Jucara和acai果實基營養補充劑的製作方法
2023-10-06 07:47:29 2
專利名稱：Jucara和acai果實基營養補充劑的製作方法
本申請是國際申請日為2004年3月22日提交的國際申請號為PCT/US2004/008739，中國申請號為200480013855.2，發明名稱為「JUCARA和
果實基營養補充劑」的分案申請。
發明領域
本發明涉及製備穩定的、可口的、凍幹的水果基營養補充劑(fruit-based dietary supplement)的方法及其應用。
背景技術：
在過去的幾十年裡，關於自由基對人類健康和疾病的重要性的認識開始增強。許多常見病和威脅生命的疾病，包括動脈硬化、癌症和衰老，都有自由基反應作為潛在的損傷機制。經過這段時期，我們對自由基與生命體相互作用的概念上的理解已經發展並提供了空前的機遇以促進人類生命的質量甚至延長其長度。
一類最普通的自由基是活性氧物質(ROS)。這是正常細胞呼吸和代謝的產物，通常受體內產生的抗氧化劑調節。由於汙染等環境因子和吸菸或運動等生活方式因素的影響，自由基的生成會增加。這種增加會打破機體平衡，尤其是當機體衰老和抗氧化劑生成機制喪失了其以必要速率生成那些化合物的能力時，導致氧化應激。由此導致的損傷範圍可包括生物過程的破壞、殺死細胞和遺傳物質的變異，後者將導致癌症發生。
營養補充劑在抵禦氧化應激效應和退行性疾病進展及衰老中的潛在應用在過去的二十年中已成為越來越多的研究的主題。如今市場上有許多產品包含不同水平的抗氧化劑。這些形成了食物、液體和營養補充劑的形式。這些重要的營養物通常富含於擁有維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素及其它化合物的水果和蔬菜中。
抗氧化劑假說假定補充營養抗氧化劑能夠減輕與疾病相關的氧化還原不平衡。抗氧化劑行使結合自由基、使其穩定並將其清除出系統的功能，從而減少了自由基可能造成的損傷。
目前已開發了合成的抗氧化劑如BHA(丁基化羥基苯甲醚)，BHT(丁基化羥基甲苯)和NDGA(去甲二氫愈創木酸)。天然抗氧化劑的例子有抗氧化酶類，如超氧化物岐化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和穀胱甘肽過氧化物酶，以及非酶類抗氧化劑如生育酚(維生素E)、抗壞血酸(維生素C)、類胡蘿蔔素和穀胱甘肽。
然而，合成的抗氧化劑可能因在其體內的強毒性而導致過敏反應和腫瘤形成，並且由於溫度敏感性而易於分解。另一方面，雖然天然抗氧化劑在體內比合成的抗氧化劑安全，但卻有效果弱的問題。因此，要求開發在使用中無安全問題同時又具有優秀抗氧化活性的新天然抗氧化劑。
許多研究闡明了多酚黃酮類化合物的保護功能。黃酮類化合物的抗誘變、抗癌變和免疫刺激功能已有報導。黃酮類化合物是一大類天然存在的多酚化合物，發現於水果、蔬菜、穀物、樹皮、茶葉和酒中，已被證實有體內清除自由基的潛力。
花色素苷是天然存在的化合物，是許多水果、蔬菜、穀物和花朵呈紅色、紫色和藍色的原因。例如，如藍莓、歐洲越桔(bilberry)、草莓、覆盆子、波森莓、marionberries、酸果蔓等漿果的顏色，歸因於許多不同的花色素苷。在自然界中已鑑定了超過300種結構不同的花色素苷。因為花色素苷是天然存在的，它們作為食物和飲料的著色劑的應用引起了許多興趣。原花色素苷是在水果和蔬菜中發現的另一類黃酮類化合物，雖然無色，但具有抗氧化活性。
最近，對花色素苷色素的興趣加強了，因為其作為營養補充劑對健康可能有好處。例如，歐洲越桔(Vaccinium myrtillus)中的花色素苷長期以來一直被用來增進視敏度和治療循環障礙。有實驗證據表明某些花色素苷和黃酮類化合物具抗炎症功能。另外，有報導稱口服花色素苷對治療糖尿病和潰瘍有好處，許多還有抗病毒和抗微生物活性。黃酮類化合物這些理想性質的化學基礎據信與其抗氧化能力有關。因此，與漿果及其它水果和蔬菜的抗氧化特性歸結於它們的花色素苷含量。
如今的市場上有許多產品含有不同水平的抗氧化劑。這些形成了食物、液體和營養補充劑的形式。這些重要的營養物通常富含於擁有維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素及其它化合物的水果和蔬菜中。抗氧化劑行使結合自由基、使其穩定並將其清除出系統的功能，從而減少了自由基可能造成的損傷。
由於許多水果和蔬菜中都含有這些重要的營養物，所以能夠評估這些食品中抗氧化劑吸收自由基的能力就十分重要。在Tufts大學的USDA研究者開發了一種稱為ORAC(Oxygen Radical AbsorbanceCapacity，氧基吸收能力)的實驗室檢測，對不同食物依其抗氧化劑含量和結合自由基能力進行分級。通過這種檢測，不同食物的抗氧化能力可進行比較和分析。
需要鑑定具高ORAC分值的水果或蔬菜和基於其上的營養補充劑的開發和生產。
發明概述
本發明涉及具有高ORAC分值和環加氧酶抑制活性的
果實和Jucara果實的鑑定。一方面本發明提供一種營養補充劑組合物，包含凍幹的果漿，其中總花色素苷(anthocyanin)濃度大於約1毫克/克總重，該組合物具有大於約350微摩爾TE/克總重的ORACFL值和小於約3％總重的殘留水含量。在一個實施方案中，該營養補充劑組合物中的凍乾果漿是凍幹的
果漿。在另一個實施方案中，該營養補充劑組合物中的凍乾果漿是凍幹的Jucara果漿。在一個實施方案中本發明的營養補充劑組合物進一步包含一種藥用載體。在一個優選實施方案中，本發明營養補充劑中花色素苷總濃度為從約1毫克/克總重到約500毫克/克總重。在另一個優選實施方案中，營養補充劑中的總花色素苷濃度為從約1毫克/克至約100毫克/克總重。在還有另一個優選實施方案中，營養補充劑中總花色素苷濃度為從約1毫克/克到約10毫克/克總重。在另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約10毫摩爾TE/克的ORACFL值。在另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約5毫摩爾TE/克的ORACFL值。在還有另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約1毫摩爾TE/克的ORACFL值。在一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約0.01％到約3％。在另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約0.1％到約3％。在還有另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約1％到約3％。
另一方面，本發明提供一種包含凍乾果漿的營養補充劑組合物，其中組合物具有大於約15阿司匹林(Aspirin)_毫克當量/克總重的環加氧酶抑制活性和低於約3重量％總重的殘留水含量。在一個實施方案中，該營養補充劑組合物中的凍乾果漿是凍幹的
果漿。在另一個實施方案中，該營養補充劑組合物中的凍乾果漿是凍幹的Jucara果漿。在一個實施方案中本發明的營養補充劑組合物進一步包含一種藥用載體。在一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的環加氧酶抑制值為從約15阿司匹林_毫克當量/克總重到約10,000阿司匹林_毫克當量/克總重。在另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的環加氧酶抑制值為從約15阿司匹林_毫克當量/克總重到約1,000阿司匹林_毫克當量/克總重。在還有的另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的環加氧酶抑制值為從約15阿司匹林_毫克當量/克總重到約100阿司匹林_毫克當量/克總重。在一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約0.01％到約3％。在另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約0.1％到約3％。在還有另一個優選實施方案中，營養補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約1％到約3％。
另一方面本發明提供了生產穩定和美味的水果基營養補充劑組合物的方法，該方法包含收穫果實；稱重果實；用水清洗果實；在約75℃至約100℃的溫度下用水洗滌果實為期約5秒鐘至10分種；給果實去殼(hulling)以從果實中分離果漿；將果漿凍至約-5℃以下；凍乾果漿，其凍幹條件能產生殘留水含量低於3重量％的顆粒狀、凍乾果漿粉末，其中凍乾果漿比果漿製劑更穩定和可口。在一個實施方案中，果實是
果實。在另一個實施方案中，果實是Jucara果實。在一個實施方案中，清洗步驟包括用0.1％(v/v)的衛生水清洗果實。在另一個實施方案中，檸檬酸在冰凍前被加入到果漿製劑中。在另一個實施方案中，洗滌步驟包括在溫度為約80℃下在水中清洗果實為期約10秒鐘。在還有另一個實施方案中，去殼步驟包括對果實機械去殼為期約2分鐘至5分鐘，去殼步驟使用每2千克果實約1升水。在還有另一個實施方案中，製作營養補充劑組合物的方法產生一種水果基營養補充劑組合物，該組合物具有高於約350微摩爾TE/克總重的ORCAFL值。在另一個實施方案中，製作營養補充劑組合物的方法產生一種水果基營養補充劑組合物，該組合物具有約從350微摩爾TE/克總重到約10毫摩爾TE/克總重的ORCAFL值。在另一個實施方案中，製作營養補充劑組合物的方法產生一種水果基營養補充劑組合物，該組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約5毫摩爾TE/克總重的ORCAFL值。在還有另一個實施方案中，製作營養補充劑組合物的方法產生一種水果基營養補充劑組合物，該組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約1毫摩爾TE/克總重的ORCAFL值。在另一個優選實施方案中，製作營養補充劑組合物的方法產生一種水果基營養補充劑組合物，該組合物具有大於約15阿司匹林_毫克當量/克總重的環加氧酶抑制值。在一個優選實施方案中，製作營養補充劑組合物的方法產生一種水果基營養補充劑組合物，該組合物的環加氧酶抑制值為從約15阿司匹林_毫克當量/克總重到約10,000阿司匹林_毫克當量/克總重。在另一個優選實施方案中，製作營養補充劑組合物的方法產生一種水果基營養補充劑組合物，該組合物的環加氧酶抑制值為從約15阿司匹林_毫克當量/克總重到約1,000阿司匹林_毫克當量/克總重。在還有另一個優選實施方案中，製作營養補充劑組合物的方法產生一種水果基營養補充劑組合物，營養補充劑組合物的環加氧酶抑制值為從約15阿司匹林_毫克當量/克總重到約100阿司匹林_毫克當量/克總重。
在還有的另一方面，本發明提供一種方法，預防或治療哺乳動物體內由病理性自由基反應導致的疾病或損傷，該方法包括給該哺乳動物施用有效量的本發明的水果基營養補充劑組合物，其中該組合物猝滅(quench)自由基並減少病理性自由基導致的損傷。在一個實施方案中，所述疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌症、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性迴腸炎(Crohn′s disease)、血管病、關節炎、潰瘍、急性呼吸窘迫症候群、缺血-再灌注損傷、神經變性疾病、自閉症、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎症導致的組織損傷以及環境毒素導致的組織損傷。
在還有的另一方面，本發明提供一種減輕哺乳動物內病理性自由基反應的有害效應的方法，所述哺乳動物遭受疾病或損傷，該疾病或損傷是由哺乳動物中的病理性自由基反應所導致的，所述方法包括向該哺乳物施用有效量的本發明的水果基營養補充劑組合物，其中該組合物猝滅自由基並減少病理性自由基導致的損傷。在一個實施方案中，所述疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌症、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性迴腸炎(Crohn′s disease)、血管病、關節炎、潰瘍、急性呼吸窘迫症候群、缺血-再灌注損傷、神經變性疾病、自閉症、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎症導致的組織損傷以及環境毒素導致的組織損傷。
在還有的另一方面，本發明提供一種方法以抑制哺乳動物體內環加氧酶活性，該方法包括給該哺乳動物施用有效量的本發明的水果基營養補充劑組合物。在一個實施方案中，該水果基營養補充劑組合物中進一步包含藥用載體。在另一個實施方案中，該水果基營養補充劑組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。
另一方面，本發明提供一種方法以預防或治療與哺乳動物體內環加氧酶活性增強相關的疾病或損傷，該方法包括給該哺乳動物施用有效量的本發明的水果基營養補充劑組合物。在一個實施方案中，該水果基營養補充劑組合物中進一步包含藥用載體。在另一個實施方案中，該水果基營養補充劑組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。在一個實施方案中，所述疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌症、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性迴腸炎(Crohn′sdisease)、血管病、關節炎、潰瘍、急性呼吸窘迫症候群、缺血-再灌注損傷、神經變性疾病、自閉症、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎症導致的組織損傷以及環境毒素導致的組織損傷。
本發明的這些以及其它目的將在本發明下面提供的詳細描述中顯現。
附圖簡述
參照下述附圖本發明可被更充分地理解，圖表只起說明作用。
圖1顯示了凍幹
粉的典型吸收譜。
圖2顯示了由LC/MS/MS色譜技術測定的凍幹Jucara粉的花色素苷譜圖(profile)。
圖3是一幅示意圖，顯示了凍幹Jucara粉的花色素苷的化學結構。
圖4顯示了由LC/MS/MS色譜技術測定的凍幹
粉的花色素苷譜圖。
圖5是一幅示意圖，顯示了凍幹
粉內花色素苷的化學結構。
圖6顯示了由HPLC和質譜色譜技術測定的凍幹Jucara粉內酚化合物的譜圖。
圖7是一幅示意圖，顯示了凍幹Jucara粉內酚化合物的化學結構。
圖8顯示了由色譜技術測定的凍幹
粉和凍幹Jucara粉內原花色素苷(proanthocyanin)的譜圖。
圖9是示意圖，顯示了凍幹
粉和凍幹Jucara粉內原花色素苷化合物的化學結構。
圖10是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選蔬菜的抗氧化活性。
圖11是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選新鮮水果的抗氧化活性。
圖12是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選新鮮水果的抗氧化活性。
圖13是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的凍幹
粉和凍幹Jucara粉與所選新鮮水果的抗氧化活性。
圖14是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的凍幹
和所選新鮮水果的抗氧化活性。
圖15是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的凍幹
粉和所選新鮮蔬菜的抗氧化活性。
圖16是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選水果、蔬菜和堅果的抗氧化活性。
圖17是柱狀圖，比較了曲ORAC分析技術測定的所選堅果的抗氧化活性。
圖18是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的脫水
和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化活性。
圖19是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的凍幹
粉和所選新鮮蔬菜的抗氧化活性。
圖20是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的脫水
和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化活性。
圖21是一柱狀圖，比較了由ORACHO分析技術測定的水果、蔬菜的抗氧化活性。
圖22是流程示意圖，詳述了
果汁製備。
圖23是用於
果汁製備的去殼設備示意圖。
圖24是流程示意圖，詳述了凍幹
粉的製備方法。
發明詳述
因此應當理解下面在不同細節水平所述發明的某方面、方式、實施方案、變化和特徵是為了提供對本發明充分的理解。通常，這些公開內容提供了有益的營養補充劑組合物、這些組合物與其它營養補充劑組合物的組合以及其生產和應用的方法。
因此，本發明的多個方面涉及到某特定營養補充劑組合物的治療或預防性應用以預防或治療由病理性自由基反應引起的疾病或損傷。本發明的多個方面進一步涉及到特定營養補充劑組合物的治療或預防性應用以預防或治療與環加氧酶酶活性增強相關的疾病或損傷。因此，後附多個闡明這些方面的詳細實施方案。
應當理解所述對醫學病症的治療和預防的多種方式意指「充分」，即包括全部但也包括不完全治療或預防，從中獲得了一些生物學和醫學相關的結果。
定義
此處所述「受試者」，優選指哺乳動物，如人類，但也可以是動物，如家養動物(如狗、貓之類)、農場動物(如牛、羊、豬、馬之類)和實驗動物(如大鼠、小鼠、豚鼠之類)。
化合物的「有效量」，如此處所述，指足以獲得理想治療和/或預防效果的數量，例如，可導致對所處理疾病產生預防或使其相關症狀得到減輕的數量。給受試者施用的化合物的量將取決於疾病的種類和嚴重性以及個體的特徵，如一般健康狀況、年齡、性別、體重及耐藥性。用量還將取決於疾病的程度、種類和嚴重性。熟練技術人員能夠根據這些及其它因素決定合適的劑量。典型地，本發明中化合物的有效量，足以獲得治療或預防效果，範圍從每天約0.000001mg/千克體重到每天約10,000mg/千克體重。優選地，劑量範圍從每天約0.0001 mg/千克體重到每天約100mg/千克體重。本發明的化合物也可以彼此組合施用，或者與一種或多種另外的治療化合物組合施用。
是巴西北部Para地區特有的眾所周知的棕櫚樹種。
以細的樹幹和圓蛋形簇狀果實為特徵，其果實為深紫色，有時熟後甚至接近於黑色。
的拉丁名稱為阿薩依(Euterpe oleracea)，Martius；科，棕櫚科(Palmaceae)。英文也稱為「卷心棕櫚(Cabbage Palm)」。在巴西稱為
Amazonas，palmito Acai，acaizeiro，acal，assai，jicara，Jucara，palmiteiro，piria在哥倫比亞稱為assai和manaca；及uacai；在蘇利南稱為manaka，pinapalm，prasara，wapoe，和wasei。
一詞還包括另一種Euterpe亞種，E.catinga Wallace，其在巴西也有發現並稱為
最後，
也包括另一個Euterpe亞種，E.precatoria Martius，發現於玻利維亞並為南美地區所知，也稱為
和″jucara″。
″Jucara″是另一種棕櫚樹。Jucara的拉丁名為阿沙依(Euterpeedulis)，Martius；科，棕櫚科。在巴西也稱為assai，acai，plamito，palmito doce，iucara，palmito Jucara，ripeira，icara，Jucara，ensarova，palmiteiro。Jucara一詞還包括另一個Euterpe亞種，E.espiritosantensis Femandes，其在巴西也有發現並稱為″Jucara″。最後，
也包括另一個Euterpe亞種，E.precatoriaMartius，發現於玻利維亞並為南美地區所知，也稱為
和″Jucara″。
所有本申請中引用的參考文獻在此結合作為參考。
抗氧化性能及其應用
本發明鑑別出兩個科的棕櫚樹(
和Jucara)的果實，具有比其它任何檢測的水果或蔬菜顯著更高的ORAC分值。
已知
果實含有高比例的單不飽和及多不飽和脂肪酸，以及相對低濃度的飽和脂肪和反式脂肪酸。還已知
果實富含類脂、纖維和蛋白，並含有維生素E和花色素苷，兩種已知的抗氧化劑。然而，這些果實在過去沒有被充分利用，因為
果實非常易於因氧化和細菌、真菌及酵母等微生物汙染而迅速腐敗。因此，由
果實製備的水果和果汁腐敗很快，迅速失去其可口性和抗氧化功能-幾乎一半的花色素苷在果實採摘後兩天內分解。為了能將產品推向更廣大的市場，在克服
果實和果汁迅速腐敗的努力中，一些公司已經嘗試將果漿冷凍。然而，用這種方式對
果實進行簡單冷凍需要密切監視溫度-即使是微小的溫度偏差也將導致變質酶和發酵劑的活化。另外，當融化這樣冷凍的果漿以使用時，這些試劑仍然被活化並導致果漿粗糙(grittiness)。
前述問題，與其它問題一起，被本發明所解決。明確地，如實施例中所描述，本發明提供了穩定的和可口的
基營養補充劑組合物，其具有比其它任何檢測的冷凍水果或蔬菜顯著更高的花色素苷濃度和更高的ORAC分值。
作為本發明的結果，目前已明確
果實提供了一個營養補充劑的很好的來源。在本發明之前，該水果主要用作能量飲料或作為具短暫架上保存期的冷凍處理物(frozen treat)的一部分。本發明的
基營養補充劑組合物提供了穩定的和可口的產品，具有顯著更長的架上保存時間，同時顯著提高了
果實的抗氧化性能。本發明使該水果的高營養特性不但得到保持，而且顯著增強，並放心享用而不必擔心快速腐敗。
雖然前述討論主要集中於
果實和由其衍生的營養補充劑，本發明還提供了Jucara-基營養補充劑組合物，該組合物也具有比其它任何所測定的凍乾果實或蔬菜組合物顯著更高的花色素苷濃度並產生更高的2ORAC分值。如下將述，Jucara果實，及由其衍生的營養補充劑，也含有極高水平的原花色素苷類並對羥基自由基(hydroxyl radical)和過氧化亞硝酸鹽顯示高抗氧化活性。
根據本發明，
果實和Jucara果實、果汁、營養補充劑及其它由
果實和Jucara果實衍生的組合物用於治療、逆轉、和/或預防自由基和氧化應激的有害效應。
自由基和氧化應激
在過去的幾十年裡，自由基，具高度反應性及因此所導致高度破壞性的分子，其對人類健康和疾病的重要性已越來越多地被認識。許多常見病和威脅生命的人類疾病，包括動脈硬化症、癌症和衰老，都以自由基反應作為潛在的損傷機制。
自由基是一個在外圍軌道上具有一個或多個未配對電子的分子。這些分子種類中許多都是以氧(有時是氮)為中心的。實際上，我們呼吸的氧分子就是一個自由基。這些高度不穩定的分子傾向於與鄰近分子迅速反應，貢獻、吸引或甚至共享它們的外圍電子。這個反應不但改變了鄰近的靶分子，有時是以意義深遠的方式，而且還經常通過靶分子傳遞未配對電子，產生次級自由基或其它ROS，其可繼續與新的靶分子反應。實際上，ROS的高活性許多是源於其產生了這樣的分子鏈式反應，將其效果有效地放大了許多倍。抗氧化劑能提供保護是因為它們能清除在ROS對許多生物分子造成損傷前將其清除，或防止氧化損傷擴散，例如，通過打斷脂質過氧化作用的自由基鏈式反應。
ROS和人類健康
由於我們的身體持續地暴露於來自外部的(陽光、其它形式的射線、汙染)和內源性自由基及其它ROS中，ROS介導的組織損傷是大量疾病發生的最後共同通路。
射線損傷
射線損傷代表了一種重要的ROS介導的疾病的原因。極端的例子包括太陽內部和熱核爆炸中心的物理化學反應。至於更常遇到的射線水平，取決於具體情況，所受損傷的約三分之二並非由射線本身介導，而是由繼發產生的ROS導致。這並有僅僅適用於射線損傷的急性毒性形式，還適用於慢性、誘變(和由此導致的致癌)效果。
這個原理一個重要的臨床應用在癌症放射性治療中常常遇到。大型腫瘤經常生長得超出了其血液供應的能力而使中心的腫瘤細胞死亡，儘管周圍的細胞仍然能得到良好的氧供應。在這兩個區域之間是一個供氧貧乏的腫瘤區域，但仍能保持存活。這類腫瘤的放射性治療對周圍區域特別有效，在這些區域有充足的氧濃度供應以形成殺腫瘤性ROS。氧貧乏的中心區所受損傷程度顯著減小。雖然在中心的死細胞無論如何不能存活，但在這兩個區域之間的氧供應貧乏、但仍活著的細胞可在放射性治療中存活安全的數量，並因此導致腫瘤的後期局部復發。這就是為什麼許多大腫瘤通過放射性治療(以在其邊緣殺死腫瘤)和手術切除包括這些特別危險的殘存細胞在內的瘤體相結合的方式進行治療的原因。
癌症和其它惡性腫瘤
癌症和其它惡性腫瘤都有基於細胞遺傳信息改變而導致的不受約束的細胞生長和增殖。大多數情況下，例如，通常約束細胞生長和複製的一個或多個基因發生突變，或者是發生失活。這些遺傳缺陷直接引起遺傳密碼的缺失和序列改變，遺傳密碼即是細胞內的DNA基團。這種DNA損傷常見的最終通常原因是自由基損傷。我們的DNA以每天計所受的無數損傷中，大多數被胞內的正常DNA修復機制所修復，儘管其中一些導致了細胞死亡。由於這些損傷是零星發生的並在基因組內呈一定隨機分布，大多數致死性DNA損傷是臨床無關性的，僅導致在上百萬細胞中損失一些細胞。然而，如果在影響生長調節的損傷中有一個細胞存活，它就可以不受約束地增殖並迅速生長通過正向自然選擇而佔據細胞數量的主要部分。其結果就是腫瘤，常常是惡性的，其中生長和增殖機制顯著缺失。因此，對遺傳物質的自由基損傷是致癌的主要最後共同通路。
ROS在胞內的產生不僅可通過外部的放射性源，也可作為體內正常代謝過程的副產物而生成。內源性自由基的一個重要來源是某些藥物、汙染物及其它化學試劑和毒品的正常代謝，這些物質通稱異生素。雖然這些中的一部分具有直接毒性，但許多其餘物質通過這些機體對其解毒的代謝過程產生大量自由基流。一個例子是對除草劑百草枯的代謝。曾有一段時間，藥品實施管理局(drug enforcement authorities)使用這種除草劑來殺滅大麻植物。種植者意識到他們能夠在大麻枯萎前收穫噴灑過藥物的植株。許多吸食這類產品者隨後死於急性肺損傷。幸運地，該方法已經被作為解決此毒品問題的特別不人道的方式而廢止了。
百草枯的故事是自由基毒性代謝機制特別突出的例子，許多經常遇到的異生素，包括香菸的煙霧、空氣汙染物、和甚至酒精也是有毒的，它們在我們體內分解代謝產生的自由基的效果，常常在很大程度上是致癌的。此外，越來越多的證據表明飲食中富含水果和蔬菜，這富含天然抗氧化劑，少含飽和脂肪酸(特別易受ROS攻擊而損傷的靶體)，降低了動脈硬化和癌症的風險。
動脈硬化症
動脈硬化是發達社會中死亡和過早傷殘的主要原因。此外，目前的預測估計到2020年心血管病，尤其是動脈硬化，將成為全球總疾病負擔的最主要原因，總疾病負擔定義為從健康壽命中因傷殘或早死所減去的年數。動脈硬化是一個複雜的過程，可導致心臟病發作、中風、和因動脈粥樣硬化斑堵塞動脈而導致的肢體喪失。這種硬化斑是氧化了的脂肪的一種形式。當自由基與脂質反應，其後果是脂質過氧化，與黃油暴露於空氣中的氧時變得腐臭是同樣的過程。雖然許多因素影響動脈硬化的發展和嚴重性，一個主要的因素是ROS-介導的我們低密度脂蛋白(LDLs，或″壞膽固醇″)的過氧化反應。預防心臟病和中風的食療方法就是部分基於在降低脂肪本身攝取的同時，加入食物抗氧化劑以限制LDL的氧化。這些方法已經使心臟病的死亡率顯著降低，但本發明的組合物在將來可以提供一個安全的藥學預防，而不必象食療和運動一樣依賴於人的意志。
神經疾病和神經變性疾病
神經疾病和神經變性疾病影響了數以百萬的美國人。這包括抑鬱症、強迫性神經疾病、阿爾茨海默氏病、過敏、厭食、精神分裂症，以及其它由神經遞質水平的不適當的調節或免疫系統功能不適當的調節導致的神經性病症，以及如ADD(注意力缺陷障礙)和ADHD(注意缺陷障礙[伴多動])等行為失常。大量的這類疾病似乎都有ROS毒性作為其神經細胞破壞基本機理的重要組成部分，包括，但不限於，肌萎縮性側索硬化(ALS，或Lou Gehrig’s病)、帕金森氏病和阿爾茨海默氏症。
缺血-再灌注損傷
當某個器官缺少血液供應(缺血)時會被損傷，這不僅是由暫時性缺氧導致，還由與再灌注血液恢復供應時而再引入的氧發生反應所產生的ROS所導致。在某些臨床表現中，這種損傷可通過施用抗氧化劑而預防，給藥有時甚至可在缺血期後，但要在再灌注之前。例如，在含有抗氧化劑和其它試劑的溶液中保存腎臟、肝臟及其它器官如今是移植前的常規程序。另一個例子是心臟外科手術中阻止心跳前阻斷自由基產生酶功能的藥物的應用。這些藥物輔助預防當心臟重新啟動和血流恢復後的再灌注損傷。這種再灌注損傷機制還被發現在外傷、大手術或休克後的多器官衰竭病人中起重要作用。多器官功能衰竭目前是重症護理室中最主要的致死因素，正進行廣泛努力以更好地了解ROS是如何在此症候中起作用的。
衰老
衰老是一個非常複雜的科學認識尚相對模糊的過程。目前有證據表明衰老是一系列的過程，即，一系列受控的機制，並不僅僅是長年累月裡磨損和損傷的被動積累。如果衰老是一系列的過程，這些過程中的一些是可能被控制的，或至少是可更改的。這些過程中最重要者包括由自由基和其它ROS介導的分子損傷的積累。最近的研究顯示ROS代謝的治療操作確實能夠顯著地延長小鼠的總壽命。
孤獨症
已開發了許多不同的對孤獨症的治療方法。然而這些治療方法中許多都是針對疾病的症狀而不是原因。例如，從精神分析學到精神藥理學的療法已被應用於孤獨症的治療。儘管某些臨床症狀可經這些治療而減輕、案例中的較小部分顯示最好也只不過是有一定的改善作用。只有一小部分孤獨症患者變得能夠象自信的成年人那樣生活。
在初步研究中，一種
基的營養補充劑被提供給一個言語非常有限的孤獨症兒童，隨後報導該兒童的言語有了顯著提高。
環加氧酶抑制劑的性質和應用
本發明鑑定出兩個科的棕櫚樹(
和Jucara)的果實，對環加氧酶的兩種異構體，COX-1和GOX-2，都具有顯著的抑制功能。環加氧酶(有時稱作前列腺素內過氧化物合酶)與前列腺素的合成有關。COX-1表達被認為是組成型的，因為觀察到基底水平的COX-1的mRNA和蛋白的存在並產生前列腺素以完成正常的生理功能。相反地，COX-2的表達是誘導型的。
根據本發明，
果實和Jucara果實、果汁、營養補充劑、和其它由
果實和Jucara果實衍生的物質用於治療、逆轉、和/或預防與環加氧酶活性增加相關的疾病或損傷。
胃十二指腸黏膜防禦
胃上皮處於一系列內生性有毒因子的持續攻擊之下，這些因子包括HCl、胃蛋白酶原/胃蛋白酶、和膽汁酸鹽。此外，穩定的外源性物質流如藥物、酒精、細菌遇到胃黏膜。一個高度複雜的生物系統在適當地提供防禦以避免黏膜損傷或修復可能發生的損傷。
前列腺素類在胃上皮防禦/修復中起重要的作用。胃黏膜含有豐富的前列腺素。這些花生四烯酸的代謝物調節黏膜碳酸氫鹽和粘液的釋放，抑制胃壁細胞分泌，並對保持黏膜血流和周圍細胞重建很重要。前列腺素類是衍生自酯化的花生四烯酸，該酸由磷脂(細胞膜)經磷脂酶A2的作用而形成。控制前列腺素合成中限速步聚的一個關鍵酶是環加氧酶(COX)，該酶以兩種異構形式存在(COX-1，COX-2)，每一種都在結構、組織分布和表達上有獨特的特徵。COX-1在包括胃、血小板、腎和內皮細胞等的組織宿主內表達。此異構體能組成型的方式表達並在保持腎功能完整、血小板聚集和胃腸黏膜完整中起重要作用。相反地，COX-2的表達可被炎症刺激所誘導，而且它被表達於巨噬細胞、白細胞、成纖維細胞和滑膜細胞中。用於組織炎症的非類固醇類消炎藥(NSAIDs)的有益效果歸因於COX-2的抑制。COX-2-抑制劑具有將胃腸道毒性最小化的同時提供降低組織炎症的有益效果的潛力。
類風溼性關節炎
類風溼性關節炎(RA)是一種不明病因的慢性多系統疾病。儘管有許多系統性表現，RA的典型特徵是持續性炎性滑膜炎，通常涉及對稱分布的外周關節。滑膜炎炎症導致關節破壞和骨腐蝕及繼發性關節完整性改變的可能是此病的標誌。
RA醫學處理的第一步是應用非類固醇類抗氧化藥物(NSAIDs)和簡單鎮痛劑以控制局部炎症進程的症狀和跡象。這些藥劑在減輕病徵和症狀上是快速有效的，但它們在疾病的發展上似乎只有很小的效果。NSAIDs阻斷了Cox酶的活性並因此阻斷了前列腺素類、環前列腺素、和血栓素類的生成。結果，它們具有了鎮痛、消炎和退熱的功能。此外，這些藥劑可能發揮其它消炎效用。由於這些藥劑都與廣泛的毒副作用譜有關，本發明的天然營養補充劑組合物可提供NSAIDs的無毒替代物。
癌症
環加氧酶已在許多癌症中有所研究，COX-1或COX-2似乎在幾種癌症形式中有作用。例如，COX-1和COX-2都顯示出在肺癌小鼠中被高度表達(Bauer等.，2000，Carcinogenesis 21，543-550)。據報導COX-1在人巨噬細胞中被菸草致癌物質所誘導並與NFκB的激活相關(Rioux&Castonguay，2000，Carcinogenesis 21，1745-1751)。據報導COX-1但不是COX-2在人卵巢癌中被表達(Dor et al.，1998，J.Histochem.Cytochem.46，77-84)。根據Ryu等人(2000，Gynecologic Oncology 76，320-325)的研究，COX-2的表達在子宮頸癌一期的表達很高。據報導COX-2在人子宮頸癌中被過量表達(Kulkami et al.，2001，Clin.Cancer Res.7，429-434)。最後，據報導COX-1在子宮頸癌中被正調控並提議用COX-1抑制劑來治療子宮頸腫瘤病症。Sales等，US專利申請20030220266。
根據本發明，
果實和Jucara果實、果汁、營養補充劑、和其它由
果實和Jucara果實合成的物質用於治療、逆轉、和/或預防與環加氧酶活性增加相關的癌症。
藥用組合物和製劑
本發明的水果基營養補充劑可單獨用於飲料、保健品、輸注液、或食物原料，或與其它營養補充劑或治療劑相結合。本發明的水果基營養補充劑可單獨使用或進一步與藥用化合物、載體、或具有有利傳遞性能(即適於傳遞給受試者)的輔劑製成製劑使用。這樣的組合物典型地包含本發明的水果基營養補充劑和藥用載體。此處術語「藥用載體」傾向於包括任何及所有與藥用相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌化合物、等滲和緩釋化合物，以及類似物質。合適的載體見述於最新版的Remington′s藥學》，業內的標準參考書，在此一併作為參考。這種載體或稀釋劑的優選實施例包括，但不限於，水、生理鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液、以及5％人血清白蛋白。脂質體和非水性載體如非揮發性油也可使用。用這些介質和化合物製備藥學活性物質是業內周知的。除非任何常規介質或化合物與該活性成分不相容，否則將其用於此組合物都是計劃中的。附加的活性化合物也可被結合到此組合物中來。
本發明的藥用組合物製成與計劃施用途徑相容的製劑。施用途徑的例子包括口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。pH可用酸或鹼調節，如鹽酸或氫氧化鈉。
口服組合物通常包括一種惰性稀釋劑或可食用載體。它們可被包被於凝膠膠囊、囊片中或壓縮至片劑中。為了達到經口治療施用的目的，本發明的水果基營養補充劑可整合於賦形劑中並以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。口服組合物還可利用流動載體製備以用作漱口劑，其流動載體中的化合物經口應用發出嗖嗖聲(swished)並被吐出或咽下。藥物相容性粘合化合物，和/或賦形物質可包括進來作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑之類可含有任意的下列組合物，或具相似性質的化合物粘合劑如微晶纖維素、西黃蓍膠、或凝膠；賦形劑如澱粉或乳糖，分散劑如海藻酸、Primogel、或玉米澱粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠狀二氧化矽；甜味化合物如蔗糖或糖精；或調味化合物如薄荷、水楊酸甲酯、或橙味劑(orange flavoring)。
本發明中水果基營養補充劑也可製成栓劑形式的藥用組合物(如，與常規栓劑基質如可可脂和其它甘油酯一起)或用於直腸傳遞的保留灌腸劑。
在一個實施方案中，本發明的水果基營養補充劑與能保護化合物不被機體快速清除的載體共同製備，這些載體如可控釋放製劑，包括植入物和微囊傳遞系統。可使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類(polyorthoesters)、和聚乳酸。製備這些製劑的方法對專業技術人員將是熟知的。這些材料還可從Alza公司和Nova醫藥公司以商業途徑獲得。Liposomal懸液也可用作藥用載體。這些可根據業內周知的方法製備，例如，如美國專利No.4,522,811中所述。
製成劑量單位形式的口服製劑或腸道外製劑對易於施用和劑量均勻特別有利。術語劑量單位形式指適合作為對治療對象的單位劑量的物理不連續的單元，每個單位包含經計算與所需藥用載體聯合能產生理想治療效果的預定劑量的活性化合物。本發明劑量單元形式的規格確定於和依賴於水果基營養補充劑的獨特性質和要獲得的特定治療效果，以及這些個體治療用活性化合物混合技術中固有的限制。藥用組合物可與施用說明書一起置於容器、包裝或分配器內。
本發明經參考下面實施例進一步說明，這些實施例並不意味著限制本發明的範圍。本領域技術人員將熟知許多修改，無論是對材料還是方法，可在不偏離本發明目的和權利的情況下實施。
實施例
實施例1凍幹
的組成分析
凍幹
OPTACAI；Lot#231003/0410-C的組分分析詳述於下面表1和表2。
表1
表2
除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的含水量依AOAC方法參考#926.08測定。待測樣品蛋白含量依AOAC方法參考#991.20E測定。待測樣品脂肪含量依AOAC方法參考#933.05測定。待測樣品灰分含量依AOAC方法參考#935.42測定。待測樣品碳水化合物含量根據差異計算。待測樣品的熱量含量應用Atwarter因子計算。糖含量用AOAC方法參考#982.14測定。待測樣品內總食物纖維素用AOAC方法參考#991.43測定。待測樣品膽固醇含量用AOAC方法參考#994.10測定。待測樣品脂肪酸譜用AOAC方法參考#969.33測定。待測樣品鈉、鈣和鐵含量用AOAC方法參考#984.27測定。待測樣品內維生素C含量用AOAC方法參考#967.22測定。待測樣品內維生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法測定。微生物測定基本按實施例36(見下文)中所詳述進行。痕量礦物質/金屬用IBC實驗室(Integrated BiomoleculeCorporation，Tucson，AZ)的IPC/MS(Aligent HP-7500a)方法分析。
實施例2 凍幹
組成分析
凍幹
FD漿果粉(lot# 231003/0410-C)成分分析由IBC實驗室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)進行。結果詳見下面表3。
表3
除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的含水量依AOAC方法參考#926.08測定。待測樣品蛋白含量依AOAC方法參考#991.20E測定。待測樣品脂肪含量依AOAC方法參考#933.05測定。待測樣品灰分含量依AOAC方法參考#935.42測定。待測樣品碳水化合物含量根據差異計算。待測樣品的熱量含量應用Atwarter因子計算。糖含量用AOAC方法參考#982.14測定。待測樣品內總食物纖維素用AOAC方法參考#991.43測定。待測樣品膽固醇含量用AOAC方法參考#994.10測定。待測樣品脂肪酸譜用AOAC方法參考#969.33測定。待測樣品鈉、鈣和鐵含量用AOAC方法參考#984.27測定。待測樣品內維生素C含量用AOAC方法參考#967.22測定。待測樣品內維生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法測定。痕量礦物質/金屬用IBC實驗室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)的IPC/MS(AligentHP-7500a)方法分析。
實施例3凍幹
營養分析 [O117]一份100克凍幹
的營養分析由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547501)進行。結果詳見於下面表4。
[O118]表4
除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的含水量依AOAC方法參考#926.08測定。待測樣品蛋白含量依AOAC方法參考#991.20E測定。待測樣品脂肪含量依AOAC方法參考#933.05測定。待測樣品灰分含量依AOAC方法參考#935.42測定。待測樣品碳水化合物含量根據差異計算。待測樣品的熱量含量應用Atwarter因子計算。糖含量用AOAC方法參考#982.14測定。待測樣品內總食物纖維素用AOAC方法參考#991.43測定。待測樣品膽固醇含量用AOAC方法參考#994.10測定。待測樣品脂肪酸譜用AOAC方法參考#969.33測定。待測樣品鈉、鈣和鐵含量用AOAC方法參考#984.27測定。待測樣品內維生素C含量用AOAC方法參考#967.22測定。待測樣品內維生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法測定。
實施例4凍幹Jucara果實的營養分析
100g份量凍幹Jucara果實的營養分析由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378581)進行。結果詳見於下面表5。
表5
除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的含水量依AOAC方法參考#926.08測定。待測樣品蛋白含量依AOAC方法參考#991.20E測定。待測樣品脂肪含量依AOAC方法參考#933.05測定。待測樣品灰分含量依AOAC方法參考#935.42測定。待測樣品碳水化合物含量根據差異計算。待測樣品的熱量含量應用Atwarter因子計算。糖含量用AOAC方法參考#982.14測定。待測樣品內總食物纖維素用AOAC方法參考#991.43測定。待測樣品膽固醇含量用AOAC方法參考#994.10測定。待測樣品脂肪酸譜用AOAC方法參考#969.33測定。待測樣品鈉、鈣和鐵含量用AOAC方法參考#984.27測定。待測樣品內維生素C含量用AOAC方法參考#967.22測定。待測樣品內維生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法測定。
實施例5凍幹
粉中甾醇類的定量分析
凍幹
粉(#001
Powder；Flora ID No.210823003)中甾醇成分用高分辨氣相色譜(HRGC)(Flora Research Laboratories，Grand Pass，OR)測定，如表6所述。
表6
待測樣品中固醇含量用配備了FID和自動進樣器的HewlettPackard 5890 II系列氣相色譜儀測定，採用INA方法109.001。用5-α-膽甾烷作標準物(Matreya，Inc.Pleasant Gap，PA)。這些分析所用的柱子是Restek Rtx-5，5％二苯基-95％二甲基聚矽氧烷，60m×0.25mm，0.25μm膜厚。
實施例6凍幹
殘留水含量(Residual Humidity)分析
製劑的殘留水含量在凍幹前後用Instituto Adolfo Lutz(1976)(UNIVERSIDADE DE
PAULO，Faculdfáde do Ciencias FarmacéuticasDenartamento de Alimentos e Nutricilio Experimental Laboratorio de Analistede Alimentos)方法測定。
果漿粗製品的水含量為85.37+/-0.14％。凍幹
果漿的殘留水含量為1.06％。antocianinas總共(mg/100g
果漿)為239.32+/-0.74，用Francis & Fuleki，(J.Food Sci，V.33，p.72-77，1968)方法測定。圖1顯示了凍幹
粉的典型吸收譜。
實施例7 Jucara和
製劑中花色素苷和酚類化合物分析
I.概述
A原花色素類(proanthocyanidins)
原花色素可能有助於解釋「法國悖論」，或為什麼低冠心病發病率存在於法國以脂肪類食物和紅酒消費高而知名的省份中。紅酒可被認為是一些有效的黃酮類化合物的酒精浸出液，這些黃酮類化合物包括葡萄籽中的原花色素類。在一個挑戰性的研究中，Fulvio Ursini，M.D.，來自義大利Padova大學，對志願者餵以配有或不配有紅酒的高脂肪餐。他發現在那些喝紅酒者體內餐後血漿內過氧化物水平要低得多(Ursini F，等Post-prandial plasma peroxidesa possible link between diet andatherosclerosis.Free Rad Biol Med 1998；25250-2.)。
伴有疫學證據的一系列動物和體外研究以及少量的初級人體研究揭示了與這些化合物相關的大量保健效果。這些益處中主要的是對心臟病和癌症的抗氧化性保護。
原花色素類-更專業地稱為原花色素低聚物，並由此稱為OPC-是一類黃酮類化合物。以前稱為「縮合單寧」，所有原花色素都是化學相似的，區別僅在於它們聚酚環的形狀及連接物的輕微變化。自然中，一大堆不同的原花色素總是被同時發現，範圍從單個單元到許多相連單元(低聚物)的複雜分子。
原花色素是一組高度特異的生物類黃酮，從1960年代後期開始因其血管壁增強功能和自由基清除活性而得到廣泛研究。原花色素是已知最具潛力的自由基清除劑，具有比維生素E高達50倍和比維生素C高達20倍的抗氧化能力。原花色素還具對細胞膜的親和性，這為降低毛細血管通透性和脆性提供了營養支持。儘管生物類黃酮在自然界中廣泛分布，強效的原花色素化合物是最豐富的並可從海岸松樹皮和葡萄種子或果仁中得到。
歐洲越桔浸出物含有聲稱具增視功能和已證明有血管增強功能的花色素類。據稱歐洲越桔能降低視覺疲勞並通過其對視紫紅質-視蛋白系統的親和而改善從亮處到暗處的調節性，視紫紅質-視蛋白系統是介導亮和暗視覺和昏暗處視覺適應的色素系統。然而，在以色列和美國做的兩項軍用研究並未能從歐洲越桔浸出物中發現任何這種好處。無論如何，該浸出物可能促進了視網膜自身的酶學抗氧化防禦。
在血管系統中花色素浸出物通過增加細胞內維生素C水平來支持血管壁的完整性，降低了某些蛋白水解酶/溶酶體酶的透化效果，穩定細胞膜，並刺激膠原和結締基質組織的合成。
葡萄籽(種子)是原花色素或pycnogenols的潛在資源。JacquesMasquelier，Ph.D.，原花色素研究的開創者和術語″pycnogenol″的創造者，在其第二階段的原花色素研究中使用了葡萄種子浸出物。
體外研究認為OPC類還提供了癌症保護。Vaccinium-科漿果中的OPC類，包括藍莓、越橘(lingonberry)和酸果蔓，能阻斷腫瘤生長，這通過阻止腫瘤細胞內蛋白合成而防止其增殖而實現(Bomser J，和Madhavi D.L.In vitro anticancer activity of fruit extracts from Vacciniumspecies.Planta Med，1996；62212-6.)。同樣是在實驗室中，大麥麩中的OPC使為骨髓白血病細胞轉變為非癌性(Tamagawa K，和Fukushima S.Proanthocyanidins from barley bran potentiate retinoic acid-inducedgranulocytic and sodium butyrate-induced monocytic differentiation of HL60cells.Biosci Biotechnol Biochem，1998；621483-7.)。另一個體外實驗發現一種獲得專利的葡萄種子浸出物殺死了癌細胞，抑制了人乳腺癌、肺癌、胃癌和骨髓性白血病細胞的達73％的細胞生長，並提高了正常細胞的生長(Ye，X.和Krohn.R.L.The cytotoxic effects of a novel 1H636 grape seedproanthocyanidin extract on cultured human cancer cells.Mol Cell Biochem，1999；19699-108.)。
原花色素可保護機體免受許多潛在毒性試劑的損傷。醋氨酚，泰諾林TM中的活性組合物，是潛在的肝毒素，在美國每年導致75,000例需住院治療的中毒。動物實驗顯示用100mg/kg的一種專利葡萄種子浸出物預處理一周防止了醋氨酚對肝臟的損傷。器官的損傷通過研究肝細胞受損狀況和監測動物的健康來評估(Ray SD，等A novel proanthocyanidin 1H636 grape seed extract increases in vivo bcl-XI expression and preventsacetaminophen-induced programmed and unprogrammed cell death in mouseliver. Arch Biochem Biophys.，1999；369(1)42-58.)。
原花色素類可能比預防疾病做得更多；它們能幫助延緩衰老並減少衰老的可見跡象。氧化損傷導致了我們皮膚上大多數衰老的可見跡象。通過防止這種損傷，皮膚將保持年輕的樣子。達到這個目的的一個方法是減少紫外(UV)線的損傷效果。防曬產品已經合併了多種抗氧化劑意在它們將防止陽光對皮膚的損傷。在一項研究中，葡萄種子的OPC類獨自發揮了與維生素E有相同效果的抗氧化作用一可保護不同多不飽和脂肪酸免受紫外線導致的過氧化反應(Carini M.，等The protection ofpolyunsaturated fatty acids inmicellar systems
UVB-inducedphoto-oxidation by procyanidins from Vitis vinifera L.，and the protectivesynergy with vitamin E.Infl J Cosmetic Sci.，1998；20203-15.)。同樣是在該研究中，葡萄源OPC類與維生素E協同作用，使其失活形式轉變為活性形式並因此起到有效的維生素E補充劑的作用。
衰老過程的一部分是彈性蛋白酶對皮膚的降解，該酶與炎症反應有關。OPC類特異性地阻斷彈性蛋白酶，因此保持了彈性蛋白的完整性(Meunier MT，和Villie F.The interaction of Cupressus sempervirens L.proanthocyanidoiic oligomers with elastase and elastins.J Pharm Beig.，1994；49453-61.)。
如果動物實驗的結果可適用於人類，OPC類甚至能幫助長出一頭更濃密的頭髮。日本研究者給小鼠剃毛後發現它們毛髮中的40％能自然生長回復。然而，當將三種花色素中的任一種的1％溶液施用於皮膚，70％到80％的毛髮生長回復了。試管實驗證實OPC類確實刺激了毛髮角質形成細胞生成比對照多三倍的毛髮(Takahashi T，et al.Procyanidin oligomersselectively and intensively promote proliferation of mouse hair epithelial cellsin vitro and activatehairfollicle growth in vivo.J Invest Dermatol.，1999；112310-6.)。
B.酚類化合物藤黃菌素-4』-葡萄糖苷
抑制巨噬細胞中促炎症反應細胞因子的生成。抗癌類黃酮毒性真核DNA拓撲異構酶I
II.凍幹JUCARA粉中花色素苷的測定
凍幹Jucara粉中的花色素苷譜用LC/MS/MS測定並顯示於圖2。圖2中LC/MS/MS的峰結果總結於表7。
花色素苷和OPC分析(酚類化合物)按下面詳述進行。簡要地，粉狀樣品同時差別地被水和乙酸乙酯萃取。收集各層並過濾除去固體。完整的花色素苷從水層用HPLC在Zorbax 5μm 150×4.6mm的C-18柱上以梯度流動相(1ml/分鐘流量)分析，流動相包括A(0.5％磷酸)、B(水∶乙腈∶乙酸∶磷酸-50∶48.5∶1∶0.5)，梯度程序為初始100％A，20分鐘80％A，30分鐘40％A，36分鐘80％A。用外部標準物進行定性/定量。低聚原花色甙從乙酸乙酯層在蒸發乾燥並復溶於無水乙醇後分析。色譜在Phenyl-hexylLuna 3μm 250×3.5mm柱上用梯度流動相進行，流動相包括。A(水∶乙腈∶乙酸-89∶9∶2)、B(水∶乙腈-20∶80)，梯度程序為初始100％A，25分鐘60％A，32分鐘100％B，40分鐘100％A。通過基於母體表兒茶酸和兒茶酸環結構的消光係數的原理進行鑑定/定量。
表7
凍幹Jucara粉中的花色素苷類的結構見圖3
III.凍幹
粉中花色素苷的測定
凍幹
粉中的花色素苷譜用LC/MS/MS測定並顯示於圖4。圖4中LC/MS/MS的峰結果概括於表8。
表8 依前所述進行分析
凍幹
粉中的花色素苷類的結構見圖5。
IV.凍幹Jucara粉和凍幹
粉中花色素苷的含量
凍幹Jucara粉和凍幹
粉中花色素苷的含量概括於表9。
表9花色素苷的含量
依前所述進行分析。
V.凍幹Jucara粉中各種酚類的鑑定
用HPLC和質譜分析凍幹Jucara粉中各種酚類譜系並示於圖6。
圖6中的HPLC峰結果概括於下面表10。
表10酚類峰鑑別及其質譜數據
凍幹Jucara粉中存在的各酚類化合物的結構顯示於圖7。凍幹
粉中未發現有大量的酚類化合物。分析依前文所述進行。
VI.凍幹
粉和凍幹JUCARA粉中原花色素類的測定
凍幹
粉和凍幹Jucara粉的原花色素類譜用色譜法測定並顯示於圖8。如圖8所詳示，原花色素譜。B1是表兒茶精和兒茶素。從B2到B8的峰代表從二聚體到八聚體的B類原花色素苷。A2是由質譜顯示具有一個A類黃烷間鍵的二聚物。圖8所顯示的峰結果總結於表11。
表11凍幹樣品中的原花色素含量
Jucara含有非常高水平的原花色素，以及，抗羥基自由基和過氧化亞硝酸鹽的高抗氧化活性。圖9顯示了凍幹
粉和凍幹Jucara粉中檢測到的原花色素類的典型結構。分析依前文所詳述進行。
實施例8凍幹
漿果粉中花色素苷含量組成分析
凍幹
FD漿果粉(lot# MAL001)中花色素苷成分的分析由IBC實驗室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)完成。結果詳示於下面表12。
表12
花色素苷和OPC分析依Brunswick實驗室所用方法進行。簡要地，粉狀樣品同時分別用水和乙酸乙酯萃取。收集各層並過濾除去固體。完整的花色素苷從水層用HPLC在Zorbax 5μm 150×4.6mm的C-18柱上以梯度流動相(1ml/分鐘流量)分析，流動相包括A(0.5％磷酸)、B(水∶乙腈∶乙酸∶磷酸-50∶48.5∶1∶0.5)，梯度程序為初始100％A，20分鐘80％A，30分鐘40％A，36分鐘80％A。用外部標準物進行定性/定量。低聚原花色甙從乙酸乙酯層在蒸發乾燥並復溶於無水乙醇後分析。色譜在Phenyl-hexyl Luna 3μm 250×3.5mm柱上用梯度流動相進行，流動相含有A(水∶乙腈∶醋酸-89∶9∶2)B(水∶乙腈-20∶80)，採用下述程序-初始100％A，25分鐘60％A，32分鐘100％B，40分鐘100％A。通過基於母體表兒茶酸和兒茶酸環結構的消光係數的第一原理進行鑑定/定量。
實施例9凍幹
的脂肪酸分析
凍幹
果漿的脂肪酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547512)完成。結果詳述於表13、表14和表15。
表13
表14
表15
除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis of AOAcIntemational，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的脂肪酸譜依AOAC方法參考#969.33測定。
實施例10凍幹Jucara果實的脂肪酸分析
凍幹Jucara果實的脂肪酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378575)完成。結果詳述於表16、表17和表18。
表16
表17
表18
除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis of AOAcInternational，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的脂肪酸譜依AOAC方法參考#969.33測定。
實施例11凍幹
的胺基酸分析
通過離子交換色譜和柱後衍生化分析胺基酸
胺基酸分析依下述常規步聚進行。
A.原理
本方法用6N鹽酸水解後再用離子交換色譜定量測定胺基酸含量。鄰苯二甲醛(O-phthaldehyde)被用於柱後衍生及隨後的螢光檢測。
B.範圍
本方法適用於配料、含有混合飼料蛋白的物質。
f0190]C.關鍵點
乾燥樣品時避免蒸發時間過長。可能會發生某些胺基酸的損失。
D.試劑和藥品及方法 1.水，HPLC級，EM Science EM WA0004-1或家用水純化系統 2.鄰苯二甲醛，試劑級，Anresco 0317。
3.胺基酸標準溶液，2.5pmol/mL，Sigma A9531。
4.甲醇，HPLC級，chempure 831-295或相當產品 5.Brij 3溶液，30％(w/w)，Sigma 430Agr.6 6.2-巰基乙醇，(2-羥基乙硫醇)，Sigma M-6250。
7.L-正亮氨酸，SigmaN-6877。
8.皮氏緩衝液，pH 2.2、3.28和7.40，Picketing laboratories Na 220、Na 328和Na 740。
9.氫氧化鉀，顆粒，Chempure 831-706。
10.氫氧化鈉，顆粒，Chempure 832-050。
11.鹽酸，6N標準溶液，Chempure RR-155。
12.乙二胺四乙酸EDTA四鈉鹽，水合物，Sigma ED4SS。
13.氮源 14.硼酸，Chempure 830-314。
15.正亮氨酸內標-在分析天平上稱重0.1mg，0.1640g的正亮氨酸。轉移到1000mL容量瓶中。加入250mL HPLC級水。加入1mL濃鹽酸並混勻。用HPLC級水補齊體積，混合併超聲處理。此溶液將含1.25 pxn/mL L-正亮氨酸。冷藏以避免細菌生長。
16.胺基酸標準溶液-將胺基酸標準溶液瓶暖至室溫。吸取5.0 mL到50ml容量瓶中。吸取10.0mL的1.25pm/mL L-正亮氨酸內標到相同的50ml容量瓶。用HPLC級水補齊體積。充分混全並超聲處理幾分鐘。轉移標準溶液入4mL Waters樣品瓶中，0℃保存。
17.氫氧化鉀溶液，50％-在最大載量天平上，稱150g的氫氧化鉀置入稱重過的1升Nalgene容器中。用150g去離子水溶解，如有必要則攪拌。用前使溶液冷卻至室溫。
18.硼酸緩衝液-稱122克硼酸入稱重過的2000ml燒杯並加入1800ml的HPLC級水。用50％氫氧化鉀溶液調pH到11.0。轉移此溶液至4升玻璃水壺中用HPLC級水充滿(4升)並充分混合。終溶液的pH應在10.4。
19.皮氏緩衝液流動相 a.pH 3.28-此緩衝液可從瓶中取出使用。用0.45pm過濾膜過濾並在用於HPLC前真空超聲脫氣。
b.pH 7.40-此緩衝液可從瓶中取出使用。用0.45pm過濾膜過濾並在用於HPLC前真空超聲脫氣。
20.氫氧化鈉，0.2N-稱16克氫氧化鈉顆粒入一個2升容量瓶。加入約1000mL HPLC級水並混合至氫氧化鈉溶解。稱0.5g EDTA，加入此容量瓶。用HPLC級補劑體積，混合併用0.45mm濾膜過濾。用塑料加侖壺作為HPLC用的容器。定期過濾。
21.鄰苯二甲醛-稱1.4g鄰苯二甲醛(OPA)晶體入50mL燒杯。加20mLHPLC級甲醇並超聲處理至晶體溶解。將溶液加入到一個約含1500ml硼酸緩衝液的2升容量瓶中混勻。在通風櫥中，加入4.0mL 2-巰基乙醇(惡臭！)。用硼酸鹽緩衝液補齊體積並混勻。用0.45pm濾器過濾溶液。將濾過的溶液傾入兩個1升的Nalgene瓶中並在每個瓶中加3.0mL Brij-35。用氮蓋住瓶子並充分混合。冷藏至需用。OPA溶液在此條件下穩定約1周(可延長至2周)。
E.設備及儀器 1.Waters 712B型自動注射器或等價產品。
2.Waters 6000型泵(2)，Water 2100或等價產品。
3.Digital Pro380附Waters Expert軟體或等價產品。
4.Kratos FS-950螢光檢測器或等價產品。
5.Kratos URS 051柱後泵或等價產品 6.Fiatron柱加熱器，Eppendorf CII-30或等價產品。
7.Fisher Isotemp爐，215P型或等價產品。
8.Savant Speed Vac濃縮器，SVC-20011型。
9.Savant冷凝疏水器，RT-490型。
10.Savant化學疏水器，SCT-120型。
11.Savant一次性酸蒸汽中和倉，DC12OA型。
12.Precision直驅真空泵，Dd-310型或等價產品。
13.真空計，Waters Pico-Tag工作站或等價產品。
14.Glass-Col小型脈衝旋渦器，58216型或等價產品。
15.Beckman pH140計，Beckman 123118或等價產品 16.Mettler分析天平，AE16O型或等價產品 17.Millipore溶劑過濾器，Waters 85116 18.Interaction-載鈉離子交換柱，帶保護柱。Interaction色譜儀AMI 1. 19.Bransonic超聲水浴220型 20.Mettler頂加載天平，P-1000型 21.Pipeman。Gilson，1ml和5ml，Rainin P4000和P-5000 22.通用lit pipes槍頭，1mL SoS mL，Rainin 23.帶Luer-Lok的Plastipak注射器，3cc×1/10cc，BI)9585或等價產品。
24.針式濾器，聚丙烯，聚四氟乙烯，0.45微米，Nalgene 199-2045。
25.Magna尼龍66膜，47mm直徑，0.45微米孔徑，Fisher N045PO410。
26.RepipetII分配器，S mL，Fisher 13-687-62A。
27.Universal fir pipes槍頭，200-100C)d.VWR 53508-819。
28.一次性培養管，12×75mm，硼矽酸鹽玻璃，VWR 60825-550或等價產品。
29.樣品瓶組，4mL，包括接頭和PFET隔膜，Waters 73108 30.帶彈簧的低體積插入物，塑料，4mL樣品瓶用，Waters 72163。
31.Firestone閥，快速衝洗，Ace Glass mc，8766 32.培養管，一次性，20×150mm，螺口蓋，硼矽酸鹽玻璃，VWR60826.280。
33.一次性培養管的螺口蓋，20mm 0])，PTFB墊，VWR 60828-570。
34.Brinkman離心磨碎機，ZM-1型(帶0.5ruin screen)或等價產品。
F.樣品製備
樣品被儘可能研磨細以保持最小失水。用Brinkman離心磨碎機(型號ZM-1)或等價產品研磨樣品，用0.5mm篩得到研細的研磨物。
G.步驟 1.分析天平校正並歸零。
2.在胺基酸分析稱重前對樣品的蛋白含量有所了解是有幫助的。對此有所了解後，在分析天平上稱出相當於含20mg蛋白的樣品(參見FreeAmino Acid Determination附錄)。對於幾乎純淨的樣品，稱大約38mg。在實驗室記事本上記錄所稱重量。樣品隨後定量地轉移入有標記的20×150旋轉螺口培養管。
3.用Repipet II分配器，將15mL 6N鹽酸加入每個培養管。因為樣品經過研磨且數量很少，避免使用可能造成培養管內樣品損失的汲出(drafts)。
4.在通風櫥內，將75微升2-巰基乙醇加入每個培養管(注1)。這能夠更好的測定L-蛋氨酸峰。
5.將每個培養管firestone化(注2)，在氮氣(10-12 psi)和真空間至少每種切換5次。
6.樣品在氮下時旋上PTFE-表面的蓋子。
7.培養管置於爐內110℃±2℃24小時。
8.組裝Savant蒸發系統。使用前至少2小時前開啟系統電源，這樣冰箱單元才能有足夠的時間達到-92℃的工作溫度。真空泵油徹底脫氣。如果需要，這一點通過打開泵上載氣閥和打開泵進行。通常一小時是足夠的。完成後合上載氣閥並關閉泵。
9.24小時後，從爐中取出培養管並冷卻至室溫。
10.向每個培養管中加入5mL HPLC級水。旋上蓋子充分混合。
11.向每個培養管中加入5mL正亮氨酸內標(1.25 pm/mL)(注3)。(在此如必要的話分析可暫停至下一天進行。如需保存過夜則將培養管保存於0℃。) 12.使用1mL的pipetman，將2mL水解產物轉移至有標記的12×75mm一次性培養管。
13.打開高速真空濃縮器的蓋子，將含2mL水解產物的試管圍繞轉子置入位置以使負載良好平衡。
14.關上蓋子，打開通風口開始離心。當轉子達到其操作轉速進時，關閉真空計的通風口打開真空泵。如有必要，蒸發過程可能需過夜進行。當在一天的晚些時候蒸發許多樣品將會是這樣。
15.樣品乾燥後(真空計讀數小於500毫升)，緩慢打開通風口向箱內通入空氣。關閉泵，當箱內徹底通氣後立即關閉離心機，取出試管。
16.將3mL皮氏鈉稀釋劑220加入每個試管並在旋渦混合前作短暫超聲處理。
17.在3mL注射器上附0.45pm濾器。製備的水解產物濾至一個有標記的含有帶彈簧的Waters低體積插入物的4mL小瓶中，然後置於712B上。
18.HPLC條件 a.所有緩衝液和OPA溶液真空超聲脫氣。緩衝液管置入相應的緩衝液中，OPA管置入OPA溶液中。用3.28緩衝液以0.5mL/分鐘的流速平衡柱子至少20分鐘。
b.螢光計的靈敏度檔設到450，範圍為0.5，時間常數為1秒，背景抑制為′to″。
c.柱加熱器溫度設為60℃並在運行中監控。
d.開啟OPA泵並將流速設為0.50mL/分鐘(如有必要在下遊調節)。
e.將標準樣置於WISP的位置#1和#2上。建立多個方法和/或方法表並注入20 F1標準樣。用60分鐘完成運行。觀察結果的色譜。如色譜不滿意則注射第三次。
f.每測5個樣品作一個標準樣。更新了的響應係數將會產生並被應用於隨後的進樣。
g.如果譜峰超出了窗口，重處理樣品並在校正表中調整保留時間以march該樣品的保留時間。列印並保存更正過的新譜圖。
h.用2種緩衝液進行梯度洗脫使用Waters軟體，用2個緩衝液建立一個令人滿意的梯度以洗脫胺基酸。泵表19如下
表19標準泵表
J.計算 響應因子＝胺基酸量(mg)x正亮氨酸面積(內標) 胺基酸面積 然後RF×樣品胺基酸面積＝胺基酸濃度(mg) 正亮氨酸內標面積 由於樣品體積決定了最終濃度，胺基酸濃度乘以樣品體積＝最終胺基酸濃度
K.注釋 1.如果必要，可以用巰基乙酸替換-如果所用Brij-35不能很好保留Lrs quek。
2.Firestone步驟包括在超聲浴內交替抽空和用氮氣清洗酸-樣品溶液。這使溶液脫氣並在酸上面創造了一個惰性氣體氛圍從而使水解過程中胺基酸的氧化達到最小。
3.用一個5mL的pipetman，用室溫水校至5.000B±0.005g。
4.在良好真空下，樣品會在管內凍結。如果是這樣，約45至60分鐘後，取出試管並在含熱水的燒杯內加熱水解產物。將試管放迴轉子繼續蒸發。
L.確認
M.質量控制 1.依照質量保證手冊中所詳述的標準品質量保證規範 2.對照標準品(第二標準品)應包括於每次樣品檢測中。目前使用酪蛋白作為對照品。
3.對照標準品的結果將被記錄於實驗室記錄本中。
4.標準品重複測定誤差不得超過8％。
5.記錄本由進行檢測的分析員初始化並註明日期。
6.記錄本登記由本部門內另一分析員檢查、了解、初始化並註明日期。
N.參考文獻 1.JAOACVol 65，No.2，1982，pp 496-497.Calculated ProteinEfficiency Ration. 2.Degussa-Literature Digest for the Feedstuffs Industry-Amino AcidAnalysis.Chemie/Anwendungstechnik HanauStadtteil Wolfgang，Fed.Rep.ofGermany. 3.The Peptides，Vol.4，Amino Acid Analysis of Peptides，Ch 5.pp217-259，JR Benson，P.C.Louie and LA.Bradsbaw.Copyright 1981，AcademicPress，Inc. 4.USDA Chemistry Laboratory Guidebook，G-41 5.IAOAGVol.68，No.5，1985，pp811-821.Sample Preparation forChromatography of Amino AcidsAcid Hydrolysis of Proteins.
II.凍幹
果漿的胺基酸分析
凍幹
果漿的胺基酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547512)完成。結果詳見表20。
表20
實施例12凍幹Jucara果實的胺基酸分析
凍幹Jucara果實的胺基酸分析由由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378575；如實施例11所詳述)完成。結果詳見表21。
表21
實施例13用ORACFL分析對凍幹Arai和所選蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析
I.常規ORAC分析
ORAC分析是Cao等人開發，並最初報導於1993年″Cao G，Alesslo HM，Cutler RG，Oxygen radical absorbance capacity assay forantioxidant.Free Rad.Biol.Med.199314303-11″。為使分析過程自動化進行了一些修改並報導於1995年″Automated Assay of Oxygen RadicalAbsorbance Capacity with the COBAS FARA II Guohua Cao，Carl P.Verdon.Akin H.B.WU，Hong Wang和Ronald L.Prior，CLINICAL CHEMISTRY，Vol.41，No.12，1995″。
從那以後，自動化了的ORAC分析得到廣泛覆蓋和應用，並且因此，ORAC值已經變得常見於研究中和天然產物市場。BrunswickLaboratories於1997年購買了兩臺COBAS FARA 11分析儀，複製了由Cao、Prior等人開發的自動化方法，如今，已經建立了一個包含超過5000個點的資料庫，包括了水果、蔬菜、飲料、穀物、功能性/工程性食物、浸出物以及其它天然產品資源的ORAC數據。
Brunswick Laboratories，與USDA一起，引進了一種新的螢光探針，螢光素，在與β-藻紅蛋白進行並行比較下已經在幾百個樣品中進行了檢測。螢光素，不象β-PE，不與待測樣品相互反應，並且作為合成的化合物，螢光素沒有可檢測到的批間差異。最重要的是，在相同條件下進行多次檢測的樣品保持了一致和可重複的結果
以螢光素作為螢光探針的ORAC分析的開發已經通過與初始自動化ORAC分析的開發者們合作而被實施了，初始的自動化ORAC分析以β-PE為螢光探針。基於廣泛的機械化研究，兩個團體都鎖定了基於螢光素的ORAC分析作為新的ORAC方法標準。此處所述這兩種ORAC分析方法通過使用下標區分藻紅蛋白使用PE，ORACPE，螢光素使用FL，ORACFL。
II.對凍幹
粉的分析及其和和所選蔬菜的的比較
用ORACFL分析技術測定比較了凍幹
粉(Brunswick Lab ID.02-0104.；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖10)。凍幹
粉的ORAC值測定為442μmolTE/g。這個值比紫甘藍高出10倍(42μmol TE/g)(圖10)。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例14用ORACFL分析對凍幹
和所選新鮮水果的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了凍幹
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brumswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮水果的抗氧化活性(如上所述)(圖11)。如圖11所示，凍幹
粉的ORAC值(536μmole TE/g)比無論是新鮮
(185μmole TE/g)還是黑樹黴(black raspberry)(164μmole TE/g)的ORAC值都高2倍以上。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例15用ORACFL分析對凍幹
和所選新鮮水果的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了凍幹
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮水果的抗氧化活性(如上所述)(圖12)。凍幹
粉的ORAC值測定為442μmole TE/g。這個值是黑樹黴(164μmole TE/g)的2倍以上。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例16用ORACFL分析對凍幹
和所選水果的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了凍幹
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選水果的抗氧化活性(如上所述)(圖13)。如圖13所示，凍幹
粉的ORAC值為442μmol TE/g。凍幹Jucara粉的ORAC值為1193 TE/g。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例17用ORACFL分析對脫水
和所選新鮮水果的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了凍幹
粉(23100/0410-C；Brunswick Lab ID 03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮水果的抗氧化活性(如上所述)(圖14)。如圖14所示，凍幹Aqai粉的ORAC值(536μmol TE/g)是黑樹黴(164μmol TE/g)ORAC的3倍以上。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例18用ORACFL分析對凍幹
和所選新鮮蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了凍幹
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖15)。如圖15所示，凍幹
粉的ORAC值(536μmol TE/g)是紫甘藍的ORAC值(42μmol TE/g)的10倍以上。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例19用ORACFL，分析對所選水果、蔬菜和堅果的抗氧化能力進行的比較分析
圖16顯示用ORAC分析技術測定的水果、蔬菜和堅果的抗氧化活性(Brunswick Laboratories，Wareham，MA；如上詳述)。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例20用ORACFL分析對凍幹
和所選堅果的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了凍幹
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選堅果的抗氧化活性(如上所述)。凍幹
粉的ORAC值為442μmol TE/g。這個值是美洲山核桃的ORAC值(164μmol TE/g)的4倍以上(圖17)。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例21用ORACFL分析對脫水
和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了脫水
(BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖18)。如圖18所示，脫水
粉的ORAC值(536μmolTE/g)比脫水黑樹黴(340μmol TE/g)ORAC值高。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例22用ORACFL分析對脫水
和所選新鮮蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了脫水
(BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖19)。如圖19所示，脫水
粉的ORAC值(536μmol TE/g)比紫甘藍的ORAC值(42μmol TE/g)高出10倍以上。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例23 ORAChydro分析對脫水水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析
表22總結了脫水水果和蔬菜(Brunswick Laboratories，Wareham，MA)經ORAChydro分析技術測定的抗氧化活性(如上所述)。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
表22
實施例24 ORAChydro分析對脫水水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析
表23總結了脫水水果和蔬菜(Brunswick Laboratories，Wareham，MA)經ORAChydro分析技術測定的抗氧化活性(如上所述)。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
表23
實施例25用ORACFL分析對凍幹
和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析
用ORACFL分析技術測定比較了凍幹
粉末(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Bnmswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖20)。如圖20所示，凍幹
粉的ORAC值(536μmol TE/g)高於脫水黑樹黴的ORAC值(340μmol TE/g)。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例26用Trans-Reveratrol分析對凍幹
粉進行的抗氧化能力分析
凍幹
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性經Trans-Resveratrol分析(如上所述)測定為1.1μg/g。
使用HP1100系列HPLC用HPLC色譜法分析樣品，配有帶2個條形預過濾器和自動取樣器/進樣器的Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl(250×4.6mM)，二元HPLC泵，柱加熱器，二極體陣列檢測器，和螢光探測器。流動相A2是去離子水∶乙腈∶乙酸(89∶9∶2 v/v)。流動相B2是乙腈∶去離子水(80∶20v/v)。所有生物樣品存放於-80℃冷凍機內至分析用。所有乾燥的和水果樣品用20ml甲醇(MeOH)萃取。萃取後的樣品用超聲處理1小時。將所有樣品在4℃下以14000rpm離心5分鐘。以1ml/min的流速用35分鐘的運行時間和10分鐘運行後時間來分析樣品。保留時間大約是26分鐘。梯度如下設置10分鐘處0％B；25分鐘處40％B；32分鐘處100％B；35分鐘處100％B。監測280nm處的光吸收。用HPLC定量化合物是在已知溶液中測定化合物未知濃度的過程。這包括向HPLC注入一系列已知濃度的Resveratrol標準化合物溶液進行檢測。這些已知濃度的譜圖將給出一系列與所注化合物濃度相關的譜峰。
實施例27 Jucara和
製劑中對羥基和過氧化亞硝酸鹽的抗氧化活性分析
I.概述
A.過氧化亞硝酸鹽
過氧化亞硝酸鹽是一氧化氮(NO)和過氧化物的細胞毒產物。過氧化亞硝酸鹽是非常強的氧化劑，比一氧化氮或過氧化物分別作用的毒性大得多。
多種病理與過氧化亞硝酸鹽的形成有關，過氧化亞硝酸鹽是NO和過氧化物反應形成的強氧化劑。此反應是迄今已知最快的NO反應，將兩個相對非反應性的基團轉變為一個更具活性的氧化劑，過氧化亞硝酸鹽。當更多NO生成時，和/或當發生O2-水平上升時，就不可逆地生成過氧化亞硝酸鹽。
過氧化亞硝酸鹽是包含於許多病理生理過程中的強氧化劑。過氧化亞硝酸鹽可在細胞脂膜間自由運輸。過氧化亞硝酸鹽的滲透係數計算值可與水良好比擬並且比過氧化物高約400倍，因此是一種重要的生物效應分子，這不僅是因為其活性，還因為其擴散性(Lee，J.，Maria，S.S.Peroxynitrite rapidly permeates phospholipid membranes.Proc Natl Acad Sci.，1997.)。
考慮到這些，糖尿病、動脈硬化症和缺血-再灌注損傷等病理與以O2水平升高為特點的氧化應激相關，O2-可導致過氧化亞硝酸鹽形成。最近的證據還顯示多種硬化症和阿爾茨海默症與過氧化亞硝酸鹽形成有關。另外，過氧化亞硝酸鹽還包含於缺血和再灌注、敗血症和成人呼吸性窘迫症中。缺血和再灌注相伴於分別由黃嘌呤氧化酶和NAPDH氧化酶活化而導致的過氧化物水平升高。因此，過氧化亞硝酸鹽似乎與許多存在著NO和O2-不平衡的病理有關。過氧化亞硝酸鹽的形成對非特異性免疫很理想，但對在NO的信號傳遞過程中可能不好。
生物學上過氧化亞硝酸鹽從一氧化氮和過氧化物的反應中形成。過氧化物岐化酶(SOD)降低了過氧化物並預防過氧化亞硝酸形成(見我的綜述Pryor，W.A.和Squadrito，G.L.(1995).Am.J.Physio.(Lung Cell.Mol.Physiol.12)268，L699-L722).The chemistry of peroxynitritea productfrom the reaction of nitric oxide with superoxide)。過氧化亞硝酸鹽是強氧化劑，其自身可氧化許多生物分子。然而，在生物系統中，它通常與二氧化碳相結合以形成反應性中間產物，如ONOOCO2-、O2NOCO2-、COO3-和NO2-。在這些中間產物中，只有COO3-和NO2-參與了與生物靶分子的雙分子反應；CO2的加合物ONOOCO2-和O2NOCO2-壽命太短而在能發生雙分子反應前就降解了。
已知由過氧化亞硝酸鹽等導致的氧化應激損傷血管上皮，此過程導致動脈硬化(Thom，S.R.和Ischiropoulos，H.Mechanism of oxidativestress from low levels of carbon monoxide.Health Effects Institute ResearchReport，number 80，1997.)。
B.羥基自由基(hydroxyl radical)
如果自由基的功能是破壞分子和組織，那麼羥基自由基就是自由基中的自由基。它與其路徑上發現的實際上是任何分子以擴散速率發生反應，包括DNA、膜脂、蛋白和糖類等大分子。以DNA來說，羥基自由基可引起鏈斷裂以及脫氧核糖和嘌呤及嘧啶鹼基中的化學變化。
受損傷的蛋白，其中的許多是神經元的關鍵酶，喪失了其功效，細胞功能衰退。許多組織內的蛋白氧化，包括大腦，已被提出作為與衰老有關的功能缺陷的原因。
羥基是衍生自過氧化氫(H2O2)的第三代基團，依次地，過氧化氫衍生自超氧化物岐化酶反應產生的過氧化物基團。
過氧化氫在鐵或銅等轉換金屬的存在下被穀胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶還原成羥基。
II.結果
凍幹
粉和凍幹Jucara粉(Brunswick Lab ID.BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化能力經ORAC分析技術測定(如上所述)並在概括於下面表24。
表24抗羥基和過氧化亞硝酸鹽的抗氧化活性的測定
表24的HORAC結果表達為微摩爾沒食子酸當量/克。表24中的NORAC結果表達為微摩爾Trolox當量/克。
實施例28
和Jucara製劑類似超氧化物岐化酶的活性和環加氧酶抑制活性的分析
I.過氧化物(O2-)清除活性(SOD)分析
A.背景
據估計成人(70kg體重)總耗氧的1％被轉化為過氧化物陰離子。在休息狀態下一個成人利用3.5mL O2/kg/min，這將導致0.147mol/天O2-。O2-據信是其它反應性氧化物如過氧化氫、過氧化亞硝酸鹽和羥基(來自過氧化氫)產生的原因。因此，人體內O2-清除能力是抵禦氧化應激的第一道防線。實際上，據報導在轉基因蠅內超氧化物岐化酶和過氧化氫酶的過表達使壽命延長達三分之一，也許，歸因於減少了的氧化應激，這種減少可從低蛋白羰基含量得到反映(Orr和Sohal，Science 2631128-1130，1994)。血內過氧化物清除能力是一個人抗氧化狀態的非常重要的參數。本分析是設計用來以高通量的方式對此參數進行精確定量。
B.實驗方法
儀器
Precision 2000八通道液體處理系統和來自Bio-tek Inc.(Winooski，VT)的Synergy HT microplate UV-VWAS和螢光儀。
試劑
Hydroethidine來自Polysciences，Inc.(Warrington，PA)。黃嘌呤氧化酶(源於酪乳，目錄號X4875)、黃嘌呤、超氧化物岐化酶(源於牛紅細胞，目錄號S 2515)購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
i.試劑準備
緩衝液。緩衝液包括含100μM二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的75mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)。為製備此緩衝，稱取0.0393g二乙烯三胺五乙酸(DTPA)加入10mL ORAC緩衝液工作溶液。這產生了10mL的10mMDTPA貯存液。接下來，向2mL DTPA貯存液中加入198mL ORAC緩衝液工作溶液。這產生了200mL的100μM含DTPA的O2-緩衝液工作溶液。
黃嘌呤氧化酶。購自Sigma的黃嘌呤氧化酶懸液(存於冰箱)用緩衝液稀釋20倍以形成均勻溶液。取19mL O2-緩衝液並加入1mL黃嘌呤氧化酶懸液。這產生了20mL的黃嘌呤氧化酶工作溶液，每天新鮮配製。
黃嘌呤溶液。稱取黃嘌呤(15mg)置於乾淨的玻璃瓶內。加5mL0.1N氫氧化鈉(0.1N NaOH)，旋渦混合併超聲處理溶液至固體溶解。加95mL O2-緩衝液並旋渦混合。這產生了100mL的黃嘌呤溶液。此溶液存放於室溫以避免黃嘌呤沉澱。黃嘌呤溶液每天新鮮配製。
Hydroethidine(HE)工作溶液。二氫乙錠貯存液-將0.04g二氫乙錠加入20mL乙腈中。這產生了20mL的HE貯存液(2mg/mL)，分裝於小瓶中-80℃保存。然後，將0.125mL二氫乙錠(HE)貯存液加入到24.875mL黃嘌呤溶液中。超聲處理並加熱至溶液澄清。這產生了25mL的Hydroethidine(HE)工作溶液，每天新鮮配製。
超氧化物岐化酶工作溶液(SOD)。將三萬單位SOD(Sigma)重構於10mL緩衝溶液中。將此溶液分裝成小份(0.4mL每小瓶，貯存液)並保存於-20℃。這產生了3000單位，被稀釋至30單位備用(見下)。200μL SOD3000單位貯存液加入19.8mL O2-緩衝液中以製備20mL SOD 30單位工作液。
對照。貯存液錳(III)5，10，15，20四氯化物儲存液1144μM，保存於-80℃。為了製備工作溶液，用O2-緩衝液將貯存液稀釋100倍並旋渦混合。取9.9 mL O2-緩衝液加入100μL錳貯存液，10mL的11.44μM錳工作液，置於G1孔和G12孔作為對照。
分析方法
此分析在配有96-孔微孔板的Precision 2000液體處理系統上進行，採用下面步驟 ●在一號板(聚丙烯)中，將200μL樣品加入孔B1、C1、E1、F1和B12、C12、E12、F12。
●將200μL SOD工作溶液加入D1和D12孔中。
●將200μL O2-緩衝液加入到A1、H1、A12，和H12孔中。
●將200μL錳工作液加入G1和G12孔中。
●試劑依如下方式載入precision 2000中B架上的杯中 B1中20mL O2-緩衝液 B2中20mL HE B4中20mL黃嘌呤氧化酶溶液 ●在Precision2000上進行A×2稀釋(ORAC×2)。進行稀釋以使所有樣品、標準品、和空白都稀釋2、4、8、16、32倍。
●將每個孔中的25μL溶液轉移到反應板中(聚苯乙烯，320μL)然後加入150μL HE工作溶液。
●在37℃下溫育讀數板20分鐘。
●溫育結速後，通過運行AAPH附加(B4)程序加入黃嘌呤氧化酶。這使得20μL黃嘌呤氧化酶工作液被加入到2號板的所有孔中。
●加入黃嘌呤氧化酶後，將板置於讀板儀下。
●在激發光濾光器在485±25nm和發射光濾光器在590±30nm下每分鐘讀取反應板和螢光連續十分鐘，讀數參比於下面設為5000單位的D1孔。2號板設計(聚丙烯)每孔含150μL HE工作溶液，25μL樣品，和25μL黃嘌呤氧化酶(在預熱後30分鐘加入)。
C.數據處理
從原始數據中得到線性曲線，通過用來控制讀板儀的KC-4程序計算曲線斜率。輸出斜率並用微軟Excel軟體進一步計算。
簡化的化學動力學
O2-經下面由黃嘌呤氧化酶催化的反應持續產生。過氧化物生成的速率是恆定的並對黃嘌呤是偽零級，黃嘌呤對於黃嘌呤氧化酶是大量過剩的。
黃嘌呤+O2 尿酸+O2-(1)
所形成的過氧化物或者與HE反應或者被超氧化物岐化酶清除。
HE+O2- 氧化型HE (2) 2O2- O2+H2O2 (3) O2-+樣品 P(4)。
假設穩態O2-濃度、O2-清除劑(SOD)不存在(Vo)和存在(V)情況下的螢光增長速率具有下列關係 Vo/V＝1+k3[SOD]/(k2.[He]) (5)
對Vo/V和[SOD]繪圖將給出一條截距在(0，1)且斜率為k3/k2[HE]的直線。對於未知樣品，未知樣品和標準樣品間斜率的比為 {k3/k2[HE]}/-{ks/k2[HE])＝k3/ks(6)
方程(5)將根據對一個樣品Vo/V和濃度作圖曲線中所用的濃度，以SOD測定當量/克或每升樣品為單位，給出一個樣品的相對SOD活性。
II.環加氧酶分析
A.簡介
炎症是我們的免疫系統對因病毒和微生物等病原體以及化學或物理創傷造成的侵入物的響應。有時會疼痛，炎症通常是發熱反應。但在一些例子中炎症發展到慢性狀態，與關節炎、多發性硬化症甚或癌症等衰老性疾病相關。實驗生物學和系統生物學研究已闡明了複雜的炎症過程。在許多其它方式中，控制炎症的一種方式是抑制與炎症直接相關的環加氧酶-2(COX-2)的活性。還發現非固醇類消炎藥(NSAIDs)是優良的COX抑制劑。NSAID類的有益效果可聯繫到對COX-2和COX-1的抑制。這些合成的COX抑制劑包括阿司匹林、布洛芬、napoxen和塞來考昔(celebrexTM)。更多的研究成果已經發現了更具選擇性和活性的COX-2抑制劑作為新一代NSAIDs。
從歷史看，炎症用的草藥已經被用了幾千年。實際上，Celsus圍繞AD40定義「發紅、灼熱、疼痛、瘤」(紅、熱、痛和腫)是，目前，炎症症狀。只是在最近植物浸出物的反應機理才在分子生物學水平有所研究，採用COX-1和COX-2抑制劑分析作為從草藥混合物中分離有效組合物的指導。這個方法還在營養藥物工業中使對鎮痛和消炎草藥補充劑的效果得以更好評估和優化。為了滿足工業上植物源樣品COX抑制能力的測定要求，採用了一種體外COX-1和COX-2抑制劑篩選分析法，加以改進以提高效率和降低成本。此處所述是適用於植物產品的COX-1和COX-2抑制活性分析的細節。
B.分析原理
COX-1和COX-1都催化花生四烯酸的氧化生成前列腺素類(圖1)。酶活性可通過耗氧速率進行測定。實際上，酶的活力單位被定義為「一單位酶37℃下在0.1M tris-HCl緩衝液pH 8.0中，含100mM花生四烯酸、5mM EDTA、2mM苯酚和1mM血色素，每分鐘消耗1nmol氧氣」。用Oxytherm實時監測氧濃度(圖2)，Oxytherm是一種氧濃度測定系統，購自Hansatech。初始耗氧速率得自動力學曲線。在抑制劑存在下，初始速率下降。IC50，初始耗氧速率下降50％時的濃度，被用來表示COX-1和2的抑制活性。選擇性表示為COX-1和COX-2的IC50的比值。樣品通常溶於二甲基亞碸(DMSO)、乙醇或水中。
C.實驗細節
(1)分析條件 儀器Oxytherm 緩衝液0.1M Tris-HCl，pH 8.0，含5mM EDTA，2mM苯酚和1mM血紅素 溫度37℃ 初始[O2]212mM 酶體積5mL(或～100單位) 總體積0.5mL 樣品體積5mL 底物5μL花生四烯酸(濃度10mM溶於0.01M NaOH溶液) 血紅素5 mL(終濃度1 mM) 數據記錄速度每秒5次讀數
(2)實驗步驟
加入半毫升Tris緩衝液(37℃烘箱溫育)到反應箱內後再加入5mL溶於DMSO的100mM血紅素。向此溶液中加入5mL COX-1(或10mLCOX-2)酶溶液(直接使用獲自供應商的產品)。混合物溫育1分鐘。加入五毫升樣品(溶於DMSO或乙醇)並溫育1分鐘。加入五毫升花生四烯酸並觀察反應速率。通過動力學曲線獲得初始速率。
樣品萃取和溶解固體樣品根據其溶解性用二甲基亞碸(DMSO)、乙醇、50％丙酮水溶液或水萃取。水基液體樣品直接檢測或必要時用水稀釋。油基樣品溶解於DMSO或乙醇用於分析。
質量控制
IC50當50％的酶活被抑制時的樣品濃度。較低的IC50意味著高活性。IC50比此數值表示樣品對COX酶抑制的選擇性。當比值為1時，無選擇性。如果比值小於1，樣品對COX-1的抑制強於COX-2。如果比值大於1，樣品對COX-2的抑制更強。標準偏差為約20％。
D.參考文獻 1.Nathan，Nature 2002，420846-52. 2.Tracey，Nature 2002，420853-59. 3.Couzer and Marnett，Chemical Rev.2003，ASAP. 4.Wu et al.，J.Agri.Food Chem.，2002，50701-05. 5.Smith and Marnett，Biochim，Biophys.Acta 1991，1083，1-17. 6.Johnson等，Arch.Biochem.Biophys.1995，32426-34. 7.Culmacz and Lands W.E.M.Requirements forhydroperoxide by thecydooxygenase and peroxidaseacitivties of andin H synthase.Prostaglandins1983，25，531-40.
III.
和凍幹Jucara粉的過氧化物陰離子清除能力
凍幹
粉和凍幹Jucafra粉的過氧化物陰離子清除能力如上所述測定(Brunswick Lab ID.Brunswick Laboratories，Wareham，MA)。研究得最多的天然來源的超氧化物岐化酶(SOD)是小麥芽SOD。小麥芽的SOD活性是每克基質160至500單位。比較而言，凍幹
粉和凍幹Jucafra粉的氧化物清除能力非常強，如下表25所概括。
表25
如上詳述測量在凍幹
粉和凍幹Jucara粉(Brunswick Lab ID.Brunswick Laboratories，Wareham，MA)存在或不存在時環加氧酶(COX)活性(1類COX，即，COX I和2類COX，即，COX II)的活性。如表25(見上)和表26(見下)所總結，凍幹
粉和凍幹Jucara粉抑制了COX酶。如表26所示，凍幹
粉和凍幹Jucara粉抑制了COX I和COX II兩種同功酶。凍幹
粉和凍幹Jucara粉，因此在預防和治療與COX I和COXII活性相關的炎症疾病中，如關節炎，是有效的。
表26
實施例29用ORACno分析對水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析
圖21顯示了用ORAC分析技術(Brunswick Laboratories，Wareham，MA；如上所述)測定的水果和蔬菜的抗氧化活性。ORACFL分析，以螢光素作為螢光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。
實施例30
果汁製備
圖22詳述
果汁製備的流程圖，包括水果洗滌和其巴氏消毒。對果實和果汁更好的保存將使該食物的消費得以保持其營養價值並將易於其在收穫季節之間的商品化組織。
果汁的製備和處理過程見圖22。
果實去殼(hulling)可通過若干不同方式進行，軟化條件依不同的產品而變化。
I.果漿提取過程優化-軟化和機械去殼
果實去殼可通過若干方式進行，每個生產商都有其自己的方式處理
(軟化時間和溫度，每千克果實用水量，果實停留在機器內的時間)。為了保持我們實驗中的重複性並確保良好的結果，有必要優化和系統化果實提取過程。
大多數情況下，
果實去殼在一種有垂直軸的、特別精製的用於
果實的去殼機上。典型機械去殼機的圖片見圖23。該機器設計每次處理2千克
以使每批處理的果實數量能最小。
浸泡果實的時間和水溫依供貨商的不同而不同。果實可在攪拌前在室溫流水下浸泡幾個小時或者也可在溫水中短時間(10或20分鐘)內被軟化。
在實驗室中，考查了幾個軟化時間(0，5，10，15，20，30分鐘)和浸泡水溫(30，40，45，50和60℃)。儘管結果提示不同軟化條件之間沒有顯著性差異，觀察到當
在45℃水中軟化20分鐘時有更大的產量。
總去殼時間，以及其間的用水量和用水方式，構成了對產量和果汁密度的十分重要的變量。考查了5個總去殼時間(從2:30到5:00變化)並且對於每個總時間，考查了首次注水前的不同去殼時間，以及將水注入去殼機的不同方式(去殼過程末期果汁的滴落時間設為45秒)。總用水量為1升每2公斤果實(為了得到理想的果汁，不很濃，不很淡)。
根據這些研究，注意到去殼總時間和去殼機內的置水方式對乾物質中的產量有非常顯著的效果。根據這些經驗，設置如下果汁製備步驟 1.稱取2千克原料
2.準備5個容器，每個裝有200mL水。
3.將
置入機器中，在時間0處開機。
4.去殼1分鐘後，立即放置第一個200mL水容器。
5.在1分30秒；2分；2分30秒；和3分鐘後，分別加入其餘四個容器中的一個。
6.讓其滴落45秒至3分45秒。
分析了部分果汁的再循環效果。儘管此製備果汁的技術十分普遍，未發現乾物質產量的差別。
II.
果實收穫後微生物學性狀的演化
當比較收穫期和收穫間期時
的特性和質量，發現在味覺質量和科學指標的數據上(微生物學，重量，顏色)有顯著變化。例如，在Belm出售的收穫期的
便宜又豐富。它具有好的質量，因為它來自於Beim附近的地區，沒有遭受運輸過程中的變化。另一方面，在收穫間期，
生產數量少，其味覺特性不如收穫期的
並且更貴。收穫間期出產的
來自遠得多的地區(Maranho，Maraj島)，在到達Belm港前經歷了漫長旅途。果實收穫至出售/消費間的時間間隔十分重要(水果收穫後在室溫下維持的最長時間有48小時就很長了)。
發現購自收穫間期的
比收穫期的有更多的微生物載量。在收穫期，每克新鮮
的平均微生物載量為106微生物/克乾果漿-相當於10ml果汁。在收穫間期，每克的微生物平均載量上升到109，表明高出1000倍的微生物載量。因此，有必要確定導致汙染增加的原因主要是因為那些地區低質量的棕櫚樹、不良運輸條件，還是因為在收穫後的時間增加，導致新鮮水果中已經存在的微生物的自然生長。研究了收穫和處理之間時間間隔的影響並將其與微生物載量相關聯。
30小時期間內在不同時間間隔處檢測新鮮水果(取自收穫後10小時)中微生物載量。結果顯示水果原始微生物載量有可檢測的和規律性的增加。剛收穫後每克乾果漿的微生物載量為約105-106微生物(細菌，黴菌和酵母)而40小時後達到最大值，稍高於每克乾果漿109微生物。由於收穫後40小時觀察到的微生物載量十分相似於收穫間期的值，可能可以推斷收穫期內外微生物載量的不同主要是由於果實表面微生物的自然生長，而不是那些地區棕櫚樹的低質量。
因此，
就在剛剛收穫後使用，在微生物載量有明顯增加之前，以避免產品質量的變化(不僅是微生物增加導致的性質改變還有因為為保存產品而必需採用熱輻射處理而導致的變化)。然而，下面評估了降低微生物載量的方法。
III.清洗
研究了清洗方法對降低果汁中微生物載量的效果。研究使用了收穫間期的
這意味著具有嚴重汙染水平的
在處理之前，用0.1％(v/v)濃度的衛生水(hygienic water)清洗水果，使得微生物載量降低2到400倍(考慮用沒加化學物質的飲用水清洗)。
IV.洗滌
洗滌過程被作為
果汁製備的初始步驟，因為它在處理
之前降低了微生物載量，而沒有明顯改變其質地。對於
果實，在處理步驟前的洗滌已被描述作幫助保持果汁的質量和完整性，從而，保持了
果汁的感官特徵、質地和營養等品質(Toumas，1994)。
洗滌包括在處理前將果實在熱水或沸水中或蒸汽中置一段時間(Cruess，1995)。選擇此處理，旨在降低果實表面存在的汙染劑，被果實的物理結構所解釋。此果實只有一小層淺層果漿，果漿與熱水或蒸汽間的短暫接觸可使不是十分高溫或長時間的處理產生積極的效果。
研究的進行不僅採用了收穫期的
還採用了收穫間期的
嘗試了一些不同溫度(從75℃到100℃)和幾個洗滌時間(從5秒到10分鐘)(Rogez et al.，1996)。處理對微生物載量(細菌，黴菌和酵母)的降低有顯著影響。然而，洗滌條件對過氧化物酶的失活沒有效果，因為這些酶更加抗熱。只有更高的洗滌溫度和更長的時間才能部分降低過氧化物酶的活性(達20％)。但更苛刻的處理(即溫度高於80℃且時間長於10秒)導致見於果汁的表面的果汁中脂肪物質(微黃色的油)的分離。這種質地的改變降低了消贊者對產品的接受程度，因為其外觀。
由於更多的激烈洗滌造成的口感特點的損失高得多，且不能進一步減少微生物載量，所以選用溫度80℃時間10秒作為
果實的更好的洗滌條件。
實施例31
飲料製備的方法和製備標準
I.混合指導
14∶1脫水需要重量比為13份水/液體與1份脫水物。使用
的可能的飲料種類幾乎是無限的。下面提供3個例子 混合物1將二十五克
粉加入到325ml冷水中。中速混合混合物至少30秒以充分水化粉末。如果混合可持續約1分種將增進其質感。
混合物2將二十五克
粉加入到200ml水和125克冰中，混合30秒。混合可持續一分鐘。
混合物3用125ml奶或奶油替代冰產生美味的smoothie。
因為
含糖和維生素C量低，所以很少需要預防氧化/發酵。推薦加入糖和維生素C。純
的味道相當溫和，顏色是很深的慄色。1-2匙糖或其它甜味劑的加入很好地美化了風味。顏色可通過加入維生素C(一種酸)而變得更紅。加入紅色食物色素也將創造出更開胃或吸引人的外觀。而且，在混合物內加入一支香蕉，以及噴灑水果格蘭諾拉麥片幹配菜，也能為
飲料製備提供創造性的改變。
II.儀器
混合器；Gram天平；毫升測量裝置
III.
果漿鑑定和質量標準
1.目的
本規則目的是建立用於飲料的適於
完整果漿和
的最小鑑定和質量標準。本規則不適於用於其它任何用途的
果漿。
2.定義
完全果漿和
是
樹(Euterpe oleracea，Mart.)果實的可食用部分用適當技術性方法軟化後的提取產物。
3.分類
產品將根據向果漿中加入水/液體量進行分類，如下 3.1
完全果漿是未加水而從
提取的果漿，用機械方法，未過濾。它可進行物理儲存過程。
3.2稠或特製
(A類)是加水提取的果漿，含14％以上總固體量並且外觀非常濃稠。
3.3中等或正常
(B類)是加水提取的果漿，含11％至14％總固體量並且外觀濃稠。
3.4稀或普通
(C類)是加水提取的果漿，含8％至11％總固體量並且外觀不濃稠。
4.基本配料
完全果漿和
得自新鮮、成熟和健康的果實，根據前述規格，且無任何使本產品不適於消費的塵土、寄生蟲或微生物。
5.可選配料
5.1水
用於果漿提取的水必須是可飲用水。
5.2 Acidulante
對於經巴氏消毒保存於室溫的
可根據「生產管理規範」(GMP)加入檸檬酸。
6.組成
6.1
完全果漿和
必須保有符合該水果特徵的組成，沒有變更、與其它品種水果混合或任何非法操作。
6.2
完全果漿必須符合下列物理、化學和感官特徵
6.2.1物理和化學
表27
6.2.2感官特徵
體觀麵糊狀，從包括果實的表面中呈深色點顏色紫色
果肉的純紫色和綠色
果肉淺綠色味道特徵性的(見下)
6.3
(特級、正常或普通)必須符合下列物理、化學和感官特徵。
6.3.1物理和化學特徵
表28
6.3.2感官特徵
體觀乳濁液必須在加熱甚至到80℃時保持穩定。顏色對紫
果漿為Violet紫色，對綠
果漿為淺綠色。氣味特徵性(見下)
6.4完全
果漿和
可能含有限制水平以內的果實非食用部分，該限制水平不改變產品的質量和感官特徵。完全
果漿和
必須符合《一般水果果漿質量標準》內指定的所有其它物理、化學、顯微鏡、微生物和感官特徵。
6.5
完全果漿和
中黴菌和酵母總數的上限是5×103。
7.添加劑
用於直接消費的最大1千克包裝的完全
果漿和
必須通過物理過程保存，禁止使用化學防腐劑或色素物質，除非從
果實中得到的色素。
實施例32凍幹
的製備
一種製備凍幹
粉的方法詳見圖24。如其所示，採集
果實並去核。然後取出果漿並冰凍。來自許多
果實的果漿被凍幹以產生凍乾粉。凍幹的
粉比未處理的
果實果漿製劑穩定，後者在數小時內即迅速降解，這使它們變得不好吃。在處理過程中和冰凍前向
果實果漿加檸檬酸對進一步穩定果實果漿製劑是有用的。檸檬酸可用於穩定其它經本發明中方法處理的水果果漿製劑，如Jucara。
由於酶和與從果實取出的果漿數量相比在果皮上的高比例的發酵劑載量，
的生產是一個特別不可逆的事件序列。由於這個原因，
生產傳統上限於本地並立刻消費。
冰凍果漿必須保存在-5℃或更低的溫度。在更高溫度下，酶類和發酵劑變得活躍並改變果漿的特徵。一個效應是產生不可溶化合物，前述的grit，這在最後一批中是明顯的。這些不溶物見於第一批
脫水物(來自兩個處理器)並發現是由脫水製備過程中解凍所引起的。這個問題通過不使冰凍的
果漿在經冰凍乾燥脫水前預融而得到解決。就是說，一旦Azurai果漿冰凍後，在凍幹脫水前不能使其在-5℃以上的溫度融化。脫水前未預融製備的
果漿產生顆粒狀、凍幹的
粉，脫水十分成功並保持了質量、色澤、品質和風味。因此，本發明提供了一種方法製備水果基營養補充劑，其中果漿的製備方法中一旦果漿被分離和冰凍在脫水前就不得預融。本方法對從許多水果中製備凍幹實果粉是有用的，比如，但不限於，
果實和Jucara果實，可被再脫水並保持優質顏色、品質和味道。
這種顆粒，凍幹的果實粉避光儲存於塑料紋的箔袋中直至使用。
實施例33凍幹
製劑對所選微生物穩定性的攻擊性檢測
I.目標
本研究的目標是實施初步的攻擊檢測以評估產品在受酵母、黴菌、乳酸菌、沙門氏菌和葡萄球菌中的每一株攻擊時的微生物穩定性(Silliker Laboratories Research Center，South Holland，IL)。
II.應用
本研究提供了一種對可能的酸敗生物和兩種病原體的產品篩查。它適於收集關於產品的原始數據和/或在開發中比較許多產品製劑。
III.限制
每種攻擊生物只使用一個菌株，存在產品對該菌株生長有抗性但對其它菌株易感的可能性。生長於對照產品內的攻擊生物中，不到研究結束不進行檢測。本研究受限於時間間隔、儲存溫度和報導的範圍。本研究不預期超出四周的結果。
IV.材料與方法
A.受檢產品
從客戶處得到標有
果實-凍幹」的一個3.5千克的可封口箔袋的產品。產品保存於環境溫度至研究開始。
B.攻擊菌
用來自Silliker Research Culture Collection(SRCC)的凍幹的Aspergillus niger(黴菌)、Zygosaccharomyces bailii(酵母)、Lactobacillusfructivorans(乳酸菌)、Salmonella typhimurium和Staphylococcus aureus攻擊產品，如表29所列。用平板計數法檢驗存活的細胞或孢子數量。
表29
C.待測樣品製備和儲存
將產品無菌依100克小份分裝入6個無菌容器內。一份用作陰性對照。其餘小份接種約每克10000克隆形成單位濃度的培養物。接種後，充分混合樣品並儲存於75_。
D.樣品分析
在第0天和第28天分析未接種的對照份的攻擊菌。在第0、7、14、21和28天分析被接種的各份。在每個時間段從每份中取出一個單獨的11-克樣品用平板計數法分析攻擊菌。
V.結果和討論
食品的微生物穩定性可通過對其用酸敗性和病原性微生物進行攻擊而測定。如果攻擊生物的水平在儲存過程中沒有增加，則產品製劑可抗微生物生長並認為其是微生物學穩定的。
結果顯示於30和表31。如數據所示，在儲存過程中酵母、黴菌、乳酸菌、細菌、沙門氏菌和葡萄球菌在對照或接種了的小份中沒有增加。這樣，當儲存於75_並用酵母、黴菌、乳酸菌、細菌、沙門氏菌和葡萄球菌攻擊下，
果實凍乾產品至少28天內是微生物學穩定的。如下所示，本產品在攻擊下是穩定的。
表30
果實-凍幹的未接種對照樣
表31
果實-凍幹的接種樣
VI.凍幹AAI的貯存期研究
凍幹
製劑貯存期的研究由Silliker Laboratories實施並列於下面表32內。
表32 貯存期研究結果
一種食品的味道、氣味和外觀(感官質量)是消費者用以判斷食品可接受程度的根本標準。這些品質在食品內的微生物區系-細菌、酵母和黴菌-生長並代謝可用營養時開始變化。感官性變化在微生物數量很高以前一般不易覺察。引起酸敗所需微生物的數量依食品種類和其中生長的微生物種類不同而不同。但是，通常，貯存期末限制了存放時間。因此，凍幹
果實產品的貯存期為存於75_至少12個月。
實施例34大鼠內14天處理後觀察期研究』
果漿-凍幹』急性口服毒性(限制檢測)
進行大鼠內14天施用後觀察期的研究以評估凍幹
果漿的急性口服毒性(研究代碼PCDL-0221；Pharmaceutical Control andDevelopment Laboratory Co.Ltd.，9.Mexik6i Street Budapest，H-1149)。
I.一般信息
A.劑量
2000mg/kg體重的單次口服限制劑量的
果肉凍乾物(批號22.10)通過強飼法口服施用於大鼠。觀察實驗動物的死亡率和中毒症狀14天。在第15天開展總病理檢查。實驗動物的體重對應於它們的種類和在研究過程中的年齡。口服施用2,000mg/kg劑量的』
果漿-凍幹』未發生死亡。未觀察到中毒的臨床症狀。第15天進行的預定的屍體解剖揭示沒有毒性總病理變化。可得出結論2000mg/kg單口服劑量的
果實凍乾物在雄性和雌性大鼠內未發現副作用。
B.目的
開發在大鼠體內單劑量口服施用凍幹
果漿的潛在毒性效果的數據。受檢物預期用於營養補充劑。
C.研究類別
臨床前毒理研究符合美國藥品食品監督管理局的非臨床實驗研究實驗管理規範和Hungarian Act 1998XXVIII.管理動物保護的原則。限制實驗。
D.對研究草案的偏離
i.用於已消失的生產商的T61材料的特徵
原始草案Hoechst Veterinar GmbH
最終報告Intervet International
原因生產商名稱變更
ii.死亡率
原始草案施用4小時後進行觀察，之後每天兩次。
最終報告施用4小時後進行觀察，之後在工作日開始和結束的時候每天進行兩次，周末每天進行一次，直到第15天早晨。
原因過程被描述得比原來更為精確。
iii.一般狀態，外觀，行為和臨床症狀
原始方法在施用後期間，對動物每天兩次檢查直至第15天早晨。
最終報告在施用後期間，除周末對動物每天兩次檢查直至第15天早晨，周末檢查一次。
原因過程被描述得比原來更為精確。
II.待檢物和參考物
A.待檢物特徵
待檢物特徵詳見下面表33。
表33
B.微生物分析
C.用於懸浮待檢物的物質特徵
i.甲基纖維素
甲基纖維素(批號127H1066；有效期02/2003)購自Sigma並在使用前存於室溫。
ii.蒸餾水
蒸餾水(批號A0010102；有效期03/2003)購自PCDL並在使用前存於室溫。
iii.驗屍前過麻醉用品的特徵
T61(批號09W008；有效期05/2006)，每升含有0.2g乙甲丁醯胺，0.005g terracing鹽酸鹽和0.05g美貝碘銨，購自Intervet International並在使用前存於室溫下毒品用安全盒內。
iv.待檢物配製
在不早於施用前30分鐘稱取必要量的待檢物懸浮於含1％甲基纖維素的溶液中。製備下列懸液 2000mg/kg正常劑量5.0g
果漿加50ml 1％甲基纖維素溶液。在處理中用OP-951型Radelkis磁力攪拌器攪拌懸液。
v.配製的待檢物的濃度控制
取配製好的待檢物樣品檢查濃度和均一性。濃度和均一性檢查通過稱重法進行。所測懸液上部、中部和下部(均一性檢查)的三份三平行樣本的濃度在可接受的±10％範圍內，即，上+4.4±4.6％，中+4.0±4.8％，下+5.4±2.8％
III.檢測系統
A.動物
Sprague Dawley大鼠，CrlCD BR(到達時6-7周齡)被用於本研究。雄性體重範圍從143.9g到159.4g。雌性體重從140.5g到161.4g。定購的動物群30(雄性15隻，雌性15隻)。研究中所用動物數量20(雄性10隻，雌性10隻)。大鼠購自Charles River Hungary Ltd。到達時動物是SPF並在研究過程中保存於常規環境。根據國際慣例通常用大鼠進行毒理實驗。Sprague Dawley株是具有充足譜係數據的周知的實驗模型。
用耳朵標號鑑別動物並以5隻同性的數量養於籠中。籠子貼有標籤，註明大鼠的ID號、研究編號、給藥途徑、性別和實驗期結束日期。
動物飼養條件列於表34。環境條件列於表35。
表34動物飼養條件
表35環境條件
連續記錄溫度和相對溼度。除了給藥前的禁食期、給藥期間和給藥後觀察的最初二小時，動物可自由獲得標準大鼠和小鼠鼠食VRF-1。食物的組成受控於製造商Altromin GmbH，D-4937 Lage/LippeLange Str.42。食品依製造日期區分(30.09.2002)，穩定性4個月。大鼠經飲水瓶可自由獲得自來水。飲用水由PCDL微生物系每月檢查。給藥前觀察動物5天。只有無任何臨床症狀的健康的動物才用於本研究。
動物分組按計算機產生的隨機表格進行。動物基於其體重被隨機分組，從而使每個組中的體重分布相似。
IV.實驗設計
劑量水平和分組列於表36。
表36
劑量選擇的原理如下所述。預計人
果漿的日劑量為大約1000mg每天，對應於一個成人(70千克)14mg/kg體重或一個4歲兒童(20kg)50mg/kg。本研究所用2000mg/kg限制劑量對應於一個成人消費的140倍的日劑量或40倍兒童劑量，如果兒童的體重以5g計的話。
V.給藥
施用是強飼口服。施用途徑依國際慣例選擇。口服途徑是接受待檢品的人類的預期途徑。待檢品的施用以單劑量實施。待檢品以20mg/kg體重的量施用。實驗期包括5天環境適應、給藥日、包括給藥日在內的14天給藥後觀察期，和第15天屍檢。
VI.觀察，檢測
A.致死率
施用4小時後進行觀察，之後在工作日開始和結束的時候每天進行兩次，周末每天進行一次，直到第15天早晨。死亡時間應儘可能精確記錄。
B.一般狀態，外觀，行為和臨床症狀
受藥前進行一次仔細的大鼠臨床觀察，然後，在給藥6小時後連續進行。在其後的時期裡，除了周末檢查一次外，每天檢查兩次檢查動物直到第15天早晨。記錄要被觀察的症候，包括皮膚、毛髮、眼睛和可見黏膜的變化；分泌物和排洩物的出現和自律活性(例如，流淚、豎毛、腹瀉、瞳孔尺寸、非正常呼吸方式)。此外，步態、體態和對抓取的反應的潛在變化以及發生嗜睡、戰慄、痙攣或緊張的運動，重複或怪異的行為。
C.體重
在動物剛到實驗室時、隨機分組那天、給藥日和屍檢前實驗的第2、8、和15天對其稱重。
VII.屍和組織檢查
A.屍檢
所有給藥後觀察期結束時存活的大鼠在T61過麻醉下解剖檢查。仔細觀察和記錄外部和內部狀態。未進行器官的顯微境檢查。
VIII.評價，統計分析
雄性組和雌性組分別評價
A.參數值
計算了關於體重的平均值和標準偏差。
B.非參數值(致死率和臨床症狀)
制表列出死亡率、臨床症狀和粗查結果。
IX.方法
實驗依照現行藥物控制和開發實驗室有限公司(Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co.Ltd.)毒理部的標準操作程序進行。
X.動物保護
為了動物的利益避免對動物不必要的使用。命令對明顯垂死的動物的溫柔殺死由研究的主管人員負責。本方法(限制性檢測)使用了相比於其它已知和承認的急性毒理實驗減少了的實驗動物數量。
XI.數據記錄和歸檔
如標準操作程序所指示，以如下正確的形式保存所有原始數據 待檢品重量 動物房日誌 體重日誌 死亡和臨床觀察日誌 屍檢記錄
研究所得數據收集於研究文件夾中。研究記錄，所有研究中和研究結果的數據，與研究有關的所有文檔和信息，待檢樣品的對照樣和最終報告將在PCDL的檔案中保存至少15年然後提供給資助者。
Xll.結果
A.死亡率
給藥後觀察期的14天內觀察到的死亡率概括於下面表37。
表37
表38概括了
果漿-凍幹』大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中給藥後觀察期的14天內雄性受檢對象的單獨的死亡數據。
表38雄性
表39概括了
果漿-凍幹』大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中給藥後觀察期的14天內雌性受檢對象的單獨的死亡數據。
表39雌性
給大鼠單劑量口服施用2,000mg/kg劑量的
果漿-凍幹』後未發生死亡。所有雄性和雌性存活至14天觀察期結束。
B.臨床症狀
在14天給藥後觀察期內觀察到的臨床症狀概括於下面表40
表40
表41概括了
果漿-凍幹』大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中14天給藥後觀察期內雄性受檢對象的單獨的臨床症狀。
表41雄性
表42概括了
果漿-凍幹』大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中14天給藥後觀察期內雌性受檢對象的單獨的臨床症狀。
表42雌性
在給藥日和14天給藥後觀察期內未觀察到任何給藥組動物中毒。
C.體重
在14天給藥後觀察期內觀察到的雄性體重概括於下面表43。
表43雄性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雌性對象體重概括於下面表44。
表44雌性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雄性受檢對象體重變化概括於下面表45。
表45雄性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雌性受檢對象體重變化概括於下面表46。
表46雌性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雄性受檢對象個體體重概括於下面表47。
表47雄性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雌性受檢對象個體體重概括於下面表48。
表48雌性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雄性受檢對象個體體重變化概括於下面表49。
表49雄性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雌性受檢對象個體體重變化概括於下面表50。
表50雌性
D.宏觀病理學
受檢動物的宏觀病理學結果概括於表51。
表51
受檢雄性動物的宏觀病理學結果概括於表52。
表52雄性
所有動物存活至預期在第15天的屍檢，所有動物檢驗證明沒有毒理學變化。
E.評價
單劑量口服施用2,000mg/kg
果漿-凍幹』劑量後未發生死亡。未發生中毒臨床症狀。按計劃在第15天進行的屍檢揭示無中毒性宏觀病理學變化。結論是未發現2,000mg/kg的單口服劑量
果漿-凍幹』在雄性和雌性大鼠內的副作用。
實施例35對Jucara果漿『凍幹』的急性口服毒性的大鼠內14天給藥後觀察期研究(限制檢測)
進行大鼠內14天施用後觀察期的研究以評估凍幹Jucara果漿的急性口服毒性(研究代碼PCDL-0222；Pharmaceutical Control andDevelopment Laboratory Co.Ltd.，9.Mexikói Street Budapest，H-1149)。
I.一般信息
A.劑量
2000mg/kb體重的單口服限制劑量的』Jucara果漿-凍幹』(批號2208)通過強飼法口服施用於大鼠。觀察實驗動物的死亡率和中毒症狀14天。在第15天開展總病理檢查。實驗動物的體重對應於它們的種類和在研究過程中的年齡。口服施用2,000mg/kg劑量的』Jucara果漿-凍幹』未發生死亡。未觀察到中毒的臨床症狀。第15天按計劃進行的屍體解剖揭示沒有中毒性總病理變化。結論是2000mg/kg單口服劑量的』Jucara果漿-凍幹』在雄性和雌性大鼠內未發現副作用。
B.目的
開發在大鼠體內單劑量口服施用Jucara果漿-凍幹的潛在毒性效果的數據。受檢物預期用於營養補充劑。
C.研究類別
臨床前毒理研究符合美國藥品食品監督管理局的非臨床實驗研究實驗管理規範和Hungarian Act 1998XXVIII.管理動物保護的原則。限制級實驗。
D.對研究草案的偏離
i.用於已消失的生產商的T61材料的特徵
原始草案Hoechst Veterinar GmbH
最終報告Intervet Intemational
原因生產商名稱變更
ii.死亡率
原始草案施用4小時後進行觀察，之後每天兩次。
最終報告施用4小時後進行觀察，之後在工作日開始和結束的時候每天進行兩次，周末每天進行一次，直到第15天早晨。
原因過程被描述得比原來更為精確。
iii.一般狀態，外觀，行為和臨床症狀
原始方法在施用後期間，對動物每天兩次檢查直至第15天早晨。
最終報告在施用後期間，除周末對動物每天兩次檢查直至第15天早晨，周末檢查一次。
原因過程被描述得比原來更為精確。
II.待檢物和參考物
A.待檢物特徵
待檢物特徵詳見下面表53。
表53
B.微生物分析 [05491微生物限制檢測由PCDL的微生物部依c.USP實施。
C.用於懸浮待檢物的物質特徵
i.甲基纖維素
甲基纖維素(批號127H1066；有效期02/2003)購自Sigma並在使用前存於室溫。
ii.蒸餾水
蒸餾水(批號A0010102；有效期03/2003)購自PCDL並在使用前存於室溫。
iii.驗屍前過麻醉用品的特徵
T61(批號09W008；有效期05/2006)，每升含有0.2g乙甲丁醯胺，0.005g terracing鹽酸鹽和0.05g美貝碘銨，購自Intervet International並在使用前存於室溫下毒品用安全盒內。
iv.待檢物配製
在不早於施用前30分鐘稱取必要量的待檢物懸浮於含1％甲基纖維素的溶液中。
製備下列懸液2000mg/kg正常劑量5.0g Jucara果漿加50ml 1％甲基纖維素溶液。在處理中用OP-951型Radelkis磁力攪拌器攪拌懸液。
v.配製的待檢物的濃度控制
取配製好的待檢物樣品檢查濃度和均一性。
濃度和均一性檢查通過稱重法進行。所測懸液上部、中部和下部(均一性檢查)的三份三平行樣本的濃度在可接受的±10％範圍內，即，上+9.4±4.2％，中+9.4±4.6％，下+6.6±2.0％
III.檢測系統
A.動物
Sprague Dawley大鼠，CrlCD BR(到達時6-7周齡)被用於本研究。雄性體重範圍從143.8g到151.9g。雌性體重從144.2g到161.6g。定購的動物群30(雄性15隻，雌性15隻)。研究中所用動物數量20(雄性10隻，雌性10隻)。大鼠購自Charles River Hungary Ltd。到達時動物是SPF並在研究過程中保存於常規環境。根據國際慣例通常用大鼠進行毒理實驗。Sprague Dawley株是具有充足譜係數據的周知的實驗模型。
用耳朵標號鑑別動物並以5隻同性的數量養於籠中。籠子貼有標籤，註明大鼠的ID號、研究編號、給藥途徑、性別和實驗期結束日期。
動物飼養條件概括於下面表54中。
表54
環境條件概括於下面表55中。
表55
連續記錄溫度和相對溼度。
除了給藥前的禁食期、給藥期間和給藥後觀察的最初二小時，動物可自由獲得標準大鼠和小鼠鼠食VRF-1。食物的組合物受控於製造商Altromin GmbH，D-4937 Lage/Lippe Lange Str.42。食品依製造日期區分(30.09.2002)，穩定性4個月。大鼠經飲水瓶可自由獲得自來水。飲用水由PCDL微生物系每月檢查。給藥前觀察動物5天。只有無任何臨床症狀的健康的動物才用於本研究。
動物分組按計算機產生的隨機表格進行。動物基於其體重被隨機分組，從而使每個組中的體重分布相似。
IV.實驗設計
劑量水平和分組列於表56
表56
劑量選擇的合理性如下所述。預計人Jucara果漿的日劑量為大約1000mg每天，對應於一個成人(70千克)14mg/kg體重或一個4歲兒童(20kg)50mg/kg。本研究所用2000 mg/kg限制劑量對應於一個成人消費的140倍的日劑量或40倍兒童劑量，如果兒童的體重以5g計的話。
V.給藥
施用是強飼口服。施用途徑依國際慣例選擇。口服途徑是接受待檢品的人類的預期途徑。待檢品的施用以單劑量實施。待檢品以20ml/kg體重的量施用。實驗期包括5天環境適應、給藥日、包括給藥日在內的14天給藥後察期，和第15天屍檢。
VI.觀察，檢測
A.致死率
施用4小時後進行觀察，之後在工作日開始和結束的時候每天進行兩次，周末每天進行一次，直到第15天早晨。死亡時間應儘可能精確記錄。
B.一般狀態，外觀，行為和臨床症狀
受藥前進行一次仔細的大鼠臨床觀察，然後，在給藥6小時後連續進行。在其後的時期裡，除了周末檢查一次外，每天檢查兩次檢查動物直到第15天早晨。記錄要被觀察的症候，包括皮膚、毛髮、眼睛和可見黏膜的變化；分泌物和排洩物的出現和自律活性(例如，流淚、豎毛、腹瀉、瞳孔尺寸、非正常呼吸方式)。此外，步態、體態和對抓取的反應的潛在變化以及發生嗜睡、戰慄、痙攣或緊張的運動，重複或怪異的行為。
C.體重
在動物剛到實驗室時、隨機分組那天、給藥日和屍檢前實驗的第2、8、和15天對其稱重。
VII.屍和組織檢查
A.屍檢
所有給藥後觀察期結束時存活的大鼠在T61過麻醉下解剖檢查。仔細觀察和記錄外部和內部狀態。未進行器官的顯微境檢查。
VIII.評價，統計分析
雄性組和雌性組合物分別評價
A.參數值
計算了關於體重的平均值和標準偏差。
B.非參數值(致死率和臨床症狀)
制表列出死亡率、臨床症狀和粗查結果。
IX.方法
實驗依照現行藥物控制和開發實驗室有限公司(Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co.Ltd.)毒理部的標準操作程序進行。
X.動物保護
為了動物的利益避免對動物不必要的使用。命令對明顯垂死的動物的溫柔殺死由研究的主管人員負責。本方法(限制性檢測)使用了相比於其它已知和承認的急性毒理實驗減少了的實驗動物數量。
XI.數據記錄和歸檔
如標準操作程序所指示，以如下正確的形式保存所有原始數據 待檢品重量 動物房日誌 體重日誌 死亡和臨床觀察日誌 屍檢記錄
研究所得數據收集於研究文件夾中。研究記錄，所有研究中和研究結果的數據，與研究有關的所有文檔和信息，待檢樣品的對照樣和最終報告將在PCDL的檔案中保存至少15年然後提供給資助者。
Xll.結果
A.死亡率
給藥後觀察期的14天內觀察到的死亡率概括於下面表57。
表57
表58概括了『Jucara果漿-凍幹』大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中給藥後觀察期的14天內雄性受檢對象個體的死亡數據。
表58雄性
表59概括了『Jucara果漿-凍幹』大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中給藥後觀察期的14天內雌性受檢對象的單獨的死亡數據。
表59雌性
給大鼠單劑量口服施用2,000mg/kg劑量的『Jucara果漿-凍幹』後未發生死亡。所有雄性和雌性存活至14天觀察期結束。
B.臨床症狀
在14天給藥後觀察期內觀察到的臨床症狀概括於下面表60
表60
表61概括了『Jucara果漿-凍幹』大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中14天給藥後觀察期內雄性受檢對象的單獨的臨床症狀。
表61雄性
表62概括了』Jucara果漿-凍幹』大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中14天給藥後觀察期內雌性受檢對象的單獨的臨床症狀。
表62雌性
在給藥日和14天給藥後觀察期內未觀察到任何給藥組動物中毒。
C.體重
在14天給藥後觀察期內觀察到的雄性體重概括於下面表63
表63雄性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雌性對象體重概括於下面表64
表64雌性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雄性受檢對象體重變化概括於下面表65
表65雄性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雌性受檢對象體重變化概括於下面表66
表66雌性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雄性受檢對象個體體重概括於下面表67
表67雄性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雌性受檢對象個體體重概括於下面表68。
表68雌性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雄性受檢對象個體體重變化概括於下面表69。
表69雄性
在14天給藥後觀察期內觀察到的雌性受檢對象個體體重變化概括於下面表70。
表70雌性
動物的體重和體重增加對應於其種類和研究中的年齡。
D.宏觀病理學
受檢動物的宏觀病理學結果概括於表71。
表71
受檢雄性動物的宏觀病理學結果概括於表72。
表72雄性
受檢雄性動物的宏觀病理學結果概括於表73。
表73雌性
所有動物存活至預期在第15天的屍檢，所有動物檢驗證明沒有毒理學變化。
E.評價
單劑量口服施用2,000mg/kg』Jucara果漿-凍幹』劑量後未發生死亡。未發生中毒臨床症狀。按計劃在第15天進行的屍檢揭示無中毒性宏觀病理學變化。結論是未發現2,000mg/kg的單口服劑量『Jucara果漿-凍幹』在雄性和雌性大鼠內的副作用。
等價方案
儘管本發明已結合其特定的實施方案描述，應當理解它能被進一步改進。此外，本申請意欲覆蓋本發明的任何改變、應用或改編，包括這些從本公開內容的偏離，該偏離在本發明所屬領域內已知或者通過常規實踐獲得，而屬於後附權利要求的範圍內。
權利要求
1.一種營養補充劑組合物，包含凍幹的阿薩依(Euterpe oleracea)
果漿，其中組合物
(a)包含總濃度大於約1毫克/克總重的花色素苷；
(b)ORACFL值大於約350微摩爾TE/克總重；和
(c)殘留水含量小於總重的約3重量％。
2.一種營養補充劑組合物，包含凍幹的
果漿，其中所述組合物
(a)環加氧酶抑制值大於約15阿司匹林_mg當量/克總重；和
(b)殘留水含量小於總重的約3重量％。
3.權利要求1或2中的組合物，其中的營養補充劑組合物進一步包含藥用載體。
4.一種生產穩定的和可口的
基營養補充劑組合物的方法，該方法包括以下步驟
(a)收穫
果實；
(b)稱重
果實；
(c)用水清洗
果實；
(d)用水在約75℃到100℃的溫度下洗滌
果實約5秒到10分鐘的一段時間；
(e)給
果實去殼以從
果實中分離
果漿；
(f)將
果漿冷凍至低於約-5℃的溫度；和
(g)在產生顆粒狀的、殘留水含量低於3重量％的凍幹
果漿粉末的條件下凍幹
果漿；
其中凍幹
果漿粉末比
果漿製劑更穩定和更可口。
5.權利要求4所述的方法，其中清洗步驟包括用0.1％(v/v)的衛生水清洗
果實。
6.權利要求4所述的方法，其中洗滌步驟包括在約80℃的溫度下在水中洗滌
果實約10秒鐘的一段時間。
7.權利要求4所述的方法，其中去殼步驟包括將
果實機械去殼約2分種到約5分鐘的一段時間，去殼步驟的進行使用約1升水/2千克
果實。
8.權利要求4所述的方法，其中
基營養補充劑組合物的ORACFL值大於約350微摩爾TE/克總重。
9.權利要求4所述的方法，其中
基營養補充劑組合物具有的環加氧酶抑制值大於約15阿司匹林_毫克當量/克總重。
10.一種預防或治療哺乳動物中由病理性自由基反應所導致的疾病或損傷的方法，該方法包括向該哺乳動物施用有效量的權利要求1-3中任何一項的
基營養補充劑組合物，其中該組合物猝滅自由基並減少由病理性自由基所導致的損傷。
11.權利要求10所述的方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌症、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性迴腸炎、血管病、關節炎、潰瘍、急性呼吸窘迫症候群、缺血-再灌注損傷、神經變性疾病、自閉症、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎症導致的組織損傷以及環境毒素導致的組織損傷。
12.一種減輕哺乳動物內病理性自由基反應的有害效應的方法，所述哺乳動物遭受疾病或損傷，該疾病或損傷是由哺乳動物中的病理性自由基反應所導致的，所述方法包括向該哺乳物施用有效量的權利要求1-3中任何一項的
基營養補充劑組合物，其中該組合物猝滅自由基並減少由病理性自由基所導致的損傷。
13.權利要求12所述的方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌症、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性迴腸炎、血管病、關節炎、潰瘍、急性呼吸窘迫症候群、缺血-再灌注損傷、神經變性疾病、自閉症、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎症導致的組織損傷以及環境毒素導致的組織損傷。
14.一種抑制哺乳動物內環加氧酶的方法，該方法包括向該哺乳物施用有效量的組合物，該組合物包含權利要求1-3中任何一項的
基營養補充劑組合物。
15.權利要求14所述的方法，其中組合物進一步包含藥用載體。
16.權利要求14所述的方法，其中組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。
17.一種預防或治療哺乳動物體內與環加氧酶活性升高相關的疾病或損傷的方法，該方法包括向該哺乳物施用有效量的組合物，該組合物包含權利要求1-3中任何一項的
基營養補充劑組合物。
18.權利要求17所述的方法，其中組合物進一步包含藥用載體。
19.權利要求17所述的方法，其中組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。
20.權利要求13中所述方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌症、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性迴腸炎、血管病、關節炎、潰瘍、急性呼吸窘迫症候群、缺血-再灌注損傷、神經變性疾病、自閉症、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎症導致的組織損傷以及環境毒素導致的組織損傷。
全文摘要
本發明涉及穩定的、可口的、凍幹的水果基營養補充劑。明確地，本發明涉及Aai果實和Jucara果實的具高抗氧化性能和環加氧酶抑制活性的組合物及其應用。本發明進一步提供從Aai果實和Jucara果實中製作穩定的、可口的、凍幹的水果基營養補充劑的方法。
文檔編號A61K36/889GK101238895SQ20071018231
公開日2008年8月13日 申請日期2004年3月22日 優先權日2003年3月21日
發明者K·A·默多克, A·G·紹斯 申請人:K2A公司