一種薯蕷皂苷青黴菌及其製備方法

2023-10-05 23:53:49 2

專利名稱：一種薯蕷皂苷青黴菌及其製備方法
技術領域：
本發明涉及能將薯蕷皂苷分解成薯蕷皂素的菌株，更具體涉及薯蕷皂苷青黴菌(Penicillum dioscin 051016.CCTCCNoM206001)，本發明還涉及該薯蕷皂苷青黴菌的製備方法。薯蕷皂苷青黴菌用於將含薯蕷皂苷的原料經發酵產生薯蕷皂素。
背景技術：
薯蕷皂素是從薯蕷屬植物中提取的，黃姜屬薯蕷屬，是提取薯蕷皂素的主要資源。用薯蕷皂素為原料的合成藥有200多種，其中有60％以上的甾體激素以薯蕷皂素為原料。
從薯蕷原料中提取薯蕷皂素的傳統方法是採用酸解法。用酸解法的提取工藝會產生大量的酸性有機廢水，汙染產區環境和河流，進行汙水處理將使生產成本大幅增加。因此，人們一直試圖用其它方法來替代酸解法，以避免對環境的汙染，並且取得了一定的進展。
現有從薯蕷原料中提取薯蕷皂素的方法有a、直接酸水解；b、預發酵後再進行酸水解；c、分離後再進行酸水解；d、酶解後再進行酸水解；e、微生物發酵後再進行酸水解等。
a、直接酸水解是傳統提取薯蕷皂素的方法該方法先用硫酸或鹽酸將薯蕷原料進行酸水解，水解物用鹼性物質中和至中性，再用水洗滌，乾燥後，再用溶劑提取薯蕷皂素，由於皂素在植物體內主要以薯蕷皂苷的形式與纖維素結合存在於細胞壁中，又因為植物細胞壁比較堅韌，因此直接酸水解法提取薯蕷皂素的提取率較低。
b、預發酵後再進行酸水解提取薯蕷皂素的方法為先將薯蕷原料在酸水解前自然發酵，使材料中的澱粉分解，植物體疏鬆後再進行酸水解，然後提取薯蕷皂素，可使薯蕷皂素的收率高於直接酸水解法。現在我國多數廠家都採用這種工藝生產薯蕷皂素。但由於自然發酵過程中多種微生物參與發酵，發酵條件難以控制，雜質增多使薯蕷皂素質量下降。為了提高薯蕷皂素的產率，除了預發酵法以外，加入纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、苦杏仁酶以及葡萄糖苷酶等酶液先進行酶解，使薯蕷皂苷暴露出來，在酸水解時可提高薯蕷皂素的產率。
c、分離後再進行酸水解提取薯蕷皂素的方法為將薯蕷原料加水磨碎過篩，先分離出纖維渣，過濾液經過沉澱排水後，上清液濃縮後用乙醇提取，乙醚沉澱得到水溶性皂苷，把分離得到的皂苷澱粉漿加入澱粉酶進行酶解，酶解後的糖渣再進行酸水解。
d、酶解後再進行酸水解提取薯蕷皂素的方法是華中工學院趙書申等人發明的，該方法採用純種黑麴黴菌，用未經自然發酵的生產原料，經蒸煮破壞了自身存在的各種酶以後，直接用黑麴黴菌接種發酵，再經硫酸水解，提取薯蕷皂素，其產率較前面的提取方法提高許多。
e、微生物發酵後再進行酸水解的方法是西北植物研究所和陝兩省衛東醫藥化工廠發明的，該方法將工藝路線分為三部分第一步先分離出纖維素，第二步接種菌種降解澱粉生成酵母粉，並得到糖渣，第三步將得到的糖渣進行酸水解，再提取皂素。該方法也比傳統工藝的提取率要高，並且減少了廢水的排放量。
綜上所述，雖然所有的工藝改進都比傳統直接採用酸解法提高了薯蕷皂素的提取率，且減少了酸水汙染物的排放量。但上述的所有工藝，無一例外地仍然需經過酸水解的步驟。因此，不可避免地會產生酸性有機廢水汙染物，且總量很大，而汙水處理的成本很高，導致許多酸性有機廢水汙染物對產區的環境和河流造成了嚴重的汙染。

發明內容
本發明的目的是提供一種薯蕷皂苷青黴菌，該菌可在常溫與含薯蕷皂苷的植物原料發酵，直接將薯蕷皂苷酶解成薯蕷皂素，薯蕷皂素得率達90％以上，不產生酸性有機廢水汙染物。本發明另一的目的是提供薯蕷皂苷青黴菌的製備方法，該方法是將薯蕷皂苷水解物純化至目的菌可能生長，而其它菌難以生長的環境，自然誘導薯蕷皂苷青黴菌的產生，再經檢測和純化得到薯蕷皂苷青黴菌。
為了達到上述目的，本發明採用如下技術方案一種薯蕷皂苷青黴菌051016，(Penicillum dioscin 051016)CCTCC NoM206001。
該薯蕷皂苷青黴菌的製備方法包含下列步驟(一)菌株的誘導、初篩方法按下列步驟進行a1、將含加入薯蕷皂苷原料洗淨、晾乾，其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成漿；a2、加溫至60℃，保溫2小時，過濾，取提取液；a3、將濾渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加溫至60℃，保溫2小時，過濾，取提取液；a4、重複步驟3；a5、合併三次提取液，於70℃減壓回收溶劑後得到提取物，加入原料量20倍的蒸餾水溶解提取物，再加入薯蕷皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重複萃取兩次，合併三次正丁醇萃取液，70℃減壓回收正丁醇至粉末狀，即為薯蕷皂苷；a6、將薯蕷皂苷用2Mol/L鹽酸95℃回流水解6小時，減壓蒸去酸水至幹，用1Mol/L的NaOH溶液調整PH值在4-7，85℃乾燥成薯蕷皂苷水解物；a7、加入薯蕷皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，殘渣與蒸餾水按重量1∶2的比例攪勻後作為培養基，置於20℃～28℃、相對溼度65％～80％的環境下，放置8～12天；a8、取培養基上不同形態的菌落作進一步地篩選；(二)按下列步驟，用高效液相檢測色譜儀檢測每種菌落與含薯蕷皂苷原料發酵後得到薯蕷皂素的含量，並根據薯蕷皂素含量的高低取捨菌落b1、將2～4克的含薯蕷皂苷原料洗淨，加入其重量5-10倍的自來水，磨碎成漿，100℃蒸煮30分鐘，冷至室溫；b2、取5mm2的菌落拌入含薯蕷皂苷原料的漿中，30℃發酵20～30小時，5000rmp離心10分鐘，棄上清液，取沉降物；b3、將沉降物在60℃乾燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合併提取液；
b4、60℃回收石油醚至幹，得到薯蕷皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作為待測樣品；b5、用高效液相檢測色譜儀檢測薯蕷皂素，條件為安捷倫1100型儀器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色譜柱，柱溫25℃，流動相為3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，檢測波長206nm；薯蕷皂素標準品溶於3∶2的甲醇/乙腈中，製備成1mg/ml的溶液，進樣量2μl，分析過程15分鐘；另取待測樣品同法進行高效液相色譜分析；b6、比較待測樣品中各種菌落所得產物的檢測結果，選取與含薯蕷皂苷原料發酵後得到薯蕷皂素含量最高的菌落；(三)菌株的純化按下列步驟進行c1、培養基由下列成分按重量的百分比組成蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO40.1、Fe2(SO4)30.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蕷皂苷水解物2、瓊脂1.5、餘者為水；c2、將培養基加熱至100℃，保溫30分鐘，製成平板，冷卻至20℃～30℃；c3、將步驟(二)得到的菌落用塗布法接種於培養基製成的平板上，25℃～30℃培養3-4天；c4、取培養基上不同形態的菌落；c5、再按步驟(二)得到菌落，從該菌落中取到的菌株即為本發明所述的薯蕷皂苷青黴菌。
本發明與現有技術相比具有以下優點1、與傳統採樣方法相比，本發明根據化學環境限制法或曰底物純化法的思路，將底物純化至目的菌可能生長的環境，除去了可能滋生其它菌類的底物，從而限制了其它菌類生長的條件，因此，本發明可簡便、快速地完成目的菌株的誘導篩選；2、本發明所得薯蕷皂苷青黴菌具有高度的專一性，即底物即便是兩種或兩種以上的薯蕷皂苷，所得產物均為薯蕷皂素；3、本發明所得薯蕷皂苷青黴菌具有很高的活性，使得用其發酵後的薯蕷皂素得率達90％以上；4、本發明所得薯蕷皂苷青黴菌可在常溫與含薯蕷皂苷原料發酵，取代酸水解，可降低能耗、減少環境汙染。


圖1為薯蕷原料經薯蕷皂苷青黴菌發酵得到的產物與酸水解後得到的產物的高效液相色譜分析結果的比較圖。
圖2為薯蕷原料經自然發酵得到的產物，經高效液相色譜分析之結果圖。
具體實施方案以下對薯蕷皂苷青黴菌及其製備方法作進一步的說明。
薯蕷皂苷青黴菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCCNoM206001。
薯蕷皂苷青黴菌的製備方法包含下列步驟(一)菌株的誘導、初篩方法按下列步驟進行a1、將含薯蕷皂苷原料洗淨、晾乾，加入其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成漿；
a2、加溫至60℃，保溫2小時，過濾，取提取液；a3、將濾渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加溫至60℃，保溫2小時，過濾，取提取液；a4、重複步驟3；a5、合併三次提取液，於70℃減壓回收溶劑後得到提取物，加入原料量20倍的蒸餾水溶解提取物，再加入薯蕷皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重複萃取兩次，合併三次正丁醇萃取液，70℃減壓回收正丁醇至粉末狀，即為薯蕷皂苷；a6、將薯蕷皂苷用2Mol/L鹽酸95℃回流水解6小時，減壓蒸去酸水至幹，用1Mol/L的NaOH溶液調整PH值在4-7，85℃乾燥成薯蕷皂苷水解物；a7、加入薯蕷皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，殘渣與蒸餾水按重量1∶2的比例攪勻後作為培養基，置於20℃～28℃、相對溼度65％～80％的環境下，放置8～12天；a8、取培養基上不同形態的菌落作進一步地篩選；(二)按下列步驟，用高效液相檢測色譜儀檢測每種菌落與含薯蕷皂苷原料發酵後得到薯蕷皂素的含量，並根據薯蕷皂素含量的高低取捨菌落b1、將2～4克的含薯蕷皂苷原料洗淨，加入其重量5-10倍的自來水，磨碎成漿，100℃蒸煮30分鐘，冷至室溫；b2、取5mm2的菌落拌入含薯蕷皂苷原料的漿中，30℃發酵20～30小時，5000rmp離心10分鐘，棄上清液，取沉降物；
b3、將沉降物在60℃乾燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合併提取液；b4、60℃回收石油醚至幹，得到薯蕷皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作為待測樣品；b5、用高效液相檢測色譜儀檢測薯蕷皂素，條件為安捷倫1100型儀器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色譜柱，柱溫25℃，流動相為3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，檢測波長206nm；薯蕷皂素標準品溶於3∶2的甲醇/乙腈中，製備成1mg/ml的溶液，進樣量2μl，分析過程15分鐘；另取待測樣品同法進行高效液相色譜分析；b6、比較待測樣品中各種菌落所得產物的檢測結果，選取與含薯蕷皂苷原料發酵後得到薯蕷皂素含量最高的菌落；(三)菌株的純化按下列步驟進行c1、培養基由下列成分按重量的百分比組成蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO40.1、Fe2(SO4)30.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蕷皂苷水解物2、瓊脂1.5、餘者為水；c2、將培養基加熱至100℃，保溫30分鐘，製成平板，冷卻至20℃～30℃；c3、將步驟(二)得到的菌落用塗布法接種於培養基製成的平板上，25℃～30℃培養3-4天；c4、取培養基上不同形態的菌落；c5、再按步驟(二)得到菌落，從該菌落中取到的菌株即為本發明所述的薯蕷皂苷青黴菌。
圖1為薯蕷原料經薯蕷皂苷青黴菌發酵得到的產物與酸水解後得到的產物的高效液相色譜分析結果的比較圖。
其橫坐標為保留時間，縱坐標為吸收強度。經高效液相色譜分析保留時間在11分鐘左右為薯蕷皂素，上圖0017.D為經薯蕷皂苷青黴菌發酵得到的產物，其保留時間為11.1分鐘，下圖0016.D為經酸水解得到的產物，其保留時間為11.08分鐘，兩者的誤差為0.02分鐘，因此，兩者可視為同一種產物。
用薄層色譜(TLC)分析及熔點測定均表明所得到的產物與皂素對照品一致。
圖2為薯蕷原料經自然發酵得到的產物，經高效液相色譜分析之結果圖。
該結果說明，薯蕷原料經自然發酵得到的產物不一定相同，其薯蕷皂素的產率甚微。
實施列用薯蕷皂苷青黴菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCCNoM206001製備薯蕷皂素的方法按下列步驟進行。
1、取薯蕷原料100公斤，清洗至無泥沙和其它雜質，經高效液相色譜分析，該薯蕷原料含薯蕷皂素2.3％；2、加入500公斤的水，將薯蕷原料破碎至5毫米以下；3、將已破碎的物料裝入發酵罐中，加入500克的氨水，拌勻，26℃密閉放置1小時；4、25℃接入100克的薯蕷皂苷青黴菌Penicillum dioscin051016，CCTCC NoM206001，攪拌均勻，在PH4～7條件下，26℃發酵30小時；5、過濾，將濾渣在65℃乾燥，再加入300升80℃沸程的石油醚；7、60℃回流提取2～3次，合併提取液；8、60℃回收石油醚至薯蕷皂素結晶析出；9、過濾，取薯蕷皂素結晶；10、用薯蕷皂素結晶兩倍重量的80℃沸程的石油醚60℃溶解，再緩慢加入乙醇至溶液渾濁，放置過夜，重結晶；11、濾取結晶，60℃乾燥4小時，稱重得2.08公斤薯蕷皂素，經高效液相色譜分析薯蕷皂素含量98.07％。
權利要求
1.一種薯蕷皂苷青黴菌，其特徵在於，薯蕷皂苷青黴菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCC NoM206001。
2.製備權利要求1所述的一種薯蕷皂苷青黴菌的方法，其特徵在於，該方法包含下列步驟(一)菌株的誘導、初篩方法按下列步驟進行a1、將含薯蕷皂苷原料洗淨、晾乾，加入其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成漿；a2、加溫至60℃，保溫2小時，過濾，取提取液；a3、將濾渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加溫至60℃，保溫2小時，過濾，取提取液；a4、重複步驟3；a5、合併三次提取液，於70℃減壓回收溶劑後得到提取物，加入原料量20倍的蒸餾水溶解提取物，再加入薯蕷皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重複萃取兩次，合併三次正丁醇萃取液，70℃減壓回收正丁醇至粉末狀，即為薯蕷皂苷；a6、將薯蕷皂苷用2Mol/L鹽酸95℃回流水解6小時，減壓蒸去酸水至幹，用1Mol/L的NaOH溶液調整PH值在4-7，85℃乾燥成薯蕷皂苷水解物；a7、加入薯蕷皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，殘渣與蒸餾水按重量1∶2的比例攪勻後作為培養基，置於20℃～28℃、相對溼度65％～80％的環境下，放置8～12天；a8、取培養基上不同形態的菌落作進一步地篩選；(二)按下列步驟，用高效液相檢測色譜儀檢測每種菌落與含薯蕷皂苷原料發酵後得到薯蕷皂素的含量，並根據薯蕷皂素含量的高低取捨菌落b1、將2～4克的含薯蕷皂苷原料洗淨，加入其重量5-10倍的自來水，磨碎成漿，100℃蒸煮30分鐘，冷至室溫；b2、取5mm2的菌落拌入含薯蕷皂苷原料的漿中，30℃發酵20～30小時，5000rmp離心10分鐘，棄上清液，取沉降物；b3、將沉降物在60℃乾燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合併提取液；b4、60℃回收石油醚至幹，得到薯蕷皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作為待測樣品；b5、用高效液相檢測色譜儀檢測薯蕷皂素，條件為安捷倫1100型儀器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色譜柱，柱溫25℃，流動相為3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，檢測波長206nm；薯蕷皂素標準品溶於3∶2的甲醇/乙腈中，製備成1mg/ml的溶液，進樣量2μl，分析過程15分鐘；另取待測樣品同法進行高效液相色譜分析；b6、比較待測樣品中各種菌落所得產物的檢測結果，選取與含薯蕷皂苷原料發酵後得到薯蕷皂素含量最高的菌落；(三)菌株的純化按下列步驟進行c1、培養基由下列成分按重量的百分比組成蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO40.1、Fe2(SO4)30.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蕷皂苷水解物2、瓊脂1.5、餘者為水；c2、將培養基加熱至100℃，保溫30分鐘，製成平板，冷卻至20℃～30℃；c3、將步驟(二)得到的菌落用塗布法接種於培養基製成的平板上，25℃～30℃培養3-4天；c4、取培養基上不同形態的菌落；c5、再按步驟(二)得到菌落，從該菌落中取到的菌株即為本發明所述的薯蕷皂苷青黴菌。
全文摘要
本發明公開了一種薯蕷皂苷青黴菌，薯蕷皂苷青黴菌Penicillumdioscin 051016.CCTCCNoM206001，涉及能將薯蕷皂苷分解成薯蕷皂苷元的菌株。該菌可在常溫與含薯蕷皂苷的植物原料發酵，直接將薯蕷皂苷酶解成薯蕷皂素，薯蕷皂素提取率達90％以上，不產生酸性有機廢水汙染物。本發明還公開了該菌的製備方法，該方法將薯蕷皂苷水解物純化至目的菌能生長，而其它菌難以生長的環境，自然誘導薯蕷皂苷青黴菌的產生，是一種快速、簡便、準確的分離、篩選能酶解薯蕷皂苷為薯蕷皂素的專一性很強的高活性菌株的方法。
文檔編號C12R1/80GK1920001SQ20061012451
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月14日 優先權日2006年9月14日
發明者盧大炎, 張麗紅, 葉晚成 申請人:中國科學院武漢植物園