並對產物測序分析，明確志賀菌染色體介導的喹諾酮耐藥的機制，設計特異的PCR引物擴增質粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS，了解志賀菌中是否存在質粒介導的喹諾酮耐藥；(6)通過對多重耐藥的志賀菌株進行質粒圖譜分析、接合試驗、轉化試驗、southern雜交、PCR擴增檢測1、2、3類整合子的整合酶基因intI並對整合子的全可變區測序分析來了解耐藥性傳播的分子機制；(7)對新發現的耐藥酶、耐藥位點及通過前述方法無法明確的耐藥現象進行隨機分子克隆進一步闡述或發現新的耐藥機制。
本發明存在以下特點1.本發明對某地區分離的志賀菌進行PFGE指紋圖譜分析，建立資料庫，闡明該地區菌痢流行的分子特徵，並爭取使本試驗室能成為PulseNet China的一個分支。
2.本發明實驗室經多年研究已建立了檢測臨床致病菌ESBLs、AmpC酶的表型和基因型的成熟技術，在國內率先報導了DHA-1等質粒AmpC酶，通過這些技術我們闡明志賀菌對三代頭孢菌素的耐藥機制。
3.我國是目前世界上細菌對喹諾酮耐藥性最高的國家，腸桿菌科細菌對氟喹諾酮的耐藥機制主要是編碼DNA促旋酶gyrA、拓撲異構酶IVparC的喹諾酮耐藥決定(QRDRs)發生基因突變，而最近發現的質粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnr則改變了傳統的染色體介導的觀點，而且當細菌獲得qnr基因後其本身QRDR鹼基突變的機率明顯升高，通過對此機制深入研究將使我們更加深入和全面的闡述細菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機制。在志賀菌中由於國外的菌株對氟喹諾酮的敏感率高而很少能獲得耐藥株，所以有關其耐藥機制的研究很少，尤其是質粒介導的耐藥。我國有少數在福氏志賀菌中檢測染色體QRDRs突變的報導，但其研究均局限於單一的血清型或局部地區的菌株，而質粒介導的耐藥也未見報導，本發明充分利用我國豐富的耐藥菌基因資源對上述機制進行了深入研究。
4.志賀菌的耐藥性日益嚴重，耐藥質粒的水平轉移是其主要原因第一個耐藥″R″質粒，第一個介導四環素耐藥質粒，第一個介導喹諾酮耐藥質粒均是首次在志賀菌中發現，而最近的研究顯示整合子在志賀菌的多重耐藥性方面則起著重要作用。整合子的一個顯著特點是具有突出的基因捕獲及表達能力。目前在細菌耐藥中的作用是國內外的一個研究熱點，志賀菌中整合子的研究方面國外已發現了兩類整合子的存在，其可變區同時攜帶多個耐藥基因盒，如dfaA、oxa、tet、cat等分別介導對磺胺、氨苄西林、四環素和氯黴素的耐藥，但有關整合子與三代頭孢菌素和氟喹諾酮耐藥基因關係的研究很少，國內也未見報導。本發明將把多重耐藥志賀菌中的質粒、整合子聯繫起來，有所突破。
本發明將把多重耐藥志賀菌中的質粒、整合子及耐藥基因有機聯繫起來，系統研究其耐藥性轉移的機制，並對整合子的全可變區測序分析來了解耐藥性傳播的分子機制，作到了有所突破。
具體實施方式
實施例的技術路線包括如下步驟(1)血清學分型對收集的志賀菌通過生化試驗進行菌種鑑定，並採用志賀菌屬多價診斷血清對志賀菌屬的四種血清型及其不同的亞型進行血清學分型。
(2)藥敏試驗按照NCCLS規定，採用紙片擴散法對上述菌株進行藥敏試驗，質控菌株ATCC25922，所選用的抗菌藥物紙片包括氨苄西林、四環素、萘定酸、複方磺胺、環丙沙星、頭孢噻肟和頭孢他啶。上述試驗中對氟喹諾酮和三代頭孢菌素耐藥的菌株用Etest試條(瑞典AB BIODISK公司)檢測其MIC值，用WHONET5.3軟體對藥敏結果進行分析。
(3)脈衝場凝膠電泳(PFGE)嚴格按照PulseNetUSA提供的針對志賀菌的標準試驗方案進行，(http//www.cdc.gov/pulsenet/protocols/ecoli_salmonella_shigella_protocols.pdf)BioNumerics軟體(Applied Maths，Kortrijk，比利時)分析PFGE圖像建立資料庫。
(4)耐三代頭孢菌素機制分析表型篩選ESBLs和AmpC酶根據藥敏結果用雙紙片平行抑制試驗檢測產ESBLs菌株，用本實驗室建立的改良三相水解試驗檢測產AmpC酶菌株。
等電聚焦電泳按照美國BIO-RAD操作說明進行。
ESBLs和AmpC酶基因型PCR檢測根據耐藥表型和β-內醯胺酶的pI值，選擇設計特異性的ESBL引物(如SHV、TEM、CTX-M)和AmpC引物(如DHA、CMY)，PCR產物經純化後在ABI Prism 3700 DNA測序儀上測序。
(5)氟喹諾酮耐藥機制分析通過GenBank已知的基因序列用Primer Premier軟體設計擴增DNA促旋酶gyrA、拓撲異構酶IVparC喹諾酮耐藥決定(QRDRs)、質粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS的特異引物擴增上述耐藥基因並測序。
(6)質粒分析質粒圖譜和酶切圖譜分析耐藥菌株用UNIQ-10質粒抽提試劑盒(上海生工)抽提後通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳作圖，以11種超螺旋混合質粒(美國Sigma)為分子量標準。對來自不同菌株相同大小的質粒酶切後1％瓊脂糖凝膠電泳作圖。
質粒結合試驗篩選三代頭孢菌素耐藥質粒和喹諾酮耐藥質粒。
質粒轉化試驗篩選轉化成功的耐藥質粒。
(7)整合子分析根據文獻分別用針對不同整合酶的特異引物PCR擴增篩選整合子IintI1、intI2、intI3，對陽性菌株設計針對整合子全可變區引物進行PCR擴增並測序。
(8)對新發現的耐藥酶、耐藥位點及前述方法無法明確的耐藥菌株採用Sau3AI消化細菌染色體DNA或耐藥質粒，BamHI酶切質粒pBK-CMV進行分子克隆，重組質粒在大腸桿菌HB101中進行表達。
A、主要技術指標
1.脈衝場凝膠電泳(PFGE)志賀菌進行PFGE指紋圖譜分析，建立資料庫，闡明山東地區菌痢流行的分子流行特徵。
2.雙紙片平行抑制試驗及三相水解試驗檢測耐三代頭孢菌素的志賀菌中的超廣譜β內醯胺酶(ESBLs)和AmpC酶表型。
3.等電聚焦電泳檢測酶的等電點。
4.聚合酶鏈反應(PCR)技術設計特異PCR引物(1)擴增耐三代頭孢菌素的志賀菌中的編碼超廣譜β內醯胺酶(ESBLs)和AmpC酶的耐藥基因，明確其基因型別。(2)擴增對氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株中DNA促旋酶gy rA、拓撲異構酶IVparC喹諾酮耐藥決定(QRDRs)基因並對產物測序分析，明確志賀菌染色體介導的喹諾酮耐藥的機制。(3)擴增質粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS，了解我國志賀菌中是否存在質粒介導的喹諾酮耐藥。(4)檢測1、2、3類整合子的整合酶基因intI並對整合子的全可變區測序分析來了解耐藥性傳播的分子機制。
5.質粒圖譜分析、接合試驗、轉化試驗、southern雜交分析耐藥基因傳播途徑是染色體、質粒或整合子。
6.隨機分子克隆對本研究新發現的耐藥酶、耐藥位點及通過前述方法無法明確的耐藥現象進行進一步闡述或發現新的耐藥機制。
B、工作基礎本發明組多年從事細菌耐藥性方面的研究工作，了解本專業的研究前沿，建立了一支結構合理、具有良好團隊精神的專業研究隊伍，在革蘭陰性桿菌的耐藥機制和分子流行病學分析方面形成了較強的專業特色。
1.本發明負責人為某地區臨床檢驗中心微生物學組組長，負責某地區各地市醫院檢驗科室間質量評價工作，與各個實驗室有密切聯繫，可以保證志賀菌株的來源和質量。
2.本實驗室建立了長期的細菌耐藥性監測的資料庫和電腦分析系統，可對細菌的表型耐藥特徵和耐藥趨勢進行精確、科學的分析。
3.建立了ESBLs、AmpC和金屬酶等重要耐藥細菌的表型及基因型檢測的方法，在國內首先發現並報導鑑定出DHA-1等耐藥基因。
4.建立了成熟的repPCR、PFGE等醫院和社區感染的分子流行病學監測方法。
C、工作條件細菌鑑定、藥敏檢測和分析系統API、ATB和VITEK2系統法國生物梅裡埃公司E test系統瑞典AB BIODISK公司藥敏專用分析軟體WHONET5.3，世界衛生組織CHEF-Mapper脈衝場電泳儀，美國BIO-RAD公司等電聚焦電泳儀phastsys2tem型，美國Pharmacia公司MDF-U2086S低溫冰箱，SANYOTanon GIS-2020凝膠成像系統，上海天龍公司電轉儀electroporator 2510，德國eppendorf9700型PCR儀，AppliedBiosystems。
權利要求
1.一種控制志賀菌分子傳播流行的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)對收集自某地區的志賀菌進行血清學分型，確定這一地區菌痢流行的主要血清型及不同地區是否存在差異；(2)嚴格按照美國疾病預防和控制中心分子分型網站PulseNetUSA提供的針對志賀菌的標準試驗方案對收集的志賀菌進行脈衝場凝膠電泳，通過BioNumerics軟體分析確定各地區菌痢流行的分子亞型及地區間的相關性，初步建立該地區志賀菌DNA指紋圖譜分型資料庫；(3)按照CLSI要求對所收集的志賀菌進行紙片擴散法藥敏試驗，了解這一地區志賀菌對不同抗菌藥物的表型耐藥特徵並篩選出對三代頭孢菌素和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株；(4)用雙紙片平行抑制試驗及三相水解試驗檢測耐三代頭孢菌素的志賀菌中的超廣譜β內醯胺酶和AmpC酶，通過等電聚焦電泳、特異PCR引物擴增及其產物的序列分析明確其基因型；(5)對氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株通過PCR擴增DNA促旋酶gyrA、拓撲異構酶IVparC喹諾酮耐藥決定QRDRs並對產物測序分析，明確志賀菌染色體介導的喹諾酮耐藥的機制，設計特異的PCR引物擴增質粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS，了解志賀菌中是否存在質粒介導的喹諾酮耐藥；(6)通過對多重耐藥的志賀菌株進行質粒圖譜分析、接合試驗、轉化試驗、southern雜交、PCR擴增檢測1、2、3類整合子的整合酶基因intI並對整合子的全可變區測序分析來了解耐藥性傳播的分子機制；(7)對新發現的耐藥酶、耐藥位點及通過前述方法無法明確的耐藥現象進行隨機分子克隆進一步闡述或發現新的耐藥機制。
全文摘要
本發明公開了一種控制方法，特別公開了一種控制志賀菌分子傳播流行的方法。該方法包括如下步驟(1)確定一地區菌痢流行的主要血清型及不同地區是否存在差異；(2)初步建立該地區志賀菌DNA指紋圖譜分型資料庫；(3)按照CLSI要求對所收集的志賀菌進行紙片擴散法藥敏試驗；(4)分析明確其基因型；(5)了解志賀菌中是否存在質粒介導的喹諾酮耐藥；(6)對整合子的全可變區測序分析來了解耐藥性傳播的分子機制；(7)進一步闡述或發現新的耐藥機制。本發明將把多重耐藥志賀菌中的質粒、整合子及耐藥基因有機聯繫起來，系統研究其耐藥性轉移的機制。
文檔編號G01N33/15GK1837811SQ200610043619
公開日2006年9月27日 申請日期2006年4月24日 優先權日2006年4月24日
發明者王勇 申請人:王勇