芪類化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應系統中的應用的製作方法
2023-11-04 21:46:42 1
本發明屬於醫藥技術領域，涉及芪類化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應系統中的應用，具體涉及白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應系統中的應用。
背景技術：
抗生素的廣泛使用導致越來越多的致病菌產生了耐藥性，因此，急需開發新的抗生素和建立新的治療模式。近來的研究發現，很多病原菌的致病性是由一種密度依賴的群體感應系統(Quorum Sensing，QS)調控，群體感應系統通過介導致病基因的表達，調控病原菌生物被膜(biofilm)的形成，對其致病性進行調控。高效的群體感應抑制劑(QSI)有望實現對病原菌致病性和生物被膜的控制。
最早發現的具有QS抑制活性的天然產物是從紅藻中分離得到的溴化呋喃酮，它能夠抑制銅綠假單胞菌等細菌的QS活性，大幅降低細菌生物膜對抗生素的抗性(Gram,L.,et al.Applied and environmental microbiology,1996.62(11):4284-4287)。從葡萄和花生等食物中分離出的一種天然抗毒素白藜蘆醇，已被證明具有抗炎、抗氧化等多種活性，並能抑制奇異變形桿菌毒力因子的表達(Won-Bo Wang,et al.Journal of MedicalMicrobiology(2006),55,1313–1321)。
銅綠假單胞菌是最常見的與醫院感染有關的革蘭氏陰性菌，特別容易感染免疫功能不全的病人以及患有肺部疾病囊胞性纖維症的病人。銅綠假單胞菌通過兩個AHL介導的QS系統來控制多種毒力因子的表達，包括外蛋白酶、鐵載體、外毒素和一些次級代謝物。此外，銅綠假單胞菌是一個強大的生物膜形成者，而生物膜的形成被認為是一個重要的病原性特徵。
芪類化合物是一類重要的植物激素，廣泛存在於植物界中。目前，芪類化合物的研究集中在其抗菌、抗氧化及抗癌等生物活性方面，但其對銅綠假單胞菌是否具有QSI活性未有報導。
技術實現要素：
本發明的目的之一是提供芪類化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應系統中的應用，具體是白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應中的應用。
本發明的目的之二是提供芪類化合物在製備銅綠假單胞菌群體感應抑制劑中的應用。
本發明的目的之三是提供芪類化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應抑制劑中的最低有效濃度，其中，白藜蘆醇的最低有效濃度為100μM，優選為300μM以上，更優選為400μM以上；白皮杉醇的最低有效濃度為100μM，優選為400μM以上；氧化白藜蘆醇的最低有效濃度為10μM，優選為400μM以上。
本發明具有以下有益效果：
三種芪類化合物均能在不影響銅綠假單胞菌PAO1生長的情況下，顯著抑制其群體感應，其中白藜蘆醇的活性最高；濃度為100μM時，三種化合物均能很好地抑制銅綠假單胞菌PAO1的群集運動；當濃度為400μM時，三種化合物均能顯著地抑制綠膿菌素的產生，抑制率分別為59.3％、37.1％和50.2％。
附圖說明
圖1是實施例1中三種芪類化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇對銅綠假單胞菌PAO1產綠膿菌素能力的影響結果圖。
圖2是實施例2中三種芪類化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇對銅綠假單胞菌PAO1生長的影響結果圖。
圖3是實施例3中空白對照組(a)、DMSO對照組(b)和三種芪類化合物白藜蘆醇(c)、氧化白藜蘆醇(d)及白皮杉醇(e)對銅綠假單胞菌群集運動的抑制結果圖。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作進一步的說明，其目的是為更好理解本發明的內容，但所舉的實施例並不限制本發明的保護範圍。
實施例1
三種芪類化合物抑制銅綠假單胞菌PAO1綠膿菌素產生的實驗。
配製NB培養基滅菌備用；挑取已劃線培養好的銅綠假單胞菌PAO1單菌落到NB培養基中，37℃過夜培養；取30μL過夜培養的菌液1:1000稀釋到裝有30mL NB培養基的錐形瓶中，同時加入不同濃度的芪類化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇，使其終濃度分別為100、200、300及400μM，等體積的DMSO作為對照組，混勻後放入搖床中，150rpm、37℃培養16-18h，每組重複三次；取5mL上述得到的培養液到10mL離心管中，8000×g離心5min；將上清液轉移至一個新的10mL離心管中，加入3mL三氯甲烷，充分混勻，靜置；棄去水相，加入1mL 0.2M HCl，充分混勻後8000×g離心5min，測粉紅到深紅色上層溶液的OD520。
綠膿菌素是由銅綠假單胞菌QS系統調控產生的一種重要的毒力因子，在侵襲性感染中起著重要作用。由圖1可以看出，三種化合物均能顯著地抑制綠膿菌素的產生，且抑制效果隨藥物濃度的增加而增強，呈現出劑量依賴性。其中白藜蘆醇的抑制效果最好，氧化白藜蘆醇次之，白皮杉醇末之；在400μM時，三種化合物均能顯著地抑制綠膿菌素的產生，抑制率分別為59.3％、37.1％和50.2％。
實施例2
三種芪類化合物生長曲線的測定。
取30μL過夜培養的菌液1:1000稀釋到裝有30mL NB培養基的錐形瓶中，同時加入不同濃度的芪類化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇，使其終濃度為400μM，等體積的DMSO作為對照組，150rpm、37℃條件下培養；起始培養開始時，取200μL各培養液於96孔板中，用酶標儀測其於620nm處的吸光度；從起始培養開始，每隔2h，取一次菌液測其在620nm處的吸光度，直至24h；對所得數據進行統計學分析。
綠膿菌素產量的減少可能是化合物對銅綠假單胞菌群體感應系統的抑制引起的，也可能是化合物抑制了銅綠假單胞菌的生長引起的。因此，為了排除生長抑制對群體感應抑制的影響，我們測定了在400μM下三種化合物對銅綠假單胞菌PAO1的生長曲線。結果如圖2所示，與對照相比，在400μM下，三種化合物對銅綠假單胞菌PAO1的生長無明顯影響。這一結果進一步證明綠膿菌素產量的減少歸功於三種化合物對銅綠假單胞菌的群體感應抑制活性，而不是生長抑制活性。
實施例3
三種芪類化合物抑制銅綠假單胞菌PAO1群集運動(swarming)的實驗。
配製swarming培養基(NB培養基8g、葡萄糖5g、瓊脂5g、蒸餾水1000mL，調PH至7.2左右)，滅菌後冷卻至50℃左右時加入不同濃度的芪類化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇，混勻後倒入已滅菌的平板中，其中芪類化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇為100、200、300及400μM，同時以等體積的DMSO作為溶劑對照組。待平板凝固後，取2μL PAO1的過夜菌液接種到瓊脂板的中央；37℃倒置培養16h後觀察結果。
銅綠假單胞菌的群集運動(swarming)受其群體感應系統調控。因此，測定三種化合物對銅綠假單胞菌群集運動的影響可以作為又一個指標，來進一步驗證三種化合物對銅綠假單胞菌群體感應的影響。如圖3所示，和未加任何物質的陰性對照組(a)和溶劑DMSO對照組(b)相比，在群集運動平板上，各個測定濃度的白藜蘆醇(c)、白皮杉醇(e)及氧化白藜蘆醇(d)均能顯著地抑制銅綠假單胞菌的群集運動的直徑及分叉數，展現出顯著的群集運動抑制效果。