抗原結合構建體的製作方法

2023-10-06 06:19:24 1

專利名稱：抗原結合構建體的製作方法
抗原結合構建體背景抗體在治療應用方面的用途眾所周知。抗體為包含至少兩條重鏈和兩條輕鏈的異多聚體糖蛋白。除IgM外，完整抗體通 常是大約150Kda的異四聚體糖蛋白，其由兩條同樣的輕(L)鏈和兩條同樣的重鏈(H)鏈組 成。通常每一條輕鏈由一個共價二硫鍵與重鏈連接，同時不同免疫球蛋白同種型重鏈之間 的二硫鍵的數目不同。每一條重鏈和輕鏈也具有鏈間二硫鍵橋。每一重鏈在一端有可變結 構域(VH)，接著是多個恆定區。每一輕鏈有可變結構域(VL)並在其另一端有恆定區；輕鏈 恆定區與重鏈第一恆定區並排，輕鏈可變結構域與重鏈可變結構域並排。基於恆定區氨基 酸序列，將來自大部分脊椎動物物種的抗體輕鏈指定為稱為κ和λ的兩類中的一種。根據 其重鏈恆定區的胺基酸序列，可將人抗體指定為5種不同類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。 可將IgG和IgA進一步再分為亞類:IgGU IgG2、IgG3和IgG4 ；和IgAl和IgA2。在小鼠和 大鼠中具有至少IgG2a、IgG2b的物種間變體。抗體可變結構域因抗體含有顯示特定變化性 的稱為互補決定區(CDR)的某些區域而提供結合特異性。可變區更保守的部分被稱為構架 區(FR)。完整重鏈和輕鏈可變結構域各自包含由三個CDR連接的四個FR。各鏈中的CDR 通過FR區緊密接近保持在一起，並與來自其它鏈的CDR促成抗體的抗原結合位點的形成。 恆定區不直接參與抗體抗原間結合，但呈現各種效應器功能，例如參與以下功能抗體依賴 性細胞介導細胞毒性(ADCC)、經由結合Fc γ受體的吞噬作用、經由新生Fc受體(FcRn)的 半衰期/清除率和經由補體級聯的Clq組分的補體依賴性細胞毒性。IgG抗體結構的特性是有兩個抗原結合位點，其中兩個都特異性針對同一表位。因 此，它們為單特異性。雙特異性抗體是對至少兩種不同的表位有結合特異性的抗體。製備所述抗體的 方法為本領域所知。傳統上，雙特異性抗體的重組製備是基於兩個免疫球蛋白H鏈-L鏈 配對的共表達，其中兩個H鏈具有不同的結合特異性，參見=Millstein等，Nature 305 537-539(1983) ；W093/08829 ；和 Traunecker 等 ΕΜΒ0，10，1991，3655-3659。因為 H 鏈和 L 鏈隨機分配，產生了十種不同的抗體結構的潛在混合物，其中僅一種具有所需的結合特異 性。備選方法涉及讓具有所需結合性特異的可變結構域與重鏈恆定區融合，所述重鏈恆定 區包含至少部分鉸鏈區、CH2和CH3區。優選使含輕鏈結合所需位點的CHl區存在於融合體 中的至少之一中。將編碼這些融合體以及需要時的L鏈的DNA插入到單獨的表達載體中， 然後共轉染到合適的宿主生物體。然而可將兩條或所有三條鏈的編碼序列插入到一個表達 載體。在一種方法中，雙特異性抗體由在一條臂上具有第一結合特異性的H鏈和在另一條 臂上提供第二結合特異性的H-L鏈對組成，參見W094/04690。也參見Suresh等Methods in Enzymology 121，210，1986。其它方法包括包含單結構域結合位點的抗體分子，其由 W02007/095338 提出。發明概述本發明涉及抗原結合構建體，所述構建體包含連接一個或多個表位結合結構域的 蛋白質骨架，其中所述抗原結合構建體具有至少兩個抗原結合位點，其中至少之一來自表
5位結合結構域，並且其中至少之一來自配對的VH/VL結構域。本發明進一步涉及抗原結合構建體，所述構建體包含至少一個包含兩個或多個式 I結構的同型二聚體
(R7)m (R8)m
II
(R6)m(R3)m
II
輕鏈恆定結構域……·重鏈恆定結構域1
II
(R5)m (R2)m
II
(R4)m X I
(R1)n
(I)其中X代表包含重鏈恆定結構域2和重鏈恆定結構域3的抗體恆定區；R1、R4、R7和R8代表獨立選自表位結合結構域的結構域；R2代表選自重鏈恆定結構域1和表位結合結構域的結構域；R3代表選自配對的VH和表位結合結構域的結構域；R5代表選自輕鏈恆定結構域和表位結合結構域的結構域；R6代表選自配對的VL和表位結合結構域的結構域；η代表獨立選自以下的整數0、1、2、3和4 ；m代表獨立選自以下的整數0和1 ；其中重鏈恆定結構域1和輕鏈恆定結構域相連接(associate)；其中存在至少一個表位結合結構域；並且當R3代表配對的VH結構域時，R6代表配對的VL結構域，由此兩個結構域一 起能夠結合抗原。本發明涉及基於IgG的結構和製備所述構建體的方法及其用途，尤其是在治療中 的用途，所述基於IgG的結構包括單克隆抗體或連接一個或多個結構域抗體的片段。本發明還提供編碼本文所述任一種抗原結合構建體的重鏈的多核苷酸序列和編 碼本文所述任一種抗原結合構建體輕鏈的多核苷酸。所述多核苷酸表示對應於等同多肽序 列的編碼序列，然而，應該理解，可將所述多核苷酸序列連同起始密碼子、合適的信號序列 和終止密碼子一起克隆到表達載體中。本發明還提供重組轉化的或轉染的宿主細胞，所述宿主細胞包含一種或多種編碼
6任一種本文所述抗原結合構建體的重鏈和輕鏈的多核苷酸。本發明進一步提供用於製備任一種本文所述抗原結合構建體的方法，所述方法包 括在無血清培養基中培養包含第一和第二載體的宿主細胞的步驟，所述第一載體包含編碼 任一種本文所述抗原結合構建體的重鏈的多核苷酸，所述第二載體包含編碼任一種本文所 述抗原結合構建體的輕鏈的多核苷酸。本發明進一步提供藥用組合物，所述藥用組合物包含本文所述抗原結合構建體及 可藥用載體。本發明還提供包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示多肽序列的結構域抗體或由 其組成的結構域抗體。本發明一個方面提供從SEQID N0:60或SEQ ID NO :61所示的多核 苷酸序列表達的蛋白質。定義本文所用術語「蛋白質骨架」包括但不限於免疫球蛋白(Ig)骨架(例如IgG骨 架)，其可為四鏈抗體或兩鏈抗體，或其可僅包含抗體的Fc區，或其可包含來自抗體的一個 或多個恆定區，所述恆定區可為人源或靈長類源，或其可為人和靈長類恆定區的人造嵌合 體。所述蛋白質骨架除一個或多個恆定區外還可包含抗原結合位點，例如所述蛋白質骨架 包含全IgG。所述蛋白質骨架能夠連接其它蛋白質結構域，例如具有抗原結合位點的蛋白質 結構域，例如表位結合結構域或ScFv結構域。「結構域」是摺疊的蛋白質結構，其具有不依賴蛋白質其餘部分的三級結構。結構 域通常負責蛋白質不相關聯的功能特性，在很多情況下可將其添加、除掉或轉移到其它蛋 白質而不丟失所述蛋白質其餘部分和/或結構域的功能。「單一抗體可變結構域」是摺疊的 多肽結構域，其包含抗體可變結構域的序列特點。因此，其包括完整的抗體可變結構域和經 修飾的可變結構域，例如，其中一個或多個環已被不具有抗體可變結構域特性的序列取代 的可變結構域，或已被截短的或包含N-或C-末端突出端的抗體可變結構域，以及保留至少 全長結構域的結合活性和特異性的可變結構域的摺疊片段。短語「免疫球蛋白單一可變結構域」指抗體可變結構域(Vh、Vhh、\)，所述抗體可變 結構域獨立於不同V區或結構域地特異性結合抗原或表位。免疫球蛋白單一可變結構域可 以以某種形式(例如同多聚體或異多聚體)與其它不同可變區或可變結構域存在，其中所 述其它區或結構域對於通過單一免疫球蛋白可變結構域結合抗原不是必需的(即其中免 疫球蛋白單一可變結構域不依賴另外的可變結構域結合抗原)。「結構域抗體」或「dAb」與 如本文所用術語「免疫球蛋白單一可變結構域」 一樣，能夠結合抗原。免疫球蛋白單一可變 結構域可為人抗體可變結構域，但也包括來自以下其它物種的單一抗體可變結構域例如 齧齒動物(例如如WO 00/29004所公開)、鉸口鯊和駱駝(Camelid)VHHdAb。駱駝Vhh為源自 以下物種的免疫球蛋白單一可變結構域多肽包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和駱馬，它 們都產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體。所述Vhh結構域可根據本領域能獲得的標準技術人源 化，認為所述結構域仍為本發明「結構域抗體」。本文所用Vh包括駱駝Vra結構域。NARV是在 軟骨魚(包括鉸口鯊)中鑑定的另一類免疫球蛋白單一可變結構域。這些結構域也被稱為 新型抗原受體可變結構域(Novel Antigen Receptor variable region通常縮寫為V(NAR) 或 NARV)。進一步的詳細資料參見 Mol. Immunol. 44，656-665 (2006)和 US20050043519A。術語「表位結合結構域」指特異性結合獨立於不同的V區或結構域地特異性結合抗原或表位的結構域，所述表位結合結構域可為結構域抗體(dAb)，例如人、駱駝或鯊魚免 疫球蛋白單一可變結構域，或其可為選自以下的骨架衍生物結構域CTLA-4 (Evibody)；脂 質運載蛋白；來源於蛋白A的分子，例如蛋白A的Z-結構域(Affibody，SpA)、A-結構域 (Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白，例如GroEl和GroES ；轉鐵蛋白(trans-body)；錨蛋白重 復蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結構域(四連凝集素(Tetranectin)) 』人γ-晶體 蛋白和人泛素(affilin) ；PDZ結構域；人蛋白酶抑制劑蠍毒素kimitz型結構域；和纖連蛋 白(adnectin)；對它們進行過蛋白質工程改造，以便獲得結合不同於天然配體的配體。CTLA_4(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)是在主要⑶4+T-細胞上表達的⑶28-家 族受體。其胞外結構域具有可變結構域樣Ig摺疊。對應於抗體CDR的環可被異源序列 取代，以提供不同的結合性質。經過工程改造具有不同結合特異性的CTLA-4分子也被稱 為 Evibody。進一步的詳細資料參見 Journal of Immunological Methods 248(1-2)， 31-45(2001)。脂質運載蛋白是胞外蛋白質家族，其轉運小疏水分子如類固醇、膽汁三烯、類視黃 醇和脂質。它們具有在錐形結構開放末端處具有多個環的剛性摺疊二級結構，可以 經過工程改造以結合不同靶抗原。Anticalin大小為160-180個胺基酸，源自脂質運載蛋 白。進一步的詳細資料參見 Biochim Biophys Acta 1482 :337_350 (2000)，US7250297B1 和 US20070224633。Affibody為源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的骨架，可將 其工程改造以結合抗原。所述結構域由大約58個胺基酸的三螺旋束組成。通過表面殘基 的隨機化產生文庫。進一步的詳細資料參見Protein Eng. Des. Sel. 17，455-462 (2004)和 EP1641818A1。Avimer為源自A-結構域骨架家族的多結構域蛋白質。大約35個胺基酸的天然 結構域採用明確的二硫鍵合結構。通過對由A-結構域家族表現的天然變異進行改組來產 生多樣性。進一步的詳細資料參見 Nature Biotechnology 23 (12)，1556-1561 (2005)和 Expert Opinion onlnvestigational Drugs 16 (6), 909-917 (2007 年六月)。轉鐵蛋白為單體血清轉運糖蛋白。可通過在允許的表面環中插入肽序列對轉鐵蛋 白進行工程改造以結合不同的靶抗原。工程改造的轉鐵蛋白骨架的實例包括Trans-body。 進一步的詳細資料參見 J. Biol. Chem 274，24066-24073 (1999)。設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin)源自錨蛋白(Ankyrin)，所述錨蛋白為介導內 膜蛋白與細胞骨架連接的蛋白質家族。單一錨蛋白重複序列為由兩個α-螺旋和β-轉 角組成的33個殘基的基序。可通過使每一重複序列的第一個α-螺旋和β-轉角中的 殘基隨機化對其進行工程改造以結合不同靶抗原。可通過增加功能模件(module)的數 量來增大其結合界面(親和力成熟方法)。進一步的詳細資料參見J.Mol.Biol.332， 489-503(2003)、PNAS 100 (4)，1700-1705 (2003)和 J. Mol. Biol. 369，1015-1028 (2007)和 US20040132028A1。纖連蛋白是可對其進行工程改造以結合抗原的骨架。Adnectin由人纖連蛋白III 型(FN3)的15個重複單位的第10個結構域的天然胺基酸序列骨架組成。可對β-夾層 的一端的三個環進行工程改造以使Adnectin能特異性識別目的治療靶標。進一步的詳 細資料參見 ProteinEng. Des. Sel. 18，435-444(2005)、US20080139791、W02005056764 和
8US6818418B1。肽適體為由固定骨架蛋白組成的組合識別分子，其通常是含有插入到活性位點的 限制性可變肽環的硫氧還蛋白(TrxA)。進一步的詳細資料參見Expert Opin. Biol. Ther. 5， 783-797(2005)。微體源自天然存在的長為25-50個胺基酸的含有3-4個半胱氨酸橋的微蛋白質， 微蛋白實例包括KalataBl和食魚螺毒素和打結素(knottin)。微蛋白具有可工程改造以包 括至多25個胺基酸而不影響微蛋白的整體摺疊的環。工程改造的打結素結構域的進一步 的詳細資料參見W02008098796。其它表位結合結構域包括用作骨架以工程改造不同靶抗原結合特性的蛋白質，包 括在 Handbook of Therapeutic Antibodies (2007，由 Stefan Dubel 主編)第 7章-非抗體 骨架和Protein Science 15:14-27(2006)中綜述的人Y-晶體蛋白和人泛素(affilin)、 人蛋白酶抑制劑kimitz型結構域、Ras-結合蛋白AF-6的PDZ-結構域、蠍毒素(卡律布德 蠍毒素(charybdotoxin) )、C_型凝集素結構域(四連凝集素)。本發明表位結合結構域可 源自這些備選蛋白質結構域中的任一種。本文所用術語「配對的VH結構域」、「配對的VL結構域」和「配對的VH/VL結構域」 指僅當與其配偶體(partner)可變結構域配對時特異性結合抗原的抗體可變結構域。在任 何配對中總是有一個VH和一個VL，術語「配對的VH結構域」指VH配偶體，術語「配對的VL 結構域」指VL配偶體，術語「配對的VH/VL結構域」指兩個結構域一起。在本發明一個實施方案中，抗原結合位點以以下Kd結合抗原至少ImM的Kd，例 如10ηΜ、1ηΜ、500ρΜ、200ρΜ、IOOpM的Kd，對每一抗原如Biacore 所測量，例如在方法4或5 中所述的Biacore 方法。本文所用術語「抗原結合位點」指構建體上能夠特異性結合抗原的位點，其可為單 一結構域，例如表位結合結構域，或其可為如能在標準抗體上發現的配對的VH/VL結構域。 在本發明某些方面，單鏈Fv(ScFv)結構域可提供抗原結合位點。本文所用術語「mAb/dAb」和「dAb/mAb」指本發明抗原結合構建體。這兩個術語可 互換使用，意欲具有如本文所用相同的意義。本文所用術語「重鏈恆定結構域1」指免疫球蛋白重鏈的CHl結構域。本文所用術語「輕鏈恆定結構域」指免疫球蛋白輕鏈的恆定結構域。發明詳述本發明涉及包含蛋白質骨架的抗原結合構建體，所述骨架連接一個或多個表位結 合結構域，其中所述抗原結合構建體具有至少兩個抗原結合位點，其中至少一個來自表位 結合結構域，其中至少一個來自配對的VH/VL結構域。所述抗原結合構建體包含蛋白質骨架，例如Ig骨架(例如IgG)，例如單克隆抗體， 所述骨架連接一個或多個表位結合結構域，例如結構域抗體，其中所述結合構建體具有至 少兩個抗原結合位點，其中至少一個來自表位結合結構域。本發明涉及製備所述抗原結合 構建體的方法及其用途，尤其是在治療中的用途。本發明抗原結合構建體的某些實例在

圖1中闡述。本發明抗原結合構建體也被稱為mAbdAb。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體的蛋白質骨架為Ig骨架，例如IgG骨架或IgA骨架。化6骨架可包含抗體的所有結構域(即011、012、013、￥!1、￥1^)。本發明抗 原結合構建體可包含選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE的IgG骨架。本發明抗原結合構建體具有至少兩個抗原結合位點，例如其具有兩個結合位點， 例如其中第一個結合位點對抗原第一表位具有特異性，第二結合位點對同一抗原的第二表 位具有特異性。在另一實施方案中，有4個抗原結合位點，或6個抗原結合位點，或8個抗 原結合位點，或10個或更多個抗原結合位點。在一個實施方案中，所述抗原結合構建體對 不止一個抗原具有特異性，例如對兩個抗原，或對三個抗原，或對四個抗原具有特異性。在另一方面，本發明涉及包含至少一個包含兩個或更多個式I結構的同型二聚體 的抗原結合構建體


m
(R7)1
I
(R6)m
I
(R8)m I
(R3)m I
輕鏈恆定結構域·…·重鏈恆定結構域
I
(R5)m I
(R4)m
m
I
(R2) I
χ
I
(R1)n
其中
X代表包含重鏈恆定結構域2和重鏈恆定結構域3的抗體恆定區； R1 > R4> R7和R8代表獨立選自表位結合結構域的結構域； R2代表選自重鏈恆定結構域1和表位結合結構域的結構域； R3代表選自配對的VH和表位結合結構域的結構域； R5代表選自輕鏈恆定結構域和表位結合結構域的結構域； R6代表選自配對的VL和表位結合結構域的結構域； η代表獨立選自以下的整數0、1、2、3和4 ； m代表獨立選自以下的整數0和1 ； 其中重鏈恆定結構域1和輕鏈恆定結構域相連接； 其中存在至少一個表位結合結構域；
當R3代表配對的VH結構域時，R6代表配對的VL結構域，由此兩個結構域-夠結合抗原。在一個實施方案中，R6代表配對的VL，R3代表配對的VH。在另一實施方案中，R7和R8任一個或兩個都代表表位結合結構域。
-起能
10
在又一實施方案中，R1和R4任一個或兩個都代表表位結合結構域。在一個實施方案中，R4存在。在一個實施方案中，R1R7和R8代表表位結合結構域。在一個實施方案中，R1R7和R8及R4代表表位結合結構域。在一個實施方案中，(R1)n^ (R2)m、(R4)m和(R5)m = O,即不存在，R3為配對的VH結 構域，R6為配對的VL結構域，R8為VH dAb，而R7為VL dAb。在另一實施方案中，(R1)n^ (R2)m、(R4)m和(R5)n^O,即不存在，R3為配對的VH結 構域，R6為配對的VL結構域，R8為VH dAb，而(R7)m = 0，即不存在。在另一實施方案中，(R2)m和(R5)mSO,即不存在，R1SdAb, R4SdAb, R3為配對 的VH結構域，R6為配對的VL結構域，(R8)n^P (R7)m = 0，即不存在。在本發明一個實施方案中，所述表位結合結構域為dAb。應該理解，本文所述任一種抗原結合構建體能夠中和一種或多種抗原。本說明書中各處使用的關於本發明抗原結合構建體的術語「中和」及其語法變體， 意指在本發明抗原結合構建體存在下靶標的生物活性與在缺乏所述抗原結合構建體時的 靶標的活性相比，總體或部分降低了。可由於(但不限於)以下一種或多種原因發生中和 封阻配體結合，妨礙配體激活受體，下調受體或影響效應器功能。可以若干方法測量中和水平，例如通過使用由下文實施例及方法提出的測定中的 任何一種，例如測量配體受體結合抑制的測定，其可如例如方法12、19或21或實施例32中 任一個所述進行。通過評估在中和性抗原結合構建體存在下配體與其受體之間結合的降低 情況來測量這些測定中VEGF、IL-4、IL-13或HGF的中和。還可例如在TFl測定中測量中和水平，該測定可例如如方法8、9、10、20或21中所 述來實施。在該測定中IL-13、IL-4或這兩種細胞因子的中和都可通過評估在中和性抗原 結合構建體存在下抑制TFl細胞增殖來測量。或者，可在EGFR磷酸化測定中測量中和，該 測定可例如如方法13所述實施。可通過評估在中和性抗原結合構建體存在下受體的酪氨 酸激酶磷酸化的抑制來測量該測定中的EGFR中和。或者，可用MRC-5細胞中的IL-8分泌 測定來測量中和，該測定可例如如方法14或15中所述來實施。在該測定中可通過評估在 中和性抗原結合構建體存在下IL-8分泌的抑制來測量NF α或IL-IRl的中和。例如，通過評估在中和性抗原結合構建體存在下配體與其受體之間的結合降低情 況來評估中和的其它方法在本領域已知，包括例如Biacore 測定。本發明備選方面提供抗原結合構建體，所述抗原結合構建體具有與本文所舉例的 抗體至少基本上等同的中和活性，例如，分別在實施例4和20中提出的TFl細胞增殖測定 或 pSTAT6 信號轉導抑制測定中保留 586H-TVAAPS-210 或 PascoH-G4S_474 或 PascoH-474、 除去GS的PascoH-474、PascoL-G4S_474或PascoHL-G4S_474的中和活性的抗原結合構建 體；或例如在實施例14. 6和14. 7提出的VEGFR結合測定或IGF-IR受體磷酸化的抑制中保 留BPC1603、BPC1604、BPC1605、BPC1606的中和活性的抗原結合構建體。本發明抗原結合構建體包括對IL-13具有特異性的抗原結合構建體，例如包含能 夠結合IL-13的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合IL-13的配對的VH/VL的 抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合IL-13的抗體。抗原結合構建體可包含 能夠結合IL-13的dAb。
在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體對不止一種抗原具有特異性，例如其 中所述抗原結合構建體能夠結合選自IL-13、IL-5和IL-4的兩種或更多種抗原，例如其中 能夠結合IL-13和IL-4，或其中能夠結合IL-13和IL-5，或其中能夠結合IL-5和IL-4。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體對不止一種抗原具有特異性，例如其 中所述抗原結合構建體能夠結合選自IL-13、IL-5和IL-4的兩種或更多種抗原，例如其 中能夠同時結合IL-13和IL-4，或其中能夠同時結合IL-13和IL-5，或其中能夠同時結合 IL-5 和 IL-4。應該理解，本文所述任何抗原結合構建體可以能夠同時結合兩種或更多種抗原， 例如其如通過用合適測定的化學計量學分析所測定，所述合適的測定例如實施例部分方法 7中所述測定。本發明抗原結合構建體實例包括具有對IL-4有特異性的表位結合結構域(例如 抗-IL-4dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的C-末端或η_末端)的IL-13抗 體，例如具有 SEQ ID NO: 16-39、SEQ IDNO :41_43、SEQ ID NO 87-90, SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO 152或SEQID NO 155所述的重鏈序列的mAbdAb。本發明抗原結合構建體包括具有 連接到重鏈的η-末端的IL-4表位結合結構域的IL-13抗體。本發明抗原結合構建體包括 具有連接到輕鏈的η-末端的IL-4表位結合結構域的IL-13抗體。本發明抗原結合構建體 包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-4表位結合結構域的IL-13抗體。本發明抗原結合構 建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-4表位結合結構域的IL-13抗體。所述抗原結合 構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原特異性的另外的表位結合結構域，所述 表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。這樣的抗原結合構建體的實例包括具有對IL-13有特異性的表位結合結構域(例 如抗-IL-13dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的c_末端或n_末端)的IL-4 抗體，例如具有 SEQ ID NO 48-53, SEQID NO :91、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :149、SEQ ID NO 150或SEQ IDNO 157-160中所述的重鏈序列和/或SEQ ID NO :54_59中所述的輕鏈序 列的 mAbdAb。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域 的IL-4抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的IL-13表位結合結 構域的IL-4抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-13表位 結合結構域的IL-4抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-13 表位結合結構域的IL-4抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同 的抗原特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或 η-末端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。所述抗原結合構建體的實例包括具有對IL-5有特異性的表位結合結構域(例如 抗-IL-5dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的C-末端或η_末端)的IL-13抗 體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-5表位結合結構域的IL-13 抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的IL-5表位結合結構域的 IL-13抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-5表位結合結構 域的IL-13抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-5表位結合 結構域的IL-13抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末端 和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。所述抗原結合構建體實例包括具有對IL-13有特異性的表位結合結構域(例如 抗-IL-13dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的c_末端或n_末端)的IL-5抗 體，例如具有SEQ ID NO 72中所述的輕鏈序列的mAbdAb。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域 的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的IL-13表位結合結 構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-13表位 結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-13 表位結合結構域的IL-5抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同 的抗原特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或 η-末端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。所述抗原結合構建體實例包括具有對IL-5有特異性的表位結合結構域(例如 抗-IL-5dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的C-末端或η_末端)的IL-4抗 體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-5表位結合結構域的IL-4 抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的IL-5表位結合結構域的 IL-4抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-5表位結合結構域 的IL-4抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-5表位結合結 構域的IL-4抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原特異 性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末端和 /或輕鏈的C-末端和/或η-末端。所述抗原結合構建體實例包括具有對IL-4有特異性的表位結合結構域(例如 抗-IL-4dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的C-末端或η_末端)的IL-5抗 體，例如具有SEQ ID NO 71中所述的重鏈序列的mAbdAb。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-4表位結合結構域的 IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的IL-4表位結合結構域 的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-4表位結合結 構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-4表位結 合結構域的IL-5抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原 特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末 端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。本發明還提供三特異性結合構建體，其能夠結合IL-4、IL-13和IL_5。所述抗原結合構建體的實例包括具有對IL-4有特異性的表位結合結構域(例如 抗-IL-4dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的C-末端或η-末端)和對IL-13 有特異性的表位結合結構域(例如抗_IL-13dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈 的C-末端或η-末端)的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的Π-末端的IL-4表位結合結構域和 連接到輕鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-4表位結合結構域和連接到輕鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-連接到重鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的IL-連接到輕鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的IL-連接到重鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的IL-連接到重鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-連接到輕鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-連接到輕鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的IL-連接到重鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-連接到重鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-連接到重鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的IL-連接到輕鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-5抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原特異性的另外 的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末端和/或輕鏈 的C-末端禾口 /或η-末端。本發明抗原結合構建體包括對IL-18具有特異性的抗原結合構建體，例如包含能 夠結合IL-18的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合IL-18的配對的VH/VL的 抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合IL-18的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 IL-18 的 dAb。本發明還提供能夠結合IL-4、IL-13和IL-18的三特異性結合構建體。所述抗原結合構建體實例包括具有對IL-4具有特異性的表位結合結構域(例如 抗-IL-4dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的C-末端或η-末端)和對IL-13 具有特異性的表位結合結構域(例如抗_IL-13dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕 鏈的C-末端或η-末端)的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-4表位結合結構域和 連接到輕鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-4表位結合結構域和 連接到輕鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的IL-4表位結合結構域和
4表位結合結構域和 4表位結合結構域和 4表位結合結構域和 4表位結合結構域和 4表位結合結構域和 4表位結合結構域和 4表位結合結構域和 4表位結合結構域和 4表位結合結構域和 4表位結合結構域和連接到重鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的 連接到輕鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的 連接到重鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的 連接到重鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的 連接到輕鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的 連接到輕鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的 連接到重鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的 連接到重鏈的C-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的 連接到重鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的 連接到輕鏈的η-末端的IL-13表位結合結構域的IL-18抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原特異性的另外 的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末端和/或輕鏈 的C-末端和 /或η-末端。本發明抗原結合構建體包括對TNF α具有特異性的抗原結合構建體，例如包含能 夠結合TNF α的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合TNF α的配對的VH/VL的 抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合TNF α的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 TNFa 的 dAb。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體對不止一種抗原具有特異性，例如其 中所述抗原結合構建體能夠結合選自TNFa、EGFR和VEGF的兩種或更多種抗原，例如其中 所述抗原結合構建體能夠結合TNF α和EGFR，或其中所述抗原結合構建體能夠結合TNF a 和VEGF，或其中所述抗原結合構建體能夠結合EGFR和VEGF。所述抗原結合構建體實例包 括具有對EGFR具有特異性的表位結合結構域(例如抗-EGFR dAb，其連接到重鏈的c_末端 或η-末端或輕鏈的C-末端或η-末端)的TNF α抗體，例如具有SEQ ID NO :74中所述的 重鏈序列和/或SEQ ID NO 79中所述的輕鏈序列的mAbdAb。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的EGFR表位結合結構域的 TNFa抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的EGFR表位結合結構域 的TNF α抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的EGFR表位結合結 構域的TNF α抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的EGFR表位結 合結構域的TNF α抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原
IL-4表位結合結構域和 IL-4表位結合結構域和 IL-4表位結合結構域和 IL-4表位結合結構域和 IL-4表位結合結構域和 IL-4表位結合結構域和 IL-4表位結合結構域和 IL-4表位結合結構域和 IL-4表位結合結構域和特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末 端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的TNF α表位結合結構域 的EGFR抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的TNF α表位結合結 構域的EGFR抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的TNFa表位 結合結構域的EGFR抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的TNF α 表位結合結構域的EGFR抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同 的抗原特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或 η-末端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。所述抗原結合構建體實例包括具有對VEGF具有特異性的表位結合結構域(例如 抗-VEGF dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的C-末端或η-末端)的TNF α抗 體，例如具有SEQ ID NO :75、78或185中所述的重鏈序列的mAbdAb。本發明抗原結合構建體可對不止一種抗原具有特異性，例如其中所述抗原結合構 建體能夠結合TNFa及選自IL-4和IL-13的一種或兩種抗原，例如其中所述抗原結合構建 體能夠結合TNF α和IL-4，或其中所述抗原結合構建體能夠結合TNF α和IL-13，或其中所 述抗原結合構建體能夠結合TNF α和IL-13和IL-4。所述抗原結合構建體實例包括具有對 TNF α具有特異性的表位結合結構域(例如抗-TNF α adnectin,其連接到重鏈的c_末端或 η-末端或輕鏈的C-末端或η-末端)的IL-13抗體，例如具有SEQ ID NO 134或135中所 述的重鏈序列的mAbdAb。所述抗原結合構建體其它實例包括具有對TNF α具有特異性的表 位結合結構域(例如抗-TNF α adnectin,其連接到重鏈的c_末端或n_末端或輕鏈的c_末 端或η-末端)的IL-4抗體，例如具有SEQ ID NO 146或147中所述的重鏈序列的mAbdAb。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的VEGF表位結合結構域的 TNFa抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的VEGF表位結合結構域 的TNF α抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的VEGF表位結合結 構域的TNF α抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的VEGF表位結 合結構域的TNF α抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原 特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末 端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的TNF α表位結合結構域 的VEGF抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的TNF α表位結合結 構域的VEGF抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的TNFa表位 結合結構域的VEGF抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的TNF a 表位結合結構域的VEGF抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同 的抗原特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或 η-末端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。本發明抗原結合構建體包括對CD-20具有特異性的抗原結合構建體，例如包含能 夠結合CD-20的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合CD-20的配對的VH/VL的 抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合⑶-20的抗體，例如，其可包含具有SEQ ID NO
16120和117的重鏈和輕鏈序列的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合⑶-20的dAb。 對⑶-20具有特異性的mAbdAb的實例為具有SEQ ID NO 116，118中所述的重鏈序列的 mAbdAb，或具有SEQ ID NO 119或121中所述的輕鏈序列的mAbdAb。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原特異性的另外 的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末端和/或輕鏈 的C-末端禾口 /或η-末端。本發明抗原結合構建體包括對ILlRl具有特異性的抗原結合構建體，例如包含能 夠結合ILlRl的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合ILlRl的配對的VH/VL的 抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合ILlRl的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 ILlRl 的 dAb。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體對不止一種抗原具有特異性，例如其 中所述抗原結合構建體能夠結合ILlRl和第二種抗原，例如其中所述抗原結合構建體能夠 結合ILlRl和VEGF。所述抗原結合構建體實例包括具有對VEGF具有特異性的表位結合結 構域(例如抗-VEGF dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的c_末端或n_末端) 的ILlRl抗體，例如具有SEQ ID NO 77中所述的輕鏈序列的mAbdAb。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的VEGF表位結合結構域的 ILlRl抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的VEGF表位結合結構域 的ILlRl抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的VEGF表位結合結 構域的ILlRl抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的VEGF表位結 合結構域的ILlRl抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原 特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末 端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的η-末端的ILlRl表位結合結構域 的VEGF抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的η-末端的ILlRl表位結合結 構域的VEGF抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到重鏈的C-末端的ILlRl表位 結合結構域的VEGF抗體。本發明抗原結合構建體包括具有連接到輕鏈的C-末端的ILlRl 表位結合結構域的VEGF抗體。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同 的抗原特異性的另外的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或 η-末端和/或輕鏈的C-末端和/或η-末端。本發明抗原結合構建體包括對EGFR具有特異性的抗原結合構建體，例如所述抗 原結合構建體包含能夠結合EGFR的表位結合結構域，或包含結合EGFR的配對的VH/VL。抗原結合構建體可包含能夠結合EGFR的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 EGFR的dAb。所述抗原結合構建體某些實例將能夠結合包含SEQ ID NO 103的EGFR上的 表位，例如，包含 SEQ ID NO :97-SEQ ID N0:102 禾口 SEQ ID NO :104_SEQ ID N0:107 中所述 的CDR中的一個或多個的抗原結合構建體。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體對不止一種抗原具有特異性，例如其 中所述抗原結合構建體能夠結合選自EGFR、IGF-1R、VEGFR2和VEGF的兩個或多個抗原， 例如其中所述抗原結合構建體能夠結合EGFR和IGF-1R，或其中所述抗原結合構建體能夠結合EGFR和VEGF，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGF和IGF-1R，或其中所述抗 原結合構建體能夠結合EGFR和VEGFR2，或其中所述抗原結合構建體能夠結合IGF-IR和 VEGFR2,或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGF和VEGFR2，或其中所述抗原結合構建體 能夠結合EGFR、IGF-IR和VEGFR2，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGF、IGF-IR和 VEGFR2,或其中所述抗原結合構建體能夠結合EGFR、VEGF和VEGFR2，或其中所述抗原結合 構建體能夠結合EGFR、VEGF和IGF1R。所述抗原結合構建體實例包括具有對VEGFR2具有 特異性的表位結合結構域(例如抗-VEGFR2 adnectin,其連接到重鏈的c_末端或n_末端 或輕鏈的C-末端或η-末端)的EGFR抗體，例如具有SEQ ID NO :136、140或144中所述的 重鏈序列和/或SEQ ID NO :138、142或145中所述的輕鏈序列的mAbdAb。所述抗原結合構建體實例包括具有對VEGF具有特異性的表位結合結構域(例如 抗-VEGF dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的c_末端或n_末端)的EGFR抗 體，例如具有SEQ ID NO 165、174、176、178、184或186中所述的重鏈序列和/或SEQ ID NO 188或190中所述的輕鏈序列的mAbdAb。所述抗原結合構建體實例包括具有對EGFR具有特異性的表位結合結構域(例如 抗-EGFR dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的c_末端或n_末端)的VEGF抗 體，例如具有SEQ ID NO 180中所述的重鏈序列的mAbdAb。所述mAbdAb還可包含SEQ ID NO 182中所述的輕鏈序列。所述抗原結合構建體實例包括具有對VEGF具有特異性的表位結合結構域(例如 抗-VEGF脂質運載蛋白，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的C-末端或η_末端)的 IGF-IR抗體，例如具有SEQ ID NO 123或125中所述的重鏈序列的mAbdAb。所述mAbdAb 還可包含SEQID NO 113中所述的輕鏈序列。所述抗原結合構建體實例包括具有對VEGFR2具有特異性的表位結合結構域(例 如抗-VEGFR2 adnectin,其連接到重鏈的c_末端或η-末端或輕鏈的c_末端或η-末端) 的IGF-IR抗體，例如具有SEQ ID NO 124或133中所述的重鏈序列的mAbdAb。所述mAbdAb 還可包含SEQID NO 113中所述的輕鏈序列。本發明抗原結合構建體包括對IL-23具有特異性的抗原結合構建體，例如包含能 夠結合IL-23的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合IL-23的配對的VH/VL的 抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合IL-23的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 IL-23 的 dAb。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體對不止一種抗原具有特異性，例如其 中所述抗原結合構建體能夠結合選自TH17型細胞因子(例如IL-17、IL-22或IL-21)的 兩種或更多種抗原，例如其中所述抗原結合構建體能夠結合IL-23和IL-17，或其中所述 抗原結合構建體能夠結合IL-23和IL-21，或其中所述抗原結合構建體能夠結合IL-23和 IL-22。所述抗原結合構建體實例包括具有對IL-17具有特異性的表位結合結構域(例如 抗-IL-17dAb，其連接到重鏈的C-末端或η-末端或輕鏈的c_末端或n_末端)的IL-23抗 體。本發明抗原結合構建體包括對PDGFRa具有特異性的抗原結合構建體，例如，包 含能夠結合PDGFR α的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合PDGFR α的配對的VH/VL的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合PDGFR α的抗體。抗原結合構 建體可包含能夠結合PDGFR α的dAb。本發明抗原結合構建體包括對FGFRl具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含 能夠結合FGFRl的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合FGFRl的配對的VH/VL 的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合FGFRl的抗體。抗原結合構建體可包 含能夠結合FGFRl的dAb。本發明抗原結合構建體包括對FGFR3具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含 能夠結合FGFR3的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合FGFR3的配對的VH/VL 的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合FGFR3的抗體。抗原結合構建體可包 含能夠結合FGFR3的dAb。本發明抗原結合構建體包括對VEGFR2具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含 能夠結合VEGFR2的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合VEGFR2的配對的VH/VL 的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合VEGFR2的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結 合 VEGFR2 的 dAb。本發明抗原結合構建體包括對VEGFR3具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含 能夠結合VEGFR3的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合VEGFR3的配對的VH/VL 的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合VEGFR3的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結 合 VEGFR3 的 dAb。本發明抗原結合構建體包括對VE鈣黏著蛋白(cadherin)具有特異性的抗原結合 構建體，例如，包含能夠結合VE鈣黏著蛋白的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含 結合VE鈣黏著蛋白的配對的VH/VL的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合VE鈣黏著蛋白的抗體。抗原結合構建體可包含 能夠結合VE鈣黏著蛋白的dAb。本發明抗原結合構建體包括對神經氈蛋白(neuropilin)具有特異性的抗原結合 構建體，例如，包含能夠結合神經氈蛋白的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合 神經氈蛋白的配對的VH/VL的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合神經氈蛋白的抗體。抗原結合構建體可包含能夠 結合神經氈蛋白的dAb。本發明抗原結合構建體包括對Flt-3具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含 能夠結合Flt-3的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合Flt-3的配對的VH/VL 的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合Flt-3的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 Flt-3 的 dAb。本發明抗原結合構建體包括對ron具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含能 夠結合ron的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合ron的配對的VH/VL的抗原 結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合ron的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合
19ron 的 dAbo本發明抗原結合構建體包括對Trp-I具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含 能夠結合Trp-I的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合Trp-I的配對的VH/VL 的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合Trp-I的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 Trp-I 的 dAb。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體對不止一種抗原具有特異性，例如其 中所述抗原結合構建體能夠結合牽涉癌症的兩種或更多種抗原，例如其中所述抗原結合 構建體能夠結合選自以下的兩種或更多種抗原PDGFRa、FGFRl、FGFR3、VEGFR2、VEGFR3、 IGF1R、EGFR和VEGF、VE鈣黏著蛋白、神經氈蛋白、Flt_3、ron、Trp-I、CD-20，例如其中所述 抗原結合構建體能夠結合PDGFR α和FGFRl，或其中所述抗原結合構建體能夠結合PDGFR a 和VEGF，或其中所述抗原結合構建體能夠結合PDGFR α和FGFR3，或其中所述抗原結合構建 體能夠結合PDGFR α和VEGFR2，或其中所述抗原結合構建體能夠結合PDGFR α和VEGFR3， 或其中所述抗原結合構建體能夠結合PDGFR α和IGF1R，或其中所述抗原結合構建體能夠 結合PDGFR α和EGFR，或其中所述抗原結合構建體能夠結合PDGFR α和VEGF，或其中所述 抗原結合構建體能夠結合PDGFR α和VE鈣黏著蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合 PDGFRa和神經氈蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合PDGFR α和Flt_3，或其中所 述抗原結合構建體能夠結合PDGFR α和ron，或其中所述抗原結合構建體能夠結合PDGFR a 和Trpl，或其中所述抗原結合構建體能夠結合PDGFRa和CD-20，或其中所述抗原結合構 建體能夠結合FGFRl和FGFR3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFRl和VEGFR2，或 其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFRl和VEGR3，或其中所述抗原結合構建體能夠結 合FGFRl和IGF1R，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFRl和EGFR，或其中所述抗原 結合構建體能夠結合FGFRl和VEGF，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFRl和VE鈣 黏著蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFRl和神經氈蛋白，或其中所述抗原結 合構建體能夠結合FGFRl和Flt-3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFRl和ron， 或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFRl和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建體能夠結 合FGFRl和CD-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFR3和VEGFR2，或其中所述抗 原結合構建體能夠結合FGFR3和VEGFR3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFR3和 IGF1R，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFR3和EGFR，或其中所述抗原結合構建體能 夠結合FGFR3和VEGF，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFR3和VE鈣黏著蛋白，或其 中所述抗原結合構建體能夠結合FGFR3和神經氈蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結 合FGFR3和Flt-3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFR3和ron，或其中所述抗原結 合構建體能夠結合FGFR3和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建體能夠結合FGFR3和CD-20， 或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR2和VEGFR3，或其中所述抗原結合構建體能夠 結合VEGFR2和IGF1R，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR2和EGFR，或其中所述 抗原結合構建體能夠結合VEGFR2和VEGF，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR2和 VE鈣黏著蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR2和神經氈蛋白，或其中所述抗 原結合構建體能夠結合VEGFR2和Flt-3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR2和 ron,或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR2和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建體能
20夠結合VEGFR2和CD-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR3和IGF-1R，或其中所 述抗原結合構建體能夠結合VEGFR3和EGFR，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR3 和VEGF，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR3和VE鈣黏著蛋白，或其中所述抗原 結合構建體能夠結合VEGFR3和神經氈蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR3 和Flt-3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGFR3和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建 體能夠結合VEGFR3和⑶-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合IGFlR和EGFR，或其中 所述抗原結合構建體能夠結合IGFlR和VEGF，或其中所述抗原結合構建體能夠結合IGFlR 和VE鈣黏著蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合IGFlR和神經氈蛋白，或其中所述 抗原結合構建體能夠結合IGFlR和Flt-3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合IGFlR和 ron，或其中所述抗原結合構建體能夠結合IGFlR和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建體能 夠結合IGFlR和CD-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合EGFR和VEGF，或其中所述抗 原結合構建體能夠結合EGFR和VE鈣黏著蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合EGFR 和神經氈蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合EGFR和Flt-3，或其中所述抗原結合 構建體能夠結合EGFR和ron，或其中所述抗原結合構建體能夠結合EGFR和Trp-Ι，或其中 所述抗原結合構建體能夠結合EGFR和CD-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGF 和VE鈣黏著蛋白，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGF和神經氈蛋白，或其中所述抗 原結合構建體能夠結合VEGF和Flt-3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGF和ron， 或其中所述抗原結合構建體能夠結合VEGF和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建體能夠結 合VEGF和CD-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VE鈣黏著蛋白和神經氈蛋白，或其 中所述抗原結合構建體能夠結合VE鈣黏著蛋白和Flt-3，或其中所述抗原結合構建體能夠 結合VE鈣黏著蛋白和ron，或其中所述抗原結合構建體能夠結合VE鈣黏著蛋白和Trp_l， 或其中所述抗原結合構建體能夠結合VE鈣黏著蛋白和CD-20，或其中所述抗原結合構建體 能夠結合神經氈蛋白和Flt-3，或其中所述抗原結合構建體能夠結合神經氈蛋白和ron，或 其中所述抗原結合構建體能夠結合神經氈蛋白和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建體能夠 結合神經氈蛋白和CD-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合Flt-3和ron，或其中所述 抗原結合構建體能夠結合Flt-3和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建體能夠結合Flt-3和 CD-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合ron和Trp-Ι，或其中所述抗原結合構建體能 夠結合ron和⑶-20，或其中所述抗原結合構建體能夠結合Trp-I和⑶-20。所述抗原結合構建體還可具有一個或多個具有相同或不同的抗原特異性的另外 的表位結合結構域，所述表位結合結構域連接到重鏈的C-末端和/或η-末端和/或輕鏈 的C-末端禾口 /或η-末端。本發明抗原結合構建體包括對β澱粉狀蛋白具有特異性的抗原結合構建體，例 如，包含能夠結合β澱粉狀蛋白的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合β澱粉 狀蛋白的配對的VH/VL的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合β澱粉狀蛋白的抗體。抗原結合構建體可包含 能夠結合β澱粉狀蛋白的dAb。本發明抗原結合構建體包括對CD-3具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含能 夠結合CD-3的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合CD-3的配對的VH/VL的抗 原結合構建體。
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抗原結合構建體可包含能夠結合CD-3的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 CD-3 的 dAb。本發明抗原結合構建體包括對gpIIIb/IIa具有特異性的抗原結合構建體，例如， 包含能夠結合gpIIIb/IIa的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合gpIIIb/IIa 的配對的VH/VL的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合gpIIIb/IIa的抗體。抗原結合構建體可包含能 夠結合 gpIIIb/IIa 的 dAb。本發明抗原結合構建體包括對TGFi3具有特異性的抗原結合構建體，例如，包含 能夠結合TGFii的表位結合結構域的抗原結合構建體，或包含結合TGFii的配對的VH/VL 的抗原結合構建體。抗原結合構建體可包含能夠結合TGF β的抗體。抗原結合構建體可包含能夠結合 TGFβ 的 dAb。在本發明一個實施方案中，提供本文所述的本發明抗原結合構建體，其包含致使 抗體具有降低的ADCC和/或補體激活或效應器功能的恆定區。在一個所述實施方案中，重 鏈恆定區可包含IgG2或IgG4同種型的天然喪失能力的恆定區或突變的IgGl恆定區。合 適修飾的實例闡述於EP0307434中。一個實例包括在235和237 (EU索引編號)位的丙氨 酸殘基的取代。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體將保留Fc功能性，例如能夠具有ADCC 和CDC活性之一或二者。所述抗原結合構建體可包含位於輕鏈(例如在輕鏈C-末端)上 的表位結合結構域。本發明還提供通過在抗體輕鏈上配置表位結合結構域，尤其是通過在輕鏈C-末 端配置表位結合結構域，來保持抗原結合構建體的ADCC和CDC功能的方法。所述ADCC和 CDC功能可通過任何合適的測定法來測量，例如實施例15. 3中所述的ADCC測定法和實施例 15. 4中所述的⑶C測定法。本發明還提供通過在抗體重鏈上配置表位結合結構域，尤其是通過在重鏈C-末 端配置表位結合結構域，來降低抗原結合構建體的CDC功能的方法。所述CDC功能可通過 任何合適的測定法來測量，例如實施例15. 4中所述的CDC測定法。在另一實施方案中，本發明抗原結合構建體能夠結合選自VEGF、IGF-IR和EGFR的 兩種或更多種抗原，例如，其能夠結合EGFR和VEGF、或EGFR和IGF1R、或IGF1R和VEGF，或 例如其能夠結合TNF和IL1-R。在包含IGF-IR結合位點的本發明實施方案中，本發明抗原 結合構建體的IGF-IR結合位點可包含在蛋白質骨架中的配對的VH/VL結構域，所述配對的 VH/VL結構域可包含選自以下的序列中所述的CDR中的一個或多個SEQ ID NO 80、SEQ ID N0:81、SEQID NO :82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO :85 禾口 SEQ IDNO :86，例如， 其可包含至少SEQ ID NO :80中所述的CDRH3，例如，其可包含SEQ ID NO 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID N0:82、SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 85 禾口 SEQ ID NO :86 中所述的所有 CDR。在包含EGFR結合位點的本發明實施方案中，本發明抗原結合構建體可結合包含 成熟或正常或野生型EGFR序列的第273-501位殘基的表位，例如，其可結合包含成熟或正 常或野生型EGFR的第287-302位殘基(SEQ ID NO 103)的表位。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體的EGFR結合位點可包含在蛋白質骨架中的配對的VH/VL結構域，所述配對的VH/VL結構域可包含選自以下序列中所述的CDR 中的一個或多個:SEQ ID NO :104、SEQ ID NO :105、SEQ ID NO :106、SEQ ID NO :100、SEQ ID NO: 101和SEQ ID NO 102，例如，其可包含SEQ ID NO 106中所述的CDRH3，或其可包含 SEQ ID N0:104、SEQ ID N0:105、SEQ ID N0:106、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:101 禾口 SEQ ID NO 102中所述的所有6個⑶R。所述配對的VH/VL結構域可進一步包含另外的殘基，尤 其是在重鏈⑶R中，在一個實施方案中，⑶RHl可包含SEQ ID NO 104加上至多5個另外的 殘基，例如，SEQ ID NO :97中所述的5個另外的殘基中的一個或多個，⑶RH2可包含SEQ ID NO 105加上至多2個另外的殘基，例如SEQ ID NO 98和SEQ ID NO 107中所述的2個另 外的殘基中的一個或兩個，而⑶RH3可包含SEQ ID NO 106加上至多2個另外的殘基，例如 SEQ ID NO :99中所述的2個另外的殘基中的一個或兩個。在一個實施方案中，配對的VH/ VL包含以下序列中所述的CDR中的一個或多個SEQ ID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO: 99,SEQ ID NO 100,SEQ ID NO 101 和 SEQ ID NO :102，例如，其可包含至少 SEQ ID NO 99 中所述的 CDRH3，例如，其可包含 SEQ ID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 99、SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO 101和SEQ ID NO 102中所述的所有6個⑶R(合適的抗體的更詳細的資 料可在 W002/092771 和 W02005/081854 中找到)。在一個實施方案中，抗原結合構建體包含作為結構域抗體(dAb)的表位結合結構 域，例如所述表位結合結構域可為人VH或人VL、或駱駝Vhh或鯊魚dAb (NARV)。在一個實施方案中，抗原結合構建體包含作為選自以下的骨架衍生物的表位結合 結構域CTLA-4 (Evibody)；脂質運載蛋白；諸如蛋白A的Z-結構域等來源於蛋白A的分子 (Affibody，SpA)、A-結構域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白，例如 GroEl 和 GroES ；轉鐵蛋 白(trans-body)；錨蛋白重複蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結構域(四連凝集素)； 人Y-晶體蛋白和人泛素(affilin) ；PDZ結構域；人蛋白酶抑制劑蠍毒素kimitz型結構 域；和纖連蛋白(adnectin)；對它們都進行蛋白質工程改造以便實現與不同於天然配體的 配體結合。本發明抗原結合構建體可包含連接到表位結合結構域adnectin的蛋白質骨架， 例如含連接到重鏈C-末端的adnectin的IgG骨架；或其可包含連接到adnectin的蛋白質 骨架，例如含連接到重鏈η-末端的adnectin的IgG骨架；或其可包含連接到adnectin的蛋 白質骨架，例如含連接到輕鏈C-末端的adnectin的IgG骨架；或其可包含連接到adnectin 的蛋白質骨架，例如含連接到輕鏈η-末端的adnectin的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域CTLA-4的 IgG骨架，例如含連接到重鏈η-末端的CTLA-4的IgG骨架；或其可包含例如含連接到重鏈 C-末端的CTLA-4的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端的CTLA-4的IgG骨 架；或其可包含含連接到輕鏈C-末端的CTLA-4的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域脂質運載 蛋白的IgG骨架，例如含連接到重鏈η-末端的脂質運載蛋白的IgG骨架；或其可包含例如 含連接到重鏈C-末端的脂質運載蛋白的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端 的脂質運載蛋白的IgG骨架；或其可包含含連接到輕鏈C-末端的脂質運載蛋白的IgG骨
^K O在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域SpA的IgG骨架，例如含連接到重鏈η-末端的SpA的IgG骨架；或其可包含例如含連接到重鏈C-末端 的SpA的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端的SpA的IgG骨架；或其可包含 含連接到輕鏈C-末端的SpA的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域affibody 的IgG骨架，例如含連接到重鏈η-末端的affibody的IgG骨架；或其可包含例如含連接到 重鏈C-末端的affibody的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈n_末端的affibody 的IgG骨架；或其可包含含連接到輕鏈C-末端的affibody的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域affimer 的IgG骨架，例如含連接到重鏈η-末端的affimer的IgG骨架；或其可包含例如含連接到 重鏈C-末端的affimer的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端的affimer的 IgG骨架；或其可包含含連接到輕鏈C-末端的affimer的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域GroEI的 IgG骨架，例如含連接到重鏈η-末端的GroEI的IgG骨架；或其可包含例如含連接到重鏈 C-末端的GroEI的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端的GroEI的IgG骨架； 或其可包含含連接到輕鏈C-末端的GroEI的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域轉鐵蛋白 的IgG骨架，例如含連接到重鏈的η-末端的轉鐵蛋白的IgG骨架；或其可包含例如具有連 接到重鏈C-末端的轉鐵蛋白的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端的轉鐵蛋 白的IgG骨架；或其可包含含連接到輕鏈C-末端的轉鐵蛋白的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域GroES的 IgG骨架，例如含連接到重鏈的η-末端的GroES的IgG骨架；或其可包含例如具有連接到 重鏈C-末端的GroES的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端的GroES的IgG 骨架；或其可包含含連接到輕鏈C-末端的GroES的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域DARPin的 IgG骨架，例如含連接到重鏈η-末端的DARPin的IgG骨架；或其可包含例如含連接到重鏈 C-末端的DARPin的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端的DARPin的IgG骨 架；或其可包含含連接到輕鏈C-末端的DARPin的IgG骨架。在其它實施方案中，其可包含蛋白質骨架，例如連接到表位結合結構域肽適體的 IgG骨架，例如含連接到重鏈η-末端的肽適體的IgG骨架；或其可包含例如含連接到重鏈 C-末端的肽適體的IgG骨架；或其可包含例如含連接到輕鏈η-末端的肽適體的IgG骨架； 或其可包含含連接到輕鏈C-末端的肽適體的IgG骨架。在本發明一個實施方案中，有4個表位結合結構域，例如4結構域抗體，其中2個 表位結合結構域可對相同抗原具有特異性，或存在於抗原結合構建體的所有表位結合結構 域可對相同抗原具有特異性。可通過用接頭將本發明蛋白質骨架連接到表位結合結構域。合適的接頭實例包 括以下胺基酸序列所述胺基酸序列長度可為1個胺基酸到150個胺基酸，或1個胺基酸 到140個胺基酸，例如1個胺基酸-130個胺基酸，或1-120個胺基酸，或1_80個胺基酸，或 1-50個胺基酸，或1-20個胺基酸，或1-10個胺基酸，或5-18個胺基酸。所述序列可具有其 自己的三級結構，例如，本發明接頭可包含單一可變結構域。在一個實施方案中，接頭大小等同於單一可變結構域。合適的接頭大小可為1-20埃，例如小於15埃或小於10埃或小於5埃。在本發明一個實施方案中，用接頭將至少一個表位結合結構域直接連接到Ig骨 架，所述接頭包含1-150個胺基酸，例如1-20個胺基酸，例如1-10個胺基酸。所述接頭可 選自以下接頭中的任何一種=SEQID N0:6-ll中所述的接頭；『STG』(絲氨酸、蘇氨酸、甘 氨酸)；『GSTG』或『RS』 ；例如接頭可為『TVAAPS』，或接頭可為『GGGGS』。在本發明抗原結 合構建體中使用的接頭可單獨包含或除包含其它接頭外還包含一組或多組GS殘基，例如 『GSTVAAPS』或『TVAAPSGS』或『GSTVAAPSGS』。在另一實施方案中，在表位結合結構域(例 如dAb)與Ig骨架之間沒有接頭。在另一實施方案中，通過接頭『TVAAPS』將表位結合結構 域(例如dAb)連接到Ig骨架。在另一實施方案中，通過接頭『TVAAPSGS』將表位結合結構 域(例如dAb)連接到Ig骨架。在另一實施方案中，通過接頭『GS』將表位結合結構域(例 如dAb)連接到Ig骨架。在一個實施方案中，本發明抗原結合構建體包含能夠結合人血清白蛋白的至少一 個表位結合結構域。在一個實施方案中，有至少3個抗原結合位點，例如有4或5或6或8或10個抗 原結合位點，並且抗原結合構建體能夠結合至少3或4或5或6或8或10個抗原，例如其 能夠同時結合3或4或5或6或8或10個抗原。本發明還提供用於醫學的抗原結合構建體，例如用於製備用於治療癌症或諸如哮 喘、風溼性關節炎或骨關節炎等炎性疾病的藥物。本發明提供治療罹患癌症或諸如哮喘、風溼性關節炎或骨關節炎等炎性疾病的患 者的方法，所述方法包括給予治療量的本發明抗原結合構建體。本發明抗原結合構建體可用於治療癌症或諸如哮喘、風溼性關節炎或骨關節炎等 炎性疾病。例如若蛋白質骨架含有源自具有效應器功能的抗體的Fc區，例如若蛋白質骨架 包含來自IgGl的CH2和CH3，則本發明抗原結合構建體可具有某些效應器功能。效應器功 能的水平可根據已知技術而變化，例如通過CH2結構域突變，例如其中IgGlCH2結構域在選 自239和332和330的位點具有一個或多個突變，例如突變選自S239D和I332E和A330L， 致使抗體效應器功能提高，和/或例如改變本發明抗原結合構建體的糖基化概況，致使Fc 區的巖藻糖基化降低。用於本發明的蛋白質骨架包括包含抗體所有結構域的完整單克隆抗體骨架，或本 發明蛋白質骨架可包含非常規抗體結構，例如單價抗體。所述單價抗體可包含配對的重鏈 和輕鏈，其中重鏈鉸鏈區經過修飾致使重鏈不會同型二聚體化，例如闡述於W02007059782 中的單價抗體。其它單價抗體可包含配對的重鏈和輕鏈，它們與缺乏功能可變結構域和CHl 區的第二條重鏈二聚體化，其中第一條和第二條重鏈經過修飾致使它們形成異型二聚體而 不是同型二聚體，從而產生含兩條重鏈和一條輕鏈的單價抗體，例如在W02006015371中所 述的單價抗體。所述單價抗體可提供表位結合結構域可連接的本發明蛋白質骨架，例如實 施例32所述的抗原結合構建體。用於本發明的表位結合結構域為獨立於不同V區或結構域地特異性結合 抗原或表位的結構域，其可為結構域抗體，或可為選自以下的骨架衍生物的結構域
25CTLA-4 (Evibody)；脂質運載蛋白；源自蛋白A的分子，例如蛋白A的Z-結構域(Affibody， SpA)、A-結構域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白，例如GroEl和GroES ；轉鐵蛋白 (trans-body)；錨蛋白重複蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結構域(四連凝集素)；人 Y -晶體蛋白和人泛素(affilin) ；PDZ結構域；人蛋白酶抑制劑蠍毒素kimitz型結構域； 和纖連蛋白(adnectin)；它們已經過蛋白質工程改造以實現與不同於天然配體的配體結 合。在一個實施方案中，它們可為結構域抗體或其它合適的結構域，例如選自以下的結構 域CTLA-4、脂質運載蛋白、SpA、Aff ibody、avimer、GroEl、轉鐵蛋白、GroES和纖連蛋白。在 一個實施方案中，它們可選自dAb、Affibody、錨蛋白重複蛋白(DARPin)和adnectin。在另 一實施方案中，它們可選自Affibody、錨蛋白重複蛋白(DARPin)和adnectin。在另一實施 方案中，它們可為結構域抗體，例如選自人、駱駝或鯊魚(NARV)結構域抗體的結構域抗體。可在一個或多個位置將表位結合結構域連接到蛋白質骨架。這些位置包括蛋白質 骨架的C-末端和N-末端，例如在IgG重鏈的C-末端和/或輕鏈的C-末端，或例如在IgG 重鏈的N-末端和/或輕鏈的N-末端。在一個實施方案中，將第一表位結合結構域連接到蛋白質骨架，將第二表位結合 結構域連接到第一表位結合結構域，例如，其中所述蛋白質骨架為IgG骨架，可將第一表位 結合結構域連接到IgG骨架重鏈的C-末端，並可將該表位結合結構域以其C-末端連接到 第二表位結合結構域；或例如，可將表位結合結構域連接到IgG骨架輕鏈的C-末端，並可讓 該第一表位結合結構域進一步以其C-末端連接到第二表位結合結構域；或例如，可將第一 表位結合結構域連接到IgG骨架輕鏈的η-末端，並可讓所述第一表位結合結構域進一步以 其η-末端連接到第二表位結合結構域；或例如，可將第一表位結合結構域連接到IgG骨架 重鏈的η-末端，並可讓該第一表位結合結構域進一步以其η-末端連接到第二表位結合結 構域。所述抗原結合構建體實例闡述於實施例31中。當表位結合結構域為結構域抗體時，某些結構域抗體可適於骨架內的特定位置。用於本發明的結構域抗體可以在常規IgG重鏈和/或輕鏈的C-末端處連接。另 外，可將某些dAb連接到常規抗體重鏈和輕鏈兩者的C-末端。在將dAb的N-末端融合到抗體恆定結構域(Ch3或CL)的構建體中，肽接頭可輔助 dAb結合抗原。實際上，dAb的N-末端僅挨著涉及抗原結合活性的互補決定區(CDR)。因 此，短肽接頭在表位結合結構域與蛋白質骨架的恆定結構域之間起間隔物的作用，其可使 得dAbCDR更易接觸抗原，因此其可以以高親和力結合。dAb與IgG連接所處的環境將根據它們所融合的抗體鏈而不同當在IgG骨架的抗體輕鏈的C-末端處融合時，預期每一個dAb位於抗體鉸鏈和Fc 部分附近。很可能所述dAb彼此將離得較遠。在常規抗體中，Fab片段之間的角度和每一 個Fab片段與Fc部分之間的角度可顯著不同。很可能的是，對於mAbdAb而言，Fab片段之 間的角度將不會差異很大，同時對於每一 Fab片段與Fc部分之間的角度可觀察到某程度的 角度限制。當在IgG骨架的抗體重鏈的C-末端處融合時，預期每一 dAb位於Fc部分的CH3結 構域附近。預期這不會影響Fc對Fc受體(例如c γ RI、II、III、FcRn)的結合特性，因為 這些受體結合(engage with)CH2結構域(對於Fc γ RI、II和III類受體而言)或結合CH2 和Ch3結構域之間的鉸鏈(例如FcRn受體)。所述抗原結合構建體的另一特徵為預期兩個dAb在空間上彼此靠近，前提是由合適接頭提供柔韌性，這些dAb甚至可形成同型二聚體， 從而累增成(Propagate)Fc部分的『拉鏈式』四級結構，而這可因此提高構建體的穩定性。這樣的結構上的考慮可有助於選擇使表位結合結構域例如dAb連接到蛋白質骨 架例如抗體上的最合適的位置。抗原大小、其位置(在血液中或在細胞表面上)、其四級結構(單體或多聚體 結構)可變化。因存在鉸鏈區，常規抗體無需特別設計就能作為銜接構建體(adaptor construct)起作用，其中在Fab片段的末端的兩個抗原結合位點的方向可大幅度變化，因 此能適應抗原的分子特性及其環境。相比之下，連接到抗體或其它蛋白質骨架(例如包含 無鉸鏈區抗體的蛋白質骨架)的dAb可能直接或間接地具有較小的結構柔韌性。了解溶液狀態和Ab的結合模式也是有幫助的。積累了很多體外dAb在溶液中 可主要以單體、同型二聚體或多聚體形式存在的證據(Reiter等(1999) J Mol Biol 290 第 685-698 頁；Ewert 等(2003) J MolBiol 325，第 531-553 頁 Jespers 等(2004) J Mol Biol 337 第 893-903 頁 Jespers 等(2004) Nat Biotechnol 22 第 1161-1165 頁；Martin 等(1997) Protein Eng. 10 第 607-614 頁；Sepulvada ^ (2003) J Mol Biol 333 第 355-365 頁)。這很容易讓人聯想到體內觀察到的Ig結構域的多聚體化事件，例如Bence-Jones蛋 白(它們為免疫球蛋白輕鏈的二聚體(Epp等(1975)Biochemistry 14第4943-4952頁； Huan 等(1994)Biochemistry33 第 14848-14857 頁；Huang 等(1997)Mol immunol 34 第 1291-1301 頁)和澱粉樣纖維(James 等(2007) J Mol Biol. 367 :603_8)。例如，對於易於在溶液中二聚體化的結構域抗體，可能期需使其與Fc部分的C-末 端連接優先於與輕鏈C-末端連接，因為與Fc的C-末端連接將使得那些dAb在本發明抗原 結合構建體的情況下二聚體化。本發明抗原結合構建體可包含對單一抗原具有特異性的抗原結合位點，或可具 有對兩種或更多種抗原具有特異性或對單一抗原上的兩個或多個表位具有特異性的抗原 結合位點，或可存在每一個都對相同或不同的抗原上的不同的表位有特異性的抗原結合位
點ο抗原結合位點可各自對抗原具有結合特異性，所述抗原例如人或動物蛋白質，包 括細胞因子、生長因子、細胞因子受體、生長因子受體、酶(例如蛋白酶)、酶的輔因子、DNA 結合蛋白、脂質和糖類。包括細胞因子、生長因子、細胞因子受體、生長因子受體和其它蛋 白質在內的合適的靶標包括但不限於ApoE、Apo-SAA, BDNF、心肌營養蛋白-1、CEA、⑶40、 CD40 配體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF 受體、ENA-78、嗜伊紅細胞趨化因子(Eotaxin)、 嗜伊紅細胞趨化因子_2、Exodus-2、FAP α、酸性FGF、鹼性FGF、成纖維細胞生長因子-10、 FLT3配體、CXXXC趨化分子(CX3C)、⑶NF、G-CSF, GM-CSF, GF-β 1、人血清白蛋白、胰島素、 IFN-Y、IGF-I, IGF-I I, IL-I α、IL-I β、IL-1 受體、IL-I 受體 1 型、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8 (72 個胺基酸)、IL-8 (77 個胺基酸)、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、ΙΡ-10、角質形成細胞生長 因子-2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴細胞趨化蛋白、穆勒氏抑制物(Mullerian inhibitory substance)、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白(monocyte attractant protein)、M_CSF、c-fms、v-fmsMDC (67 個胺基酸)、MDC (69 個胺基酸)、MCP_1 (MCAF)、MCP_2、 MCP-3、MCP-4、MDC (67 個胺基酸)、MDC (69 個胺基酸)、MIG、MIP-I α、MIP-I β、ΜΙΡ—3 α、
27ΜΙΡ-3 β、ΜΙΡ-4、骨髓祖細胞抑制因子-1 (MPIF-I)、ΝΑΡ-2、神經營養因子(Neurturin)、神 經生長因子、β -NGF, ΝΤ-3、ΝΤ-4、制瘤素 M、PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4、RANTES, SDFl α ,SDFl β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β 2、TGF-β 3、月中 瘤壞死因子(TNF)、TNF- α、TNF- β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、 VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、 GRO-γ、HCCl、1-309、HER UHER 2,HER 3,HER 4、血清白蛋白、vWF、澱粉狀蛋白(例如澱粉 狀蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE和本文公開的其它靶標。應該理解以上列舉內容並不全面。在某些實施方案中，蛋白酶抗性肽或多肽結合肺組織中的靶標，例如選自以下的 革巴標TNFRl、IL-I、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、 IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Ra 1、IL-13Ra 2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、 IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、 CD56、CD 138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、糜蛋白 酶、FGF、弗林蛋白酶、內皮素-1、嗜伊紅細胞趨化因子類(例如嗜伊紅細胞趨化因子、嗜伊 紅細胞趨化因子_2、嗜伊紅細胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-U I COS, IgE、IFNa、1-309、整 聯蛋白、L-選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、中性粒細胞彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、 PARC、PD-I、RANTES、SCF、SDF-1、涎免凝集素 8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、類 胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4 β 7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、ανβ8、 cMET、CD8、vWF、澱粉狀蛋白(例如澱粉狀蛋白α )、MMP12、PDKl和IgE。具體而言，本發明抗原結合構建體可用於治療與IL-13、IL_5和IL_4相關的疾病， 例如特應性皮炎、變應性鼻炎、克羅恩氏病(crohn』 sdisease)、C0PD、纖維化疾病或病況 例如特發性肺纖維化、進行性系統性硬化症、肝纖維化、肝肉芽腫、血吸蟲病、利什曼病、細 胞周期調節病例如何杰金氏病(Hodgkins disease)』細胞慢性淋巴性白血病，例如所述構 建體可用於治療哮喘。本發明抗原結合構建體可用於治療與諸如IGF-1R、VEGF和EGFR等生長因子有關 的疾病，例如癌症或風溼性關節炎，其中可使用所述療法治療的癌症類型實例有乳腺癌、前 列腺癌、肺癌和骨髓瘤。本發明抗原結合構建體可用於治療與TNF有關的疾病，例如關節炎，例如風溼性 關節炎或骨關節炎。本發明抗原結合構建體可用於治療與ILl-R有關的疾病，例如關節炎，例如風溼 性關節炎或骨關節炎。本發明抗原結合構建體可用於治療與CD-20有關的疾病，例如自身免疫性疾病， 例如牛皮癬、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、風溼性關節炎、青少年風溼性關節炎、 系統性紅斑狼瘡、諸如多發性硬化症等神經退行性疾病、諸如COPD等中性粒細胞驅動的疾 病、Wegener脈管炎、囊腫性纖維變性、斯耶格倫綜合症(Sjogrenssyndrome)、慢性移植排 斥、1型糖尿病移植物抗宿主病、哮喘、變應性疾病異位性皮炎、溼疹皮炎、變應性鼻炎、包括 甲狀腺炎、脊柱關節病、強直性脊柱炎、葡萄膜炎、多軟骨炎或硬皮病在內的其它自身免疫 性疾病；或癌症，例如B-細胞淋巴瘤或成熟B細胞瘤，例如CLL或SLL。本發明抗原結合構建體可用於治療與IL-17和IL-23有關的疾病，例如牛皮癬、 炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、風溼性關節炎、青少年風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡、諸如多發性硬化症等神經退行性疾病、諸如COPD等中性粒細胞驅動的疾病、Wegener脈 管炎、囊腫性纖維變性、斯耶格倫綜合症、慢性移植排斥、1型糖尿病移植物抗宿主病、哮喘、 變應性疾病異位性皮炎、溼疹皮炎、變應性鼻炎、包括甲狀腺炎、脊柱關節病、強直性脊柱 炎、葡萄膜炎、多軟骨炎或硬皮病在內的其它自身免疫性疾病。本發明抗原結合構建體可通過用包含編碼本發明抗原結合構建體序列的表達載 體轉染宿主細胞來產生。表達載體或重組質粒通過使這些編碼抗原結合構建體的序列與常 規調控序列以可操作方式連接來產生，所述常規調控序列能夠在宿主細胞中調控複製和表 達和/或調控從宿主細胞分泌。調控序列包括啟動子序列(例如CMV啟動子)和可源自其 它已知抗體的信號序列。同樣地，可產生第二表達載體，其具有編碼互補的抗原結合構建體 輕鏈或重鏈的DNA序列。在某些實施方案中，除了考慮編碼序列和選擇標記外，該第二表達 載體與第一表達載體相同，以確保儘可能每一條多肽鏈都能功能表達。或者，抗原結合構建 體的重鏈和輕鏈編碼序列可位於單個載體上，例如在同一個載體的兩個表達盒中。通過常規技術用第一和第二載體二者來共轉染(或簡單地通過單個載體轉染)所 選擇的宿主細胞，以製備包含重組或合成的輕鏈和重鏈二者的經轉染的本發明宿主細胞。 然後通過常規技術培養所轉染的細胞，以產生工程改造的本發明抗原結合構建體。通過諸 如ELISA或RIA等合適的測定法，從培養物中篩選包含重組重鏈和/或輕鏈二者結合的抗 原結合構建體。可採用類似的常規技術來構建其它抗原結合構建體。本領域技術人員可選擇用於本發明方法及組合物構建中所用的克隆和亞克隆步 驟的合適載體。例如，可使用常規PUC系列克隆載體。一種載體pUC19可購自供應商，例如 Amersham(Buckinghamshire, United Kingdom)或 Pharmacia(Uppsala，Sweden)。另夕卜，會邑 夠容易地複製，具有大量的克隆位點及選擇基因(例如抗生素抗性)並易於操作的任何載 體都可用於克隆。因此，克隆載體的選擇不是本發明的限制因素。表達載體的特徵還可在於適用於擴增異源DNA序列表達的基因，例如哺乳動物二 氫葉酸還原酶基因(DHFR)。其它優選的載體序列包括聚A信號序列，例如來自牛生長激素 (BGH)和β球蛋白啟動子序列(i^glopro)。可通過本領域技術人員眾所周知的技術合成 用於本文的表達載體。可通過市購或天然來源獲得或通過已知方法合成所述載體組分，例如複製子、選 擇基因、增強子、啟動子、信號序列等等，用於指導在所選宿主中表達和/或分泌重組DNA產 物。為了該目的也可選擇本領域已知的用於哺乳動物、細菌、昆蟲、酵母和真菌表達的眾多 類型的其它合適的表達載體。本發明還包括用含有編碼本發明抗原結合構建體的序列的重組質粒轉染的細胞 系。用於克隆及用於這些克隆載體的其它操作的宿主細胞也為常規宿主細胞。然而，可將 來自不同大腸桿菌(E. coli)株系的細胞用於複製克隆載體和構建本發明抗原結合構建體 的其它步驟。用於表達本發明抗原結合構建體的合適的宿主細胞或細胞系包括哺乳動物細胞， 例如NS0、Sp2/0、CH0 (例如DG44)、⑶S、HEK、成纖維細胞細胞(例如3T3)和骨髓瘤細胞，例 如，其可在CHO或骨髓瘤細胞中表達。可使用人細胞，由此使得分子可以以人糖基化型式來 修飾。或者，可使用其它真核細胞系。合適的哺乳動物宿主細胞的選擇及用於轉化、培養、 擴增、篩選和產物產生及純化的方法為本領域所知。參見例如上面引用的Sambrook等。
可證明細菌細胞作為宿主細胞適用於表達重組FAb或本發明其它實施方案(參 見例如 Pliickthun，Α.，Immunol. Rev.，130 151-188 (1992))。然而，由於在細菌細胞中表 達的蛋白質傾向於非摺疊或不恰當摺疊形式或呈非糖基化的形式，在細菌細胞中產生的任 何重組Fab將必須為保留抗原結合能力接受篩選。如果由細菌細胞表達的分子以合適的 摺疊形式產生，那麼該細菌細胞將是所期需的宿主，或在備選實施方案中該分子可在細菌 宿主中表達然後接著重摺疊。例如，用於表達的不同株系的大腸桿菌是生物技術領域眾所 周知的宿主細胞。在該方法中還可採用不同株系的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、鏈黴菌 (Streptomyces)、其它桿菌等。若需要，本領域技術人員已知的酵母菌細胞株系以及昆蟲細胞(例如果蠅 (Drosophila)和鱗翅目(L印idoptera))和病毒表達系統也可作為宿主細胞使用。參見例 如 Miller 等，Genetic Engineering, 8 :277_298，PlenumPress (1986)及其中引用的參考文 獻。可構建載體的通用方法、產生本發明宿主細胞所需的轉染方法和從所述宿主細胞 產生本發明抗原結合構建體所需的培養方法，都可為常規技術。通常，本發明培養方法為無 血清培養方法，通常是通過在無血清混懸液中培養細胞。同樣地，產生本發明抗原結合構建 體後，可按照本領域標準方法將其從細胞培養內含物中純化，所述方法包括硫酸銨沉澱、親 和柱、柱色譜、凝膠電泳等等。所述技術在本領域技術範圍內，其不構成對本發明的限制。例 如，改變的抗體的製備闡述於WO 99/58679和WO 96/16990中。表達抗原結合構建體的又一方法可利用在轉基因動物中的表達，例如如美國專利 第4，873，316號所述。其涉及使用動物酪蛋白啟動子的表達系統，當將其通過轉基因納入 到哺乳動物中時，使得雌性動物可在其乳汁中產生所需的重組蛋白質。本發明另一方面提供製備本發明抗體的方法，所述方法包括培養用編碼本發明抗 體輕鏈和/或重鏈的載體轉化的或轉染的宿主細胞並回收藉此產生的抗體的步驟。本發明提供製備本發明抗原結合構建體的方法，該方法包括以下步驟(a)提供編碼抗原結合構建體重鏈的第一載體；(b)提供編碼抗原結合構建體輕鏈的第二載體；(c)用所述第一和第二載體轉化哺乳動物宿主細胞(例如CH0)；(d)在有助於從所述宿主細胞分泌抗原結合構建體到所述培養基中的條件下培養 步驟(c)的宿主細胞；(e)回收步驟(d)所分泌的抗原結合構建體。一旦用所需方法表達抗原結合構建體後，通過用合適的測定法來檢查其體外活 性。目前採用常規ELISA測定方式以評估抗原結合構建體與其靶標的定性及定量結合。另 外，還可使用其它體外測定法來驗證中和效價，之後進行後續的人臨床研究以評估忽略常 規清除機制的抗原結合構建體在體內的持續性。治療劑量及持續時間涉及本發明分子在人循環中的相對持續時間，可由本領域技 術人員根據待治療病症及患者的一般健康狀況來調整。可設想的是，可能需要長期(例如 4-6個月)重複給藥(例如每周1次或每2周1次)以達到最佳治療效果。本發明治療劑的給藥方式可為將藥物遞送給宿主的任何合適的途徑。本發明抗
30原結合構建體和藥用組合物尤其適用於胃腸外給予，即皮下(s. C.)、鞘內、腹膜內、肌肉內 (i.m.)、靜脈內(i.v.)或鼻內給予。可將本發明治療劑製備成在可藥用載體中含有作為活性成分的有效量的本發明 抗原結合構建體的藥用組合物。在本發明預防性藥物中，優選以注射即用的形式並優選以 生理PH緩衝的含有抗原結合構建體的水性混懸劑或溶液劑。胃腸外給予的組合物通常應 包含本發明抗原結合構建體溶液或其溶解於可藥用載體(優選水性載體)的混合物。可採 用多種水性載體，例如0. 9%鹽水、0. 3%甘氨酸等。這些溶液可無菌製備並通常不含微粒物 質。可通過眾所周知的常規滅菌技術(例如過濾)使這些溶液無菌。根據接近生理條件的 需要，組合物可含有可藥用輔助物質(例如PH調節劑和緩衝劑等)。在所述藥物製劑中的 本發明抗原結合構建體的濃度可大範圍變化，即從小於約0. 5%、通常為或至少約到差 不多15或20%重量，其主要基於流液體積、粘度等根據所選的特定給藥方式來選擇。因此，用於肌內注射的本發明藥用組合物可製備為含有ImL無菌緩衝水及以下 量的本發明抗原結合構建體約Ing-約lOOmg，例如約50ng-約30mg或更優選約5mg-約 25mg。相似地，用於靜脈內輸注的本發明藥用組合物可製備為含有約250ml無菌林格氏液 和每毫升林格氏液約Img-約30mg並優選5mg-約25mg的本發明抗原結合構建體。用於制 備可胃腸外給予的組合物的實際方法眾所周知，或對本領域技術人員顯而易見，其詳述於 例如Remington' sPharmaceutical Science,第 15版,Mack Publishing Company,Easton, Pennsylvania中。關於製備可靜脈內給予的本發明抗原結合構建體製劑，參見Lasmar U 禾口 Parkins D"The formulation of Biopharmaceuticalproducts (生物藥物製品配製)，，， Pharma. Sci. Tech. today，第 129-137 頁，第 3 卷(200 年 4 月 3 日)；Wang，W"Instability， stabilisation andformulation of liquid protein pharmaceuticals ( M ^ M I=I ^J 物製劑的不穩定性、穩定化及配製)」，Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188 ；Ahem Τ. J.， Manning Μ· C.主 編 的 Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B, New York, NY :Plenum Press (1992) ；Akers, Μ. J. "Excipient-Druginteractions in Parenteral Formulations (胃腸外製劑中賦形劑-藥物之間的相互作用)」，J. Pharm Sci 91 (2002)2283-2300 ；Imamura, K 等"Effectsof types of sugar on stabilization of Protein in the dried state (糖種類對幹態蛋白質穩定化的作用)」，J Pharm Sci 92(2003) 266-274 ；Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protei n-structure-stabilizingeffect during freeze—drying (在凍幹期間賦形劑結晶及 其蛋白質結構穩定化作用)」，J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039 Johnson, R, 「Mannito1-sucrose mixtures-versatile formulations for proteinlyophilization(用 於蛋白質凍幹的甘露醇_蔗糖混合物多功能製劑)，，，J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922 ；Ha, E Wang W, Wang Yj. "Peroxideformation in polysorbate 80 and protein stability (在聚 山梨醇酯80中過氧化物的形成和蛋白質穩定性)」，J. Pharm Sci，91，2252-2264，(2002)， 它們的整體內容在此弓I作參考，讀者尤其應參考這些文獻。 優選本發明治療劑在藥物製劑中呈單位劑量形式存在。合適的治療有效劑量將易 於由本領域技術人員確定。可按照其體重計算患者的合適的劑量，例如，合適的劑量可在 以下範圍內0. 01-20mg/kg,例如 0. l-20mg/kg,例如 l_20mg/kg，例如 10_20mg/kg 或例如 l-15mg/kg，例如10-15mg/kg。為了有效治療病症，在本發明中人使用的合適的劑量可在以下範圍內0. Ol-lOOOmg，例如 0. Ι-lOOOmg，例如 0. l_500mg，例如 500mg，例如 0. I-IOOmg 或 0. l-80mg,或0. l-60mg或0. l_40mg，或例如I-IOOmg或l_50mg的本發明抗原結合構建體， 它們可經胃腸外給予，例如經皮下、靜脈內或肌肉內給予。若有需要，所述劑量可以以合適 的時間間隔重複給予，這由醫生適當選擇。本文所述抗原結合構建體可凍幹儲存，並在使用前以合適的載體復溶。該技術顯 示對常規免疫球蛋白有效，可採用本領域已知的凍幹和復溶技術。有若干種本領域已知的方法可用於發現本發明使用的表位結合結構域。術語「文庫」指異質的多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每一個成員具有單 個多肽或核酸序列。在這個意義上，「文庫」是「譜(repertoire)」的同義詞。文庫成員之 間的序列差異是造成文庫中存在多樣性的原因。文庫可呈簡單的多肽或核酸混合物形式， 或可呈用核酸文庫轉化的生物體或細胞形式，例如細菌、病毒、動物或植物細胞等等。在一 個實例中，每一個單獨的生物體或細胞僅含有一個或有限個數的文庫成員。有利的是，為了 使得由核酸編碼的多肽表達，可將該核酸納入到表達載體中。因此，在一個方面，文庫可呈 宿主生物體群的形式，每一生物體含有表達載體的一個或多個拷貝，所述表達載體含有核 酸形式的單個文庫成員，其可被表達以產生其對應的多肽成員。因此，宿主生物體群具有編 碼多種多肽的眾多譜的可能性。「通用構架」是對應於抗體序列保守區的單獨的抗體構架序列，其如Kabat所定義 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest ( 貞目的 的胃白歹I」)，，， US Department of Health and Human Service)，或為對應於人種系免疫球蛋白譜或結構 的單獨的抗體構架序列，其如Chothia和Lesk，(1987) J. Mol. Biol. 196 :910_917所定義。 可有單一構架或一套所述構架，業已發現它們儘管只在超變區變化，但使得可衍生幾乎任 何結合特異性。在一個實施方案中，用算法BLAST 2 Sequences使用預設參數(Tatusova， Τ. Α.等，FEMS Microbiol Lett，174 187-188 (1999))，來製備並測定本文所定義的胺基酸 和核苷酸序列比對和同源性、相似性或同一性。表位結合結構域和抗原結合位點可各自對通用配體(genericligand)或任何所 需靶配體具有結合特異性，所述配體例如人或動物蛋白，包括細胞因子、生長因子、細胞因 子受體、生長因子受體、酶(例如蛋白酶)、酶的輔因子、DNA結合蛋白、脂質和糖類。包括細 胞因子、生長因子、細胞因子受體、生長因子受體和其它蛋白在內的合適的靶標包括但不限 於ApoE、Apo-SAA, BDNF、心肌營養蛋白-1、CEA、CD40、CD40 配體、CD56、CD38、CD138、EGF、 EGF受體、ENA-78、嗜伊紅細胞趨化因子、嗜伊紅細胞趨化因子-2、Exodus_2、FAPa、酸性 FGF、鹼性FGF、成纖維細胞生長因子-10、FLT3配體、CXXXC趨化分子(CX3C)、⑶NF、G-CSF, GM-CSF、GF-β 1、人血清白蛋白、胰島素、IFNi、IGF-I, IGF-II, IL-I a、IL-I β、IL-I 受 體、IL-I 受體 1 型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL_8(72 個胺基酸)、IL_8(77 個 胺基酸)、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 α、抑制素β、ΙΡ-10、角質形成細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴細胞趨化蛋 白、穆勒氏抑制物、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白、M-CSF、c-fmS、V-fmsMDC(67 個胺基酸)、MDC (69 個胺基酸)、MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67 個胺基酸)、 MDC(69 個胺基酸)、MIG、MIP-I a、MIP-I β、ΜΙΡ—3 a、MIP—3 β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制因子-1 (MPIF-I)、NAP-2、神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、ΝΤ-3、ΝΤ-4、制瘤素Μ、 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4、RANTES, SDFl α、SDFl β、SCF, SCGF、幹細胞因子(SCF)、 TARC, TGF- α、TGF- β、TGF- β 2、TGF- β 3、月中瘤壞死因子(TNF)、TNF- α、TNF- β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-I、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受 體 2、VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、GRO- y、HCCl、1-309、HERl、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、澱粉狀蛋白(例如澱粉狀蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE和本文公開的其 它靶標。應該了解該名單並非詳盡無遺。在某些實施方案中，結合的是肺組織中的靶標，例如選自以下的靶標TNFR1、 IL-U IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、 IL-12R、IL-13、IL-13Ra 1、IL_13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、 IL-23 IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDl la、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、 CD138、ALK5、EGFR、FcERU TGFb, CCL2、CCL18、CEA, CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-I)、糜蛋白酶、 FGF、弗林蛋白酶、內皮素-1、嗜伊紅細胞趨化因子(例如嗜伊紅細胞趨化因子、嗜伊紅細胞 趨化因子_2、嗜伊紅細胞趨化因子_3),GM-CSF, ICAM-1、ICOS、IgE, IFNa, 1_309、整聯蛋白、 L-選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-I、MMP、中性粒細胞彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、PARC、 PD-I、RANTES、SCF、SDF-I、涎免凝集素 8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-I、TNF、TRANCE、類胰蛋白 g|、VEGF、VLA_4、VCAM、α 4 β 7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、α νβ 8,cMET, ⑶8、vWF、澱粉狀蛋白(例如澱粉狀蛋白a)、MMP12、PDKl和IgE。當在本文所述方法中使用展示系統(例如聯繫核酸的編碼功能與核酸編碼的肽 或多肽的功能特性的展示系統)時，例如選擇dAb或其它表位結合結構域時，通常有利的是 擴增或增加編碼所選擇的肽或多肽的核酸的拷貝數。這提供了有效方法來獲得足夠量核酸 和/或肽或多肽，以用於通過本文所述方法或其它合適的方法進行另外輪次的選擇，或用 於製備另外的譜(例如親和力成熟譜)。因此，在某些實施方案中，選擇表位結合結構域的 方法包括使用展示系統(例如聯繫核酸的編碼功能和核酸編碼的肽或多肽的功能特性的 展示系統，例如噬菌體展示)，並另外包括擴增或增加編碼所選擇的肽或多肽的核酸的拷貝 數。可用任何合適的方法例如通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應擴增核酸。在一個實例中，所述方法採用聯繫核酸編碼功能和核酸編碼的多肽的物理、化 學和/或功能特性的展示系統。這樣的展示系統可包含多個可複製的遺傳包(genetic package)，例如噬菌體或細胞(細菌)。展示系統可包含文庫，例如噬菌體展示文庫。噬菌 體展示是展示系統的實例。業已闡述多種合適的噬菌體展示系統(例如單價展示和多價展示系統)。(參 見例如Griffiths等，美國專利第6，555，313 Bl號(在此引作參考)Johnson等，美國 專利第5，733，743號(在此引作參考)；McCafferty等，美國專利第5，969，108號(在 此引作參考)；Mulligan-Kehoe，美國專利第5，702，892號(在此引作參考)；Winter, G.等，Annu. Rev.Immunol. 12 :433_455 (1994) ；Soumillion, P.等，Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3) 175-189 (1994) ；Castagnoli, L.等，Comb. Chem. HighThroughput Screen(高通量篩選)，4(2) 121-133 (2001))。在噬菌體展示系統中展示的肽或多肽可在 任何合適的噬菌體上展示，舉例而言，所述細菌噬菌體例如絲狀噬菌體(例如fd、M13、Fl)、 裂解性噬菌體(例如T4、T7、λ )或RNA噬菌體(例如MS2)。
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通常產生或提供展示作為含合適噬菌體衣殼蛋白(例如fd pill蛋白)的融合蛋 白的肽或噬菌體多肽的譜的噬菌體文庫。融合蛋白可在噬菌體衣殼蛋白的末端或若需要在 內部位置展示肽或多肽。例如，被展示的肽或多肽可存在於PlII的氨基末端到結構域1的 位置。(pill的結構域1也被稱為Ni)。可將被展示的多肽直接融合到pill (例如pill的 結構域1的N-末端)，或用接頭融合到pill。若有需要，融合體可進一步包含標籤(tag) (例如myc表位、His標籤)。用任何合適的方法可產生包含作為含噬菌體衣殼蛋白的融 合蛋白展示的肽譜或多肽譜的文庫，例如通過將編碼被展示的肽或多肽的噬菌體載體或噬 菌粒載體的文庫引入到合適的宿主細菌，並培養所得到的細菌以產生噬菌體(例如若有需 要，則用合適的輔助噬菌體或補充質粒(complementingplasmid))。可用任何合適的方法 (例如沉澱和離心)從培養物回收噬菌體文庫。展示系統可包含含有任何所需多樣性量的肽譜或多肽譜。例如，所述譜可含有具 有對應於由一種生物體、一組生物體、所需組織或所需細胞類型表達的天然存在多肽的氨 基酸序列的肽或多肽，或可含有具有隨機或隨機化胺基酸序列的肽或多肽。若有需要，多肽 可享有共同核心或骨架。例如，譜或文庫中的所有多肽可基於選自以下的骨架蛋白A、蛋 白L、蛋白G、纖連蛋白結構域、anticalin、CTLA4、所需酶(例如聚合酶、纖維素酶)或來自 免疫球蛋白超家族的多肽，例如抗體或抗體片段(例如抗體可變結構域)。在譜或文庫中 的多肽可包含隨機或隨機化胺基酸序列的限定區及共有胺基酸序列的區。在某些實施方案 中，譜中所有或基本上所有多肽為所需類型，例如所需的酶(例如聚合酶)或所需的抗體的 抗原結合片段(例如人Vh或人VJ。在某些實施方案中，多肽展示系統包含多肽譜，其中每 一個多肽包含抗體可變結構域。例如，譜中的每一個多肽可含有Vh、&或Fv(例如單鏈Fv)。可用任何合適的方法將胺基酸序列多樣性引入到肽或多肽或骨架的任何所需區 域中。例如，可通過用任何合適的誘變方法(例如低保真度PCR、寡核苷酸介導的誘變或定 點誘變、用NNK密碼子多樣化)或任何其它合適的方法製備編碼多樣化的多肽的核酸文庫， 來將胺基酸序列多樣性引入靶區域，例如抗體可變結構域的互補決定區或疏水結構域。若 有需要，可使待多樣化的多肽區域隨機化。構成譜的多肽的大小是主要的選擇問題，多肽大小不必一致。譜中的多肽可具有 至少三級結構(形成至少一個結構域)。選擇/分離/回收可用任何合適的方法從譜或文庫(例如在展示系統中)選擇、分離和/或回收表 位結合結構域或結構域群。例如，基於選擇特性(例如物理特性、化學特性、功能特性)來 選擇或分離結構域。合適的選擇性功能特性包括譜中的肽或多肽的生物活性，例如結合通 用配體(例如超抗原)、結合靶配體(例如抗原、表位、底物)、結合抗體(例如通過在肽或 多肽上表達的表位)和催化活性。(參見例如，Tomlinson等，W099/20749 ；WO 01/57065 ； WO 99/58655)。在某些實施方案中，從基本上所有結構域共享共同的選擇性特徵的肽或多肽文庫 或譜中選擇和/或分離蛋白酶抗性肽或多肽。例如，結構域可選自其中基本上所有結構域 具有以下特徵的文庫或譜結合共同的通用配體、結合共同的靶配體、結合共同抗體(或被 共同抗體結合)或擁有共同的催化活性。該選擇類型尤其可用於製備基於具有所需生物活 性的母體肽或多肽的結構域譜，例如當實施免疫球蛋白單一可變結構域的親和力成熟時。
基於結合共同通用配體的選擇可產生含有作為原始文庫或譜組分的所有或基本 上所有結構域的結構域集或群。例如，可通過淘選或用合適的親和基質選擇、分離和/或回 收結合靶配體或通用配體(例如蛋白A、蛋白L或抗體)的結構域。可通過將配體(例如通 用配體、靶配體)溶液加入到合適的容器(例如試管、培養皿)中並使配體沉積或覆蓋在容 器壁上來實施淘選。可洗掉過量配體，可將結構域加到容器中，並將容器保持在適於肽或多 肽結合固定化配體的條件下。可洗掉未結合的結構域，並可例如用任何合適的方法(例如 刮擦或降低PH)來回收結合的結構域。合適的配體親和基質通常含有配體共價或非共價連接其上的固相支持體或珠粒 (例如瓊脂糖)。可在適用於使結構域與基質上的配體結合的條件下用批處理、柱處理或任 何其它合適的處理使親和基質與肽或多肽(例如業已與蛋白酶孵育的譜)結合。可洗掉不 結合親和基質的結構域，用任何合適的方法洗脫並回收已結合的結構域，例如用較低PH的 緩衝液、用溫和變性劑(例如尿素)或用競爭結合配體的肽或結構域洗脫。在一個實例中， 在適用於使譜中的結構域與靶配體結合的條件下讓生物素化的靶配體與譜結合。用固定化 (例如在珠粒上)的親和素或鏈黴親和素回收已結合的結構域。在某些實施方案中，通用配體或靶配體為抗體或其抗原結合片段。與在文庫或譜 的肽或多肽中基本上保守的肽或多肽的結構特徵結合的抗體或抗原結合片段尤其可用作 通用配體。適於用作分離、選擇和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽所用的配體的抗體和抗原 結合片段可為單克隆或多克隆的，並可用任何合適的方法製備。文庫/譜可用任何合適的方法製備或獲得編碼和/或含有蛋白酶表位結合結構域的文庫。 可設計文庫以編碼基於目標結構域或骨架(例如選自文庫的結構域)的結構域，或可用本 文所述方法從另一文庫中選擇文庫。例如，可用合適的多肽展示系統來製備富含結構域的 文庫。可用任何合適的方法容易地產生編碼所需結構域類型的譜的文庫。例如，可獲 得編碼所需多肽類型(例如免疫球蛋白可變結構域)的核酸序列，並且可例如通過用易 錯的聚合酶鏈式反應(PCR)系統擴增核酸、通過化學誘變(Deng等，J. Biol. Chem.，269 9533(1994))或用細菌增變株(LoW等，J. Mol. Biol.，260 =359(1996))來製備每一個含有一 個或多個突變的核酸集合。在其它實施方案中，為了多樣化可以特定的核酸區作為靶標。用於在所選擇的位 置進行突變的方法在本領域亦眾所周知，包括例如在用或不用PCR時使用錯配的寡核苷酸 或簡併的寡核苷酸。例如，通過將突變靶向抗原結合環來產生合成的抗體文庫。業已將隨機 或半-隨機抗體H3和L3區添加到種系免疫球蛋白V基因區段，以產生含未突變構架區的大 文庫(Hoogenboom 和 Winter (1992)上述；Nissim 等(1994)見上述；Griffiths 等(1994) 見上述；DeKruif等(1995)見上述)。業已將所述多樣性延伸到包括某些或所有其它抗原 結合環(Crameri 等(1996) Nature Med. ,2 100 ；Riechmann 等(1995) Bio/Technology, 13 475 ；Morphosys, WO 97/08320，見上述)。在其它實施方案中，為了多樣化可通過例如採用 第一 PCR產物為「大引物(mega-primer)」的兩步PCR策略來靶向核酸的特定區。(參見 例如Landt，0.等，Gene 96:125-128(1990))。例如通過SOE PCR也可完成靶向的多樣化。 (參見例如 Horton，R. M.等，Gene 77:61-68(1989))。
可通過改變確定多肽序列的編碼序列致使可將許多可能的胺基酸(例如所有20 種胺基酸或其子集)引入到該位置來實現在所選位置的序列多樣性。用IUPAC命名法，最 多能的密碼子是NNK，其編碼所有胺基酸以及TAG終止密碼子。可使用NNK密碼子以引入所 需多樣性。也使用達到同樣目的的其它密碼子，包括NNN密碼子，該密碼子導致產生另外的 終止密碼子TGA和TAA。這樣的靶向方法可使得靶區域的全序列範圍得到探索。某些文庫包含作為免疫球蛋白超家族成員(例如抗體或其部分)的結構域。例如， 文庫可包含具有已知主鏈構象的結構域。(參見例如Tomlinson等，WO 99/20749)。可在 合適的質粒或載體中製備文庫。本文所用載體指分離的元件(discrete element)，其用於 將異源DNA引入到細胞中用於表達和/或其複製。可使用任何合適的載體，包括質粒(例 如細菌質粒)、病毒或噬菌體載體、人工染色體和游離型載體。這樣的載體可用於簡單克隆 和誘變，或表達載體可用於驅動文庫表達。載體和質粒通常含有一個或多個克隆位點(例 如多接頭)、複製起始點和至少一個選擇標記基因。表達載體可進一步含有驅動多肽轉錄及 翻譯的元件，例如增強子元件、啟動子、轉錄終止信號、信號序列等等。可以以使其可操作地 連接編碼多肽的克隆插入物的方式排列這些元件，由此當所述表達載體保持在適於表達的 條件下(例如在合適的宿主細胞中)時可表達並產生所述多肽。克隆載體和表達載體通常含有使得所述載體可在一個或多個所選擇的宿主細胞 中複製的核酸序列。在克隆載體中，通常該序列為能使得載體獨立於宿主染色體DNA複製 的序列，包括複製起始點或自主複製序列。對於多種細菌、酵母和病毒，所述序列眾所周知。 來自質粒PBR322的複製起始點適用於大部分革蘭氏陰性細菌，2微米質粒起始適用於酵母 菌，各種病毒複製起始點(例如SV40、腺病毒)可用於在哺乳動物細胞中克隆載體。除非在 哺乳動物細胞(例如COS細胞)中使用的複製起始點能夠複製高水平DNA，否則哺乳動物表 達載體通常不需要複製起始點。克隆載體或表達載體可含有也被稱為選擇標記的選擇基因。此類標記基因編碼使 轉化的宿主細胞在選擇培養基中存活或生長必不可少的蛋白質。因此，未用含有選擇基因 的載體轉化的宿主細胞將不能在培養基中存活。典型的選擇基因編碼的蛋白賦予抗生素及 其它毒素(例如氨節青黴素(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate) 或四環素(tetracycline))抗性，互補的營養缺陷或提供在生長培養基中不能獲得的關鍵 營養素。合適的表達載體可含有多種組分，例如複製起始點、選擇標記基因、諸如轉錄調控 元件(例如啟動子、增強子、終止子)等一種或多種表達調控元件和/或一種或多種翻譯信 號、信號序列或前導序列等。若存在，表達調控元件和信號序列或前導序列可由載體或其它 來源提供。例如，編碼抗體鏈的已克隆的核酸的轉錄和/或翻譯調控序列可用於指導表達。可提供啟動子用於在所需宿主細胞中進行表達。啟動子可為組成型或誘導型。例 如，可讓啟動子可操作地連接編碼抗體、抗體鏈或其部分的核酸，致使其指導該核酸轉錄。 可利用多種適用於原核宿主的啟動子(例如用於大腸桿菌的內醯胺酶和乳糖啟動子系 統、鹼性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統、lac、tac、T3、T7啟動子)和真核宿主的啟動子 (例如，猴腎病毒40早期或晚期啟動子、勞氏肉瘤病毒長末端重複啟動子、巨細胞病毒啟動 子、腺病毒晚期啟動子、EG-Ia啟動子)。另外，表達載體通常包含用於選擇攜帶載體的宿主細胞的選擇標記，並在可複製
36的表達載體情況下包含複製起點。編碼賦予抗生素或藥物抗性的產物的基因為常用選擇標 記，可用於原核細胞(例如內醯胺酶基因(氨苄青黴素抗性)、四環素抗性的Tet基因) 和真核細胞(例如新黴素(G418或遺傳黴素(geneticin))、gpt(黴酚酸)、氨苄青黴素或 潮黴素(hygromycin)抗性基因)。二氫葉酸還原酶標記基因使得可用甲氨蝶呤在多種宿 主中選擇。在酵母中通常將編碼宿主的營養缺陷型標記物的基因產物的基因(例如LEU2、 URA3、HIS3)用作選擇標記。還涵蓋使用病毒(例如杆狀病毒)或噬菌體載體和能夠整合 到宿主細胞基因組的載體(例如逆轉錄病毒載體)。適用於在原核細胞(例如細菌細胞，例如大腸桿菌)或哺乳動物細胞中表達的表 達載體包括例如pET 載體(例如 pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40，Novagen 等)、 噬菌體載體(例如 pCANTAB5 E,Pharmacia)、pRIT2T (蛋白 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl. l/amp、pcDNA3. 1、pRc/RSV、pEF_l(Invitrogen, Carlsbad, CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、 pSG5、pXTl (Stratagene, La Jolla, CA)、pCDEF3 (Goldman, L. A.,等，Biotechniques, 21 1013-1015(1996))、pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD)、pEF-Bos (Mizushima，S.，等， Nucleic Acids Res.，18 :5322 (1990))等等。可利用適用於不同表達宿主的表達載體，所 述不同表達宿主例如原核細胞(大腸桿菌)、昆蟲細胞(果蠅(Drosophila Schnieder) S2 細胞，Sf9)、酵母(甲醇畢赤酵母(P. methanol!ca)、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、釀酒酵 母(S. cerevisiae))細胞和哺乳動物細胞(例如COS細胞)。載體的某些實例為能使對應於多肽文庫成員的核苷酸序列表達的表達載體。因 此，可通過讓表達多肽文庫成員的單個克隆單獨增殖並表達來進行用通用配體和/或靶 配體的選擇。如上所述，特定的選擇展示系統為噬菌體展示。因此，可使用噬菌體或噬菌 粒載體，例如，載體可為具有大腸桿菌複製起始點(用於雙鏈複製)以及此外的噬菌體復 制起始點(用於產生單鏈DNA)的噬菌粒載體。所述載體的操作及表達在本領域眾所周 知(Hoogenboom和Winter (1992)見上述；Nissim等(1994)見上述)。簡言之，載體可含 有內醯胺酶基因以賦予噬菌粒選擇性，並含有表達盒上遊的Iac啟動子，所述表達盒 可含有合適的前導序列、多個克隆位點、一個或多個肽標籤、一個或多個TAG終止密碼子和 噬菌體蛋白pill。因此，用各種大腸桿菌阻抑菌株和非阻抑菌株並加入葡萄糖、異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或輔助噬菌體(例如VCS Μ13)，載體能夠作為不表達而只產生 大量的多肽文庫成員的質粒複製，或作為產物噬菌體複製，所述產物噬菌體中某些在其表 面含有多肽-PlII融合體的至少一個拷貝。抗體可變結構域可包含靶配體結合位點和/或通用配體結合位點。在某些實施方 案中，通用配體結合位點為超抗原(例如蛋白Α、蛋白L或蛋白G)結合位點。可變結構域可 基於任何所需的可變結構域，例如人VH(例如Vh la、Vh lb, Vh 2, Vh 3, Vh 4, Vh 5, Vh 6)、人 V λ (例如 V λ I、V λ II、V λ III、V λ IV、νλ V、νλ VI 或 Vk 1)或人 V κ (例如 Vk 2、Vk 3、 Vk 4、Vk 5、Vk 6、Vk 7、Vk 8、Vk 9 或 Vk 10) ο另一類技術涉及選擇人工分隔間(artificial compartment)的譜，所述人工 分隔間使得基因可與其基因產物相連接。例如，可在由油包水乳劑形成的微膠囊中選 擇編碼所需基因產物的核酸的選擇系統闡述於W099/02671、W000/40712和Tawfik & Griffiths (1998)NatureBiotechnol 16(7) ,652-6中。可將編碼具有所需活性的基因產 物的遺傳元件分區到微膠囊中，然後在微膠囊內轉錄和/或翻譯以產生其各自的基因產物(RNA或蛋白質)。隨後挑選產生具有所需活性的基因產物的遺傳元件。本方法通過經由多 種手段檢測所需活性來選擇目的基因產物。表位結合結構域表徵可通過為本領域技術人員所熟悉的方法檢測結構域與其特異性抗原或表位的結 合，所述方法包括ELISA。在一個實例中，用單克隆噬菌體ELISA檢測結合。可按照任何合適程序實施噬菌體ELISA 以下提出例示性方案。可通過ELISA針對所選擇的抗原或表位的結合情況來篩選每一輪選擇產生的噬 菌體群，以鑑定"多克隆"噬菌體抗體。然後可通過ELISA篩選來自這些群中的單個受感 染的細菌菌落的噬菌體，以鑑定"單克隆"噬菌體抗體。也期需針對與抗原或表位的結合 情況來篩選可溶性抗體片段，這還可通過ELISA用例如針對C-或N-末端標籤的試劑來進 行(參見例如Winter等(1994) Ann. Rev. Immunology 12，433-55及其中所引用參考文獻)。還可通過PCR產物的凝膠電泳(Marks等1991，上述；Nissim等1994上述)、用探 針探測(Tomlinson等，1992J. Mol. Biol. 227，776)或通過測定載體DNA序列，來評估所選擇 的噬菌體單克隆抗體的多樣性。E. dAb 結構在例如用本文所述噬菌體展示技術從所選擇的V-基因譜選擇dAb的情況下，這些 可變結構域包含通用構架區，由此可以通過本文所定義的特定通用配體來識別它們。通用 構架區、通用配體等的使用闡述於W099/20749中。當使用V-基因譜時，多肽序列中的變化可位於可變結構域結構環內。任一可變結 構域的多肽序列可通過DNA改組或通過突變來改變，致使提高每一可變結構域與其互補對 的相互作用。DNA改組為本領域所知，由例如Stemmer, 1994，Nature 370 :389_391和美國 專利第6，297，053號教導，它們在此引作參考。其它誘變方法為本領域技術人員所熟知。用於構津dAb的骨架 .詵擇主鏈構象免疫球蛋白超家族成員在其多肽鏈方面都共享相似的摺疊。例如，儘管抗體就其 一級序列而言高度不同，但與預期的相反，序列比較和晶體結構顯示抗體的6個抗原結合 環中的5個(HI、H2、Li、L2、L3)採用少數主鏈構象或規範結構(Chothia和Lesk(1987) J. Mol. Biol.，196 901 ；Chothia 等(1989) Nature，342 :877)。因此，環長度及關鍵殘基分析 使得可預測在大部分人抗體中存在的HI、H2、Li、L2和L3的主鏈構象(Chothia等(1992) J. Mol. Biol.，227 799 ；Tomlinson 等(1995) EMBO J.，14 4628 ；Williams 等(1996) J. Mol. Biol.，264:220)。儘管就序列、長度及結構(由於使用D區段)而言H3區更多樣，但其由 於環長度短而同樣形成少數主鏈構象，這要視長度及環中及抗體構架中關鍵位置的特定殘 基的存在情況或殘基類型而定(Martin等(1996) J. Mol. Biol.，263 800 ；Shirai等(1996) FEBS Letters,399 1)。有利地的是，從結構域文庫(例如Vh結構域文庫和/或\結構域文庫)組裝dAb。 在一個方面，對結構域文庫進行設計，其中選擇某些環長度和關鍵殘基以確保成員的主鏈 構象是已知的。有利的是，為了使其無功能的機率最小化，它們是在自然界發現的免疫球蛋 白超家族分子的真正構象，其如上所述。種系V基因區段用作一個合適的基本構架用於構 建抗體或T-細胞受體文庫；其它序列也有用。可以以低頻率發生變化，以使少數功能成員
38可擁有改變的主鏈構象，所述構象並不影響其功能。規範結構理論還可用於評估由配體編碼的不同的主鏈構象的數量，以基於配體序 列預測主鏈構象，並為多樣化選擇不影響規範結構的殘基。已知在人Vk結構域中，Ll環可 採用4種規範結構中的1種，L2環具有單一的規範結構，對於L3環90%的人Vk結構域採 用4種或5種規範結構中的1種(Tomlinson等(1995)見上述)；因此，在單獨的Vk結構域 中，不同的規範結構可聯合以產生一系列不同的主鏈構象。已知νλ結構域編碼Li、L2和 L3環的一系列不同的規範結構，且Vk和νλ結構域可與可編碼Hl和Η2環的若干規範結構 的任何Vh結構域配對，那麼在這5種環中觀察到的規範結構組合的數目將極大。這表明主 鏈構象多樣性的產生對於產生大範圍的結合特異性可能是必需的。然而，通過基於單一已 知主鏈構象構建抗體文庫，業已發現與預期相反，對於產生足以靶向基本上所有抗原的多 樣性並不需要主鏈構象多樣性。甚至更意想不到的是，單一主鏈構象不必為共有結構_單 一天然存在的構象可用作整個文庫的基礎。因此，在一個特別的方面，dAb擁有單一的已知 主鏈構象。所選擇的單一主鏈構象可以是所考慮的免疫球蛋白超家族類型分子中的普通的 一種。當觀察到大量天然存在的分子採用該構象時，所述構象就是普通構象。因此，在一個 方面，單獨考慮對於免疫球蛋白結構域的每一結合環的不同主鏈構象的天然存在情況，然 後為不同環選擇天然存在的可變結構域，所述可變結構域擁有所期需的主鏈構象組僉。如 果沒有一個可以利用，那麼可選擇最接近的等同物。可通過選擇編碼所需主鏈構象的種系 基因區段來產生對於不同環的所期需的主鏈構象組合。在一個實例中，所選擇的種系基因 區段在自然界中頻繁表達，具體而言，在所有天然種系基因區段中它們可能是最頻繁地表 達。在設計文庫的過程中，可以單獨考慮對於6個抗原結合環中的每一個的不同的主 鏈構象發生率。對於111、!12、1^1、1^2和1^3，選擇20% -100%的天然存在的分子的抗原結合 環所採用的既定構象。通常，其觀察到的發生率超過35% (即35%至100%之間)，理想情 況為超過50%或甚至超過65%。由於絕大多數H3環不具有規範結構，因而優選選擇在這 些不展示規範結構的環中普通的主鏈構象。因此，對於每一種環，選擇在天然譜中最經常觀 察到的構象。在人抗體中，對於每一種環而言最普遍的規範結構(CS)如下Hl-CS 1(79% 所表達的譜)、H2-CS 3(46%)、Ll-CS 2VK (39% ), L2-CS 1(100% L3-CS IVk (36% ) (計算假設K: λ 比率為 70 :30，Hood 等(1967)Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol二， 48 133)。對於具有規範結構的H3環，在第94位殘基-第101位殘基含有鹽橋的長7個 殘基的 CDR3(Kabat 等(1991)Sequences of proteins of immunological interest, U. S. Departmentof Health and Human Services)以乎是最普遍的。在 EMBL 資料庫中有 至少16種人抗體序列含有形成該構象所需的H3長度和關鍵殘基，在用作抗體建模的基礎 的蛋白質資料庫中有至少兩種晶體結構(2cgr和ltet)。規範結構的這種組合的最頻繁表 達的種系基因區段為Vh區段3-23 (DP-47)、Jh區段JH4b、VK區段02/012 (DPK9)和Jk區段 JK1。Vh區段DP45和DP38也是合適的。因此，可將這些區段組合用作構建具有所期需單一 主鏈構象的文庫的基礎。或者，代替基於處於孤立狀態的每一結合環的不同的主鏈構象的天然發生率來選 擇單一主鏈構象，將主鏈構象組合的天然發生率作為用於選擇單一主鏈構象的基礎。例如，在抗體情況下，可確定對於抗原結合環中的任何兩個、三個、四個、五個或所有六個的規範 結構組合的自然發生率。此時所選擇的構象可為天然存在的抗體中的普通構象，並且可在 天然譜中最經常地觀察到。因此，例如在人抗體中，當考慮5種抗原結合環HI、H2、Li、L2 和L3的天然組合時，確定規範結構的最頻繁的組合，然後與H3環的最普遍的構象聯合，作 為選擇單一主鏈構象的基礎。規範序列的多樣化選擇了幾種已知主鏈構象或單一已知主鏈構象後，就可通過改變分子的結合位點 來構建dAb，以產生含結構和/或功能多樣性的譜。這意味著產生變體，致使在其結構和/ 或其功能方面具有足夠的多樣性，由此它們能夠提供一系列的活性。通常通過在一個或多個位置改變所選擇的分子來產生所期需的多樣性。可隨機選 擇待改變的位置，或它們可能已被選定。然後通過以下方式來實現變異隨機化，在隨機化 期間由任意胺基酸或其天然或合成的類似物取代胺基酸殘基產生極大量的變體；或者用一 種或多種限定的胺基酸子集置換胺基酸殘基，產生更少量的變體。業已報導用於引入所述多樣性的各種方法。可用易錯PCR(Hawkins等(1992) J. Mol.Biol.，226 :889)、化學誘變(Deng 等(1994) J. Biol. Chem. , 269 9533)或細菌增變 株(LoW等(1996) J. Mol. Biol.，260 :359)來將隨機突變引入編碼分子的基因中。用於突 變所選位置的方法在本領域亦眾所周知，包括用或不用PCR使用錯配的寡核苷酸或簡併寡 核苷酸。例如，通過以抗原結合環作為目標進行突變產生若干合成的抗體文庫。使結合人 破傷風類毒素-Fab的H3區隨機化以產生一系列新的結合特異性(Barbas等(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 :4457)。隨機或半-隨機H3和L3區業已被添加到種系V基因區 段以產生含未突變構架區的大文庫(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. , 227 381 ； Barbas 等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4457 ；Nissim 等(1994) EMBO J.，13 692 ； Griffiths 等(1994) EMBO J.，13 3245 ；De Kruif■等(1995) J. Mol. Biol.，248 97)。所述多 樣化業已延伸到包括某些或所有其它抗原結合環(Crameri等(1996) Nature Med. ,2 100 ； Riechmann 等(1995) Bio/Technology, 13 475 ；Morphosys, W097/08320,見上述)。由於環的隨機化有可能產生大約超過IO15種針對單獨的H3的結構，以及同樣大量 的其它5種環的變體，因而用目前的轉化技術或甚至通過用無細胞系統以產生代表所有可 能組合的文庫是不可行的。例如，在迄今構建的最大的文庫之一中，產生了 6xl01(l種不同的 抗體，這僅是該設計的文庫的潛在多樣性的小部分而已(Griffiths等(1994)見上述)。在一個實施方案中，僅那些直接參與產生或修飾所期需的分子功能的殘基被多樣 化。對於很多分子而言，功能應為結合靶標，因此多樣性應該集中在靶標結合位點，同時避 免改變對於分子的整體包裝或對於維持所選擇的主鏈構象很重要的殘基。在一個方面，使用其中僅那些抗原結合位點的殘基被改變的dAb文庫。這些殘基 在人抗體譜中極具多樣性，並且已知為高分辨的抗體/抗原複合體的接觸點。例如，在L2 中，已知在天然存在的抗體中位置50和53是多變的，並觀察到其與抗原接觸。相比之下， 常規方法將使由Kabat等(1991，上述)定義的相應的互補決定區(CDRl)中的所有殘基多 樣化，與文庫中多樣化的兩個殘基相比某些有7個殘基被多樣化。就產生一系列抗原結合 特異性所需的功能多樣性而言，這代表顯著改進。實際上，抗體多樣性是兩個過程的結果種系V、D和J基因區段的體細胞重組致使產生天然的初始譜(primary repertoire)(所謂的種系和連接多樣性)和導致產生重排 的V基因的體細胞超突變。人抗體序列分析顯示，初始譜多樣性集中在抗原結合位點中心， 而體細胞超突變將多樣性散布在在初始譜中高度保守的抗原結合位點的外圍區域(參見 Tomlinson等(1996) J. Mol. Biol.，256 :813)。這種互補很可能進化為搜尋序列間隔的有效 策略，儘管對於抗體明顯是獨特的，但這可能容易地應用到其它多肽譜。被改變的殘基是形 成靶標結合位點的那些殘基的子集。若有需要，靶標結合位點中不同的(包括重疊的)殘 基子集在選擇期間在不同階段被多樣化。在抗體譜情況下，當某些而不是所有抗原結合位點殘基被多樣化時，產生了初始 「天然」譜。本文上下文所用術語「天然」或「假體(dummy)」指沒有預先確定靶標的抗體分 子。這些分子類似於尚未經歷免疫多樣化的個體的免疫球蛋白基因所編碼的分子，所述尚 未經歷免疫多樣化的個體的例子為胎兒及新生兒個體，其免疫系統尚未受到多種抗原刺激 物的攻擊。然後針對一系列抗原或表位選擇該譜。若有需要，可在初始譜中被多樣化的區 域之外引入另外的多樣性。可選擇這種成熟的譜用於改變功能、特異性或親和力。應該理解的是，本文所述序列包括與本文所述序列具有基本同一性的序列，例如 至少90%同一性，例如至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少 96%或至少97%或至少98%或至少99%同一性。對於核酸，術語「基本同一性」表明當對兩種核酸或其指定序列以適當的核苷酸插 入或缺失進行最佳比對及比較時，它們有至少約80%的核苷酸、通常至少約90% -95%並 更優選至少約98% -99. 5%的核苷酸相同。或者，當區段在選擇性雜交條件下與互補鏈雜 交時存在基本上同一性。對於核苷酸和胺基酸序列，術語「同一"表明當兩個核酸或胺基酸序列之間以適 當插入或缺失進行最佳比對和比較時的相同程度。或者，當DNA區段在選擇性雜交條件與 互補鏈雜交時存在基本上同一性。兩個序列之間的同一性百分比是序列共有的同一位置數量的函數(即同一性％ =同一位置數目/位置總數乘以100)，為了兩個序列的最佳比對需要考慮空位數目及每一 空位長度。可用數學算法完成序列比較和兩個序列之間同一性百分比的測定，其如以下非 限制性實施例所述。可用GCG軟體包中的GAP程序、用NWSgapdna. CMP矩陣和40、50、60、70或80的空 位權重和1、2、3、4、5或6的長度權重，來測定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比。還可 用被整合至IJ ALIGN 程序(2. 0 版)的 E. Meyers 和 W. Miller 算法(Comput. Appl. Biosci.， 4 11-17 (1988))、用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4來測定兩個核苷 酸或胺基酸序列之間的同一性百分比。另外，可用業已整合到GCG軟體包中的GAP程序的 Needleman 和 Wunsch(J. Mol. Biol. 48 444-453 (1970))算法、用 Blossum 62 矩陣或 PAM250 矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，來測定兩個胺基酸序列 之間的同一性百分比。舉例而言，本發明多核苷酸序列可與SEQ ID NO :122參考序列同一，也就是說 100%同一，或其與參考序列比較可包括至多某些整數個的核苷酸改變。所述改變選自至少 一個核苷酸缺失、置換(包括轉換和顛換)或插入，並且其中所述改變可發生在參考核苷酸 序列的5'或3'末端位置，或這些末端位置之間的任何位置，其各自散布在參考序列的核
41苷酸之中的或在參考序列內的一個或多個鄰接基團(contiguousgroup)中。通過讓SEQ ID N0:122的核苷酸總數乘以各自同一性百分比數值(除以100)，並從所述SEQ ID N0:122核 苷酸總數減去該乘積，求出核苷酸改變數目，或nn 彡 xn_ (xn · y),其中rm為核苷酸改變數目，xn為SEQ ID NO 122核苷酸總數，y 對於50%為 0. 50、對於60%為0. 60、對於70%為0. 70、對於80%為0. 80、對於85%為0. 85、對於90% 為0. 90、對於95%為0. 95、對於97%為0. 97或對於100%為1. 00，其中在從xn減去xn與 y的任何非整數乘積之前將其四捨五入成最接近的整數。SEQ ID N0:122多核苷酸序列的 改變可在該編碼序列中產生無意義、錯義或移碼突變，藉此在所述改變後改變多核苷酸所 編碼的多肽。同樣地，在另一實施例中，本發明可多肽序列可與SEQ ID NO 26編碼的參考序列 同一，也就是說100 %同一，或其與參考序列比較可包括至多某些整數個的胺基酸改變，致 使同一性％小於100%。所述改變選自至少一個核苷酸缺失、取代(包括保守和非保守取 代)或插入，其中所述改變可發生在參考多肽序列的氨基末端或羧基末端位置，或這些末 端位置之間的任何位置，其各自散布在參考序列的胺基酸之中或在參考序列內的一個或多 個鄰接基團中。通過讓SEQ ID NO :26編碼的多肽序列中胺基酸總數乘以各自同一性百分 比數值(除以100)，然後從所述SEQ ID NO :26編碼的多肽序列中胺基酸總數減去該乘積， 求出對應於既定同一性％的胺基酸改變數目，或na ^ xa- (xa · y),其中na為胺基酸改變數目，xa為SEQ ID NO :26所編碼的多肽序列中胺基酸的總 數，y為例如對於70%為0. 70、對於80%為0. 80、對於85%為0. 85等，其中在從xa減去 xa與y的任何非整數乘積之前將其四捨五入成最接近的整數。
實施例以下方法在本文所述實施例中使用。方法1通過ELISA測定與大腸桿菌表達的重組人IL-13的結合在直接結合ELISA中評估mAbdAb分子對大腸桿菌表達的重組人IL-13的結合。簡 言之，將5 μ g/ml大腸桿菌表達的重組人IL-13 (由GSK製備並純化)包被到96孔ELISA 板。在室溫將各孔封閉1小時，然後對所述板滴定出(titrate out)mAbdAb構建體(通常 從3倍稀釋液中的大約IOOnM到大約0. OlnM)。用抗-人κ輕鏈過氧化物酶綴合抗體(貨 號Α7164，Sigma-Aldrich)的適當稀釋液或抗-人IgG γ鏈特異性過氧化物酶綴合檢測抗 體(貨號Α6029，Sigma-Aldrich)的適當稀釋液檢測結合。方法2通過ELISA測定與大腸桿菌表達的重組人IL_4的結合在直接結合ELISA中評估mAbdAb構建體對大腸桿菌表達的重組人IL_4的結合。 簡言之，將5 μ g/ml大腸桿菌表達的重組人IL-4 (由GSK製備並純化)包被到96孔ELISA 板。在室溫將各孔封閉1小時，然後對所述板滴定出mAbdAb構建體(通常從3倍稀釋液中 的大約IOOnM到大約0. OlnM)。用山羊抗-人κ輕鏈過氧化物酶綴合抗體(貨號Α7164，Sigma-Aldrich)的適當稀釋液或抗-人IgG γ鏈特異性過氧化物酶綴合檢測抗體(貨號 Α6029，Sigma-Aldrich)的適當稀釋液檢測結合。方法3誦i寸ELISA檢測丨與大腸桿菌表汰的重鉬λIL-18的結合在直接結合ELISA中評估mAbdAb構建體對大腸桿菌表達的重組人IL-18的結 合。簡言之，將5 μ g/ml大腸桿菌表達的重組人IL-18 (由GSK製備並純化)包被到96孔 ELISA板。在室溫將各孔封閉1小時，然後對所述板滴定出mAbdAb構建體(通常從3倍稀 釋液中的大約IOOnM到大約0. OlnM)。用抗-人κ輕鏈過氧化物酶綴合抗體(貨號Α7164， Sigma-Aldrich)的2000倍稀釋液或抗-人IgG γ鏈特異性過氧化物酶綴合檢測抗體(貨 號Α6029，Sigma-Aldrich)的2000倍稀釋液檢測結合。方法4對結合大腸桿菌表汰的重組人IL-13的Biacore 結合親和力評估由Biacore 分析評估了 mAbdAb構建體對於大腸桿菌表達的重組人IL-13的結合 親和力。用蛋白A或抗-人IgG捕獲抗體進行分析。簡言之，按照製造商提議通過伯胺偶 聯將蛋白A或抗-人IgG偶聯到CM5晶片上。然後將mAbdAb構建體捕獲到該表面上，以限 定濃度使人IL_13(由GSK製備並純化)通過(pass over)。用溫和的酸洗脫條件(例如 IOOmM磷酸)使該表面再生為蛋白A表面，這不會顯著影響捕獲抗體對隨後的IL-13結合 事件的能力。用與再生蛋白A表面相似的條件或通過用3M MgCl2H抗-人IgG表面再生。 在Biacore 3000和/或TlOO設備上實施該工作，用設備中的評估軟體分析數據，並擬合 為1 1的結合模型。在25°C或37°C實施Biacore 運行。方法5對結合大腸桿菌表汰的重組人IL-4的Biacore 結合親和力評估由Biacore 分析評估了 mAbdAb構建體對於大腸桿菌表達的重組人IL_4的結合 親和力。用蛋白A或抗-人IgG捕獲抗體進行分析。簡言之，按照製造商提議通過伯胺偶 聯將蛋白A或抗-人IgG偶聯到CM5晶片上。然後將mAbdAb構建體捕獲到該表面，以限定 濃度使人IL-4 (由GSK製備並純化)通過。用溫和的酸洗脫條件(例如IOOmM磷酸)使該 表面再生為蛋白A表面，這不會顯著影響捕獲抗體對隨後的IL-4結合事件的能力。用與再 生蛋白A表面相似的條件或通過用3M MgCl2H抗-人IgG表面再生。在Biacore 3000和 /或T100和/或A100設備上實施該工作，用設備中的評估軟體分析數據，並擬合為1 1 的結合模型。在25°C或37°C實施Biacore 運行。方法6對結合大腸桿菌表達的重組人IL-18的Biacore 結合親和力評估由Biacore 分析評估了 mAbdAb構建體對於大腸桿菌表達的重組人IL-18的結合 親和力。用蛋白A或抗-人IgG捕獲抗體進行分析。簡言之，按照製造商提議通過伯胺偶聯 將蛋白A或抗-人IgG偶聯到CM5晶片上。然後將mAbdAb構建體捕獲到該表面，以限定濃 度使人IL_18(由GSK製備並純化)通過。用溫和的酸洗脫條件(例如IOOmM磷酸)使該表 面再生為蛋白A表面，這不會顯著影響捕獲抗體對隨後的IL-18結合事件的能力。用與再 生蛋白A表面相似的條件或通過用3M MgCl2H抗-人IgG表面再生。在Biacore 3000和 /或T100和/或A100設備上實施該工作，用設備中的評估軟體分析數據，並擬合為1 1的結合模型。在25°C實施Biacore 運行。方法7對IL-13.IL-4或IL-18的mAbdAb雙特異件杭體或三特異件杭體的化學i十量i平估 (M Biacorea)通過伯胺偶聯將抗-人IgG固定到CM5生物傳感器晶片上。在使單一濃度的 IL-13、IL-4或IL-18細胞因子通過後，將mAbdAb構建體捕獲到該表面上，該濃度足以使結 合表面飽和，所觀察到的結合信號達到滿R-max。然後用給定公式計算化學計量化學計量=RmaX*Mw (配體)/Mw(分析物)*R(被固定或捕獲的配體)當計算不止一種在同一時間結合的分析物的化學計量時，使不同的細胞因子以 飽和細胞因子濃度序貫通過，如上計算化學計量。本工作在Biacore 3000上於25°C下用 HBS-EP運行緩衝液進行。方法8^h TF-iκ n-i3 的中禾口TF-I細胞因響應包括人IL-13在內的許多不同的細胞因子而增殖。因此，可將這 些細胞對IL-13的增殖性響應用於測量IL-13的生物活性，並隨後開發出測定mAbdAb構建 體對IL-13的中和效能(抑制IL-13生物活性)的測定法。在無菌條件下於無菌96孔組織培養板中實施測定，所有測試孔以一式三份進行。 讓大約14ng/ml大腸桿菌表達的重組人IL-13與mAbdAb構建體的各種稀釋液(通常從以3 倍稀釋滴定的200nM到0. 02nM)在50 μ 1總體積中於37°C預孵育1小時。然後將這些樣品 加到無菌96孔組織培養板的50 μ 1的TF-I細胞(以每毫升2x105個細胞的濃度)中。因 此，最後100 μ 1測定體積含有各種稀釋度的mAbdAb構建體(以從以3倍稀釋滴定的IOOnM 到0. OlnM的終濃度)、大腸桿菌表達的重組人IL-13(以7ng/ml的終濃度)和TF-I細胞 (以每毫升IxlO5個細胞的終濃度)。讓測定板在37°C增溼CO2培養箱中孵育大約3天。然 後用來自 Promega 的 iCellTitre 96 Non-Radioactive Cell ProliferationAssay'(貨 號G4100)如製造商說明書所述測定細胞增殖的量。在板讀數器中於570nm處讀取96-孔 板的樣品的吸光度。將mAbdAb構建體中和大腸桿菌表達的重組人IL-13的生物活性的能力，表示為 中和限定量的人IL-13(7ng/ml)的生物活性到50%所需的mAbdAb構建體濃度(=ND50)。 所需mAbdAb構建體的濃度越低，中和能力的功效越強。手動或通過用微軟excel固有的 Robosage軟體包計算本文提供的ND5tl數據.方法9在TF-I細胞增殖生物測定中大腸桿菌表達的重組人IL-4的中和TF-I細胞因響應包括人IL-4在內的許多不同的細胞因子而增殖。因此，可將這些 細胞對IL-4的增殖性響應用於測量IL-4的生物活性，並隨後開發出測定mAbdAb構建體對 IL-4的中和效價(抑制IL-4生物活性)的測定法。在無菌條件下於無菌96孔組織培養板中實施測定，所有測試孔以一式三份進行。 讓大約2. 2ng/ml大腸桿菌表達的重組人IL-4與mAbdAb構建體的各種稀釋液(通常從以 3倍稀釋滴定的200nM到0. 02nM)在50 μ 1總體積中於37°C預孵育1小時。然後將這些 樣品加到於無菌96孔組織培養板的50 μ 1的TF-I細胞(以每毫升2χ105個細胞的濃度)
44中。因此，最後100 μ 1測定體積含有各種稀釋度的mAbdAb構建體(以從以3倍稀釋滴定 的IOOnM到0. OlnM的終濃度)、大腸桿菌表達的重組人IL_4(以1. lng/ml的終濃度)和 TF-I細胞(以每毫升IxlO5個細胞的終濃度)。讓測定板在37°C增溼CO2培養箱中孵育大 約 3 天。然後用來自 Promega 的 『CellTitre 96 Non-Radioactive CellProliferation Assay'(貨號G4100)如製造商說明書所述測定細胞增殖的量。在板讀數器中於570nm處 讀取96-孔板的樣品的吸光度。將mAbdAb構建體中和大腸桿菌表達的重組人IL-4的生物活性的能力，表示為中 和限定量的人IL-4(1. lng/ml)的生物活性到50%所需的mAbdAb構建體濃度(=ND50)。 所需mAbdAb構建體的濃度越低，中和能力的功效越強。手動或通過用微軟excel固有的 Robosage軟體包計算本文提供的ND5tl數據.方法10^ TF-iκ n-i3 m^m^mmmm 組人IL-4的雙重中和TF-I細胞因響應包括人IL-13和人IL-4在內的許多不同的細胞因子而增殖。因 此，可將這些細胞對IL-13及IL-4的增殖性響應用於同時測量IL-13及IL-4的生物活性， 並隨後開發出測定mAbdAb構建體對IL-13及IL-4雙重中和效價(IL-13及IL-4生物活性 的雙重抑制)的測定法。在無菌條件下於無菌96孔組織培養板中實施測定，所有測試孔以一式三份進行。 讓大約14ng/ml大腸桿菌表達的重組人IL-13和大約2. 2ng/ml大腸桿菌表達的重組人 IL-4與mAbdAb構建體的各種稀釋液(通常從以3倍稀釋滴定的200nM到0. 02nM)在50 μ 1 總體積中於37°C預孵育1小時。然後將這些樣品加到無菌96孔組織培養板的50 μ IWTF-I 細胞(以每毫升2χ105個細胞的濃度)中。因此，最後100 μ 1測定體積含有各種稀釋度的 mAbdAb構建體(以從以3倍稀釋滴定的IOOnM到0. OlnM的終濃度)、大腸桿菌表達的重組 人IL-13(以7ng/ml的終濃度)、大腸桿菌表達的重組人IL_4(以1. lng/ml的終濃度)和 TF-I細胞(以每毫升IxlO5個細胞的終濃度)。讓測定板在37°C增溼CO2培養箱中孵育大 約 3 天。然後用來自 Promega 的 『CellTitre 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay'(貨號G4100)如製造商說明書所述測定細胞增殖的量。在板讀數器中於570nm處 讀取96-孔板的樣品的吸光度。方法11對結合Sf21_表達的重組人IL-5的Biacoren結合親和力評估由Biacore 分析評估了 mAbdAb分子對於Sf21_表達的重組人IL_5的結合親和 力。用蛋白A或抗-人IgG捕獲抗體進行分析。簡言之，按照製造商提議通過伯胺偶聯將 蛋白A或抗-人IgG偶聯到CM5晶片上。然後將mAbdAb分子捕獲到該表面上，以限定濃度 使人IL-5 (由GSK製備並純化)通過。用溫和的酸洗脫條件(例如IOOmM磷酸)使該表面 再生為蛋白A表面，這不會顯著影響捕獲抗體對隨後的IL-5結合事件的能力。用與再生蛋 白A表面相似的條件或通過用3M MgCl2使抗-人IgG表面再生。在Biacore 3000、T100 和A100設備上實施該工作，用設備中的評估軟體分析數據，並擬合為1 1的結合模型。在 25°C 實施 Biacore 運行。方法12
VEGF警體結合測定本測定測量VEGF165與VEGF R2 (VEGF受體)的結合及測試分子封阻該相互作用的 能力。用VEGF受體(R&D Systems，貨號357-KD_050)(在0· 2M碳酸鈉/碳酸氫鈉ρΗ9· 4 中0. 5 μ g/ml終濃度)過夜包被ELISA板，洗滌並用2 % BSA/PBS封閉。在將VEGF(R&D Systems，貨號293-VE_050)和測試分子(在含 0. 1% BSA 的 0. 05% Tween 20TMPBS 中稀 釋)預孵育1小時，隨後加入到板(3ng/ml VEGF終濃度)中。用生物素化抗-VEGF抗體 (0. 5 μ g/ml終濃度)(R&D Systems，貨號BAF293)和過氧化物酶綴合抗-生物素第二抗體 (1 5000稀釋)(Stratech，貨號200-032-096)檢測VEGF與VEGF受體的結合，並在用等 體積IMHCl終止反應後用比色底物(Sure Blue TMB過氧化物酶底物，KPL)在0D450處顯不。方法13EGFR激酶測定通過其與EGF的相互作用激活在A431細胞表面表達的EGFR，導致受體的酪氨酸 激酶磷酸化。測量EGFR酪氨酸激酶磷酸化的減少以測定測試分子的效價。讓A431細胞過 夜附著到96孔組織培養板，然後加入測試分子並放置1小時，然後與EGF(300ng/ml) (R&D Systems貨號236-EG)孵育10分鐘。使細胞裂解，並將裂解的製備物轉移到用抗-EGFR抗 體(lug/ml) (R&D Systems，貨號AF231)包被的ELISA板。捕獲在裂解細胞液中存在的磷 酸化和非磷酸化的兩種EGFR。洗掉未結合的物質後，用HRP綴合的抗-磷酸酪氨酸抗體 (1 2000稀釋)(UpstateBiotechnology，貨號16-105)特異性檢測磷酸化的EGFR。用顯 色底物使結合可視化。方法14MRC-5/TNF 測定用人肺成纖維細胞MRC-5細胞測定測試分子防止人TNF_a結合人TNFRl及中和 IL-8分泌的能力。讓系列稀釋的測試樣品與TNF-a(500pg/ml) (Peprotech)孵育1小時。 然後用MRC-5細胞懸浮液(ATCC，貨號CCL-171) (5xl03細胞/孔)對其進行1 2稀釋。過 夜孵育後，將樣品稀釋10倍，用IL-8 ABI 8200細胞檢測測定(FMAT)來測定IL-8的釋放， 其中用抗-IL_8(R&D Systems，貨號208-IL)包被的聚苯乙烯珠粒、生物素化抗_IL_8 (R&D Systems，貨號 BAF208)和鏈黴親和素 Alexanuor647 (Molecular Probes，貨號 S32357)測 定IL-8濃度。以647nm螢光發射來定位測定讀數，用包括在該測定中的IL-8標準曲線內 推(interpolate)未知 IL-8 濃度。方法15MRC-5/IL-1 測定用人肺成纖維細胞MRC-5細胞測定測試分子防止人IL-Ia結合人ILl-R及中和 IL-8分泌的能力。用胰蛋白酶處理MRC-5細胞(ATCC，貨號CCL-171)，然後作為混懸液與測 試樣品孵育1小時。然後加入IL-Ia(200pg/ml終濃度)(R&D Systems貨號:200_LA)。過 夜孵育後，用IL-8定量ELISA試劑盒(R&D Systems)與抗-IL-8包被的ELISA板、生物素 化抗-IL-8和鏈黴親和素-HRP來測定IL-8的釋放。測定讀數為450nm處的色度吸光度， 用包括在該測定中的IL-8標準曲線內推未知IL-8濃度。方法16
在全血磷-STAT6牛物測定中大腸桿菌表汰的重組人IL-13或IL_4的中和效價可用大腸桿菌表達的重組人IL-4(rhIL_14)或IL_13 (rhIL_13)離體刺激全血細 胞，以表達磷-STAT6 (pSTAT6)。本測定被開發為定量測量pSTAT6，並由此測定mAbdAb構建 體的中和效價(抑制IL-4或IL-13的生物活性)。在無菌條件下於無菌96孔組織培養板中實施測定，所有測試孔以一式三份進行。 在無血清細胞培養基中製備12ng/ml的rhIL-13或rhIL-4,加31. 2 μ L到96孔板的孔中。 以6χ的最終測定濃度製備mAbdAb構建體或同種型對照的9點稀釋曲線，將31. 2 μ L的各稀 釋液加到含有rhIL-4或rhIL-13的孔中。將125 μ L肝素化的人全血加到所有孔中，並在 混合器上混合30秒。最終測定體積含有各個稀釋度的mAbdAb構建體，連同終濃度為2ng/ mL的rhIL-13或rhIL-4。讓測定板在37°C>5% CO2中孵育60分鐘。然後通過加入62. 5 μ L的4χ裂解緩衝液裂解細胞。裂解緩衝液含有最終測定濃 度的50mM Tris鹽酸、300mM氯化鈉、1 % NP40,0. 5%脫氧膽酸鈉、50mM氟化鈉、ImM原釩酸 鈉、ImM EDTA和蛋白酶抑制劑混合物。將板置於冰上30分鐘，然後在-80°C冷凍直到用於 PSTAT6 測定。用電致化學發光免疫測定(Meso-Scale-Discovery，MSD)實施全血樣品的pSTAT6 測量。簡言之，用每孔150 μ L的5% MSD封閉劑A於室溫在混合器上以750rpm對親和素包 被的96孔MSD板封閉1小時。用每孔150 μ L的MSD Tris洗滌緩衝液洗滌板3次。每孔 加入25 μ L的捕獲抗體(生物素化小鼠抗_人STAT6單克隆抗體)，讓板在4°C孵育過夜。 讓捕獲抗體在由50mM Tris、150mM氯化鈉、0. 2% BSA,0. 5% Tween 20、ImM EDTA組成的測 定緩衝液中稀釋到4 μ g/mL。用MSDtris洗滌緩衝液洗滌板3次，然後用150 μ L的5% MSD 封閉劑A於室溫在混合器上對板封閉1小時。如前述洗滌板3次，然後每孔加入25μ L全 血裂解物或PSTAT6標定劑(calibrator)。讓板於室溫在混合器上孵育3小時。洗滌板3 次，然後加入25 μ L兔抗人pSTAT6抗體(在測定緩衝液中以1 800稀釋)，然後於室溫孵 育1小時。進一步洗滌後，每孔加入25yL的1 500稀釋的MSD TAG山羊抗-兔IgG抗 體，然後於室溫在混合器上孵育1小時。在每孔加入150yL的2x MSD讀出緩衝液T之前 再次洗滌板。在MSD SECTOR成像器上立即讀板。將mAbdAb構建體中和rhIL_13或rhIL_4生物活性的能力表示為中和2ng/mL人 IL-4或人IL-13到50%所需的mAbdAb構建體濃度(IC5tl)。所需mAbdAb構建體濃度越低， 中和能力的功效就越強。方法17通過ELISA測定與大腸桿菌表達的重組獼猴IL-13的結合在直接結合ELISA中評估mAbdAb分子對大腸桿菌表達的重組獼猴(cynomolgus) IL-13的結合。簡言之，將5 μ g/ml大腸桿菌表達的重組獼猴IL-13 (由GSK製備並純化) 包被到96孔ELISA板。在室溫將各孔封閉1小時，然後對所述板滴定出mAbdAb分子(通 常從3倍稀釋液中的大約IOOnM到大約0. OlnM)。用抗-人κ輕鏈過氧化物酶綴合抗體 (貨號Α7164，Sigma-Aldrich)的適當稀釋液或抗-人IgG γ鏈特異性過氧化物酶綴合檢 測抗體(貨號Α6029，Sigma-Aldrich)的適當稀釋液檢測結合。方法18未使用
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方法19通過ELISA檢測人IL_4與人IL4警體α (IL4Ra)結合的抑制除非另外指出，否則所有試劑在使用前於封閉液(tris緩衝的鹽水和0.05% Tween20中的4%牛血清白蛋白)中稀釋到所需濃度。用磷酸鹽緩衝鹽水中的5 μ g/ml重組 人IL4Ra-Fc嵌合體(R&D Systems，貨號604-4R)於4°C過夜包被ELISA板。所有隨後的步 驟都在室溫進行。在加入業已與0. 02 μ g/ml重組人IL-4 (由GSK製備)預混合的50 μ 1不 同濃度的mAbdAb (或陽性對照mAb或dAb)之前，讓板在封閉液中封閉2小時。在用洗滌緩 衝液(Tris緩衝的鹽水和0. 05% Tween20)洗滌板4次之前讓板孵育1小時。將50 μ 1的 0.5 μ g/ml生物素化抗-人IL-4 (R&D Systems，貨號BAF 204)溶液加入到每一孔，並孵育1 小時。用洗滌緩衝液洗滌板4次，然後加入50 μ 1/孔的1/2000稀釋的Extravadin (Sigma， 貨號E2886)。1小時後，洗滌板4次，通過與OPD過氧化物酶底物(來自Sigma)孵育來檢測 色度信號，用終止溶液(3M H2SO4酸)終止該反應，通過在板讀數器上於490nm處獲得吸光 度數據。在GraphPad Prism上對平均吸光度和標準差作圖，用Cambridge Soft BioAssay 計算IC5tl值。方法20
_2] ^h TF-i μmmm^m^mmmmmmm n-13 的中和TF-I細胞因響應包括獼猴IL-13在內的許多不同的細胞因子而增殖。因此，可將 這些細胞對IL-13的增殖性響應用於測量IL-13的生物活性，並隨後開發出測定mAbdAb構 建體對IL-13的中和效價(抑制IL-13生物活性)的測定法。在無菌條件下於無菌96孔組織培養板中實施測定，所有測試孔一式三份進行。讓 大約14ng/ml大腸桿菌表達的重組獼猴IL-13與mAbdAb構建體的各種稀釋液(通常從以3 倍稀釋滴定的IOOOnM或200nM到InM或0. 02nM)在50 μ 1總體積中於37°C預孵育1小時。 然後將這些樣品加到無菌96孔組織培養板的50 μ 1的TF-I細胞(以每毫升2χ105個細胞的 濃度)中。因此，最後100 μ 1測定體積含有各種稀釋度的mAbdAb構建體(以從以3倍稀釋 滴定的500ηΜ或IOOnM到0. 5ηΜ或0. OlnM的終濃度)、大腸桿菌表達的重組獼猴IL-13 (以 7ng/ml的終濃度)和TF-I細胞(以每毫升IxlO5個細胞的終濃度)。讓測定板在37°C增 溼CO2培養箱中孵育大約3天。然後用來自Promega的『CellTitre 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay，(貨號G4100)如製造商說明書所述測定細胞增殖的量。在板 讀數器中於570nm處讀取96-孔板的樣品的吸光度。將mAbdAb構建體中和大腸桿菌表達的重組獼猴IL-13的生物活性的能力，表示為 中和限定量的獼猴IL-13 (7ng/ml)的生物活性到50%所需的mAbdAb構建體濃度(=ND50)。 所需mAbdAb構建體的濃度越低，中和能力的功效越強。手動或通過用微軟excel固有的 Robosage軟體包計算本文提供的ND5tl數據.方法21在TF-I細胞增殖生物測定中大腸桿菌表達的重組獼猴IL-4的中和TF-I細胞因響應包括獼猴IL-4在內的許多不同的細胞因子而增殖。因此，可將這 些細胞對IL-4的增殖性響應用於測量IL-4的生物活性，並隨後開發出測定mAbdAb構建體 對IL-4的中和效價(抑制IL-4生物活性)的測定。在無菌條件下於無菌96孔組織培養板中實施測定，所有測試孔以一式三份進行。讓大約2. 2ng/ml大腸桿菌表達的重組獼猴IL-4與mAbdAb構建體的各種稀釋液(通常從 以3倍稀釋滴定的200nM到0. 02nM)在50 μ 1總體積中於37°C預孵育1小時。然後將這 些樣品加到無菌96孔組織培養板的50 μ 1的TF-I細胞(以每毫升2χ105個細胞的濃度) 中。因此，最後100 μ 1測定體積含有各種稀釋度的mAbdAb構建體(以從以3倍稀釋滴定 的IOOnM到0. OlnM的終濃度)、大腸桿菌表達的重組獼猴IL-4 (以1. lng/ml的終濃度)和 TF-I細胞(以每毫升IxlO5個細胞的終濃度)。讓測定板在37°C增溼CO2培養箱中孵育大 約 3 天。然後用來自 Promega 的 『CellTitre 96 Non-Radioactive CellProliferation Assay'(貨號G4100)如製造商說明書所述測定細胞增殖的量。在板讀數器中於570nm處 讀取96-孔板中的樣品的吸光度。將mAbdAb構建體中和大腸桿菌表達的重組獼猴IL-4的生物活性的能力，表示 為中和限定量的獼猴IL_4(1. lng/ml)的生物活性到50%所需的mAbdAb構建體濃度(= ND5tl)。所需mAbdAb構建體的濃度越低，中和能力的功效越強。手動或通過用微軟excel固 有的Robosage軟體包計算本文提供的ND5tl數據。方法22通過ELISA測定人IL-13與人IL13警體α 2(IL13Ra )結合的抑制除非另外指出，否則所有試劑在使用前於封閉液(tris緩衝的鹽水和0.05% Tween20中的牛血清白蛋白)中稀釋到所需濃度。用包被緩衝液(0.05M碳酸氫鹽 ρΗ9· 6，Sigma C-3041)溶液中的5μ g/ml在Sf21細胞中表達的重組人IL13Ra -Fc嵌合體 (R&D Systems，貨號614-1R)於4°C過夜包被ELISA板。在加入業已於37°C與30ng/ml重組 人IL-13 (由GSK製備)預孵育30分鐘的不同濃度的mAbdAb (或陽性對照mAb或dAb)之 前，讓板於室溫在封閉液(TBST中的BSA)中封閉1小時。在用洗滌緩衝液(Tris緩衝 的鹽水和0. 05% Tween20)洗滌板3次之前，讓板於室溫孵育1小時。將50 μ 1的0. 5 μ g/ ml生物素化抗-人IL-13 (R&DSystems，貨號BAF 213)溶液加入到每一孔，並在室溫孵育1 小時。用洗滌緩衝液洗滌板3次，然後加入合適稀釋度的Extravadin (Sigma，貨號E2886)。 1小時後洗滌板，通過與OPD過氧化物酶底物(來自Sigma)孵育來檢測色度信號，用終止溶 液(3M酸)終止該反應，通過在板讀數器上於490nm處獲得吸光度數據。在Excel表格上 對平均吸光度和標準差作圖，用來自微軟Excel的Robosage軟體計算IC5tl值。方法23對結合大腸桿菌表達的重組獼猴IL-13的Biacore 結合親和力評估由Biacore 分析評估了 mAbdAb (或mAb)分子對於大腸桿菌表達的重組獼猴 IL-13的結合親和力。用蛋白A或抗-人IgG捕獲抗體進行分析。簡言之，按照製造商提 議通過伯胺偶聯將蛋白A或抗-人IgG偶聯到CM5晶片上。然後將mAbdAb (或mAb)分子 捕獲到該表面上，以限定濃度使獼猴IL-13(由GSK製備並純化)通過。用溫和的酸洗脫條 件使該表面再生為蛋白A表面，這不會顯著影響捕獲抗體對隨後的IL-13結合事件的能力。 在Biacore 3000和/或T100設備上實施該工作，用設備中的評估軟體分析數據，並擬合 為1 1的結合模型。在25°C或37°C實施Biacore 運行。方法24對結合大腸桿菌表達的重組獼猴IL-4的Biacore 結合親和力評估由Biacore 分析評估了 mAbdAb (或mAb)分子對於大腸桿菌表達的重組獼猴IL_4的結合親和力。用蛋白A或抗-人IgG捕獲抗體進行分析。簡言之，按照製造商提議通過 伯胺偶聯將蛋白A或抗-人IgG偶聯到CM5晶片上。然後將mAbdAb (或mAb)分子捕獲到 該表面上，以限定濃度使獼猴IL_4(由GSK製備並純化)通過。用溫和的酸洗脫條件(例 如IOOmM磷酸)使該表面再生為蛋白A表面，這不會顯著影響捕獲抗體對隨後的IL-4結合 事件的能力。用與再生蛋白A表面相似的條件或通過用3M MgCl2H抗-人IgG表面再生。 在Biacore 3000和/或TlOO和/或AlOO設備上實施該工作，用設備中的評估軟體分析 數據，並擬合為1 1的結合模型。在25°C或37°C實施Biacore 運行。方法25基於IL-13細胞的中和測定在IL-13細胞測定中用工程改造的報告細胞系HEK Blue_STAT6測定對IL13具有 特異性的mAbdAb的效價。轉錄因子STAT6主要由兩種具有重疊生物學功能的細胞因子IL_4和IL-13激活， 這兩種細胞因子結合由IL-4Ra和IL-13Ral組成的受體複合體。配體結合後，受體複合體 激活受體相關的Janus激酶(JAK1和Tyk2)，導致STAT6募集及其磷酸化。活化的STAT6形 成轉移到細胞核的同型二聚體，誘導基因在響應型啟動子控制下轉錄。將HEK Blue-STAT6 細胞系工程改造為在所述啟動子調控下表達分泌性胎盤鹼性磷酸酶(Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase, SEAP)。將細胞接種到96孔板，並與預先平衡的人IL-13及測試分子孵育20_24小時。在 該孵育期後，然後用Quanti-blue系統(Invivogen)測量因IL-13刺激而由細胞產生的 SEAP 量。實施例11.產生雙重靶向的mAbdAb用以下方法構建表1-4中所述的雙重靶向的mAbdAb。通過將編碼結構域抗體的序 列移植到編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈(或二者)的序列上來產生表達構建體，致使表達時 dAb被連接到重鏈或輕鏈的C-末端。對於某些構建體，將接頭序列用於連接結構域抗體與 重鏈CH3或輕鏈Ck。在其它構建體中，將結構域抗體不用接頭序列直接連接到重鏈或輕 鏈。這些mAbdAb構建體的總示意圖示於圖8 (mAb重鏈用灰色畫出；mAb輕鏈用白色畫出； dAb用黑色畫出)中。由圖8中所述的mAbdAb 1型實例為PascoH-G4S_474。由圖8中所述的mAbdAb 2 型實例為 PascoL-G4S-474。由圖 8 中所述的 mAbdAb3 型實例為 PascoHL-G4S_474。mAbdAb 1型和2型為四價構建體，mAbdAb 3型為六價構建體。以下顯示描述構建mAbdAb重鏈(上圖)或mAbdAb輕鏈(下圖)的示意圖。除非 另外指出，否則將這些限制性位點用於構建表1-4所述的mAbdAb。Hindlll SpelBamHI EcoRI
VHCH1CH2CH3dAb
接頭
Hindlll BsiWIBamHI EcoRI
VlCKdAb
接頭注意對於重鏈，術語「VH」為單克隆抗體可變重鏈序列；「CH1、CH2和CH3」為人IgGl 重鏈恆定區序列；「接頭」是所用的特定接頭區的序列；「dAb」為結構域抗體序列。對於輕 鏈，術語為單克隆抗體可變輕鏈序列；「Ck 」為人輕鏈恆定區序列；「接頭」是所用的特 定接頭區的序列；「dAb」為結構域抗體序列。某些DNA表達構建體通過寡核苷酸構件(build)從頭製備。其它DNA表達構建體 通過限制性克隆或位點定向誘變從現存的構建體(其根據上文所述來製備)獲得。用標準分子生物技術將這些構建體(mAbdAb重鏈或輕鏈)克隆到哺乳動物表達載 體(RlruRld或pTT載體系列)。將哺乳動物胺基酸信號序列(如SEQ ID NO 64所示)用 於構建這些構建體。為了表達其中dAb連接到單克隆抗體重鏈的C-末端的mAbdAb，，讓合適的重鏈 mAbdAb表達載體與對於該單克隆抗體的合適輕鍊表達載體配對。為了表達其中dAb連接到 單克隆抗體輕鏈的C-末端的mAbdAb，讓合適的輕鏈mAbdAb表達載體與對於該單克隆抗體 的合適重鍊表達載體配對。為了表達其中dAb連接到單克隆抗體重鏈的C-末端並且其中dAb連接到單克隆 抗體輕鏈的C-末端的mAbdAb，讓合適的重鏈mAbdAb表達載體與合適的輕鏈mAbdAb表達載 體配對。
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1. 1.命名及所用縮寫 單克隆抗體(mAb) 單克隆抗體(mAbs) 結構域抗體(dAb) 結構域抗體(dAbs) 重鏈(H鏈) 輕鏈(L鏈) 重鏈可變結構域(Vh) 輕鏈可變結構域 人IgGl恆定重鏈區1 (CHl) 人IgGl恆定重鏈區2(CH2) 人IgGl恆定重鏈區3(CH3)
人κ輕鏈恆定區(CK)1. 2.抗-IL13mAb_ 抗 _IL4dAb如上所述構建雙特異性抗-IL13mAb-抗_IL4dAb。將多種不同的接頭用於將 抗-IL4結構域抗體連接到單克隆抗體。某些構建體沒有接頭。注意BamHI克隆位點(其編碼胺基酸殘基G和S)用於將接頭和dAb克隆到mAb重 鏈的CH3或克隆到mAb輕鏈的C κ。因此，除既定的接頭序列外，另外的G和S胺基酸殘基 也存在於接頭序列與重鏈及輕鍊表達構建體二者的結構域抗體之間，或於CH3與某些但不 是所有重鍊表達構建體中的接頭序列之間。然而，當將G4S接頭置於mAbdAb形式的mAb和 dAb之間時，已經存在BamHI克隆位點(由於G和S胺基酸殘基為G4S接頭序列內固有)， 因此，在CH3或Ck與用該接頭的構建體內的結構域抗體之間不存在另外的G和S胺基酸 殘基。當在mAbdAb形式的mAb和dAb之間不使用接頭序列時，BamHI克隆位點(並因此G 和S胺基酸殘基)仍存在於CH3或Ck與結構域抗體之間。關於mAbdAb重鏈和輕鏈的氨 基酸序列的詳細資料在表1闡述。以下若干實施例使用IL_4mAb為對照抗體。在這些實施例中所用的對照IL_4mAb 將為具有SEQ ID NO :14重鏈序列和SEQ ID NO 15輕鏈序列的抗體，或將為具有SEQ ID NO 166重鏈序列和SEQ ID NO 15輕鏈序列的抗體。這兩種IL_4mAb共享相同的⑶R，預期 它們以同樣的方式結合，因此這兩種抗體在以下實施例中都被稱為帕考珠單抗「帕考珠單 抗(Pascolizumab)」或「IL-4mAb」。以下若干實施例使用IL_5mAb為對照抗體。在這些實施例中所用的對照IL_5mAb 應為具有SEQ ID NO :65重鏈序列和SEQ ID NO :66輕鏈序列的抗體，或為具有SEQ ID NO :191重鏈序列和SEQ ID NO :66輕鏈序列的抗體。這兩種IL_5mAb共享相同的⑶R， 預期它們以同樣的方式結合，因此這兩種抗體在以下實施例中都被稱為「美泊利單抗 (Mepolizumab) 」或 「 IL_5mAb，，。在CHOKl細胞上清液中瞬時表達表1中所述的mAbdAb。在定量測定mAbdAb後，分 析這些含有mAbdAb的上清液在IL-13和IL-4結合ELISA中的活性。表 1 在CHOKl或CHOEla細胞上清液中的一種或兩者中表達表2所述的mAbdAb，經純化 並在多種IL-13和IL-4活性測定法中分析。表2 1. 3.抗-IL4mAb_ 抗-IL13dAb如上所述構建雙特異性抗-IL4mAb_抗-IL13dAb。將多種不同的接頭用於連接 抗-IL13結構域抗體與單克隆抗體。某些構建體沒有接頭。注意BamHI克隆位點(其編碼胺基酸殘基G和S)用於將接頭和dAb克隆到mAb 重鏈的CH3或克隆到mAb輕鏈的C κ。因此，除幾既定接頭序列外，另外的G和S胺基酸殘 基也存在於接頭序列與重鏈及輕鍊表達構建體二者的結構域抗體之間，或於CH3與某些但 不是所有重鍊表達構建體的接頭序列之間。然而，當將G4S接頭置於mAbdAb形式的mAb和 dAb之間時，已經存在BamHI克隆位點(由於G和S胺基酸殘基為G4S接頭序列內固有)， 因此，在CH3或Ck與用該接頭的構建體內的結構域抗體之間不存在另外的G和S胺基酸 殘基。當在mAbdAb形式的mAb和dAb之間不使用接頭序列時，BamHI克隆位點(並因此G 和S胺基酸殘基)仍存在於CH3或Ck與結構域抗體之間。關於mAbdAb重鏈和輕鏈的胺基酸序列的詳細資料在表3中闡述。在CHOKl細胞上清液中瞬時表達表3中所述的mAbdAb。在定量測定mAbdAb後，分 析這些含有mAbdAb的上清液在IL-13和IL-4結合ELISA中的活性。表3 在CH0Kl、CH0Ela或HEK293-6E細胞中的一種或多種中表達表4中所述的mAbdAb。表 4 1. 4.單克隆抗體、結構域抗體和接頭的序列ID號用於產生mAbdAb的單克隆抗體(mAb)、結構域抗體(dAb)和接頭的序列ID號示於 下表5中。表 5 成熟人IL-13胺基酸序列(無信號序列)示於SEQ ID NO 63中。成熟人IL-4胺基酸序列(無信號序列)示於SEQ ID NO 62中。
1.5. mAbdAb的表達和純化將實施例1所述的mAbdAb表達構建體轉染到CHOKl細胞、CHOEla細胞或 HEK293-6E細胞中的一種或多種細胞中，小規模(大約3ml)或中等規模(大約50ml_100ml) 或大規模(大約1升)表達，然後用固定化的蛋白A柱純化某些構建體，通過在280nm處讀 取吸光度來定量測定。1. 6.純化的mAbdAb的大小排阻色譜分析通過大小排阻色譜(SEC)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS PAGE)分 析了多種 mAbdAb。這些分子中的某些(PascoH-G4S_474，PascoL-G4S_474，PascoH-474 和 PascoHL-G4S-474.)的代表性數據分別示於圖9、10、11和12。顯示對這些除掉「GS」基序 的分子的SEC和SDS Page分析的代表性數據示於圖90-98中。在某些情況下SEC用於進一步純化這些分子以除去凝聚物。實施例2
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通過ELISA測定mAbdAb與人IL-13和人IL_4的結合2. 1.抗-IL13mAb-抗 _IL4dAb 與 IL-13 和 IL-4 的結合在直接結合ELISA (如方法1所述)中測試mAbdAb上清液對人IL-13的結合。這 些數據示於圖13中。圖13顯示所有抗-IL13mAb-抗_IL4dAb結合IL-13。這些mAbdAb的結合活性亦 與單獨的純化的抗_人IL13mAb接近相等(在2倍-3倍內)，在本測定中包括所述抗_人 IL13mAb作為IL-13結合的陽性對照，並為了直接與mAbdAb比較。包括純化的抗-人 IL4mAb (帕考珠單抗)作為IL-13結合的陰性對照。在直接結合ELISA (如方法2所述)中還測試這些分子與人IL-4的結合。這些數 據示於圖14中。圖14顯示所有抗-IL13mAb_抗_IL4dAb結合IL-4，但未觀察到在IL-4結合活性 中的某種程度變化。當mAbdAb構建體中不存在抗-IL4dAb時，未觀察到與IL-4的結合。也 包括純化的抗_人IL13mAb作為IL-4結合的陰性對照。注意在本測定中沒有檢測單獨的 抗-IL-4dAb，因為所述dAb不能被第二檢測抗體檢測；取而代之的是在本測定中用純化的 抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對照以證明IL-4結合。還可在直接結合ELISA (如方法1所述)中測試純化的mAbdAb樣品對人IL-13的 結合。這些數據示於圖15中。這些純化的抗-IL13mAb-抗-IL4dAb結合IL-13。這些mAbdAb對IL-13的結合活 性與單獨的純化的抗_人IL13mAb相等。在本測定中還包括同種型-匹配的mAb (對不相 關抗原具有特異性)作為IL-13結合的陰性對照。在直接結合ELISA (如方法2所述)中還測試這些純化的mAbdAb與人IL-4的結 合。這些數據示於圖16中。所有這些抗-IL13mAb_抗_IL4dAb結合IL-4。注意在本測定中不檢測單獨的 抗-IL-4dAb，因為所述dAb不能被第二檢測抗體檢測；取而代之的是，在該測定中使用純化 的抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對照以證明IL-4結合。在本測定中還包括同種 型_匹配的mAb (對不相關抗原具有特異性)作為IL-4結合的陰性對照。2. 2.抗-IL4mAb-抗-IL13dAb 與 IL-13 和 IL-4 的結合在直接結合ELISA (如方法2所述)中測試mAbdAb上清液對人IL-4的結合。這 些數據示於圖17 (某些樣品一式二份製備和測試，並標註為樣品1和樣品2)。圖17顯示所有這些mAbdAb結合了 IL-4。在本測定中包括單獨的純化的抗-人 IL4mAb (帕考珠單抗)，但不產生結合曲線，因為當稀釋該mAb用於測定時出錯(帕考珠單 抗業已成功用於所有其它隨後的IL-4結合ELISA)。包括純化的抗-人IL13mAb作為IL-4 結合的陰性對照。在直接結合ELISA (如方法1所述)中還測試同一 mAbdAb上清液對人IL-13的結 合。這些數據示於圖18 (某些樣品一式二份製備和測試，並標註為樣品1和樣品2)。圖18顯示所有這些抗-IL4mAb-抗-IL13dAb結合IL-13。在本測定中包括單 獨的純化的抗-人IL13mAb，但不產生結合曲線，因為當稀釋該mAb用於測定時出錯(純 化的抗-人IL13mAb業已成功用於所有其它隨後的IL-13結合ELISA)。包括純化的 抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為IL-13結合的陰性對照。注意在該測定中不檢測單獨的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因為該dAb不能被第二檢測抗體檢測。在直接結合ELISA(如方法2所述)中還檢測純化的抗-IL4mAb_抗_IL13dAb、 「PascoH-G4S-474」、「PascoH-474」、「PascoL-G4S-474」和「PascoHL-G4S-474」對人 IL-4 的 結合。這些數據示於圖19中。這些純化的抗-IL4mAb-抗-IL 13dAb結合IL-4。這些mAbdAb的結合活性與單獨 的純化的抗_IL4mAb (帕考珠單抗)接近相等(在2倍內)。在本測定中還包括同種型-匹 配的mAb (對不相關抗原具有特異性)作為IL-4結合的陰性對照。在直接結合ELISA(如方法1所述)中還檢測這些相同的純化的 抗-IL4mAb-抗 _IL13dAb、 PascoH-G4S_474、 PascoH_474、 PascoL-G4S_474 禾口 PascoHL-G4S-474對人IL-13的結合。這些數據示於圖20A。這些純化的抗-IL4mAb-抗_IL13dAb結合IL-13。在本測定中還包括同種型-匹 配的mAb (對不相關抗原具有特異性)作為IL-13結合的陰性對照。注意在本測定中沒有 檢測單獨的抗-IL-13 dAb (D0M10-53-474)，因為所述dAb不能被第二檢測抗體檢測；取而 代之的是，在本測定中使用抗_人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。在如方法17所述的直接結合ELISA中，還檢測純化的PascoH-474、 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-ELQLE-474 對獼猴 IL-13 的結合(在本 測定中也包括去除GS的PascoH-474和去除GS的PascoH-TVAAPS_474，這些分子的構建如 實施例18所述)。顯示代表性數據的圖出示於圖20B中。所有純化的PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-ELQLE-474都結合獼猴IL-13。在本測定中包括單獨的純化的抗-人IL4mAb (帕考 珠單抗)作為IL-13結合的陰性對照。包括純化的抗_人IL13mAb作為獼猴IL-13結合的 陽性對照。注意在本測定中沒有檢測單獨的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因為該dAb不能 被第二檢測抗體檢測；取而代之的是，在本測定中使用抗-人IL13mAb作為陽性對照以證明 IL-13結合。實施例3通過表面等離子共振(BIAcorelg)檢測mAbdAb與人IL-13和人IL_4的結合3. 1.通過 BIAcore 檢測抗-IL13mAb-抗 _IL4dAb 與 IL-13 和 IL-4 的結合用BIAcore 於25°C (如方法4所述)檢測mAbdAb (在CHO細胞上清液中，如1. 5 章節所述製備)對人IL-13的結合。對於該數據集，評估了兩條IL-13濃度曲線(IOOnM和 InM)，關於每一 mAbdAb構建體的相對響應捕獲水平達到1000至1300 (大約)之間。由於 使用限定濃度的IL-13，產生的數據更適用於為構建體排等級而不是準確的動力學測量。這 些數據示於表6中。表6
抗體結合親和力KD (nM)586H-250. 39586H-G4S-250. 41 所有這些抗-IL13mAb-抗-IL4dAb以相似的結合親和力結合IL-13，所述結合親 和力與單獨的純化的抗_人IL13mAb結合親和力接近相等。這些數據提示將接頭和/或 抗-IL4dAb加到抗-IL13mAb重鏈，不影響這些mAbdAb構建體內mAb組分的IL-13結合親 和力。也用BIAcore 於25°C (如方法5所述)檢測這些mAbdAb對人IL-4的結合。這 些數據示於表7中。對於該數據集，評估了四個IL-4濃度曲線(512、128、32和8nM)，在表 中指出了關於所檢測的每一 mAbdAb的大概相對響應捕獲水平。注意在本測定中沒有檢測 單獨的抗-IL-4dAb，因為不能將所述dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上； 取而代之的是，在本測定中使用抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對照以證明IL-4結
I=I ο表7 對上述某些數據集觀察到預示(caveat)。對某些數據集(*)觀察到次等曲線擬 合，因此，應該謹慎處理在這些數據中已經測定的實際結合親和力值。某些曲線觀察到正解 離(positive dissociation) (**)，因此，應該謹慎處理在這些數據中已經測定的實際結合 親和力值。另外，BIAcore 不能(即不夠靈敏)測定所有含有D0M9-112-210 dAb的mAbdAb 構建體的結合速率和解離速率，這是由於這些mAbdAb與IL-4的結合異常緊密。這些mAbdAb 對IL-4的結合動力學的測定進一步受到所觀察到的正解離作用的妨礙。這些數據示於圖 21中。在另外的實驗中獲得相似數據。這些數據示於圖22中。這2個獨立的數據集表明所有抗-IL13mAb_抗_IL4dAb結合IL_4，但結合親和力 根據用於連接抗_IL4dAb與抗-IL13mAb重鏈的接頭而變化。在本實驗中，發現接頭的存在 提高了 mAbdAb形式中抗-IL4dAb組分(當位於重鏈時)對IL-4的結合親和力。例如，具 有TVAAPS或ELQLEESCAEAQDGELDG接頭的分子似乎是更有效的結合物(binder)。當mAbdAb 構建體中不存在抗_IL4dAb時，沒有觀察到結合IL-4。由於這些mAbdAb的D0M9-112-210 組分結合得極為緊密並因此解離速率太小而不能用BIAcore 測定這一事實，測量586-接 頭-210mAbdAb對於IL-4的結合親和力是不可能的。也用BIAcore 在25°C (如方法4和5所述)檢測純化的抗-IL13mAb_抗_IL4dAb 對人IL-13和人IL-4的結合。這些數據示於表8中。表8 所有586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154 和 586H-TVAAPS-210 都以相似的結合親 和力結合IL-13，所述結合親和力與單獨的純化的抗-人IL13mAb結合親和力接近相等。所有 586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154 和 586H-TVAAPS-210 都結合 IL-4。由於該 mAbdAb 的D0M9-112-210組分結合得極為緊密並因此解離速率太小而不能用BIAcore 測定這一事 實，測量586-TVAAPS-210對於IL-4的結合親和力是不可能的。注意在本測定形式中沒有檢 測單獨的抗-IL-4dAb (D0M9-155-25、D0M9-155-154 和 D0M9-112-210)，因為不能將該 dAb 捕 獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上；取而代之的是在本測定中用抗-人IL4mAb (帕 考珠單抗)作為陽性對照以證明IL-4結合。3. 2.通過 BIAcore 測定抗-IL4mAb_ 抗 _IL13dAb 與 IL-4 和 IL-13 的結合用BIAcore 於25°C (如方法5所述)檢測mAbdAb (在CHO細胞上清液中，如1. 5 章節所述製備)對人IL-4的結合。這些數據示於表9 (某些樣品以一式二份製備並測試， 其被標註為樣品1和樣品2)。對於該數據集，評估了四個IL-4濃度曲線(ΙΟΟηΜ、IOnMUnM 和0. InM)，表中指示關於所測的每一mAbdAb的大約的相對響應捕獲水平。在本測定中還包 括同種型_匹配的mAb (對不相關抗原具有特異性)作為IL-4結合的陰性對照。表9
68 測試的所有抗-IL4mAb_抗_IL13dAb都以相似結合親和力結合IL_4，該結合親和 力與單獨的抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)的結合親和力接近相等。PascoL-EPKSC-474以比 帕考珠單抗小約2倍的效價結合IL-4。這些數據提示將接頭和抗-IL13dAb加到帕考珠單 抗的重鏈或輕鏈，並不明顯影響mAbdAb構建體中mAb組分對IL-4的結合親和力。也用BIAcore 於25°C (如方法4所述)檢測這些mAbdAb對人IL-13的結合。這 些數據示於表10 (某些樣品以一式二份製備並測定，其被標註為樣品1和樣品2)。對於該 數據集，評估了四個IL-13濃度曲線(128nM、32nM、8nM和2nM)，表中指示關於所測的每一 mAbdAb的大約的相對響應捕獲水平。表 10 在實驗2中所測的構建體的結合親和力數據也示於圖23中。所有的抗-IL4mAb_抗-IL13dAb都結合IL-13。在大部分情況下，當將接頭置於 抗-IL4mAb重鏈中時，接頭的存在似乎不提高抗-IL13dAb組分對IL-13的結合親和力。然 而，當將接頭置於抗_IL4mAb輕鏈上時，接頭的存在似乎不提高抗_IL13dAb組分對IL-13 的結合親和力。在本實驗中，PascoL-TVAAPS-474似乎具有最強的IL-13結合親和力。
注意在本測定中沒有檢測單獨的抗-IL-13dAb(D0M10-53_474)，因為不能將該 dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上；取而代之的是，在本測定中用純化的 抗-人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。在本測定中還包括同種型-匹配的 mAb (對不相關抗原具有特異性)作為IL-13結合的陰性對照。也用BIAcore 於25°C (如方法4和5所述)檢測純化的抗-IL4mAb_抗_IL13dAb 對人IL-4和人IL-13的結合。這些數據示於表11中。表11 在該實驗中，所有PascoH-G4S_474、PascoH-474、PascoL-G4S_474 和 PascoHL-G4S-474都以相似的結合親和力結合IL-4，該結合親和力與單獨的抗-人 IL4mAb (帕考珠單抗)的結合親和力接近相等。它們全部也結合IL-13。注意該測定中沒 有檢測單獨的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因為不能將dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包 被的CM5晶片上；取而代之的是，在本測定中將抗-人IL13mAb用作陽性對照以證明IL-13
社a
？口口。3. 3.用 BIAcore 的 IL-13 和 IL-4 與抗-IL4mAb_ 抗 _IL13dAb 結合的化學計量用BIAcore (如方法7所述)評估純化的抗-IL4mAb_抗_IL13dAb結合IL-13和 IL-4的化學計量。這些數據示於表12中。表12 PascoH-G4S_474、PascoH-474 和 PascoL-G4S_474 能夠結合幾乎兩個 IL-13 分子 和兩個IL-4分子。PascoHL-G4S-474能夠結合幾乎兩個IL-4分子和幾乎4個IL-13分子。 這些數據表明所測構建體能夠被預期數目的IL-13或IL-4分子完全佔據。實施例4mAbdAb在IL-13和IL_4牛物測定中的中和效價4. 1.抗-IL 13mAb-抗 _IL4dAb在TF-I細胞生物測定(如方法8所述)中測試純化的抗-IL13mAb_抗_IL4dAb 對人IL-13的中和。這些數據示於圖24中。在TF-I 細胞生物測定中，純化的抗-IL13mAb-抗-IL4dAb、586H-TVAAPS_25、 586H-TVAAPS-154 和 586H-TVAAPS-210 完全中和 IL-13 的生物活性。這些 mAbdAb 的 中和效價在單獨的純化的抗-人IL_13mAb效價的2倍內。在該測定中包括純化的 抗-人 IL-4mAb (帕考珠單抗)和純化的抗 _IL4dAb (D0M9-155-25、D0M9-155-154 或 D0M9-112-210)作為中和IL-13的陰性對照。也在TF-I細胞生物測定(如方法9所述)中檢測純化的抗-IL13mAb-抗-IL4dAb、 586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154 和 586H-TVAAPS-210 對人 IL-4 的中和。這些數據示於 圖25中。在該TF-I細胞生物測定中，586H-TVAAPS-210完全中和IL-4的生物活性。該 mAbdAb的中和效價在單獨的純化的抗-人IL-4dAb (D0M9-112-210)中和效價的2倍 內。586H-TVAAPS-25和586H-TVAAPS-154不中和IL-4的生物活性，這與單獨的純化 的抗-人 IL-4dAb (D0M9-155-25 和 D0M9-155-154)相反。如 BIAcore 所證明，純化的 586H-TVAAPS-25 和 586H-TVAAPS-154 對於 IL-4 具有 1. InM 和 0. 49nM 的結合親和力(分 別)。IL-4結合IL-4受體極為緊密(在文獻出版物中報導大約為50pM的結合親和力)，因 此，在TF-I細胞生物測定中觀察到586H-TVAAPS-25或586H-TVAAPS-154 二者都不能有效 中和IL-4的生物活性，這可能是與IL-4對於IL-4受體的效價相比，這些mAbdAb對於IL-4 的親和力相對較低的結果。在本生物測定中包括純化的抗-人IL_4mAb (帕考珠單抗)作為中和IL_4的陽性 對照。在本生物測定中包括純化的抗_人IL-13mAb作為中和IL-4的陰性對照。4. 2.抗-IL4mAb~ 抗 ~IL13dAb
在TF-I細胞生物測定(如方法9所述)中檢測純化的抗-IL4mAb-抗-IL 13dAb、 PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 對人 IL-4 的中和。這 些數據示於圖26中。在TF-I 細胞生物測定中，純化的抗-IL4mAb-抗 _IL13dAb、PascoH-G4S_474、 PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 完全中和 IL-4 的生物活性。這些mAbdAb 的中和效價與單獨的純化的抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)、純化的抗-人IL-13mAb、純化的 D0M10-53-474dAb的中和效價接近相等，並且在本生物測定中也包括對不相關抗原具有特 異性的dAb (陰性對照dAb)作為IL-4中和的陰性對照。在TF-I細胞生物測定(如方法8所述)中，檢測純化的抗-IL4mAb_抗-IL 13dAb、 PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S-474 對人 IL-13 的中和。這 些數據示於圖27中。在TF-I 細胞生物測定中，純化的抗-IL4mAb_ 抗 _IL13dAb、PascoH-G4S_474、 PascoH-474、PascoL-G4S_474 和 PascoHL-G4S_474 完全中和 IL-13 的生物活性。這些 mAbdAb的中和效價在單獨的純化的抗-IL13dAb(D0M10-53-474)中和效價的3倍內。在本 生物測定中還包括純化的抗_人IL-13mAb作為IL-13中和的陽性對照。在本生物測定中， 還包括對不相關抗原具有特異性的dAb (陰性對照dAb)和單獨的純化的抗-人IL4mAb (帕 考珠單抗)作為IL-4中和的陰性對照。還在雙重中和TF-I細胞生物測定(如方法10所述)中檢測純化的 抗-IL4mAb-抗 _IL13dAb、 PascoH-G4S_474、 PascoH-474、 PascoL-G4S_474 禾口 PascoHL-G4S-474對人IL_4和人IL-13的同時中和。這些數據示於圖28中。在雙重中和TF-I細胞生物測定中，純化的抗-IL4mAb-抗_IL13dAb、 PascoH-G4S-474、PascoH-474, PascoL-G4S_474 和 PascoHL-G4S_474 完全中和 IL-4 和 IL-13 二者的生物活性。這些mAbdAb的中和效價與純化的抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)和 純化的抗-IL13 dAb (D0M10-53-474)組合的中和效價接近相等。在該雙重IL-4和IL-13 中和生物測定中，單獨的純化的抗_人IL-13mAb、單獨的純化的抗-人IL-4mAb (帕考珠單 抗)和單獨的抗-人IL-13dAb(D0M10-53-474)(其作為陰性對照被包括在內)並不完全中 和IL-4和IL-13 二者的生物活性。實施例5dAb 的 SEC-MALLS 分析通過SEC-MALLS (大小排阻色譜法-多角度雷射散射)表徵抗原特異性dAb 的溶液狀態，結果示於表13中D0M10-53-474，dAb在溶液中以單體存在，而所有D0M9 dAb (D0M9-112-210,D0M9-155-25.D0M9-155-147 和 D0M9-155-154)可形成穩定二聚體(在 某些情況下為四聚體)。5.1.蛋白的製備將樣品純化並透析到合適的緩衝液例如PBS中。透析後過濾樣品，測定濃度 (0. 43mg/ml D0M-155-25)、(1. 35mg/ml D0M9-155-147)禾Π 1. 4mg/ml D0M9-155-159)。將 D0M10-53-474 和 D0M9-112-210 調整為 lmg/ml。BSA購自Sigma，無需進一步純化使用。5.2.大小排阻色譜法和檢測儀設置
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將帶有自動進樣器(SIL-20A)和SPD-20A Prominence紫外/可見光檢測儀的 Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC 系統連接到 WyattMini Dawn Treos (MALLS，多角度 雷射散射檢測儀)和Wyatt OptilabrEX DRI (示差折光率)檢測儀。按以下順序連接檢 測儀LS-UV-RI。RI和LS兩種儀器都在488nm波長處操作。以50mM磷酸鹽緩衝液(不含 鹽)或IxPBS ( 二者都是pH7. 4)流動相使用TSK2000 (Tosoh公司))柱(基於二氧化矽的 HPLC柱)。所用流速為0.5或Iml/分鐘，調整運行時間(45或23分鐘)來形成不同的流 速，不期望對分子的分離有顯著影響。在緩衝液中將蛋白製備成lmg/ml的濃度，注射體積 為 IOOul。5. 3.檢測儀標定按照製造商說明書用甲苯標定雷射散射檢測儀。5. 4.用BSA標定檢測儀將UV檢測儀輸出和RI檢測儀輸出連接到光散射設備上，致使能同時用Wyatt ASTRA軟體收集來自所有三個檢測儀的信號。使若干含BSA的PBS流動相的注射液(lml/ 分鐘)流過Tosoh TSK2000柱，由Wyatt軟體收集UV、LS和RI信號。然後用ASTRA軟體分 析圖錄(trace)，按照製造商說明書針對譜帶增寬對信號進行標準化、比對和校正。然後將 標定常數取平均值，並輸入到用於將來樣品運行的模板中。5. 5.絕對摩爾質量計算將IOOul的各個樣品注射到合適的預平衡柱上。樣品經過SEC柱後經過3個在線檢測儀-UV檢測儀、MALLS (多角度雷射散射)檢 測儀和DRI (示差折光率)檢測儀，其使得可測定絕對摩爾質量。在柱上進行的稀釋為約10 倍，酌情測定溶液狀態中的濃度。ASTRA以及通常在批樣品模式中執行的Zimm作圖技術的計算基礎是來自Zimm的 方程式[J. Chem. Phys. 16，1093-1099 (1948)]-^ =(方程式 1) K c ·其中· C為溶劑中溶質分子的質量濃度(g/mL)· M為重均分子量(g/mol)· A2 為第二維裡係數(mol mL/g2)·Κ* = ApWdh/dW4、1，其為光學常數，其中nQ為溶劑在入射輻射(真 空)波長的折射率，1。為入射輻射(真空)波長，以納米表示，Na為阿伏伽德羅數，等於 6. 022xl023mor1,而dn/dc為溶劑-溶質溶液關於溶質濃度變化的示差折射率增量，以mL/g 表示(該係數應該用dRI檢測儀獨立測量)。#P(q)為理論推導的波形因素，大約等於L_2y2/31+···，其中μ = (4 π/λ) sin (θ/2)，而為均方半徑。P (q)為分子的z_平均大小、 形態及結構的函數。· Rq 為超出的瑞利(Rayleigh)比(cm—1)本方程式假設為垂直偏振入射光，並對於階(order) c2有效。為了用Zimm擬合方法進行計算，我們需要展開方程式1 一階c的倒數，所述Zimm擬合方法為擬合到R/K*c對比sin2(q/2)為了用Zimm擬合方法進行計算，我們需要展開方程式1 一階c的倒數，所述Zimm 擬合方法為擬合到Rq/K*c對比sin2 (q/2)1^=^^+她「方程式2
P在該情況下合適的結果是
'V"1M-j —-2Α, 方程式 3
I ^ - /禾口=方程式 4其中m。Ed[K*C/R0]/d[Sin3(e/2)]0_o 方程式 5通過ASTRA軟體進行自動計算，其產生具有所測的每一部分(slice)的摩爾質量 圖表[Astra手冊]。將從在色譜圖中觀察到的每個峰的圖獲得的摩爾質量與一個單位的蛋白質的預 期分子量比較。這提供得到關於蛋白質溶液狀態的結論的基礎。代表性數據示於表13中。表13:概述 D0M10-53-474具有確定為約14kDa的平均摩爾質量的單峰表明在溶液中為單體狀態，其示於圖 29中。D0M9-112-210具有確定為30kDa的摩爾質量的單峰表明在溶液中為二聚體狀態，其示於圖30中。
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D0M9-155-25精緻的對稱峰，但在緩衝液前面流出。峰的中間部分用作摩爾質量測定(參見含 所有三個重疊信號的下圖)。摩爾質量為28kDa，其代表二聚體dAb，示於圖31中。所有三個信號重疊(圖32)。D0M9-155-147主峰的右邊部分確定為26kDa摩爾質量，峰的左邊向上漸陡的部分確定為高達 53kDa。該峰最可能代表二聚體和在快速平衡中的小部分四聚體。在7. 6分鐘洗脫的更小 的峰代表摩爾質量為51kDa的四聚體蛋白質(圖33)。D0M9-155-159蛋白質作為單個對稱峰流動，其確定為約28kDa的平均摩爾質量，這表明在溶液 中為二聚體狀態(圖34)。用於通過SEC-MALLS確定麗的對照BSA上所述的每一次實驗的每一次BSA流動產生預期的棚，例如含67及145kDa摩爾 質量的2個峰(單體和二聚體)(圖35)。實施例6產牛三特異件mAbdAb通過組裝PCR產生VH和VL序列然後克隆到現有的mAbdAb表達載體，或通過將 來自mAb表達載體的現有VH和VL區亞克隆到現有mAbdAb表達載體，來構建三特異性 mAb-dAb，致使當表達時，該三特異性mAbdAb具有連接到重鏈和輕鏈二者的C-末端的dAb。將接頭序列用於連接結構域抗體與重鏈CH3或輕鏈C κ。三特異性mAbdAb分子的 示意圖示於圖36(mAb重鏈畫為灰色；mAb輕鏈畫為白色；dAb畫為黑色)中。以下顯示闡明構建三特異性mAbdAb重鏈(上圖)和三特異性mAbdAb輕鏈(下
圖)的示意圖。 對於重鏈，術語「VH」為單克隆抗體可變重鏈序列；「CH1、CH2和CH3」為人IgGl重 鏈恆定區序列；「接頭」是所用的特定接頭區的序列；「dAb」為結構域抗體序列。對於輕鏈 「八」為單克隆抗體可變輕鏈序列；「Ck 」為人輕鏈恆定區序列；「接頭」是所用的特定接頭 區的序列；「dAb」為結構域抗體序列。將哺乳動物胺基酸信號序列(如SEQ ID NO 64所示)用於產生這些構建體。
6. 1.三特異性抗-IL18mAb-抗-IL4dAb_ 抗 _IL13dAb通過將編碼抗-人IL-4結構域抗體(D0M9-112-210)的序列移植到編碼重鏈的序 列上，並將編碼抗-IL13結構域抗體(D0M10-53-474)的序列移植到編碼抗-人IL-18人源 化單克隆抗體輕鏈的序列上，來構建三特異性抗-IL18mAb-抗-IL4dAb-抗_IL13dAb (也稱 為IL18mAb-210-474)。G4S接頭用於將抗-IL4結構域抗體連接到單克隆抗體重鏈上。G4S 接頭還用於將抗-IL13結構域抗體連接到單克隆抗體輕鏈上。在CHOKl細胞上清液中瞬時表達IL18mAb-210_474，在對細胞上清液中的 IL18mAb-210-474定量測定後，以多種IL-18、IL-4和IL-13結合測定法進行分析。 6. 2.三特異性抗-IL5mAb-抗-IL4dAb_ 抗 _IL13dAb通過將編碼抗-人IL-4結構域抗體D0M9-112-210的序列(SEQ IDNO 4)移植到 編碼抗-人IL-5人源化單克隆抗體(SEQ ID NO 65)的重鏈序列上，並將編碼抗-IL13結 構域抗體D0M10-53-474的序列(SEQID NO 5)移植到編碼抗-人IL-5人源化單克隆抗體 輕鏈的序列(SEQID NO 66)上，來構建三特異性抗-IL5mAb_抗-IL4dAb_抗-IL13dAb (也 稱為M印O-210-474)。G4S接頭用於將抗-IL4結構域抗體連接到單克隆抗體重鏈上。G4S 接頭還用於將抗-IL13結構域抗體連接到單克隆抗體輕鏈上。在CHOKl和HEK293-6E細胞上清液中瞬時表達該mAbdAb，在對細胞上清液定量後， 以多種IL-4、IL-5和IL-13結合測定法進行分析。 6.3.單克隆抗體、結構域抗體和接頭的序列用於產生三特異性mAbdAb的單克隆抗體、結構域抗體和接頭的序列(或在以下舉 例說明的內容中用作對照試劑)示於下表14中。表 14 成熟人IL-4胺基酸序列(無信號序列)示於SEQ ID NO 62中。成熟人IL-13胺基酸序列(無信號序列)示於SEQ ID NO 63中。6. 4.三特異性mAbdAb的表達和純化用標準分子生物學技術將編碼三特異性mAbdAb分子的DNA序列克隆到哺乳動物 表達載體(Rln、Rld或pTT)。將三特異性mAbdAb表達構建體瞬時轉染到CHOKl或HEK293-6E 細胞之一或二者中，以小規模(3ml-150ml)表達。用於產生三特異性mAbdAb的表達程序與 常規用於表達單克隆抗體的程序相同。用固定化的蛋白A柱純化某些構建體，通過在280nm處讀取吸光度來定量測定。實施例7通過ELISA測定三特異性mAbdAb與人IL-4、人IL-13和人IL-18的結合7. 1.通過 ELISA 測定 IL-18mAb-210_474 與 IL-4、IL-13 和 IL-18 的結合在直接結合ELISA(如方法1、2和3所述)中，檢測如實施例6所述製備的三特異 性 mAbdAb IL18mAb-210-474(上清液)(SEQ IDNO :69 和 70)對人 IL-18、人 IL-13 和人 IL-4 的結合，這些數據分別示於圖37、38和39(多次製備並檢測IL18mAb-210-474，其在圖中被 標註為樣品1、樣品2、樣品3等)中。這些圖顯示IL18mAb-210-474 通過 ELISA 結合 IL-4、IL-13 和 IL-18。在 IL-18 結 合ELISA中包括純化的抗-人IL18mAb作為IL-18結合的陽性對照。在IL-4結合ELISA中 沒有檢測抗-IL-4dAb(D0M9-l 12-210)，因為該dAb不能被第二檢測抗體檢測；取而代之的 是，在該ELISA中用純化的抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對照以證明IL-4結合。 在IL-13結合ELISA中沒有檢測抗-IL_13dAb (D0M10-53-474)，因為該dAb不能被第二檢 測抗體檢測；取而代之的是，在該ELISA中用純化的抗-人IL-13mAb作為陽性對照以證明 IL-13結合。如圖所示，在每次結合ELISA中包括針對不相關抗原的陰性對照mAb。
在每次ELISA中，IL18mAb-210_474樣品5的結合曲線位置上遠離其它 IL18mAb-210-474樣品的結合曲線。其原因尚不知道，然而，可能是由於在人IgG定量ELISA 中對於該特定IL18mAb-210-474樣品5的定量問題。7. 2.通過 ELISA 測定 M印0-210-474 與 IL-4 和 IL-13 的結合在直接結合ELISA (分別如方法1和2所述)中，檢測如第1部分所述製備的三特 異性mAbdAb M印o-210-474(上清液)(序列ID號為71和72)對人IL-13和人IL-4的結 合，這些數據分別示於圖40和41(M印O-210-474以一式四份製備並檢測，其被標註為樣品 1、樣品2、樣品3和樣品4)中。這些圖說明M印O-210-474通過ELISA結合IL-4和IL-13。在IL-4結合ELISA中 沒有檢測抗-IL-4dAb(D0M9-l 12-210)，因為該該dAb不能被第二檢測抗體檢測；取而代之 的是，在該ELISA中用純化的抗-人IL-4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對照以證明IL-4結 合。在IL-13結合ELISA中沒有檢測抗-IL_13dAb (D0M10-53-474)，因為該dAb不能被第二 檢測抗體檢測；取而代之的是，在該ELISA中包括純化的抗-人IL-13mAb作為陽性對照以 證明IL-13結合。如圖40和41所示，在每次結合ELISA中包括針對不相關抗原的陰性對 照 mAb。在一個瞬時轉染實驗中製備M印O-210-474樣品1和樣品2，在另一單獨的瞬時轉 染實驗中製備M印O-210-474樣品3和樣品4。在IL-13和IL-4結合ELISA中，所有四種 樣品都結合IL-13和IL-4。然而，樣品1和2相對樣品3和4結合曲線不同的原因尚不知 道，但可反映在每一次轉染實驗中產生的mAbdAb (在上清液中)的質量差異。實施例8通過表面等離子共振(BIAcoren)測定三特異性mAbdAb與人IL_4、人IL_5、人 IL-13和人IL-18的結合8. 1.通過 BIAcore 測定 L-18mAb_210-474 與 IL-4、IL-13 和 IL-18 的結合用BIAcore 於25°C (分別如方法4、5和6所述)檢測如實施例6. 1所述製備的 三特異性 mAbdAb IL18mAb-210_474 (上清液)(SEQ IDNO 69 和 70)對人 IL-4、人 IL-13 和 人IL-18的結合。捕獲水平在大約400-850響應單位範圍內。檢測每一分析物的三個濃度 (256,32和4nM)。得到的數據示於表15 (樣品以一式三份製備並檢測，其被標註為樣品1、 樣品2和樣品3)中。表 15
79 *由於正解離作用和BIAcore 技術的靈敏度水平而不能測定KD用 BIAcore 確定了 三特異性 mAbdab 結合 IL-4、IL-13 和 IL-18。mAbdAb 對 IL-18的結合親和力與單獨的純化的抗-人ILlSmAb的結合親和力接近相等，在該測定 中包括單獨的純化的抗_人IL18mAb作為IL-18結合的陽性對照，便於直接與mAbdab的 結合親和力比較。由於該三特異性mAbdAb的D0M9-112-210組分極為緊密地結合IL-4 並因此解離速率太小而不能用BIAcore 測定這一事實，不可能測定mAbdab對IL-4的 絕對結合親和力。在該測定中沒有檢測單獨的抗-IL-4dAb(D0M9-l 12-210)，因為不能將 該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上；取而代之的是，在該測定中包括 抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對照以證明IL-4結合。在該測定中沒有檢測單獨 的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因為不能將該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5
80晶片上；取而代之的是，在該測定中包括抗_人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。8. 2.通過 BIAcore 測定 M印0-210-474 與 IL-4、IL-5 和 IL-13 的結合用BIAcore 於25°C (分別如方法5、11和4所述)檢測如實施例6. 2所述製備 的三特異性mAbdAb M印o-210-474(上清液)(SEQ ID NO 71和72)對人IL-4、人IL-5和 人IL-13的結合。捕獲水平在大約450-900響應單位範圍內。對於IL-4和IL-13結合，檢 測每一分析物的5個濃度(256、64、16、4和InM)。對於IL-5結合，檢測每一分析物的4個 濃度(64、16、4和InM)。得到的數據示於表16中。表 16 用BIAcore 測定了 M印0-210-474 結合 IL-4、IL-5 和 IL-13。M印0-210-474 對 IL-5的結合親和力與純化的抗-人IL5mAb (美泊利單抗)的結合親和力接近相等，在該測定中包括純化的抗_人IL5mAb作為IL-5結合的陽性對照，便於直接與M印O-210-474的 結合親和力比較。由於該三特異性mAbdAb的D0M9-112-210組分極為緊密地結合IL-4並 因此解離速率太小而不能用BIAcore 測定這一事實，不可能測定M印O-210-474對IL-4 的絕對結合親和力。在該測定中沒有檢測單獨的抗-IL-4dAb(D0M9-l 12-210)，因為不能 將該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上；取而代之的是，在該測定中包括 抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對照以證明IL-4結合。在該測定中沒有檢測單獨的 抗-IL-13 dAb (D0M10-53-474)，因為不能將該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5 晶片上；取而代之的是，在該測定中包括抗_人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。實施例9化學計量9. 1.用 BIAcore 的 IL_4、IL_13 和 IL-18 與 IL-18mAb-210_474 結合的化學計量用BIAcore (如方法7所述)評估IL18mAb-210_474(在CHO細胞上清液中如第 1章節所述製備)(SEQ ID NO 69和70)對IL_4、IL_13和IL-18結合的化學計量。這些數 據示於表17(R-maX為飽和結合響應，其為按照方法7中給出的公式計算化學計量所需要) 中。每種細胞因子的濃度為500nM。注射位置指加入每一種細胞因子的次序。表17 化學計量數據表明IL18mAb-210-474結合大約兩個IL-18分子、兩個IL-13分子 和僅一個IL-4分子。已知單獨的抗-IL4dAb(D0M9-l 12-210)在溶液狀態中為二聚體，僅能 夠結合一個IL-4分子。因此，IL18mAb-210-474僅結合一個IL-4分子是在意料之中。這 些數據表明所測分子能被預期數目的IL-18、IL-13和IL-4分子完全佔據。所述化學計量數據還表明細胞因子的捕獲次序似乎與加入細胞因子的次序無關。實施例1010. 1.產牛雙重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb通過讓dAb與mAb重鏈C-末端融合，來構建該雙重靶向的mAbdAb。先前業已構建 了抗-TNF mAb重鏈和輕鍊表達盒。用於克隆的限制性位點在下面顯示(圖42)。為了將用於插入dAb的限制性位點引入到重鏈中，用mAb重鍊表達載體作為模板 將位點定向誘變用於產生SalI和HindIII克隆位點。然後通過PCR(用編碼SalI和HindIII 末端的引物)擴增編碼抗-EGFRdAb (D0M16-39-542)的DNA，並將其插入到經修飾的3』編碼 區，在mAb和dAb之間產生接頭「STG」 (絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸)。選擇已驗證序列的克隆(SEQ ID NO 170和169分別為輕鏈和重鏈)，按照製造商 方案用Qiagen Mega Prep試劑盒大規模製備。通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈(SEQ ID NO 73和74)在哺乳動物HEK293-6E細胞中表達mAbdAb。10. 2.雙重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb的純化和SEC分析按照已確定的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液中純化抗-TNF/ 抗-EGFR mAbdAb。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確定純化樣品的濃 度。純化的樣品的SDS-PAGE分析(圖43)顯示未經還原的樣品泳動至約170kDa，而經還原 的樣品顯示為泳動至約25和約60kDa的兩條帶，其分別對應於輕鏈和融合dAb的重鏈。對於大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb上樣到預平衡的 Superdex-200 10/30HR 柱(連接到 Akta Express FPLC 系統)，並用 PBS 以 0. 5ml/ 分鐘流 動。SEC曲線顯示作為對稱峰流動的單一物質(圖44)。10. 3.雙重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb的結合親和力分別如方法13和14所述測定對EGFR和TNF的結合親和力。用GraphPad Prism 分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。該mAbdAb的 抗-EGFR效價(圖45)計算為39. InM,而對照抗-EGFR mAb給出的EC50值為3. 4nM。在 抗-TNF生物測定(圖46)中，mAbdAb效價為3pM(0. 0028nM)，而抗-TNF對照mAb產生的 EC50為104pM。綜上所述，測定數據顯示實施例10的構建體即雙重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb對兩種抗原都有效。10. 4.雙重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb的大鼠PK在大鼠中檢測該分子的體內藥代動力學特性。靜脈內給予三隻大鼠抗-TNF/ 抗-EGFR mAbdAb,經7天(168小時)時間採集血清樣品。通過針對TNF及EGFR的ELISA 評估給藥後不同時間點殘留的藥物濃度。結果示於圖125中。PK參數證實該分子具有長半衰期，與先前觀察的未經修飾的阿達木單抗 (adalimumab)在同一區域(125小時)。進一步的詳細資料示於表17. 1中。表 17. 1
83 實施例1111. 1.產牛雙重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb採用實施例10所述相似策略製備抗-TNF/抗-VEGF。為了構建重鍊表達盒，採用編 碼實施例10重鏈的載體DNA作為起始點。用限制性酶SalI和HindIII切割抗-EGFR dAb。 通過PCR(用編碼Sail和HindIII末端的引物)擴增DOMl5-26-593 (抗-VEGF dAb)，並將 其連接到具有先前業已通過相同限制性位點切割的抗-EGFR dAb的載體主鏈，在mAb和dAb 之間產生接頭「STG」(絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸)。選擇已驗證序列的克隆(SEQ ID NO 169和168分別為輕鏈和重鏈)，大規模製 備DNA製備物，通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈(SEQ ID NO :73和75)在哺乳動物 HEK293-6E 細胞中表達抗-TNF/ 抗-VEG mAbdAb。11. 2.雙重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb的純化和SEC分析按照已確定的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液中純化抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb (命名為DMS4000)。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確 定純化樣品的濃度。純化的樣品的SDS-PAGE分析(圖47)顯示未經還原的樣品泳動至約 170kDa，而經還原的樣品顯示為泳動至約25和約60kDa的兩條帶，其分別對應於輕鏈和融 合dAb的重鏈。對於大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb上樣到經預平衡的 Superdex-200 10/30HR 柱(連接到 Akta Express FPLC 系統)，並用 PBS 以 0. 5ml/ 分鐘 流動。SEC曲線顯示作為對稱峰流動的單一物質(圖48)。11. 3.雙重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb的結合親和力分別如方法12和14所述測定對EGFR和TNF的結合親和力。用GraphPad Prism 分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。該mAbdAb的 抗-VEGF效價(圖49)計算為57pM，而對照抗-VEGF mAb給出的EC50值為366pM。在抗-TNF 生物測定(圖50)中效價為ΙΟρΜ，而抗-TNF對照mAb產生的EC50為22pM。綜上所述，測 定數據顯示實施例11的分子即雙重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb對兩種抗原都有效。11. 4.雙重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb的大鼠PK在大鼠中檢測該分子的體內藥代動力學特性。靜脈內給予三隻大鼠抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb,經10天(240小時)時間採集血清樣品。通過針對TNF及VEGF 二者的 ELISA評估給藥後不同時間點殘留的藥物濃度。結果示於圖126中。PK參數證實該分子具有可與未經修飾的阿達木單抗相比的體內藥代動力學特性。 不認為所觀察到的對VEGF組分的較短t1/2 β具有意義，其可能是測定假象。進一步的詳細 資料示於表17. 2中。
表 17. 2 11. 5.備選抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb 的產生以與上面實施例11. 1所述相似的方式構建備選抗-TNF/抗-VEGFmAbdAb，該過 程用STG接頭將同樣的抗-TNF mAb連接到重鏈C-末端上的VEGF dAb。在該案例中所用 抗-VEGF dAb為D0M15-10-11。通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈(SEQ ID NO :73和 185)在哺乳動物HEK293-6E細胞中表達該分子。該分子經表達獲得與實施例11. 2所述相 似的表達水平的mAbdAb，然而，當如實施例11. 3所述在相同的VEGF測定中檢測效價時，在 該測定中發現具有不可檢測的抑制VEGF結合VEGF受體的水平。實施例1212. L產牛雙重靶向的抗-VEGF/抗-ILlRl dAb-延伸的IgG按照在dAb和兩個鏈的恆定區之間插入假體V結構域(Dummy Vdomain)編碼區的 策略，用標準分子生物學技術構建兩個雙重靶向的dAb-延伸IgG分子。對於輕鏈，先前將抗-ILlRl dAb 00114-130-54克隆到含5&11和88丨11位點的表達 盒(圖51)，以產生dAb-Ck鏈。為了製備dAb-延伸的IgG輕鏈，通過PCR用兩端編碼BsiWI 的引物擴增假體Vk區。用BsiWI消化含有dAb-Ck表達盒的質粒。讓BsiWI消化的假體Vk 結構域與其連接，產生在兩個可變結構域之間含「TVAAPS」接頭的dAb-延伸的IgG輕鏈。按照同樣的策略產生dAb-延伸的IgG重鏈，其中將PCR擴增的含NheI端的假體 VH結構域連接到經NheI消化的dAb重鏈，在dAbD0M15-26和CHl之間(圖51)，其在兩個 可變結構域之間有接頭「ASTKGPS」。其被命名為DMS2090，具有 SEQ ID NO 163 (SEQ ID NO 162 的 DNA 序列)中所述 的序列。其與SEQ ID NO 77 (DNA序列SEQ ID NO 171)中所述的輕鏈配對。以同樣方式但用dAb D0M15-26-593構建第二條重鏈。其被命名為DMS2091，具有 SEQ ID NO 76 (DNA 序列 SEQ ID NO 172)中所述的序列。其與 SEQ ID NO 77 (DNA 序列 SEQ ID NO 171)中所述的輕鏈配對。選擇已驗證序列的克隆，按照製造商方案用Qiagen Maxi或MegaPr印試劑盒大規 模製備DNA製備物。通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈在哺乳動物細胞中表達得到的 構建體。12. 2.雙重靶向的抗-VEGF/抗-ILlRl mAbdAb的純化和SEC分析按照已確定的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液中純化兩種 抗-ILlRl/抗-VEGF dAb-延伸的IgG分子。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度 測量值確定純化樣品的濃度。DMS2090的SDS-PAGE分析示於圖52，DMS2091的SDS-PAGE分 析示於圖53。兩種純化的樣品都顯示未經還原的樣品泳動至190kDa，而經還原的樣品顯示 為泳動到35和60kDa的兩條帶，其分別對應於dAb-延伸的輕鏈和重鏈。對於大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-VEGF/抗-ILlRl dAb-延伸的-IgG上樣到經
85預平衡的 Superdex-20010/30HR 柱(連接到 Akta ExpressFPLC 系統)，並用 PBS 以 0. 5ml/ 分鐘流動。DMS2090(圖54)和DMS2091 (圖55) 二者的SEC曲線都顯示作為對稱峰流動的
單一物質。12. 3.雙重靶向的抗-VEGF/抗-ILlRl mAbdAb的結合親和力分別如方法12和15所述測定對VEGF和ILlRl的結合親和力。用GraphPad Prism 分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。計算DMS2090的 抗-VEGF效價(圖57)為158. 4pM，而對照抗-VEGF mAb給出的EC50值為689. 2pM。計算 DMS2091的抗-VEGF效價(圖56)為55pM，而對照抗-VEGF mAb給出的EC50值為766pM。在抗-ILlRl生物測定(圖46)中，DMS2090效價(圖58)為32pM，而抗-ILlRl對 照mAb產生的EC50為35pM。DMS2091效價(圖59)為17. 47pM,而抗-ILl-Rl對照mAb產 生的 EC50 為 35. 02pM。綜上所述，測定數據顯示實施例12的雙重靶向的抗-ILlRl/抗-VEGF dAb_延伸 的IgG對兩種抗原都有效。12. 4.雙重靶向的抗-VEGF/ 抗-ILlRl mAbdAb 的大鼠 PK在大鼠中檢測該分子的體內藥代動力學特性。靜脈內給予三隻大鼠抗-ILlRl/ 抗-VEGF dAb-延伸的IgG A，經7天(168小時)時間採集血清樣品。通過針對ILlRl及 VEGF兩者的ELISA評估給藥後不同時間點殘留的藥物濃度。結果示於圖127中。PK參數示於表17. 3中。表 17. 3 實施例1313. 1.產生三重靶向的抗-TNF/ 抗-VEGF/ 抗-EGFR mAbdAb用標準分子生物學技術並按照在dAb和兩種鏈的恆定區之間插入mAb V結構域編 碼區的策略，構建三重靶向的mAb。對於輕鏈，先前已將抗-EGFR dAb D0M16_39_542克隆到含SalI和BsiWI位點的 表達盒(圖15)，以產生dAb-Ck鏈。為了製備mAbdAb輕鏈，通過PCR用兩端編碼BsiWI的 引物擴增mAb VL區。用BsiWI消化含有dAb_Ck表達盒的質粒。讓經BsiWI消化的mAb VL 結構域與其連接，以產生mAbdAb輕鏈，導致產生在兩個可變結構域之間的「TVAAPS」接頭。按照同樣的策略產生mAbdAb重鏈，其中將PCR擴增的含NheI端的mAb VH區連接 到經NheI消化的dAb重鏈載體，在dAb (D0M15-26)和CHl之間(圖60)，導致產生在兩個可 變結構域之間的接頭「ASTKGPS」。選擇已驗證序列的克隆(SEQ ID NO 78和79分別為重鏈和輕鏈)，按照製造商方 案用Qiagen Mega Prep試劑盒大規模製備DNA製備物。通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈在哺乳動物細胞中表達mAbdAb。13. 2.三重靶向的抗-TNF/抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb的純化按照已確定的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液中純化抗-TNF/ 抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確定純化 樣品的濃度。經純化的樣品的SDS-PAGE分析(圖61)顯示未經還原的樣品泳動到190kDa， 而經還原的樣品顯示為泳動到35和60kDa的兩條帶，其分別對應於dAb-延伸的輕鏈和重 鏈。13. 3.三重靶向的抗-TNF/抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb的結合親和力分別如方法12、13和14所述測定對VEGF、EGFR和TNF的結合親和力。用GraphPad Prism分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。該mAbdAb 的抗-VEGF效價(圖62)計算為1. 885mM,而對照抗-VEGF mAb給出的EC50值為0. 145nM。在抗-TNF生物測定(圖636)中效價為87pM，而抗-TNF對照mAb產生的EC50為 104pM。在抗-EGFR測定(圖64)中，三重靶向mAbdAb在約300nM下產生約20%抑制。同 時計算VEGF和TNF結合的EC50值，對於EGFR結合，沒有產生用於計算EC50值的連續曲線 (fullcurve)。實施例14 :IGF-1R/VEGF mAbdAb14. 1. IGF-1R/VEGF mAbdAb 的構津從重疊寡核苷酸的PCR從頭開始構建抗IGF-IR可變重鏈和可變輕鏈基因序列。 用標準分子生物學技術在哺乳動物表達載體中將這些區域融合到人IgGl或κ恆定區。同 樣用重疊寡核苷酸的PCR構建抗VEGF結構域抗體的基因序列，並如上所述將其融合到抗 IGF-IR組分的重鏈或輕鏈基因的3』端。融合體在抗體與結構域抗體組分之間併入了兩個 胺基酸(GS)的接頭或8個胺基酸(TVAAPSGS)的接頭。此外，構建不含結構域抗體和接頭 序列的抗體重鏈和輕鏈。按照製造商方案用Endofree Qiagen Maxipr印試劑盒選擇已驗 證序列的克隆用於大規模DNA製備。在序列SEQ ID NO :108、109、111和112中，在抗體和結構域抗體之間的接頭序列 位置下劃線。可通過除掉全部接頭或通過用不同的接頭，構建備選變體。在SEQ ID NO 6 和8-11中提供其它合適的接頭實例。表18提供一系列經構建並表達的抗體。表18-經構建並檢測的抗體
87 實施例14. 2 :IGF-1R/VEGF mAbdAb的表達、純化和SEC曲線在瞬時轉染的HEK293-6E中表達重鏈和輕鏈載體組合。簡言之，用先前與 293fectin試劑(Invitrogen#51-0031)孵育的25 μ g重鏈和25 μ g輕鏈質粒，轉染50ml的 1.5xl06個細胞/ml的HEK293-6E細胞。將細胞置於37°C、5% CO2和95%相對溼度的震蕩 培養箱中。24小時後，加入蛋白腖養料培養基(feeding media)，讓細胞再生長72小時。離 心收穫上清液，接著用0. 22 μ m過濾器過濾。用蛋白A瓊脂糖柱純化表達的蛋白質，並透析 到PBS中。通過大小排阻色譜(SEC)分析純化的蛋白質，示於圖65中。在以下測定中用IGF-IR抗體(HOLO)作為比較物。該分子具有SEQID NO 110中 所述的重鏈序列和SEQ ID NO: 113中所述的輕鏈序列。在以下測定中將另一具有不相關特異性的mAbdAb用作比較物。該分子具有SEQ ID NO 87中所述的重鏈序列和SEQ ID NO 13中所述的輕鏈序列，並被命名為BPC1601。實施例14. 3 IGF-IR 結合 ELISA進行結合ELISA以檢測純化的抗-IGF-1R/VEGF mAbdAb與IGF-1R的結合。簡言 之，將 400ng/ml 重組人 IGF_lR_his 標籤(R&DSystems 305-GR)的 PBS 溶液裝到用 1 μ g/ ml抗-聚組氨酸(AbCamAB9108)包被並用封閉液(在Tris緩衝的鹽水中的4% BSA)封 閉的ELISA板中。在用TBS+0.05% Tween 20 (TBST)洗滌前讓板於室溫孵育1小時。加入 在封閉液中稀釋的各種濃度的純化的mAbdAb以及抗IGF-IR單克隆抗體(HOLO)和不相關 的mAbdAb (BPC1601)。在用TBST洗滌前讓板於室溫孵育1小時。通過加入在封閉液中以 1/1000稀釋的過氧化物酶標記的抗人κ輕鏈抗體(Sigma A7164)來檢測結合。在用TBST 洗滌前讓板於室溫孵育1小時。通過加入OPD底物(Sigma P9187)使板顯色，通過加入3M
88H2SO4終止顯色。在490nm處用板讀數器測量吸光度，作圖確定平均吸光度。結合ELISA的結果提供在圖66中，其確證所檢測的所有IGF1R-VEGF mAbdAb 變體(BPC1603-1606)都顯示以可比得上抗-IGF-IR抗體HOLO的水平與IGF-IR結 合。用 Cambridgesoft Bioassay 軟體計算 EC50 值，結果如下H0L0 (0. 1797 μ g/ ml))、BPC1603 (0. 1602 μ g/ml)、BPC1604 (0. 1160 μ g/ml)、BPC1605 (0. 1975 μ g/ml)、 BPC1606(0. 1403 μ g/ml)。不相關的對照雙特異性抗體BPC1601顯示對IGF-IR沒有可檢測 的結合。實施例14. 4 :VEGF 結合 ELISA進行結合ELISA以檢測經純化的抗-IGF-1R/VEGF雙特異性抗體與VEGF的結合。 用PBS中的400ng/ml重組人VEGF(GSK)包被並用封閉液(TBS中的4% BSA)封閉ELISA 板。加入在封閉液中稀釋的各種濃度的純化的mAbdAb，包括mAbdAb BPCI601作為陰性對 照。在用TBST洗滌前讓板於室溫孵育1小時。通過加入在封閉液中以1/1000稀釋的過氧 化物酶標記的抗人κ輕鏈抗體(Sigma A7164)來檢測結合。在用TBST洗滌前讓板於室溫 孵育40分鐘。通過加入OPD底物(Sigma P9187)使板顯色，通過加入3M H2SO4終止顯色。 在490nm處用板讀數器測量吸光度，作圖確定平均吸光度。結合ELISA的結果提供在圖67中，其確證所有四種抗-IGF-1R/VEGF mAbdAb (BPC1603-1606)都可結合固定化VEGF。BPC1605和BPC1606顯然更低的結合活性 可歸因於結構域抗體(位於輕鏈的C-末端)與檢測抗體之間的幹擾。用Cambridgesoft Bioassay 軟體計算 EC50 值，結果如下BPC1603 (0. 044 μ g/ml)、BPC1604 (0· 059 μ g/ ml)、BPC1605(0. 571 μ g/ml)。由於較低的響應值而不可能計算BPC1606的精確EC50值。 抗-IGF-IR抗體HOLO和不相關的對照mAbdAb BPC1601顯示對VEGF沒有可檢測的結合。實施例14. 5 與VEGF結合的動力學通過伯胺偶聯到CM5生物感受器晶片來固定針對人IgG的小鼠單克隆抗體 (Biacore BR-1008-39)。用該表面來捕獲抗體構建體。在捕獲後，使VEGF通過表面後，然後 用3M MgCl2使所述表面再生。用於產生動力學的VEGF濃度為256、64、16、4、1和0.25碰， 且僅將緩衝液注入捕獲表面上用於雙重參考(double referencing) 0用IxHBS-EP緩衝液 (BR-1006-69)於25°C在Biacore TlOO設備上進行實驗。用其分析軟體將數據擬合到設備 固有的1 1模型。來自兩個獨立實驗的數據示於表19中。表19-結合人VEGF的動力學 實施例14. 6 =VEGF與警體結合的抑制如方法12所述用VEGF受體結合測定測量mAbdAb活性。在該測定中獲得的抑制 VEGF與VEGFR2結合的IC50為BPC1603 (0. 037nM)BPC1604(0. OlOnM)BPC1605 (0. 167nM)BPC1606(0. 431nM)這些結果確證所有四種抗原結合構建體抑制配體結合受體。實施例14. 7 =IGF-IR受體磷酸化的抑制將3T3/LISN c4細胞以10000個細胞/孔的密度接種到96孔板中，並在完全 DMEM(DMEM-H印es改良+10% FCS)中孵育過夜。將純化的mAbdAb加到細胞中並孵育1小時。 將rhIGF-Ι加到處理的細胞中以達到50ng/ml的終濃度，並再孵育30分鐘以刺激受體磷酸 化。吸出培養基，然後通過加入RIPA裂解緩衝液(150mM NaCl、50mMTrisHCl、6mM脫氧膽酸 鈉、Tween 20)加上蛋白酶抑制劑混合物(Roche 11 697 498 001)來裂解細胞。過夜冷 凍所述板。解凍後將各孔的裂解液轉移到用2 μ g/ml抗IGF-IR捕獲抗體2B9 (GSK)預先包 被並用封閉液4%BSA/TBS封閉的96孔ELISA板。用TBST(TBS+0. 1% Tween 20)洗滌板，將 用4% BSA/TBS以1/2500稀釋的銪標記的抗磷酸酪氨酸抗體(PerkinElmer DELFIA Eu-Nl PT66)加入到各孔中。孵育1小時後洗滌板，加入DELFIA增強(PerkinElmer 1244-105)溶 液。孵育10分鐘後，用板讀數器裝置測定受體磷酸化水平以測量銪時間分辨螢光(TRF)。實驗結果提供在圖68和69中。結果確證mAbdAb BPC1603-1606可以以比得上 抗-IGF-IR單克隆抗體HOLO的水平抑制IGF-I介導的受體磷酸化。在該測定中不相關抗 體(標記為IgGl, Sigma 15154)顯示無活性。實施例15抗-⑶20/IL-13抗原結合蛋白實施例15. 1 分子生物學用基於PCR的方法和標準分子生物學技術從頭構建編碼SEQ IDNO :117和120中 所述的抗-⑶20mAb的重鏈和輕鏈序列的哺乳動物表達載體。通過將編碼抗-⑶20mAb重鏈 和輕鏈可變區的序列克隆到含有融合到抗-人IL-13結構域抗體(D0M10-53-474)的人抗 體恆定區的哺乳動物表達載體，來構建雙特異性抗-⑶20mAb-抗-IL13dAb重鏈和輕鏈。
將mAbdAb表達構建體轉染到CHOEla細胞。收穫上清液，然後用固定化的蛋白A 純化抗體，通過讀取280nm處的吸光度來定量。已構建並檢測的mAbdAb (和抗-⑶20對照 mAb)列於表20中。表 20 實施例15. 2 與人IL-13結合的動力學通過BIAcore 分析評估mAbdAb構建體對人IL-13的結合親和力。進行抗-人IgG 捕獲分析。簡言之，通過伯胺偶聯將抗-人IgG(Biacore BR-1008-39)偶聯到CM5晶片上。 然後將mAbdAb構建體捕獲到該表面。以限定濃度使人IL-13(由GSK製備並純化)通過。 用3MMgCl2使該表面再生回抗人IgG表面。該處理不顯著影響捕獲抗體對隨後的IL-13結 合事件的能力。用HBS-EP緩衝液在25°C於BIACore T100設備上進行運作。用設備中的評 估軟體分析數據，並擬合成1 1結合模型。分析結果提供在表48中，其確證所有mAbdAb 構建體結合IL-13的動力學都相當。表48-表面等離子共振(BIAcore )數據
91
通過流式細胞術用⑶20陽性細胞系(Weinl33)評估mAb_dAb與⑶20的結合。所有 mAb-dAb (BPC1401-BPC1404)和抗-⑶20對照抗體顯示平均螢光強度劑量依賴性增加(MFI) (數據未顯示)實施例15. 3 用抗-CD20/IL-13雙特異件抗體講行ADCC測定ADCC測定基於Boyd等(1995) J. Imm. Meth. 184 :29_38公開的方法。簡言之，用 銪如下標記Raji細胞(靶標)。收穫細胞，計數，並在15ml falcon試管中製備為終密度 lxlO7，用 H印es 緩衝液(50mMHEPES、83mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2. Η20、ρΗ7· 4)洗滌一次。 沉澱細胞，將Iml冰冷的銪標記的緩衝液(HEPES緩衝液加600 μ MEuCl3、3mM DTPA和25mg/ ml硫酸葡聚糖)加入到各管中。在標記開始猛烈彈擊細胞懸浮液，然後在冰上孵育的30 分鐘期間每10分鐘彈擊一次。加入IOml冰冷的修復緩衝液(含有294mg/l CaCl2. 2H20、 1. 8g/lD-葡萄糖、pH7. 4的!fepes緩衝液)，細胞在冰上再孵育10分鐘。然後離心細胞，潷 出上清液，用修復緩衝液洗滌2次，然後用完全培養基洗滌一次。然後計數標記的細胞，以 2xl05細胞/ml重新懸浮在無血清培養基中，並儲存在冰上。如下製備人純化的血單核細胞(PBMC或效應細胞)。以2000rpm將150ml全血離 心10分鐘以除掉血清。用PBS(InvitrOgen/GibCO，#14190)將細胞稀釋到原始體積的2倍。 通過加 15ml 淋巴細胞分離劑(lymphopr印)(Axis shield, #NYC1114547)製備 Accuspin 密 度梯度管(Sigma，#A2055-10EA)，以1500rpm離心1分鐘。將25ml血混懸液加入到密度梯 度管，以2500rpm離心20分鐘，讓離心機慢慢減速。棄掉IOml頂部上清液。將剩餘物(包 括「淡黃色」層)倒入乾淨試管中，用PBS加滿，以1500rpm離心5分鐘。棄掉上清液，合併 細胞沉澱，用RPMI培養基洗滌一次，重新離心並計數。在無血清RPMI培養基中以5xl06/ml 製備效應細胞。在96孔圓底板(Nunc 96 maxisorb板，#735-0199)中如下設定測定板。在無血 清RPMI培養基中以大約12 μ g/ml的起始濃度製備抗體稀釋液，甚至進一步3倍稀釋。以 下進行板布置，將50 μ 1抗體樣品加入合適的孔(僅B-G排)中，使每個稀釋度進行6個重 復。將50 μ 1 RPMI培養基加入A和H排的所有孔中。將50 μ 1的RPMI培養基加入到培養 基標記的板的所有孔中。將在RPMI培養基中稀釋到4 μ g/ml (1 μ g/ml終濃度，GSK內部材 料)的50μ1重組人IL-13加入到+IL13標記的板的所有孔中。所有板在4°C孵育最少30 分鐘。將50 μ 1銪標記的靶標細胞加入到所有板。將20 μ 1的IOX triton加入到所有板H排的所有孔中。讓板在4°C孵育最少30分鐘。將50μ1 RPMI培養基加入到僅標記靶標的 列的所有孔中。將50μ1 PBMC加入到標記的效應器靴標為25 1比率的列的所有孔中。 讓板以1500rpm離心3分鐘，並37°C孵育3-4小時。將200 μ 1的增強液(ffallac/Perkin Elmer，貨號1244-105)加入到nunc免疫吸附ELISA板(一個ELISA板對應每一個測定板) 的各孔中。將20 μ 1上清液從測定板轉移到ELISA板。讓ELISA板於室溫在板振蕩器上孵 育最少30分鐘，或儲存在4°C過夜。用時間滯後螢光測定法(time-delayed fluorimetry) (Wallac Victor板讀數器)測量銪釋放。自發裂解=只從細胞和培養基中釋放的銪的測量 值。最大裂解=通過加入Triton-XlOO (非離子去汙劑)靶標細胞的非特異性裂解。
效應器靶標靶標效應器靶標靶標 在兩個單獨的時機用兩種不同的供體PBMC進行ADCC測定。來自一個代表性測定 的結果提供在圖70和71中。另外，在單獨的時機用不同的供體PBMC進行使用較窄劑量範 圍的相似的ADCC測定。將來自該測定的結果示於圖72和73中。實施例15. 4 用抗-⑶20/IL-13雙特異性抗體進行⑶C測定用銪如下標記TOIN細胞(靶標)。簡言之，收穫細胞，計數，並在15ml falcon試 管中製備為終密度 lxio7，用 Ifepes 緩衝液(50mMHEPES、83mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2. H20、pH7.4)洗滌一次。沉澱細胞，將Iml冰冷的銪標記的緩衝液(HEPES緩衝液加上 600yMEuCl3>3mM DTPA和25mg/ml硫酸葡聚糖)加入到各管中。在標記開始猛烈彈擊細胞 懸浮液，然後在冰上孵育的30分鐘期間每10分鐘彈擊一次。加入IOml冰冷的修復緩衝液 (含有294mg/l CaCl2. 2H20、1. 8g/lD_葡萄糖、pH7. 4的H印es緩衝液)，細胞在冰上再孵育 10分鐘。然後離心細胞，潷出上清液，用修復緩衝液洗滌2次，然後用完全培養基洗滌一次。 然後計數標記的細胞，以2xl05細胞/ml重新懸浮在無血清培養基中，並儲存在冰上。通過離心從採集自內部供體的全血中移走血清。讓一半樣品在56°C熱處理30分 鍾滅活。在無血清RPMI培養基中以大約12μ g/ml的起始濃度稀釋抗體，進行5次3倍稀 釋。將50μ 1抗體樣品加入到僅B-G排的合適的孔(按照以下所述的板布置)中。將50μ 1 RPMI培養基加入到1-6列的所有孔中。在必要時將50 μ 1的重組人IL-13 (以在RPMI培養 基中4yg/ml)加入到第7-12列的各孔中。讓板在4°C孵育最少30分鐘。將50 μ 1銪標記
93的靶標細胞加入到所有板，並讓板在4°C孵育最少30分鐘。將50 μ 1血清(活性或熱滅活) 加入到合適的孔(參見以下板布置)中。讓板在37°C培養箱中孵育2-3小時，之後將所述板 以 1500印111離心3分鐘。將200口 1 的增強液(ffallac/Perkin Elmer, Catalogue#1244-105) 加入到nunc免疫吸附ELISA板(一個ELISA板對應每一個測定板)的各孔中。將20 μ 1 上清液從測定板轉移到ELISA板。讓ELISA板於室溫在板振蕩器上孵育最少30分鐘，或儲 存在4°C過夜。用時間滯後螢光測定法(Wallac Victor板讀數器)測量銪釋放。自發裂解 =只從細胞和培養基中釋放的銪的測量值。最大裂解=通過加入Triton-XlOO (非離子去
汙劑)使靶標細胞非特異性裂解。
在三個單獨的時機用三種不同的供體血清進行CDC測定。來自一個代表性測定的 結果提供在圖74和75中，並顯示抗體樣品的⑶C活性比得上無IL-13時的⑶C活性。在 過量IL-13存在下，抗體樣品BPC1401和BPC1402 (融合到重鏈的結構域抗體)的⑶C活性 降低了，而BPC1403和BPC1404 (融合到輕鏈的結構域抗體)的⑶C活性並沒有受IL-13存 在的較大影響。實施例1616. 1包含由備誅骨架組成的表位結合結構域的抗JC結合g白的設i十i^勾建將以下列出的5種備選骨架與單克隆抗體聯合以提供mAb-備選骨架雙特異性分 子 抗VEGF淚液脂質運載蛋白(TLPC) 抗 HER2 Affibody (AFFI) 抗 HER2 DARPin (DRPN) 抗雞蛋白溶菌酶(NARV)·抗-RNA 酶 A 駱駝 VHH將TLPC(其進一步的資料參見US2007/0224633)、AFFI (其進一步的資料參見
94W02005003156A1)、DRPN(其進一步的資料參見 Zahnd，C.等(2007)、J. Mol. Biol.，369， 1015-1028)和NARV(其進一步的資料參見US20050043519A)的蛋白序列逆翻譯為DNA並優 化密碼子。在這4種備選骨架的每一種中包括在N-末端處的BamHI位點和在C-末端處的 EcoRl位點，以方便克隆。用基於PCR的策略和重疊寡核苷酸從頭構建編碼這四種備選骨架DNA序列的DNA 片段。將TLPC, AFFI和DRPN PCR產物克隆到含有HOLO重鏈(抗-hlGF-lR抗體)的哺乳 動物表達載體。得到的DNA序列編碼經由TVAAPSGS接頭或GS接頭融合到重鏈的C-末端 的備選骨架。將NAR V PCR產物克隆到含有編碼帕考珠單抗(抗-IL-4抗體)重鏈的DNA 的哺乳動物表達載體。得到的DNA序列編碼經由GS接頭融合到重鏈的C-末端的NAR V。通過PCR修飾抗-RNA酶A駱駝VHH DNA序列，以在5』端包括BamHI位點並在3』 端包括EcoRl位點便於克隆。將PCR產物克隆到含有帕考珠單抗(抗-IL-4抗體)重鏈的 哺乳動物表達載體。得到的DNA序列編碼經由GS接頭融合到重鏈的C-末端的駱駝VHH。以下表21概述了業已構建的抗原結合蛋白。表 21 用293fectin(Invitrogen，12347019)將表21中所述的編碼抗原結合蛋白的重鏈 和輕鍊表達質粒瞬時共轉染到HEK 293-6E細胞。在同一天或第二天將蛋白腖養料加入到 各細胞培養物中，在初始轉染約2-6天後收穫上清液物質。用蛋白A柱純化來自上清液的 抗原結合蛋白，然後在結合測定中進行檢測。16. 2 :rhIGF-lR 結合 ELISA用1 μ g/ml抗-his-標籤抗體(Abcam，ab9108)的PBS溶液包被96孔高結合板， 並在4°C儲存過夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L 封閉液(5% BSA/DPBS緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後再進行 另一洗滌步驟。將0. 4yg/mL的rhIGF-lR(R&D Systems)以每孔50 μ L加入到各孔中。讓 板在室溫孵育1小時，然後洗滌。用封閉液在板中對純化的抗原結合蛋白質/抗體進行連續稀釋。1小時孵育後，洗滌板。用封閉液將山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗 體稀釋到1 μ g/mL，將50 μ L加入到各孔中。讓板孵育1小時。在進行另一個洗滌步驟後， 將50 μ 1的OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過 加入25 μ L的3Μ硫酸終止反應。在490nm處用VersaMaxTunable微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案讀取吸光度。圖76、78和80顯示ELISA結果，並確證抗原結合蛋白BPC1803-BPC1808結合重 組人IGF-1R。還顯示抗-IGF-IR單克隆抗體HOLO結合重組人IGF-1R，然而陰性對照抗體 (sigma 15154)顯示不結合 IGF-IR016. 3 :VEGF 結合 ELISA用0. 4 μ g/ml的hVEGF165 (R&D Systems)包被96孔高結合板，並在+4°C孵育過 夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L封閉液(5% BSA/ DPBS緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後進行另一個洗滌步驟。用 封閉液在板中對純化的抗原結合蛋白質/抗體進行連續稀釋。1小時孵育後，洗滌板。用 封閉液將山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體稀釋到1 μ g/mL，將50 μ L加入到 各孔中。讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50μ1的OPD(鄰苯二胺二鹽酸鹽) SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸終止反應。在490nm 處用VersaMax Tunable微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案讀取吸光度。圖77顯示VEGF結合ELISA結果，並確證雙特異性抗體BPC1803和BPC1804結合 人VEGF。在該測定中抗VEGF雙特異性抗體(BPC1603)用作陽性對照，顯示結合VEGF。與 此相反，顯示抗-IGF-IR單克隆抗體HOLO不結合人VEGF。16. 4 :HER2 結合 ELISA用1 μ g/ml的HER2(R&D Systems)包被96孔高結合板，並在+4°C孵育過夜。用 含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L封閉液(5% BSA/DPBS 緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後再進行一次洗滌。用封閉液在 板中對純化的抗原結合蛋白質/抗體進行連續稀釋。1小時孵育後，洗滌板。用封閉液將 山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體稀釋到1 μ g/mL，將50 μ L加入到各孔中。 讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50μ 1的OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast 底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸終止反應。在490nm處用 VersaMaxTunable微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案讀取吸光度。圖79和80顯示HER結合ELISA結果，並確證抗原結合蛋白BPC1805、BPC1806、 BPC1807和BPC1808結合重組人HER2。在該測定中赫賽汀(Here印tin)用作陽性對照，顯 示結合HER2。與此相反，顯示抗-IGF-IR單克隆抗體HOLO不結合人HER2。16. 5 :IL~4 結合 ELISA用5μ g/ml人IL-4的PBS溶液包被96孔高結合板，並在4°C儲存過夜。用含 0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L封閉液(5% BSA/DPBS緩 衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後進行另一個洗滌步驟。用封閉液 在板中對純化的抗原結合蛋白質/抗體進行連續稀釋。1小時孵育後，洗滌板。用封閉液將 山羊抗-人K輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(Sigma，A7164)稀釋到1 μ g/mL，將50 μ L 加入到各孔中。讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50μ1的OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸終止反應。在 490nm處用VersaMax Tunable微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案讀取吸光度。圖82顯示ELISA結果，並確證抗原結合蛋白BPC1809以可比得上抗IL-4單克隆 抗體帕考珠單抗的水平結合人IL-4。顯示陰性對照抗體(Sigma 15154)不結合IL-4。圖84顯示ELISA結果，並確證抗原結合蛋白BPC1816以可比得上抗IL_4單克隆 抗體帕考珠單抗的水平結合人IL-4。顯示陰性對照抗體(Sigma 15154)不結合IL-4。16. 6 :RNA 酶 A 結合 ELISA將業已用PBS稀釋的 50uL 的 lug/mL RNA酶A(Qiagen，19101)加入到 96 孔Costar 板的各孔中。讓板在室溫孵育2小時，然後用PBST洗滌板，之後將200uL的4% BSA/PBS的 封閉液加入到各孔中。讓板孵育1小時，並在加入樣品前洗滌。以2ug/mL的濃度將純化的 抗體和抗原結合蛋白BPC1809加入到第1列的孔中，然後以1 2用封閉液對板進行系列 稀釋。讓板孵育1小時然後洗滌。加入50yL用封閉液以1 1000稀釋的山羊抗-人κ 輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(Sigma，A7164)。讓板孵育1小時然後洗滌。將50 μ 1的 OPD加入到各孔中，在15-30分鐘後用3Μ硫酸終止反應。在490nm處用VersaMax Tunable 微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案讀取吸光度。圖83顯示RNA酶A結合ELISA的結果，並確證純化的人單克隆抗體_駱駝VHH雙 特異性抗體BPC1809顯示結合RNA酶A。與此相反，顯示IL-4單克隆抗體帕考珠單抗和陰 性對照(sigma 15154) 二者都不結合RNA酶A。16. 7 :HEL 結合 ELISA用5 μ g/ml的HEL (雞蛋溶菌酶，Sigma L6876)的PBS溶液包被96孔高結合板， 並在4°C儲存過夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L 封閉液(5% BSA/DPBS緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後進行另一 個洗滌步驟。用封閉液在板中對純化的抗體進行連續稀釋。1小時孵育後，洗滌板。用封 閉液將山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(Sigma，A7164)稀釋到lyg/mL，將 50 μ L加入到各孔中。讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50μ1的OPD (鄰苯二胺 二鹽酸鹽)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸終止反 應。在490nm處用VersaMax Tunable微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案 讀取吸光度。圖85顯示HEL結合ELISA的結果，並確證純化的人單克隆抗體-NAR V雙特異性 抗體BPC1816結合HEL。與此相反，顯示IL-4單克隆抗體帕考珠單抗不結合HEL。實施例1717. 1包含由adnectin組成的表位結合結構域的抗原結合蛋白的設計與構建CTOl adnectin對VEGFR2(進一步資料參見W02005/056764)具有特異性。將CTOl adnectin蛋白序列逆翻譯為DNA並優化密碼子。包括N-末端的BamHI位點和C-末端的 EcoRl位點以便於克隆。用基於PCR的策略和重疊寡核苷酸從頭構建編碼最終CTOl DNA序列的DNA片段。 將PCR產物克隆到含有HOLO重鏈(抗-hIGF-lR抗體)的哺乳動物表達載體，使得經由GS 接頭或TVAAPSGS接頭將adnectin融合到重鏈的C-末端。IGF-1R-VEGFR2雙特異性的重鏈和輕鏈的蛋白序列示於SEQ ID NO 124、113和133中。將編碼抗-TNF-αadnectin(進一步資料參見 US20080139791)的另一 adnectin 蛋白序列逆翻譯為DNA，優化密碼子，並在用前述重疊寡核苷酸PCR方法構建之前修飾為包 括末端BamHI和EcoRl位點。將PCR產物克隆到含有編碼帕考珠單抗(抗-IL-4抗體)重鏈 的DNA的哺乳動物表達載體，使得經由GS接頭或TVAAPSGS接頭將編碼抗-TNF- α adnectin 的DNA融合到重鏈C-末端。IL-4-TNF-a雙特異性重鏈和輕鏈的蛋白序列示於SEQ ID NO: 146、147 和 15 中。還設計了利用在IL-13單克隆抗體重鏈C-末端處融合的TNF-α特異性adnectin 的抗原結合蛋白。蛋白序列實例示於SEQ ID 134、13和135中。另外，業已設計基於在 抗-EGFR抗體愛必妥和IMC-11F8的重鏈或輕鏈的C-末端或N-末端處融合CTOl的雙特異 性分子。已設計的蛋白序列的實例示於SEQ ID N0:136-145中。在這些實例序列中，很多已被構建。已構建了編碼SEQ ID NO 136(融合到愛必妥 重鏈的C-末端上的CT01)、SEQ ID NO 144 (融合到愛必妥重鏈N-末端上的CT01)和SEQ ID NO 138 (融合到愛必妥輕鏈C-末端上的CT01)的DNA序列。已用基於PCR的克隆方法 構建所有這三種序列，並將其克隆到哺乳動物表達載體。下表22是已被設計和/或構建的 抗原結合蛋白的概述。表 22
99 用293fectin(Invitrogen，12347019)將編碼 BPC1801、BPC1802、BPC1822、 BPC1823、BPC1812、BPC1813和BPC1818的重鏈和輕鍊表達質粒瞬時共轉染到HEK 293-6E 細胞。在同一天或第二天將蛋白腖養料加入到各孔細胞培養物中，在初始轉染約2-6天後 收穫上清液物質。在某些情況下，在結合測定中用上清液材料作為測試物。在其它情況下， 用蛋白A柱純化抗原結合蛋白，然後在結合測定中進行檢測。17. 2 :rhIGF-lR 結合 ELISA用1 μ g/ml抗-his-標籤抗體(Abcam，ab9108)的PBS溶液包被96孔高結合板， 並在4°C儲存過夜。用含0. 05% Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L封 閉液(5% BSA/DPBS緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後進行另一個 洗滌步驟。將0. 4yg/mL的rhIGF-lR(R&D Systems)以每孔50 μ L加入到各孔中。讓板在 室溫孵育1小時，然後洗滌。用封閉液在板中對純化的抗原結合蛋白質/抗體進行連續稀 釋。1小時孵育後，洗滌板。用封閉液將山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體稀 釋到1 μ g/mL，將50 μ L加入到各孔中。讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50 μ 1 的OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過加入25 μ L 的3Μ硫酸終止反應。在490nm處用VersaMax Tunable微板讀數器(Molecular Devices) 用鹼性終點方案讀取吸光度。圖86顯示IGF-IR結合ELISA的結果，並確證純化的人單克隆抗體-adnectin雙 特異性抗體(BPC1801和BPC 1802)以可比得上抗-IGF-IR單克隆抗體HOLO的水平結合重 組人IGF-IR0顯示陰性對照抗體(Sigma 15154)不結合IGF-IR017. 3 :VEGFR2 結合 ELISA用0. 4 μ g/ml的VEGFR2 (R&D Systems)包被96孔高結合板，並在+4°C孵育過夜。 用含0. 05 %的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L封閉液(5 % BSA/ DPBS緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後進行另一個洗滌步驟。用封閉液在板中對上清液或經純化的抗體進行連續稀釋。1小時孵育後，洗滌板。用封閉液將 山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體稀釋到1 μ g/mL，將50 μ L加入到各孔中。 讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50μ 1的OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast 底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸終止反應。在490nm處用 VersaMaxTunable微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案讀取吸光度。圖87顯示VEGFR2結合ELISA的結果，並確證純化的人單克隆抗體-adnectin雙 特異性抗體(BPC1801和BPC1802)結合重組人VEGFR2。與此相反，顯示抗-IGF-IR單克隆 抗體HOLO不結合人VEGFR2。圖172顯示VEGFR2結合ELISA的結果，並確證抗原結合蛋白BPC1818和BPC1813 結合重組人VEGFR2。與此相反，顯示愛必妥不結合人VEGFR2。對於抗原結合蛋白BPC1813 和BPC1818而言，上清液中的抗體的量不能被定量，因此圖172提供的數據表示為淨上清液 材料稀釋倍數。對於愛必妥而言，在測定中以2 μ g/ml的起始濃度使用純化的材料，該起始 濃度相當於圖172中的稀釋倍數1。圖175顯示VEGFR2結合ELISA的結果，並確證抗原結合蛋白BPC1812結合重組人 VEGFR2。與此相反，顯示愛必妥和陰性對照Sigma IgG 15154抗體不結合人VEGFR2。對於 抗原結合蛋白BPC1812而言，上清液中的抗體的量不能被定量，因此圖175提供的數據表示 為淨上清液材料稀釋倍數。對於愛必妥和Sigma IgG 15154而言，在測定中以2 μ g/ml的 起始濃度使用純化的材料，該起始濃度相當於圖175中的稀釋倍數1。17. 4 :IL~4 結合 ELISA用5μ g/ml人IL_4的PBS溶液包被96孔高結合板，並在4°C儲存過夜。用含 0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L封閉液(5% BSA/DPBS緩 衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後進行另一個洗滌步驟。用封閉液 在板中對上清液或純化的抗體/抗原結合蛋白進行連續稀釋。1小時孵育後，洗滌板。用 封閉液將山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體稀釋到1 μ g/mL，將50 μ L加入到 各孔中。讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50μ1的OPD(鄰苯二胺二鹽酸鹽) SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸終止反應。在490nm 處用VersaMaxTunable微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案讀取吸光度。圖88顯示IL-4結合ELISA的結果，並確證人單克隆抗體-adnectin雙特異性抗 體(BPC1823和BPC 1822)結合重組人IL-4。顯示陽性對照抗-IL-4單克隆抗體帕考珠單 抗結合IL-4，顯示陰性對照抗體(SigmaI5154)不結合IL-4。在本實驗中重複HEK轉染以獲得具有較高抗體濃度的上清液材料。圖88b顯示通 過ELISA測定的該較高濃度的上清液人單克隆抗體-adnectin雙特異性抗體(BPC1823)與 人IL-4的結合。對於抗原結合蛋白BPC1823和BPC1822而言，上清液中的抗體的量不能被定量，因 此圖88和88b提供的數據表示為淨上清液材料稀釋倍數。對於帕考珠單抗和陰性對照抗 體(Sigma 15154)而言，在測定中以1 μ g/ml的起始濃度使用純化的材料，該起始濃度相當 於圖88和88b中的稀釋倍數1。17. 5:TNF-α 結合 ELISA用0. 4 μ g/ml 重組人 TNF α (RnD Systems 210-TA-050/CF)的 PBS 溶液包被 96 孔高結合板，並在4°C儲存過夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。 將200 μ L封閉液(5% BSA/DPBS緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然 後進行另一個洗滌步驟。用封閉液在板中對上清液或純化的抗體進行連續稀釋。1小時孵 育後，洗滌板。用封閉液將山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(Sigma，A7164) 稀釋到1 μ g/mL，將50 μ L加入到各孔中。讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50 μ 1 的OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分鐘後通過加入25 μ L 的3Μ硫酸終止反應。在490nm處用VersaMax Tunable微板讀數器(MolecularDeviees) 用鹼性終點方案讀取吸光度。圖89顯示TNF- α結合ELISA的結果，並確證人單克隆抗體-adneetin雙特異性 抗體(BPC1823和BPC1822)結合重組人TNF- α。與此相反，顯示抗-IL-4單克隆抗體帕考 珠單抗不結合重組人TNF- α。在本實驗中重複HEK轉染以獲得具有較高抗體濃度的上清液材料。圖89b顯示通 過ELISA測定的該較高濃度的上清液人單克隆抗體-adneetin雙特異性抗體(BPC1823)與 重組人TNF α的結合。顯示IgG對照不結合重組人TNF- α。對於抗原結合蛋白BPC1822和BPC1823而言，上清液中的抗體的量不能被定量，因 此圖89和89b提供的數據表示為淨上清液材料稀釋倍數。對於帕考珠單抗而言，在測定中 以1 μ g/ml的起始濃度使用純化的材料，該起始濃度相當於圖89和89b中的稀釋倍數1。17. 6 :EGFR 結合 ELISA用0. 67 μ g/ml重組人EGFR蛋白的PBS溶液包被96孔高結合板，並在4°C儲存過 夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水洗滌板2次。將200 μ L封閉液(5% BSA/ DPBS緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後進行另一個洗滌步驟。用 封閉液在板中對抗原結合蛋白質/抗體進行連續稀釋。1小時孵育後，洗滌板。用封閉液將 山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(Sigma，A7164)稀釋到1 μ g/mL，將50 μ L 加入到各孔中。讓板孵育1小時。在另一個洗滌步驟後，將50μ1的OPD (鄰苯二胺二鹽酸 鹽)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，25分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸終止反應。在 490nm處用VersaMax Tunable微板讀數器(Molecular Devices)用鹼性終點方案讀取吸光 度。圖171顯示EGFR結合ELISA的結果，並確證雙特異性抗體BPC1818和BPC1813結 合重組人EGFR。還顯示陽性對照抗體愛必妥結合重組人EGFR。與此相反，顯示Sigma IgG 15154不結合重組人EGFR。對於雙特異性抗體BPC1813和BPC1818而言，上清液中的抗體 的量不能被定量，因此圖171提供的數據表示為淨上清液材料稀釋倍數。對於愛必妥和陰 性對照抗體(Sigma 15154)而言，在測定中分別以2 μ g/ml和1 μ g/ml的起始濃度使用純 化的材料，該起始濃度相當於圖171中的稀釋倍數1。圖176顯示EGFR結合ELISA的結果，並確證雙特異性抗體BPC1812結合重組人 EGFR0還顯示陽性對照抗體愛必妥結合重組人EGFR。與此相反，顯示Sigma IgG 15154不 結合重組人EGFR。對於雙特異性抗體BPC1812而言，上清液中的抗體的量不能被定量，因 此圖176提供的數據表示為淨上清液材料稀釋倍數。對於愛必妥和陰性對照抗體(Sigma 15154)而言，在測定中分別以2 μ g/ml和1 μ g/m的起始濃度使用純化的材料，該起始濃度 相當於圖176中的稀釋倍數1。
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實施例181；中「G和S」氨某酸殘某R經被除去的IL-13/IL-4mAbdAb的結合活t牛數據18. 1.構津 mAbdAb構建了其中G和S胺基酸殘基(緊挨接頭序列)被除去的mAbdAb。用標準分子生 物學技術構建了表達質粒。這些mAbdAb如表23所述。將它們克隆，然後在HEK293-6E細 胞、CHOKl細胞或CHOEla細胞的一種或多種中表達，將它們純化(分別如實施例1、1. 3和 1. 5所述)，並在多種IL-13和IL-4活性測定中進行分析。表 23 18. 2.表汰和純化通過SEC和SDS PAGE純化並分析這些mAbdAb。製備多個純化的製備物，示於圖 90-98中的SEC和SDS PAGE數據代表這些製備物。18. 3.在盲接結合ELISA中結合人IL_4在直接結合ELISA中如方法2所述檢測純化的除去GS的PascoH-474和 除去GS的PascoH-TVAAPS-474對人IL-4的結合(在該測定中還檢測PascoH-474、 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-ELQLE-474 的結合)。完成這些分子的 多種ELISA測定，示於圖99中的數據代表這些測定。除去GS 的 PascoH-474 和除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 二者都結合人 IL-4。在
104該測定中包括單獨的純化的抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為結合IL-4的陽性對照。包 括純化的抗_人IL13mAb作為IL-4結合的陰性對照。除去GS的PascoH-474和除去GS的 PascoH-TVAAPS-474的結合活性與單獨的純化的抗_IL4mAb (帕考珠單抗)、PascoH-474、 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-ELQLE-474 相似。18. 4.在盲接結合ELISA中結合人IL-13在直接結合ELISA中如方法1所述檢測純化的除去GS的PascoH-474和除去GS 的PascoH-TVAAPS-474對人IL-13的結合(在該測定中還檢測如實施例19所述產生的分 子PascoH-616和PascoH-TVAAPS_616的結合)。完成這些分子的多種ELISA測定，示於圖 100中的數據代表所有測定。除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616全部都結合人IL-13。在該測定中包括單獨的純化的抗-人IL4mAb (帕 考珠單抗)作為IL-13結合的陰性對照。包括純化的抗-人IL13mAb作為IL-13結合的陽 性對照。注意在該測定中沒有檢測單獨的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因為該dAb不能 被第二檢測抗體檢測；取而代之的是，在該測定中使用抗-人IL13mAb作為陽性對照以證明 IL-13結合。18. 5.在首梓結合ELISA中結合猻猴IL-13還在直接結合ELISA (如方法17所述)中檢測純化的除去GS的PascoH-474、除 去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS_616mAbdAb 對獼猴 IL-13 的結 合。完成了這些分子的多種ELISA測定，示於圖101中的數據代表所有測定。除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616全部都結合獼猴IL-13。在該測定中包括單獨的純化的抗-人 IL4mAb (帕考珠單抗)作為IL-13結合的陰性對照。包括純化的抗-人IL13mAb作為獼 猴IL-13結合的陽性對照。注意在該測定中沒有檢測單獨的抗-IL-13dAb(D0M10-53-474 和D0M10-53-616)，因為該dAb不能被第二檢測抗體檢測；取而代之的是，在該測定中使用 抗-人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。18. 6.結合人 IL-4 和人 IL-13 的 Biacore 分析用BIAcore TlOO在25°C (如方法4和5所述)檢測純化的mAbdAb對人IL-4和 人IL-13的結合。這些數據示於表24中。在實驗1中，mAbdAb捕獲水平達到大約600的相對響應單位，評估了 6個IL-13和 IL-4濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、InM和0. 25nM)。在實驗1中對於mAb僅評估一個 IL-13(256nM)和 IL_4(256nM)濃度曲線。在實驗2中，達到大約400相對響應單位的mAbdAb捕獲水平，評估了 6個IL_4濃 度曲線(64nM、16nM、4nM、lnM、0. 25nM 禾口 0. 0625nM)和 6 個 IL-13 濃度曲線(256nM、64nM、 16nM、4nM、lnM和0. 25nM)。在實驗2中，對於抗-IL13mAb僅評估一個IL-13濃度曲線 (256nM)，對於帕考珠單抗，評估5個IL-4濃度曲線(64nM、16nM、4nM、InM和0. 25nM)。在實驗3中，達到大約700相對響應單位的mAbdAb或mAb捕獲水平，評估了 6個 IL-4 濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、lnM 和 0. 25nM)和 6個 IL-13 濃度曲線(256nM、 64nM、16nM、4nM、InM 和 0. 25nM)。表 24
在實驗1和2中，除去GS的PascoH-474和除去GS的PascoH-TVAAPS-474 二者都 以相似的結合親和力結合IL-4，該結合親和力與單獨的抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)的結 合親和力接近相等。除去GS的PascoH-474和除去GS的PascoH-TVAAPS-474還以相似的 結合親和力結合IL-13。注意在該測定中沒有檢測單獨的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因 為不能將該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上；取而代之的是，在該測定中 使用抗_人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。在實驗3中，除去GS的586H-210和除去GS的586H-TVAAPS-210 二者都以相似的 結合親和力結合IL-13，該結合親和力與抗-人IL13mAb的結合親和力接近相等。除去GS 的586H-210和除去GS的586H-TVAAPS-210也極為緊密地結合IL-4，然而由於正解離作用 和BIAcore 技術的靈敏度水平(*)，本方法不能測定其結合親和力。注意在該測定中沒有 檢測單獨的抗-IL-4dAb (D0M9-112-210)，因為不能將該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包 被的CM5晶片上；取而代之的是，在該測定中使用抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對 照以證明IL-4結合。18. 7.結合獼猴IL-4和獼猴IL-13的Biacore分析用BIAcore TlOO在25°C (如方法24和23所述)檢測純化的mAbdAb對獼猴 IL-4和獼猴IL-13的結合。這些數據示於表25中。mAbdAb捕獲水平達到大約600相對響 應單位，評估了 6個IL-13濃度曲線(256、64、16、4、1、0. 25nM)和5個IL-4濃度曲線(64、 16、4、1、0. 25nM)。表 25 除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、除去第二個 GS 的 PascoH-ASTKGPT-474、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474 和 PascoH-ASTKG-474 全部都以相 似結合親和力結合獼猴IL-4。除去GS的PascoH-474、除去GS的PascoH-TVAAPS-474、除去 第二個 GS 的 PascoH-ASTKGPT-474、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474 和 PascoH-ASTKG-474 全部也都以相似結合親和力結合IL-13。還用BIAcore TlOO於25°C (如方法24和23所述)檢測純化的mAbdAb對獼猴 IL-4和獼猴IL-13的結合。這些數據示於表26中。mAbdAb捕獲水平達到大約600相對響 應單位，評估了 6個IL13和6個IL-4濃度曲線(256、64、16、4、1和0. 25nM)。表 26 除去GS的586H-210和除去GS的586H-TVAAPS-210 二者都以相似的結合親和力 結合獼猴IL-13 ；這些mAbdAb似乎結合IL13比結合抗-人IL13mAb更有效，然而在該mAb 情況中，僅完成一個濃度曲線，這固然不如全濃度範圍評估精確。除去GS的586H-210和 除去GS的586H-TVAAPS-210也極為緊密地結合IL-4，然而由於正解離作用和BIAcore 技術的靈敏度水平(*)，本方法不能測定該結合親和力。注意在該測定中沒有檢測單獨的 抗-IL-4dAb (D0M9-112-210)，因為不能將該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯 片上；取而代之的是，在該測定中使用抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)作為陽性對照以證明 IL-4結合。18. 8. IL-4結合mAb dAb對隨後的IL-13結合動力學的影響及反之的Biacore分 析和IL-13結合mAbdAb對隨後的IL-4結合動力學的影Π向及反少的Biacore分析也將IL-13和IL-4BIAcore 結合測定用於研究IL-4結合除去GS的PascoH-474 對隨後的IL-13結合動力學的影響及反之；和IL-13結合586H-TVAAPS-210對隨後的IL-4 結合動力學後影響及反之。用BIAcore TlOO設備於25°C用抗-人IgG捕獲mAbdAb (或陽 性對照mAb)進行分析。簡言之，按照製造商建議通過伯胺偶聯將抗_人IgG偶聯到CM5芯 片上。然後將mAbdAb構建體(或陽性對照mAb)捕獲到該表面(以大約250-750RU)上，以 256nM使第一分析物(人IL-13或人IL-4)通過4分鐘。然後以256nM、64nM、16nM、4nM、InM 和0. 25nM的濃度使第二分析物(分別為人IL-4或人IL-13)通過，並且為了雙重參考，讓緩衝注射液通過捕獲抗體或mAbdAb表面。用評估軟體在設備中分析(擬合成1 1結合 的模型)數據。然後用3M氯化鎂再生該表面。將來自這些實驗的數據示於表27和28中。
表 27 不管人IL-4是否結合除去GS的PascoH-474，該分子對人IL-13的結合親和力都 相似。另外，不管人IL-4是否結合586H-TVAAPS-210，該分子對人IL-13的結合親和力都相 似，並所述結合親和力也類似於抗_IL13mAb對人IL-13的結合親和力。獲得的IL-4結合除去GS的PascoH-474和586H-TVAAPS-210的解離速率(kd)極 低，並且超出BIAcore TlOO的靈敏度範圍，因此不能用作結合親和力(數據未顯示)的 精確測定。然而，數據確實表明所測的所有構建體對人IL-4結合極為緊密。因此，不管人 IL-13是否結合除去GS的PascoH-474，該分子對人IL-4的結合親和力都極為緊密。另外， 不管人IL-13是否結合586H-TVAAPS-210，該分子對人IL-4的結合親和力都極為緊密。18. 9. mAbdAb 效價通過ELISA如方法19所述檢測mAbdAb對人IL-4結合人IL-4Rα的抑制。在 一個實驗中檢測示於表28的所有分子，然而，將數據繪製在兩個圖中以區分曲線圖 (586H-TVAAPS-210進行2次，這在表25中被標為樣品1和樣品2)。這些數據示於圖102 和 103.除去GS的PascoH-474與帕考珠單抗相似地抑制人IL-4與人IL4R α的結合。除去 GS 的 586Η-210、除去 GS 的 586H-TVAAPS-210、586H-TVAAPS-210、586H-210、586H-G4S_210 和586H-ASTKG-210全部都與D0M9-112-210相似地抑制人IL-4與人IL4Ra的結合。包括 帕考珠單抗和D0M9-112-210作為抑制IL-4結合IL4Ra的陽性對照。包括D0M10-53-474 和同種型-匹配的mAb (對不相關抗原具有特異性)作為抑制IL-4結合IL4Rci的陰性對 照。還用這些數據來測定各種分子的IC5tl值。IC5tl值是能夠抑制人IL-4與人IL4Ra 結合到50 %的mAbdAb或mAb或dAb的濃度。IC5tl值示於表28中。
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表 28 這些數據確證除去GS的PascoH-474的表現與帕考珠單抗相似，所有 586H-2IOmAbdAb 「家族成員」的表現與 D0M9-112_210dAb 相似。18. 10.在TF-I細胞生物測定中mAbdAb對人和獼猴IL-13的中和在TF-I細胞生物測定(分別如方法8和方法20所述)中檢測多種純化的mAbdAb 對人和獼猴IL-13的中和。在這些測定中每種分子檢測1-9次，沒有顯示所有圖表，但圖 104和105分別為顯示對人IL-13和獼猴IL-13的中和數據的代表性圖表。在本生物測定中包括 D0M10-53-474作為中和人或獼猴IL-13的陽性對照。在本生物測定中還包括對不相關抗原 具有特異性的dAb (陰性對照dAb)作為中和人或獼猴IL-13的陰性對照。在TF-I 細胞生物測定中，除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 和除去第二個 GS 的 PascoH-ASTKG-474 以及 PascoH-616、PascoH-TVAAPS-616 和 D0M10-53-616(它們如實施例19所述)完全中和人和獼猴IL-13 二者的生物活性。18. 11.在TF-I細胞生物測定中mAbdAb對人和獼猴IL-4的中和在TF-I細胞生物測定(分別如方法9和方法21所述)中檢測多種純化的mAbdAb 對人和獼猴IL-4的中和。在這些測定中每種分子檢測2次，沒有顯示所有圖表，但圖106和 107分別為顯示人IL-4和獼猴IL-4的中和數據的代表性圖表(來自數據集)。在本生物測定中包括抗_IL13mAb作為中和人或獼猴IL-4的陰性對照，包括帕考珠單抗作為中和人或 獼猴IL-4的陽性對照。另外，在這些生物測定中還檢測PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、 PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-G4S_474 對人和獼猴 IL-4 的中和。在TF-I細胞生物測定中，除去GS的PascoH-474和除去GS的PascoH-TVAAPS-474 完全中和人和獼猴IL-4 二者的生物活性。另外，在TF-I細胞生物測定中，PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-G4S_474 還完全中和人 IL-4 的生物活 性。基於從多種不同的實驗獲得的數據得出ND5tl值。ND5tl值是能夠中和IL-13或IL_4 的生物活性到50%的mAbdAb或mAb或dAb的濃度。平均ND5tl值、標準偏差(SD)和所測次 數(η)示於表29中。表 29 在 TF-I 細胞生物測定中，除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474和除去第二個GS的PascoH-ASTKGPT-474都完全中和人和獼猴IL-13的生物活性。 另夕卜，除去GS的PascoH-474、除去GS的PascoH-TVAAPS-474和除去第二個GS的 PascoH-ASTKGPT-474對人IL-13的中和效價(ND5tl值)都相似，並且在單獨的純化的 抗-IL13 dAb (D0M10-53-474)的 ND50 值的 1 倍內。在TF-I細胞生物測定中，除去GS的PascoH-474和除去GS的PascoH-TVAAPS-474 二者都完全中和人和獼猴IL-4的生物活性。另外，除去GS的PascoH-474和除去GS的 PascoH-TVAAPS-474對人IL-13和獼猴IL-13的中和效價(ND5tl值)都相似，並且在帕考珠 單抗的ND5tl值的1倍內。18. 12. mAbdAb抑制人IL-13與人IL_13Ra 2的結合的能力通過ELISA如方法22所述檢測表30所列分子對人IL-13與人IL_13Ra 2結合的 抑制。在一個實驗中檢測所有分子。數據示於圖108中。所測的所有mAbdAb抑制人IL-13與人IL13Ra 2的結合。抑制水平與 D0M10-53-474、D0M10-53-616和抗_IL13mAb的抑制水平相似。包括帕考珠單抗和陰性對 照dAb (對不相關抗原具有特異性)作為抑制IL-13結合IL13Rci 2的陰性對照。也用這些數據測定各種分子的IC5tl值。IC5tl值為能夠抑制人IL-13與人IL13Ra 2 的結合到50 %的mAbdAb或mAb或dAb的濃度。IC5tl值示於表30中。表 30 這些數據確證除去GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH_616 和 PascoH-TVAAPS-616 的表現與 D0M10-53-474、D0M10-53-616 和抗-IL13mAb 相似。實施例19含有抗-IL13D0M10-53-616dAb的 mAbdAb19. 1.含有抗-IL13D0M10-53-616dAb 的 mAbdAb 的構津通過位點定向誘變如實施例1所述從現有載體克隆表31中所述的兩種 抗-IL4mAb-抗 _IL13dAb。
表 31 19. 2.含有抗-IL13D0M10-53-616dAb 的 mAbdAb 的表汰和純化如實施例1. 3所述在HEK293-6E細胞和CHOEla細胞中表達這些mAbdAb。通過SEC 和 SDS PAGE 純化並分析 mAbdAb。製備了 PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616mAbdAb的多個純化的製備物，示於圖109 (關於PascoH-616的SEC曲 線)、110(關於 PascoH-TVAAPSJl6 的 SEC 曲線)、111 (關於 PascoH_616 的 SDS PAGE)和 112(關於？3800!1-1744 5-616的503 PAGE)中的SEC和SDS PAGE數據代表了這些製備物。19. 3.在盲接結合ELISA中mAbdAb與人IL-13的結合在直接結合ELISA (如方法1所述)中檢測PascoH-616和PascoH-TVAAPS-616純 化的mAb dAb對人IL-13的結合。這些數據示於圖113中。純化的PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616 二者都結合人 IL-13。在該測定 中包括單獨的純化的抗-人IL4mAb(帕考珠單抗)作為IL-13結合的陰性對照。包括 純化的抗-人IL13mAb作為IL-13結合的陽性對照。注意在該測定中沒有檢測單獨的 抗-IL-13dAb (D0M10-53-616)，因為該dAb不能被第二檢測抗體檢測；取而代之的是，在該 測定中使用抗_人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。19.4.對結合人IL-4和人IL-13的Biacore分析用BIAcore TlOO在25°C (如方法4和5所述)檢測純化的mAbdAb對人IL-4和 人IL-13的結合。這些數據示於表32中。在實驗1中，mAbdAb捕獲水平達到大約600相對響應單位，評估了 6個IL-13和 IL-4濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、InM和0. 25nM)。在實驗1中對於mAb僅評估一個 IL-13(256nM)和 IL_4(256nM)濃度曲線。在實驗2中，mAbdAb捕獲水平達到大約400相對響應單位，評估了 6個IL_4 (64nM、 16ηΜ、4ηΜ、1ηΜ、0· 25ηΜ 和 0· 0625ηΜ)和 6 個 IL-13 濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、InM 和 0. 25nM)。在實驗2中，對於抗_IL13mAb僅評估一個IL-13濃度曲線(256nM)，對於帕考珠 單抗，評估 5 個 IL-4 濃度曲線(64nM、16nM、4nM、lnM 和 0. 25nM)。表 32 PascoH-616和PascoH-TVAAPS-616 二者都以相似的結合親和力結合IL-4，該 結合親和力與單獨的抗-人IL4mAb(帕考珠單抗)的結合親和力相似。PascoH-616 和PascoH-TVAAPS-616 二者都結合IL-13。注意在該測定中沒有檢測單獨的 抗-IL-13dAb (D0M10-53-616)，因為不能將該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯 片上；取而代之的是，在該測定中使用抗_人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。19. 5.對結合稱猴 IL-13 的 Biacore也用BIAcore TlOO在25°C (如方法30所述)檢測純化的mAbdAb對獼猴IL-13 的結合。這些數據示於表33中。mAbdAb捕獲水平達到大約400相對響應單位，評估了 6個 IL-13濃度曲線(256、64、16,4,1和0. 25nM)。對於抗-IL13mAb僅有一個IL-13濃度曲線 (256nM)。表 33 PascoH-616和PascoH-TVAAPS-616 二者都以相似的結合親和力結合獼猴IL-13。 注意在該測定中沒有檢測單獨的抗_IL-13dAb (D0M10-53-616)，因為不能將該dAb捕獲到 蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上；取而代之的是，在該測定中使用抗-人IL13mAb作 為陽性對照以證明IL-13結合。19. 6.在TF-I細胞牛物測定中mAbdAb對人和獼猴IL-13的中和在TF-I細胞生物測定(分別如方法8和方法20所述)中檢測純化的mAbdAb對人
114IL-13和獼猴IL-13的中和。在每一測定中對這些分子檢測3次，圖114為顯示對人IL-13 的中和數據的代表性圖表。圖114a為顯示對獼猴IL-13的中和數據的代表性圖表。在本 生物測定中包括D0M10-53-616作為中和IL-13的陽性對照。在本生物測定中還包括對不 相關抗原具有特異性的dAb (陰性對照dAb)作為中和IL-13的陰性對照。平均ND5tl值、標準偏差(SD)和所測次數(η)示於表34中。表 34 在TF-I細胞生物測定中，PascoH-616和PascoH-TVAAPS-616 二者以及另外的 mAbdAb (除去GS的PascoH-TVAAPS_474和除去GS的PascoH_474)完全中和人和獼猴IL-13 的生物活性。另外，PascoH_616和 PascoH-TVAAPS_6l6 對人 IL-13 的中和效價(ND5tl 值)相似， 並且在單獨的純化的抗_IL13dAb (D0M10-53-616)的ND5tl值的2倍內。還通過ELISA 如方法 22 所述檢測 PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616 對人 IL-13 結合人IL-13Ra 2的抑制。這些數據提供在實施例18. 12中。實施例20在人全血磷-STAT6生物測定中mAbdAb中和人IL-13或IL_4的能力如方法16所述在人全血磷-STAT6生物測定中檢測mAbdAb中和人IL-13或IL_4 的能力。測定了2 種 mAbdAb 構建體(純化的抗-IL13mAb-抗-IL4dAb、586H-TVAAPS_210 ； 和純化的抗-IL4mAb-抗-IL13dAb、除去GS的PascoH_474)的IL-4或IL-13中和效價(即 抑制IL-4或IL-13生物活性)。在該測定中包括純化的抗_人IL-4mAb (帕考珠單抗)和純 化的抗_IL4dAb (D0M9-112-210)作為中和rhIL_4的陽性對照。包括純化的抗-人IL_13mAb 和純化的抗-IL13 dAb (D0M10-53-474)作為中和rhIL_13的陽性對照。包括與dAb混合的同種型匹配的mAb (二者都對不相關抗原具有特異性)作為中和rhIL-4或rhIL-13的陰性 對照。用來自不同供體的血對每種分子檢測至少2次。圖115-124為顯示代表性數據的圖表。純化的mAbdAb完全中和rhIL-13和rhIL_4的生物活性。如方法16所述，將測試分子中和rhIL-13或rhIL_4生物活性的能力表示為中和 2ng/mL人IL-4或人IL-13到50%所需的分子(例如mAbdAb)的濃度(IC50)。這些數據示 於表35中。出示了關於每一種分子的來自所有供體的合併平均IC5tl連同標準偏差。表 35 IC50 值比較表明 586-TVMPS-210 與抗 _IL13mAb 和 D0M9-112-210 相似地抑制 IL-13 和IL-4誘導的pSTAT-6 (分別在IL-13和IL-4全血測定中)。IC5tl數據的比較還表明除去GS 的PascoH-474與D0M10-53-474和帕考珠單抗相似地抑制IL-13和IL-4誘導的pSTAT_6 (分 別在IL-13和IL-4全血測定中)。對照mAb顯示在所有供體中在高達所測的最大濃度661nM 下無抑制，對照dAb顯示在所有供體中在高達所測的最大濃度2291nM下不中和。實施例21雙重靶向的抗-IL4/抗_IL13mAbdAb的大鼠PK研究在大鼠PK 研究(如表 35. 1 所概述)中評估 PascoH-G4S_474、PascoL-G4S_474、 586H-TVAAPS-210和586H-TVAAPS-154。簡言之，以2mg/kg的目標劑量水平將mAbdAb單次 靜脈內(i/v)給予雄性Sprague-Dawley大鼠(體重大約200克-220克)。在分配的時間 點(0小時到312小時)抽取1001血液樣品，處理為血漿。在人IgG檢測測定和/或IL-13配體結合測定和/或IL-4配體結合測定中，評估大鼠血漿樣品中測試分子的存在情況。另 外，還評估血漿中帕考珠單抗(在大鼠中)的PK曲線在該情況下，在人IgG檢測測定和 IL-4配體結合測定中評估帕考珠單抗在大鼠血漿樣品中的存在情況。在第一個研究中，將帕考珠單抗給予4隻大鼠。在第二個研究中，有4個治療組 (2mg/kg PascoH-G4S-474、2mg/kg PascoL-G4S_474、2mg/kg 586H-TVAAPS-210 禾Π 2mg/kg 586H-TVAAPS-154)，每組 4 只大鼠。由血漿濃度-時間曲線數據(未顯示)得出PK參數(示於表35. 1)。注意在這 些測定中不止一次分析某些血漿樣品，並且僅從這些數據集之一得出表35. 1中的PK參數。 還要注意對於個別的動物劑量，沒有將PK參數標準化，取而代之的是假定為2mg/kg的標稱 劑量。注意在對PaSCOH-G4S-474的IgG PK測定中某些遇到技術困難，因此濃度可能估計 過高。另外，在某些情況下進行兩次IgG血漿濃度-時間曲線分析(在表35. 1中被標註為 分析1和分析2)。僅在分析2中對產生自IL-13和IL-4配體結合PK測定的血漿濃度-時 間曲線數據進行分析。對PascoL-G4S-474和586H-TVAAPS-154的IL-13和IL-4配體結合 測定所產生的血漿濃度_時間曲線數據不用於獲得這些分子的PK參數。表 35. 1 在對PascoH-G4S_474的IL-13和IL_4測定中產生的血漿濃度-時間曲線數據 (及隨後獲得的PK參數)趨向於類似；在對586H-TVAAPS-210的IL_13、IL_4和IgG PK測 定中產生的血漿濃度-時間曲線數據(及隨後獲得的PK參數)也是這種情況。這表明在 整個研究過程中這些mAbdAb在大鼠血漿中是「完好」的。獲得的586H-TVAAPS-154的PK參 數比起任何其它mAbdAb，似乎與獲得的帕考珠單抗的PK參數更相似。實施例22
獼猴PK研究在獼猴中進行PK研究。以lmg/kg的目標劑量水平單次靜脈內給予動物。在分配 的時間點抽取500 μ 1血液樣品，處理為血漿。然後在IL-13配體結合測定、IL-4配體結合 測定和IL-13/IL-4橋聯測定(bridging assay)中，評估獼猴血漿樣品中測試分子的存在 情況。來自這些研究的關於「除去GS 的 PascoH-474」 和 「586H-TVAAPS-210」mAbdAb 的 初始數據與上述大鼠PK數據一致，表明這些分子比mAb更快地從系統循環中清除，但比dAb
清除慢。實施例2323. 1.產牛雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb通過將dAb融合到mAb重鏈的C-末端來構建該雙重靶向的mAbdAb。先前已構建 抗-EGFR mAb重鏈和輕鍊表達盒。用於克隆的限制性位點與由實施例10中所述的限制性 位點(Sail 和 HindIII) 一樣。然後通過PCR(用編碼SalI和HindIII端的引物)擴增編碼抗-VEGF dAb (D0M15-26-593)的DNA，並將其插入到經修飾的3，編碼區，在mAb和dAb之間產生接頭 「STG」 (絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸)。選擇已驗證序列的克隆(SEQ ID NO 164和243分別為輕鏈和重鏈)，按照製造商 方案用Qiagen Mega Prep試劑盒製備大規模DNA製備物。通過用瞬時轉染技術共轉染輕 鏈和重鏈(SEQ ID N0:165和137)在哺乳動物HEK293-6E細胞中表達mAbdAb。23. 2.雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的純化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液純化該雙重靶向的 mAbdAb。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確定純化的樣品的濃度。純 化的樣品(命名為DMS4010)的SDS-PAGE分析(圖128)顯示未經還原的樣品泳動至約 170kDa，而經還原的樣品顯示泳動至約25和約60kDa的兩條帶，其分別對應於輕鏈和融合 dAb的重鏈。為了進行大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上樣到預平衡的 S-20010/300GL柱(連接到HPLC系統)上，用PBS以Iml/分鐘流動。SEC曲線顯示作為對 稱峰流動的單一物質(圖129)。23. 3.雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的效價分別如方法12和13所述測定該分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism 分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。該mAbdAb (命名 為DMS4010)的抗-EGFR效價(圖130)計算為4. 784nM，而對照抗-EGFR mAb給出的EC50 值為4. 214nM。在抗-VEGF受體結合測定(圖131)中，該mAbdAb (命名為DMS4010)的EC50 為 58pM(0. 058nM)，而抗-VEGF 對照 mAb 產生的 EC50 為 214. IpM (0. 2141nM)。綜上所述，測 定數據顯示實施例23的構建體即雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb對兩種抗原都有 效。23. 4.雙重靶向的抗-EGFR/ 抗-VEGF mAbdAb 的 PK在將雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb (命名為DMS4010)給予獼猴後測定 其藥代動力學曲線。以5mg/kg的劑量靜脈內給予該化合物，通過在單獨的ELISA測定中
118結合EGFR和VEGF 二者來測定給藥後多個時間點藥物的血清水平。圖132顯示該測定的 結果，其中將數據與業已產生的mAb西妥昔單抗(cetuximab)(抗-EGFR)和貝伐珠單抗 (bevacizumab)(抗-VEGF)的歷史數據進行比較。進一步的詳細資料示於表36中。表 36 23. 5.產牛備選抗-EGFR/ 抗-VEGF mAbdAb以與上面實施例11. 1所述相似方式構建備選抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb，用STG接 頭將相同的抗-EGFR mAb在重鏈C-末端連接到VEGF dAb上。在該種情況下所用的抗-VEGF dAb為D0M15-10-11。通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈(SEQ ID N0:165和186)在 哺乳動物HEK293-6E細胞中表達該分子，然而，與實施例23. 2所述分子的表達相比，得到顯 著較低的表達水平。當在如實施例23. 3所述的同一 VEGF測定中檢測效價時，發現在該測 定中抑制VEGF結合VEGF受體的水平不可檢測。實施例2424. 1.不用接頭產牛雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb製備在上述實施例23中的mAbdAb的衍生物，其中除去dAb和mAb的CH3結構域 之間的「STG」接頭。SDM用於從編碼重鏈的質粒刪去編碼STG接頭的殘基。選擇已分別驗 證輕鏈和重鏈序列(SEQID N0:243和SEQ ID NO 174)的克隆，用Qiagen Mega Pr印試劑 盒按照製造商方案製備大規模的DNA製備物。通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈(SEQ ID NO 175和137)在哺乳動物HEK293-6E細胞中表達mAbdAb。24. 2.不含接頭的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的純化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液純化該雙重靶向的 mAbdAb。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確定純化的樣品的濃度。純 化的樣品(命名為DMS4011)的SDS-PAGE分析(圖133)顯示未經還原的樣品泳動至約 170kDa，而經還原的樣品顯示泳動至約25和約60kDa的兩條帶，其分別對應於輕鏈和融合 dAb的重鏈。為了進行大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上樣到預平衡的 S-200 10/300GL柱(連接到HPLC系統)上，用PBS以Iml/分鐘流動。SEC曲線顯示作為 對稱峰流動的單一物質(圖134)。24. 3.不含接頭的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的效價分別如方法12和13所述測定該分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism 分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。該mAbdAb (命名 為DMS4011)的抗-EGFR效價(圖135)計算為3. 529nM，而對照抗-EGFR mAb給出的EC50 值為3. 647nM。在抗-VEGF受體結合測定(圖136)中，該mAbdAb (命名為DMS4011)的EC50為 34209pM(0. 3429nM)，而抗-VEGF 對照 mAb 產生的 EC50 為 214. IpM(0. 2141nM)。綜上所 述，測定數據顯示實施例24的構建體即不含接頭的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb 對兩種抗原都有效。實施例2525. 1.產牛含較長接頭的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb製備在上述實施例23中的mAbdAb的衍生物，其中通過將柔性的「GGGGS」基序的 一個或多個重複插入到編碼重鏈的質粒來延長dAb和mAb的CH3結構域之間的接頭。含SEQ ID NO 175中所述的重鏈序列的第一種分子具有該基序的一個重複，因此 具有接頭「STGGGGGS」。含SEQ ID NO 177中所述的重鏈序列的第二種分子具有該基序的兩個重複，因此 具有接頭 「 STGGGGGSGGGGS 」。這兩者都獨立與實施例23 (SEQ ID NO 243)中所用的相同的輕鏈配對。選擇已驗證輕鏈和重鏈序列的克隆，用Qiagen Mega Pr印試劑盒按照製造商方案 製備大規模的DNA製備物。通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈(命名為DMS4023的 SEQ ID NO 176 和 137 ；命名為 DMS4024 的 SEQ ID NO 178 和 137)在哺乳動物 HEK293-6E 細胞中表達mAbdAb。25. 2.含較長接頭的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的純化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液純化這些雙重靶向 的mAbdAb。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確定純化的樣品的濃度。純 化的樣品DMS4023和DMS4024的SDS-PAGE分析(圖137)顯示未經還原的樣品泳動至約 170kDa，而經還原的樣品顯示泳動至約25和約60kDa的兩條帶，其分別對應於輕鏈和融合 dAb的重鏈。為了進行大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上樣到預平衡的 S-200 10/300GL柱(連接到HPLC系統)上，用PBS以Iml/分鐘流動。DMS4023 (圖138) 和DMS4024(圖139) 二者的SEC曲線都顯示具有稍微拖尾的峰的單一物質。25. 3.含有較長接頭的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的效價分別如方法12和13所述測定該分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism 分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。mAbdAb DMS4023 的抗-EGFR效價(圖140)計算為7. 066nM並且mAbdAb DMS4024的效價計算為6. 420nM,而 對照抗-EGFR mAb給出的EC50值為7. 29InM。在抗-VEGF受體結合測定(圖141)中，mAbdAb DMS4023 的 EC50 為 91. 79ρΜ(0· 09InM)並且 mAbdAb DMS4024 的 EC50 為 90ρΜ(0· 0906ηΜ)， 而抗-VEGF對照mAb產生的EC50為463. 2pM(0. 4632nM)。綜上所述，測定數據顯示實施例 25的構建體即含較長接頭的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb對兩種抗原都有效。實施例2626. 1.產生雙重靶向的抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb通過將dAb融合到mAb重鏈的C-末端來構建該雙重靶向的mAbdAb。先前已構建 抗-VEGF mAb重鏈和輕鍊表達盒。用於克隆的限制性位點與由實施例10中所述的限制性 位點(Sail和HindIII)相同。然後通過PCR(用編碼SalI和HindIII端的引物)擴增編碼抗-EGFR
120dAb (D0M16-39-542)的DNA，並將其插入到經修飾的3』編碼區，導致產生在mAb和dAb之間 的接頭「STG」(絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸)。選擇已驗證序列的克隆(SEQ ID NO 179和181分別為輕鏈和重鏈)，按照製造商 方案用Qiagen Mega Prep試劑盒製備大規模DNA製備物。通過用瞬時轉染技術共轉染輕 鏈和重鏈(SEQ ID N0:180和182)在哺乳動物HEK293-6E細胞中表達mAbdAb。26. 2.雙重靶向的抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb的純化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液純化這些雙重靶向 的mAbdAb。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確定純化的樣品的濃度。 純化的樣品(命名為DMS4009)的SDS-PAGE分析(圖142)顯示未經還原的樣品泳動至約 170kDa，而經還原的樣品顯示泳動至約25和約60kDa的兩條帶，其分別對應於輕鏈和融合 dAb的重鏈。為了進行大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上樣到預平衡的 S-20010/300GL柱(連接到HPLC系統)上，用PBS以Iml/分鐘流動。該分子的SEC曲線顯 示具有對稱峰的單一物質(圖143)。26. 3.雙重靶向的抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb的效價分別如方法12和13所述測定該分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。該mAbdAb DMS4009的抗-EGFR效價(圖144)計算為132. 4nM，而對照抗-EGFR mAb給出的EC50值為 6. 585nM。在抗-VEGF 受體結合測定(圖 145)中，該 mAbdAb 的 EC50 為 539. 7ρΜ (0. 5397nM)， 而抗-VEGF對照mAb產生的EC50為380. 5pM(0. 3805nM)。綜上所述，測定數據顯示實施例 26的構建體即雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb對兩種抗原都有效。實施例2727. 1.產生雙重靶向的抗-EGFR/ 抗-IL_13mAbdAb通過將dAb融合到mAb重鏈的C-末端來構建該雙重靶向的mAbdAb。先前已構建 抗-EGFR mAb重鏈和輕鍊表達盒。用於克隆的限制性位點與由實施例10中所述的限制性 位點(Sail 和 HindIII) 一樣。然後通過PCR(用編碼SalI和HindIII端的引物)擴增編碼 抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)的DNA，並將其插入到經修飾的3，編碼區，導致產生在mAb和 dAb之間的接頭「STG」 (絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸)。選擇已驗證序列的克隆(SEQ ID NO 243和183分別為輕鏈和重鏈)，按照製造商 方案用Qiagen Mega Prep試劑盒製備大規模DNA製備物。通過用瞬時轉染技術共轉染輕 鏈和重鏈(SEQ ID N0:137和184)在哺乳動物HEK293-6E細胞中表達mAbdAb。27. 2.雙重靶向的抗-EGFR/抗-IL_13mAbdAb的純化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液純化這些雙重靶向 的mAbdAb。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確定純化的樣品的濃度。 純化的樣品(命名為DMS4029)的SDS-PAGE分析(圖146)顯示未經還原的樣品泳動至約 170kDa，而經還原的樣品顯示泳動至約25和約60kDa的兩條帶，其分別對應於輕鏈和融合 dAb的重鏈。為了進行大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-EGFR/抗-IL_13mAbdAb上樣到預平衡
121的S-200 10/300GL柱(連接到HPLC系統)上，用PBS以0. 5ml/分鐘流動。該分子的SEC 曲線顯示具有對稱峰的單一物質(圖147)。27. 3.雙重靶向的抗-EGFR/抗-IL_13mAbdAb的效價分別如方法13和25所述測定該分子中和EGFR和IL-13的能力。用GraphPad Prism分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。mAbdAb DMS4029的抗-EGFR效價(圖148)計算為9. 033nM,而對照抗-EGFR mAb給出的EC50值 為8. 874nM。在基於IL-13細胞的中和測定(圖149)中，該mAbdAb的EC50為1. 654nM，而 抗-IL-13對照mAb產生的EC50為0. 996nM。綜上所述，測定數據顯示實施例27的構建體 即雙重靶向的抗-EGFR/抗-IL-13mAbdAb對兩種抗原都有效。實施例2828. 1.產牛其中dAb位於輕鏈上的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb通過將dAb融合到mAb輕鏈的C-末端來構建雙重靶向的mAbdAb。先前已構建 抗-EGFR mAb重鏈和輕鍊表達盒。為了引入用於將dAb插入到輕鏈的限制性位點，用mAb輕鍊表達載體作為模板使 用位點定向誘變來產生BamHI和HindIII克隆位點。然後通過PCR(用編碼SalI和HindIII 端的引物)擴增編碼抗-VEGFdAb (D0M15-26-593)的DNA，並將其插入到經修飾的3，編碼 區，導致產生mAb和dAb之間的接頭「GSTG」或「GSTVAAPS」。含SEQ ID NO 187中所述的輕鏈序列的第一種分子具有接頭「GSTG」。含SEQ ID NO 189中所述的輕鏈序列的第二種分子具有接頭「GSTVAAPS」。這兩者都獨立與SEQ ID NO 245重鏈配對。選擇已驗證輕鏈和重鏈序列的克隆，按照製造商方案用QiagenMega Pr印試劑盒 製備大規模DNA製備物。通過用瞬時轉染技術共轉染輕鏈和重鏈(SEQ ID N0:188和139 命名為DMS4013 ；禾口 SEQ ID NO 190和139命名為DMS4027)在哺乳動物HEK293-6E細胞中 表達 mAbdAb。28. 2.其中dAb位於輕鏈上的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb的純化和SEC 分析按照已建立的方案用蛋白-A親和色譜法從澄清的表達上清液純化這些雙重靶向 的mAbdAb。通過分光光度法根據在280nm處的光吸光度測量值確定純化的樣品的濃度。純 化的樣品DMS4013和DMS4027的SDS-PAGE分析(圖150)顯示未經還原的樣品泳動至約 170kDa，而經還原的樣品顯示泳動至約38和約50kDa的兩條帶，其分別對應於融合dAb的 輕鏈和重鏈。為了進行大小排阻色譜(SEC)分析，將抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上樣到預平衡的 S-200 10/300GL柱(連接到HPLC系統)上，用PBS以Iml/分鐘流動。DMS4013(圖151) 和DMS4027(圖152) 二者的SEC曲線都顯示具有對稱峰的單一物質。28. 3.其中dAb位於輕鏈上的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb的效價分別如方法12和13所述測定該分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism 分析測定數據。用S形劑量應答曲線測定效價，用最佳擬合模型擬合數據。mAbdAb DMS4013 的抗-EGFR效價(圖153)計算為7. 384nM, mAbdAb DMS4027的效價計算為7. 554nM，而對照 抗-EGFR mAb給出的EC50值為7. 093nM。在抗-VEGF受體結合測定(圖154)中，mAbdAb
122DMS4013 的 EC50 為 1. 179nM, mAbdAbDMS4027 的 EC50 為 0. 173 InM，而抗-VEGF 對照 mAb 產 生的EC50為0. 130nM。綜上所述，測定數據顯示實施例28的構建體即其中dAb位於輕鏈上 的雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb對兩種抗原都有效。實施例29雙重靴向的抗-EGFR/抗-VEGF 和抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb 的 Biacore 分析對在實施例11 (抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb)和實施例 23、24、25 和 28 (抗-EGFR/ 抗-VEGF mAbdAb)中所述的mAbdAb進行BIAcore分析，以測定它們結合其相應抗原的動力 學結合常數及解離常數。在BIAcore 3000設備上進行分析。設備溫度設定為25°C。將 HBS-EP緩衝液用作流動緩衝液。以設備最高可能比率採集實驗數據。按照製造商說明書 用標準胺偶聯化學用蛋白A包被研究級的CM5晶片上的一流動細胞，同樣處理第二批流動 細胞，但用緩衝液代替蛋白A以產生參考表面。然後將用蛋白A包被的流動細胞用於捕獲 mAbdAb。抗原如表37中所詳述以2x系列稀釋液注入。幾種稀釋液以一式二份來進行。單 獨的緩衝注入液代替配體用於本底扣除。用設備軟體自帶的動力學Wizard以隨機順序注 入樣品。在每一次循環結束時通過注入IOmM甘氨酸，pH 1.5來使表面再生。用BIA評估 軟體4. 1來進行數據處理和動力學擬合。顯示重複結果(來自同一次運作)平均值的數據 示於表37中。顯示的DMS4010的多個值代表在單獨場合的兩次實驗運作。因所分析的配 體的濃度，787nM的值可能高估了親和力。表 37 實施例30包含融合到丨雙特異+牛抗體骨架上的單一結構域抗體的寺異+牛抗體[1060]30. 1.構津用合適的限制性酶位點和所加的信號序列，從頭構建了編碼對IL-18和IL-12抗 原具有特異性的雙特異性抗體分子的可變重鏈和輕鏈結構域的基因(進一步的資料參見 WO 2007/024715)。用標準分子生物學技術將可變重鏈結構域克隆到表達載體，所述表達載 體含有經由TVAAPS接頭在恆定區的C-末端融合到抗-IL4結構域抗體D0M9-112-210 (SEQ ID NO 4)的IgGl重鏈恆定區。將輕鏈可變結構域同樣地克隆到含有Ck恆定區序列的表 達載體中。已構建和表達的抗體列入表38中。表 38 30. 2表汰和純化簡言之，用先前與293fectin試劑(Invitrogen#51-0031)孵育的重鏈和輕鍊表 達質粒共轉染25ml 1.5xl06細胞/ml的HEK293細胞。將其置於37°C、5% CO2和95% RH 的振蕩培養箱中。24小時後，加入蛋白腖養分培養基，讓細胞再生長48小時。通過離心收 獲上清液，通過ELISA定量IgG水平。將得到的mAbdAb命名為BPC1616 (SEQID N0:193和 194)。30. 3. IL-12 結合 ELISA評估了轉染的細胞上清液對重組人IL-12的結合。簡言之，用抗-人IL_12(R&D Systems AF219NA)以2 μ g/ml包被ELISA板，並用封閉液(Tris緩衝的鹽水中的4% BSA) 封閉。然後將封閉液中的25ng/ml重組人IL-12(P印rOTech#200-12)裝入板中。在用 TBS+0. 05% Tween 20 (TBST)洗滌前讓板在室溫孵育1小時。加入在封閉液中稀釋的各種 稀釋度的細胞上清液以及不相關對照抗體(帕考珠單抗和同種型匹配的對照hlgG)。在用 TBST洗滌前讓板在室溫孵育1小時。通過加入在封閉液中以1/1000稀釋的過氧化物酶標 記的抗人κ輕鏈抗體(SigmaA7164)來檢測結合。在用TBST洗滌前讓板在室溫孵育1小 時。通過加入OPD底物(Sigma P9187)來使板顯色，並通過加入3M H2SO4終止顯色。用板 讀數器在490nm處測量吸光度，作圖確定平均吸光度。結果顯示在圖155中，其顯示BPC1616結合重組人IL-12，而兩種對照抗體顯示不結合。30. 4. IL-IR 結合 ELISA評估了轉染的細胞上清液對重組人IL-18的結合。簡言之，用抗-人IL-18 (由GSK 製備)以1μ g/ml包被ELISA板，並用封閉液(Tris緩衝的鹽水中的4% BSA)封閉。加入 在封閉液中稀釋的各種稀釋度的細胞上清液以及不相關抗體(帕考珠單抗和同種型匹配 的對照人IgG)。在用TBS+0. 05% Tween 20 (TBST)洗滌前讓板在室溫孵育1小時。通過加入在封閉液中以1/1000稀釋的過氧化物酶標記的抗人κ輕鏈抗體(Sigma A7164)來檢測 結合。在用TBST洗滌前讓板在室溫孵育1小時。通過加入OPD底物(Sigma P9187)來使 板顯色，並通過加入3M H2SO4終止顯色。在490nm處用板讀數器測量吸光度，作圖確定平均 吸光度。結果顯示在圖156中，其顯示BPC1616結合重組人IL-18，而兩種對照抗體顯示不
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？口口。30. 5. IL-4 結合 ELISA評估了轉染的細胞上清液對重組人IL-14的結合。簡言之，用IL_4(由GSK製備) 以1 μ g/ml包被ELISA板，並用封閉液(Tris緩衝的鹽水中的4% BSA)封閉。加入在封閉 液中稀釋的各種稀釋度的細胞上清液以及抗-IL-4單克隆抗體(帕考珠單抗)和不相關的 抗體(同種型匹配的對照hlgG)。在用TBS+0. 05% Tween 20 (TBST)洗滌前讓板在室溫孵育 1小時。通過加入在封閉液中以1/1000稀釋的過氧化物酶標記的抗人K輕鏈抗體(Sigma A7164)來檢測結合。在用TBST洗滌前讓板在室溫孵育1小時。通過加入OPD底物(Sigma P9187)來使板顯色，並通過加入3M H2SO4終止顯色。在490nm處用板讀數器測量吸光度， 作圖確定平均吸光度。結果顯示在圖157中，其顯示BPC1616和帕考珠單抗結合重組人IL_4，而對照抗體 顯示不結合。實施例31伺☆至丨_.秘C-纖白傾付一馳騰側Ξ,鼎mAbdAb31. 1.構津構建了三種三特異性抗體(mAbdAb-dAb)，其中將兩個單一結構域抗體線內(in line)融合到單克隆抗體重鏈的C-末端。簡言之，通過PCR引入N-末端的BglII限制性位點和C-末端的BamHI限制性位 點，以使編碼結構域抗體的DNA序列位於D0M10-53-474(SEQ ID NO :5)、D0M9_155_154 (SEQ ID NO 3)和 D0M9-112-210 (SEQ ID NO 4)的側翼。然後將編碼D0M10-53-474結構域抗體的DNA片段克隆到編碼與抗IL_4結構域抗 體D0M9-112-210 (SEQ ID NO 71)融合的抗IL-5單克隆抗體重鏈的哺乳動物表達載體的 BamHI位點。將編碼D0M9-155-154和D0M9-112-210結構域抗體的DNA片段二者都獨立克 隆到編碼與抗IL-13結構域抗體D0M10-53-474(SEQ ID NO :116)融合的抗-CD20單克隆 抗體重鏈的哺乳動物表達載體的BamHI位點。得到的表達載體編碼含融合到C-末端的兩 個單一結構域抗體的重鏈。重鏈的蛋白質序列示於表39中所述的SEQ ID NO 195、196和 197。表39為業已構建的mAbdAb的概述。表 39 31. 2.表達和純化用293fectin 試劑(Invitrogen, 12347019)將編碼 BPC1008、BPC1009 和 BPC1010
重鏈和輕鏈的表達質粒共轉染到HEK 2936E細胞中。第二天將蛋白腖養料加入到細胞培養 物中，從初始轉染約2-6天後收穫上清液物質。在用結合測定檢測前用蛋白A柱純化抗體。31. 3. IL-4 結合 ELISA用包被緩衝液(0. 05M碳酸氫鹽pH9. 6，Sigma C-3041) 3中的5 μ g/ml人 IL-4 (GSK)包被96孔高結合板，並在4°C儲存過夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩 衝的鹽水(TBST)洗滌板2次。將100 μ L封閉液(含1 % BSA的TBST緩衝液)加入到各 孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。用封閉液在板中連續稀釋純化的抗體。孵育1小時後， 將板洗滌3次。將山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(SigmaA7164)在封閉 液中以1 2000稀釋，將50 μ L加入到各孔中。讓板孵育1小時。將板洗滌3次，然後將 OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，5分鐘後通過加入25 μ L的3Μ 硫酸使反應終止。用鹼性終點方案用VersaMax Tunable微板讀數器(MoleCularDevices) 在490nm處讀取吸光度。ELISA結果示於圖158中，其確證抗體BPC1008、1009和BPC1010結合重組人IL-4。 還顯示陽性對照帕考珠單抗結合重組IL-4，然而顯示陰性對照抗IL-13mAb和美泊利單抗
126不結合IL-4。也在單獨的實驗中檢測抗體BPC1009和BPC1010，其給出與圖158所示相似
的結果。31. 4. IL-5 結合 ELISA用包被緩衝液(0. 05M碳酸氫鹽ρΗ9· 6)中的5. 9 μ g/ml人IL-5 (GSK)包被96孔 高結合板，並在4°C儲存過夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水(TBST)洗滌 板2次。將100 μ L封閉液(含BSA的TBST緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至 少1小時。用封閉液在板中連續稀釋純化的抗體。孵育1小時後，將板洗滌3次。將山羊 抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(Sigma A7164)在封閉液中以1 2000稀釋，將 50 μ L加入到各孔中。讓板孵育1小時。將板洗滌3次，然後將OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽) SigmaFast底物溶液加入到各孔中，5分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸使反應終止。用鹼 性終點方案用VersaMax Tunable微板讀數器(Molecular Devices)在490nm處讀取吸光 度。圖159顯示ELISA結果，其確證抗體BPC1008結合重組人IL-5，而BPC1009和 BPC1010顯示不結合IL-5。也顯示陽性對照帕考珠單抗結合重組IL-5，然而顯示陰性對照 抗IL-13mAb和美泊利單抗不結合IL-5。IL-13 結合 ELISA用包被緩衝液(0. 05M碳酸氫鹽pH9. 6，Sigma C-3041) 3中的5 μ g/ml人 IL-13 (GSK)包被96孔高結合板，並在4°C儲存過夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩 衝的鹽水(TBST)洗滌板2次。將100 μ L封閉液(1 % BSA的TBST緩衝液)加入到各孔中， 讓板在室溫孵育至少1小時。用封閉液在板中連續稀釋純化的抗體。孵育1小時後，將板 洗滌3次。將山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(SigmaA7164)在封閉液中以 1 2000稀釋，將50 μ L加入到各孔中。讓板孵育1小時。將板洗滌3次，然後將OPD (鄰 苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，5分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸 使反應終止。用鹼性終點方案用VersaMax Tunable微板讀數器(MolecularDevices)在 490nm處讀取吸光度。ELISA結果示於圖160中，其確證抗體BPC1008、1009和BPC1010結合重組人 IL-13。還顯示陽性對照抗IL-13mAb結合重組IL-13，然而顯示陰性對照帕考珠單抗和美泊 利單抗不結合IL-13。也在單獨的實驗中檢測抗體BPC1009和BPC1010，其給出與圖160所 示相似的結果。實施例32含融合到單價骨架的單一結構域抗體的mAbdAb32. 1. mAbdAb 的構建如下構建包含單價抗體(進一步資料參見W02006015371和W02007059782)和結 構域抗體D0M-15-26-293融合體的雙特異性抗體。用基於PCR的策略接著位點定向誘變 構建編碼抗-c-MetKnob-into-hole重鏈(SEQ ID NO :202和203)的DNA序列。用基於 PCR的策略接著通過基於PCR的方法除去鉸鏈區構建了編碼抗-C-MetUnibody重鏈(SEQ ID NO 204)的DNA序列。另外，對於融合構建體，在重鍊表達盒的C-末端包括BamHI和 EcoRI限制性位點，以促進作為來自現有載體的BamHI-Ec0RI片段的抗VEGF-A結構域抗體 (D0M-15-26-593)DNA序列(編碼SEQ ID NO :75的455-570位胺基酸)的隨後克隆。得到的表達載體編碼經由GS接頭融合到重鏈C-末端的抗-VEGFA結構域抗體(SEQ ID NO 198, 199和201)。通過基於PCR的策略已構建編碼抗-c-Met輕鏈(SEQ ID NO 200)的DNA序 列。BPC1604的構建如實施例14所述。下表40為業已產生並表達的單價骨架mAbdAb 和抗體的概述。表 40 32. 2.表達和純化用293fectin(Invitrogen, 12347019)將編碼 BPC1017、BPC1018 和 BPC1020 重鏈 的表達質粒共轉染到HEK 2936E細胞中。第二天將蛋白腖養料加入到細胞培養物中，從初 始轉染約2-6天後收穫上清液物質。在用結合測定檢測前用蛋白A柱純化抗體。32. 3. HGF 受體結合 ELISA用包被緩衝液(0. 05M碳酸氫鹽ρΗ9· 6，Sigma C_3041)3中的5 μ g/ml重組人HGF R(c-MET)/Fe嵌合體(R&D system，貨號358_MT/CF)包被96孔高結合板，並在4°C儲存過夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水(TBST)洗滌板2次。將100 μ L封閉液 (含1 % BSA的TBST緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少30分鐘。將板洗滌3 次。然後用封閉液在板中連續稀釋純化的抗體。在室溫孵育1小時後，將板洗滌3次。將 山羊抗-人κ輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體(Sigma A7164)在封閉液中以1 2000稀 釋，並加入到各孔中。讓板孵育1小時。將板洗滌3次，然後將OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽) SigmaFast底物溶液加入到各孔中，5分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸使反應終止。用鹼 性終點方案用VersaMax Tunable微板讀數器(Molecular Devices)在490nm處讀取吸光 度。ELISA結果示於圖161中，其確證mAbdAb BPC1017和BPC1018以可比得上 抗體BPClO 19和BPC1020的活性結合重組人c_MET。顯示陰性對照帕考珠單抗和 BPC1604(IGF-1R/VEGF mAbdAb)不結合 c-MET。32. 4. VEGF 結合 ELISA用PBS中的0.45 PgAilAVEGF(GSK)包被96孔高結合板，並在4°C孵育過夜。用 含0. 05%的Tween-20的Tris-緩衝的鹽水(TBST)洗滌板2次。將100 μ L封閉液(含1 % BSA的TBST緩衝液)加入到各孔中，讓板在室溫孵育至少1小時。然後進行另一次洗滌步 驟。用封閉液在板中連續稀釋純化的抗體。室溫孵育1小時後，洗滌板。將山羊抗-人κ 輕鏈特異性過氧化物酶綴合抗體在封閉液中以1 2000稀釋，並加入到各孔中。讓板在室 溫孵育1小時。在另一洗滌步驟後，將OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)SigmaFast底物溶液加入 到各孔中，5分鐘後通過加入25 μ L的3Μ硫酸使反應終止。用鹼性終點方案用VersaMax Tunable微板讀數器(Molecular Devices)在490nm處讀取吸光度。圖162顯示ELISA結果，其確證抗體mAbdAb BPC1017和BPC1018結合重組人VEGF。 還顯示陽性對照BPC1604結合重組人VEGF，然而顯示帕考珠單抗、BPC1019和BPC1020不結 合 VEGF。實施例33含有抗~IL13dAb D0M10-53~546dAb 和 D0M10-53-567 的 mAbdAb33. 1.構津、表汰和純化對示於表41的抗-IL4mAb-抗-IL13dAb進行克隆並在HEK2936E細胞中瞬時表達， 純化(分別如實施例1、1. 3和1. 5所述)。表41
129 通過大小排阻色譜(SEC)和在還原條件下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電 泳(SDS PAGE)分析純化的 PascoH-TVAAPS-546 和 PascoH-TVAAPS-567mAbdAb。SEC 和 SDS PAGE數據示於圖163、164、165和166中。33. 2.與 IL-13 和 IL-4 結合的 Biacore 分析用BIAcore TlOO 於 25°C (如方法 4 和 5 所述)檢測純化的 PascoH-TVAAPS-546 和PascoH-TVAAPS-567對人IL-13和人IL-4的結合。這些數據示於表42中。表42 在該測定中所測的二種mAbdAb都以極高親和力(注意對於PascoH-TVAAPS-567 其親和力超出了設備的靈敏度)結合IL-4，且所述結合親和力與單獨的抗-人IL4mAb (帕 考珠單抗)的結合親和力相似。PascoH-TVAAPS-546和PascoH-TVAAPS-567 二者都結合 IL-13。注意在該測定中沒有檢測單獨的抗-IL-13dAb (D0M10-53-546和D0M10-53-567)，因 為不能將該dAb捕獲蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上；取而代之的是，在該測定中用 抗-人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。還用BIAcore TlOO於25°C (如方法23所述)檢測這些mAbdAb對獼猴IL-13的 結合。這些數據示於表43中。mAbdAb捕獲水平達到500和750相對響應單位之間，對於 mAbdAb 和抗-IL13mAb 二者都評估 6 個 IL-13 濃度曲線(256、64、16、4、1 和 0. 25nM)。表43[1124] PascoH-TVAAPS-546和PascoH-TVAAPS_567 二者都以相似的結合親和力結合獼猴 IL-13。注意在該測定中沒有檢測單獨的抗-IL-13dAb (D0M10-53-546和D0M10-53-567)，因 為不能將該dAb捕獲到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5晶片上；取而代之的是，在該測定中 用抗-人IL13mAb作為陽性對照以證明IL-13結合。33. 3.在TF-I細胞牛物測定中人IL-13和獼猴IL-13的中和在TF-I細胞生物測定(分別如方法8和方法20所述)中檢測純化的 PascoH-TVAAPS-546 和 PascoH-TVAAPS-567 對人 IL-13 和獼猴 IL-13 的中和。圖 167 和 168 分別顯示對人IL-13和獼猴IL-13(在TF-I細胞生物測定中)的中和數據。在這些生物測 定中包括D0M10-53-616作為中和IL-13的陽性對照。還包括對不相關抗原具有特異性的 dAb(陰性對照dAb)作為中和IL-13的陰性對照。另外，在這些測定中還檢測PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616。在TF-I 細胞生物測定中，PascoH-TVAAPS-546 和 PascoH-TVAAPS-567 二者都完全 中和人和獼猴IL-13的生物活性。從數據集計算ND5tl值。ND5tl值是能夠中和IL-13的生物活性到50%的mAbdAb或 mAb或dAb的濃度。平均ND5tl值、標準偏差(SD)和所測次數(η)示於表44中。表44 實施例34含IgG2、IrG4 和 ISG4PE 重鏈恆定區的 mAbdAb34. 1. mAbdAb 的構建[1135]通過PCR從現有構建體擴增人抗體同種型IgG2、IgG4和變體IgG4(IgG4PE)的重 鏈恆定區基因，並用標準分子生物學技術克隆到編碼PascoH-GS-474重鏈(SEQ ID NO 48) 的表達載體。已設計並檢測的mAbdAb抗體列入表45中。表45 34. 2.表汰表達了表45 中所述的 mAbdAb 連同命名為 BPC1000 的 PascoH-GS-474(SEQ ID NO: 48和15)。簡言之，用先前與293fectin試劑(Invitrogen#51-0031)孵育的重鏈和輕鍊表 達質粒共轉染含1. 5xl06細胞/ml的750 μ 1的ΗΕΚ293細胞。將這些置於37°C、5% CO2和 95% RH的震蕩培養箱中。1小時後，加入蛋白腖養分培養基，讓細胞再生長72小時。通過 離心收穫上清液。34. 3. IL-4 結合 ELISA評估了含這些mAbdAb的上清液對重組人IL-4的結合。簡言之，用人IL_4(由GSK 製備)以lPg/ml包被ELISA板，並用封閉液(Tris緩衝的鹽水中的4% BSA)封閉。加入 各種稀釋度的細胞上清液、抗IL-4單克隆抗體(帕考珠單抗)和不相關特異性的抗體(586 抗IL-13)。所有樣品都用封閉液稀釋。在用TBS+0.05% Tween 20 (TBST)洗滌前讓板在室 溫孵育1小時。通過加入在封閉液中以1/1000稀釋的過氧化物酶標記的抗人κ輕鏈抗體 (Sigma A7164)來檢測結合。在用TBST洗滌前讓板在室溫孵育1小時。通過加入OPD底 物(Sigma P9187)來使板顯色，並通過加入3M H2SO4終止顯色。在490nm處用板讀數器測 量吸光度，作圖確定平均吸光度。在圖169中提供的結果顯示含有備選同種型的mAbdAb都結合人IL-4。對於mAbdAb BPC1000、BPC1617、BPC1618和BPC1619而言，不能定量測定上清液中的抗體的量，因此，圖 169提供的數據代表潔淨上清液物質稀釋倍數。對於抗-IL4和IL-13對照抗體而言，在該 測定中使用純化的物質，所用的起始濃度分別為ι μ g/ml和1 μ g/ml (其等同於圖169中的 稀釋倍數1)。34. 4. IL-13 結合 ELISA評估了含這些mAbdAb的上清液對重組人IL-13的結合。簡言之，用人IL-13 (由
GSK製備)以5μ g/ml包被ELISA板，並用封閉液(Tris緩衝的鹽水中的4% BSA)封閉。加
入各種稀釋度的細胞上清液、抗IL-13單克隆抗體(586)和不相關特異性的抗體(帕考珠單抗抗IL-4)。所有樣品都用封閉液稀釋。在用TBS+0. 05% Tween 20 (TBST)洗滌前讓板 在室溫孵育1小時。通過加入在封閉液中以1/1000稀釋的過氧化物酶標記的抗人κ輕鏈 抗體(Sigma A7164)來檢測結合。在用TBST洗滌前讓板在室溫孵育1小時。通過加入OPD 底物(Sigma P9187)來使板顯色，並通過加入3M H2SO4終止顯色。在490nm處用板讀數器 測量吸光度，作圖確定平均吸光度。在圖170中提供的結果顯示含有備選同種型的雙特異性抗體都結合人IL-13。對 於雙特異性抗體BPC1000、BPC1617、BPC1618和BPC1619而言，不能定量測定上清液中的抗 體的量，因此，圖170提供的數據表示為淨上清液物質稀釋倍數。對於抗-IL4和IL-13對 照抗體而言，在該測定中分別以1 μ g/ml和1 μ g/ml的起始濃度(其等同於圖170中的稀 釋倍數1)使用純化的物質。實施例35備詵抗-IL-13/IL-4mAbdAb35. 1.含備詵可變區序列的抗-IL-13/IL_4mAbdAb的構津用標準分子生物學技術將編碼命名為「Cl」和「D1」的備選重鏈可變區 抗-IL-13mAb的DNA序列，從現有構建體轉移到含有編碼經由TVAAPSGS接頭在恆定區c_末 端融合到抗IL-4結構域抗體(D0M9-112-210)的hlgGl恆定區的DNA的表達載體。從頭開 始組裝編碼命名為「M0」和「NO」的IL-13mAb的備選輕鏈可變區的DNA序列，並克隆到含有 人Ck恆定區的表達載體。這些備選重鏈和輕鏈抗體可變區包含與SEQ ID N0:12和13所 述的抗-IL-13抗體相同的CDR區，但含有備選的人源化可變構架區。35. 2.用抗 IL-13mAb 「656」 可變區構津 mAbdAb用標準分子生物學技術將編碼人源化抗IL-13mAb 「656」重鏈可變區的DNA序列， 從現有構建體轉移並克隆到含有編碼經由TVAAPS接頭在恆定區C-末端融合到抗IL-4結 構域抗體(D0M9-112-210)的hlgGl恆定區的DNA的表達載體。將編碼可變輕鏈區的DNA 序列從現有構建體轉移並克隆到含有人Ck恆定區的表達載體。35. 3. mAbdAb 的表汰簡言之，用先前與293fectin試劑(Invitrogen#51-0031)孵育的重鏈和輕鍊表達 質粒共轉染25ml 1. 5xl06細胞/ml的HEK293細胞。將其置於37°C、5% CO2和95% RH的 振蕩培養箱中。24小時後，加入蛋白腖養分培養基，讓細胞再生長72小時。通過離心收穫 上清液，並通過ELISA定量IgG水平。已構建並表達的抗體列舉在表46中。表46 35. 4. mAbdAb 與 IL-13 的結合通過ELISA評估mAbdAb與IL-13的結合活性。簡言之，將5μ g/ml大腸桿菌表達 的重組人IL-13(由GSK製備並純化)包被到96孔ELISA板。於室溫封閉孔2小時，然後 用滴定法測量板中的mAbdAb構建體。用1 1000稀釋的抗-人κ輕鏈過氧化物酶綴合 抗體(貨號A7164，Sigma-Aldrich)檢測結合。圖177顯示所有測試分子都能夠結合人IL-13。儘管在該ELISA中BPC1615顯示結合，但不可能準確定量該分子的濃度，因此，在圖177中未標出該分子的IL-13結合ELISA數據。在獨立的Biacore測定(表47)中， BPC1615也顯示具有與IL-13結合的高親和力。35. 5.通過 BIAcorea 測定抗-IL13mAb_ 抗 _IL4dAb 與 IL-13 的結合也用BIAcore 於25°C (如方法4所述)檢測來自HEK細胞轉染的細胞上清液對 大腸桿菌表達的重組人IL-13的結合。BPC1601作為純化的蛋白質被檢測。表47所提供的 結合親和力確證所有抗體顯示與IL-13結合的高親和力。表47 Kappa = κ，& =和實施例36產牛對人IL-5和人IL-13具有特異件的mAbdAb36. 1. mAbdAb的構津和表汰在HEK2936E細胞中表達了具有SEQ ID NO 65中所述的重鏈和SEQ ID NO 72中 所述的輕鏈的mAbdAb分子。其被命名為美泊利單抗L-G4S-474或BPC1021。36. 2.抗-IL5mAb-抗 _IL13dAb 與 IL-5 和 IL-13 的結合在直接結合ELISA(如方法1所述)中檢測該mAbdAb (在細胞上清液中)對人 IL-13的結合。這些數據示於圖173中。樣品以一式二份被轉染並檢測，其被標註為樣品A和樣品B。該mAbdAb結合IL-13。在該測定中包括單獨的純化的抗-人IL13mAb作為IL-13 結合的陽性對照。包括純化的抗_人IL-4mAb (帕考珠單抗)和抗-人IL-5mAb (美泊利單 抗)作為IL-13結合的陰性對照。還在直接結合ELISA (如實施例31. 4所述)中檢測該mAbdAb對人IL_5的結合。 這些數據示於圖174中。美泊利單抗L-G4S-474結合IL_5。包括純化的抗-人IL4mAb (帕考珠單抗)和純 化的抗人13mAb作為結合IL-5的陰性對照。在該測定中使用純化的抗_人IL5mAb (美泊 利單抗)作為陽性對照以證明IL-5結合。序列表49:
1186]附圖f1187]圖I-'1 抗原結合構建體實例。1188]圖8 :mAbdAb構建體示意圖。1189]圖9 PascoH-G4S-474 的 SEC 和 SDS Page 分析。1190]圖10:PascoL-G4S-474 的 SEC 和 SDS Page 分析。1191]圖11:PascoH-474 的 SEC 和 SDS Page 分析。1192]圖12:PascoHL-G4S-474 的 SEC 和 SDS Page 分析。1193]圖13在J[接結合ELISA中mAbdAb上清液對人IL-13的結合。1194]圖14在J[接結合ELISA中mAbdAb上清液對人IL-4的結合。1195]圖15在J[接結合ELISA中純化的mAbdAb對人IL-13的結合。1196]圖16在J[接結合ELISA中純化的mAbdAb對人IL-4的結合。1197]圖17在J[接結合ELISA中mAbdAb上清液對人IL-4的結合。1198]圖18在J[接結合ELISA中mAbdAb上清液對人IL-13的結合。1199]圖19在J[接結合ELISA中純化的mAbdAb對人IL-4的結合。1200]圖20A 在:直接結合ELISA中純化的mAbdAb對人IL-13的結合。1201]圖20B 在:直接結合ELISA中純化的mAbdAb對獼猴IL-13的結合[1202]圖21 用BIAcore 的mAbdAb對IL-4的結合動力學。圖22 用BIAcore 的mAbdAb對IL-4的結合動力學。圖23 用BIAcore 的mAbdAb對IL-13的結合動力學。圖24 在TF-I細胞生物測定中純化的抗-IL13mAb_抗_IL4dAb中和人IL-13的 能力。圖25 在TF-I細胞生物測定中純化的抗-IL13mAb_抗_IL4dAb中和人IL-4的能 力。圖26 在 TF-I 細胞生物測定中純化的抗-IL4mAb_ 抗-IL13dAbPascoH-G4S_474、 PascoH-474, PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 中和人 IL-4 的能力。圖27 在 TF-I 細胞生物測定中純化的抗-IL4mAb_ 抗-IL13dAb、PascoH-G4S_474、 PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 中和人 IL-13 的能力。圖28 在雙重中和TF-I細胞生物測定中純化的抗-IL4mAb_抗_IL13dAb、 PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 同時中和人 IL-4 和人 IL-13的能力。圖 29 :D0M10-53-474SEC-MALLSo圖 30 :D0M9-112-210SEC-MALLSo圖 31 :D0M9-155-25SEC-MALLS。圖32 所有三種信號的D0M9-155-25SEC-MALLS重疊。圖 33 :D0M9-155-147SEC-MALLS圖 34 :D0M9-155-159SEC-MALLS用於通過SEC-MALLS確定MW的對照BSA。 三特異性mAbdAb分子的示意圖。在直接結合ELISA中三特異性mAbdAb IL18mAb-210-474(上清液)對人圖 35圖 36圖 37
IL-18的結合。圖38 在直接結合ELISA中三特異性mAbdAb IL18mAb-210_474(上清液)對人 IL-13的結合。圖39 在直接結合ELISA中三特異性mAbdAb IL18mAb-210_474(上清液)對人 IL-4的結合。
的結合。 [1222]
的結合。 [1229]
圖40 在直接結合ELISA中三特異性mAbdAb Mepo-210-474 (上清液)對人IL-13
圖41 在直接結合ELISA中三特異性mAbdAb M印ο_210_474 (上清液)對人IL-4
圖 42 抗-TNF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的克隆。 圖 43 抗-TNF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的 SDS-PAGE 分析。 圖 44 抗-TNF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的 SEC 曲線(實施例 10)。 圖45 實施例10的抗-EGFR活性。 圖46 實施例10的抗-TNF活性。
圖 47 抗-TNF/ 抗-VEGF mAb-dAb 的 SDS-PAGE 分析(實施例 11)， 圖 48 抗-TNF/ 抗-VEGF mAb-dAb 的 SEC 曲線(實施例 11)。[1230]圖49實施例11的抗-VEGF活性。[1231]圖50實施例11的抗-TNF活性。[1232]圖51抗-VEGF/抗-ILlRl dAb-延伸的-IgG的克隆(實施例12)。[1233]圖52抗-TNF/抗-VEGF dAb-延伸的IgG A的SDS-PAGE分析(實施例12)[1234]圖53抗-TNF/抗-VEGF dAb-延伸的IgG B的SDS-PAGE分析(實施例12)[1235]圖54抗-TNF/抗-VEGF dAb-延伸的IgG A的SEC曲線(實施例12)。[1236]圖55抗-TNF/抗-VEGF dAb-延伸的IgG B的SEC曲線(實施例12)。[1237]圖56實施例12 (DMS2091)的抗-VEGF活性。[1238]圖57實施例12 (DMS2090)的抗-VEGF活性。[1239]圖58實施例12(DMS2090)的抗-ILlRl活性。[1240]圖59實施例12(DMS2091)的抗-ILlRl活性。[1241]圖60抗-TNF/ 抗-VEGF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的克隆(實施例 13)。[1242]圖61抗-TNF/ 抗-VEGF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的 SDS-PAGE 分析(實施例 13)。[1243]圖62實施例13的抗-VEGF活性。[1244]圖63實施例13的抗-TNF活性。[1245]圖64實施例13的抗-EGFR活性。[1246]圖65純化的雙特異性抗體 BPCl6O3 (A) ,BPC1604 (B) ,BPC1605 (C) ,BPC1606 (D)SEC分析。[1247]圖66雙特異性抗體與固定化的IGF-IR的結合。[1248]圖67雙特異性抗體與固定化的VEGF的結合。[1249]圖68不同雙特異性抗體對配體介導的受體磷酸化的抑制。[1250]圖69不同雙特異性抗體對配體介導的受體磷酸化的抑制。[1251]圖70用抗-CD20/IL-13雙特異性抗體進行ADCC測定。[1252]圖71用抗-CD20/IL-13雙特異性抗體進行ADCC測定。[1253]圖72用較短的劑量範圍用抗-CD20/IL-13雙特異性抗體進行ADCC測定。[1254]圖73用較短的劑量範圍用抗-CD20/IL-13雙特異性抗體進行ADCC測定。[1255]圖74用抗-CD20/IL-13雙特異性抗體進行CDC測定。[1256]圖75用抗-CD20/IL-13雙特異性抗體進行CDC測定。[1257]圖76在重組人IGF-IR ELISA中BPC1803和BPC1804的結合。[1258]圖77在重組VEGF結合ELISA中BPC1803和BPC1804的結合。[1259]圖78在重組人IGF-IR ELISA中BPC1805和BPC1806的結合。[1260]圖79在重組人HER2 ELISA中BPC1805和BPC1806的結合。[1261]圖80在重組人IGF-IR ELISA中BPC1807和BPC1808的結合。[1262]圖81在重組人HER2 ELISA中BPC1807和BPC1808的結合。[1263]圖82在重組人IL-4ELISA中BPC1809的結合。[1264]圖83在RNA酶A ELISA中BPC1809的結合。[1265]圖84在重組人IL-4ELISA中BPC1816的結合。[1266]圖85在 HEL ELISA 中 BPC1816 的結合。[1267]圖86在重組人IGF-IR ELISA中BPC1801和BPC1802的結合。[1268]圖87 [1269]圖88 [1270]圖88b[1271]圖89 [1272]圖89b[1273]圖90 [1274]圖91 [1275]圖92 [1276]圖93 [1277]圖94 [1278]圖95 的 SDS PAGE。[1279]圖96
=還原條件]。
1280]圖 97
1281]圖 98
除去GS的PascoH-474的SEC曲線。
除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 的 SEC 曲線。
除去第二個 GS 的 PascoH-GS-ASTKGPT-474 的 SEC 曲線。
除去GS的586H-210的SEC曲線。
除去 GS 的 586H-TVAAPS-210 的 SEC 曲線。
除去 GS 的 PascoH-474 (B 泳道)和除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 (Α 泳道) 除去第二個 GS 的 PascoH-GS-ASTKGPT-474 的 SDS PAGE [A =非還原條件，B
除去 GS 的 586H-210 的 SDS PAGE (Α 泳道)。 除去 GS 的 586H-TVAAPS-210 的 SDS PAGE (Α 泳道)。
1282]圖99 在人IL-4ELISA中純化的除去GS的PascoH-474和除去GS的 PascoH-TVAAPS-474 的結合。
1283]圖100 在人IL-13ELISA中純化的除去GS的PascoH-474和除去GS的 PascoH-TVAAPS-474 的結合。
1284]圖101 在獼猴IL-13ELISA中純化的除去GS的PascoH-474、除去GS的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616 的結合。
1285]圖102 通過ELISA測定mAbdAb抑制人IL-4與人IL_4Ra的結合。
1286]圖103 通過ELISA測定mAbdAb抑制人IL-4與人IL_4Ra的結合。
1287]圖104 在TF-I細胞生物測定中mAbdAb中和人IL-13。
1288]圖105 在TF-I細胞生物測定中mAbdAb中和獼猴IL-13。
1289]圖106 在TF-I細胞生物測定中mAbdAb中和人IL-4。
1290]圖107 在TF-I細胞生物測定中mAbdAb中和獼猴IL_4。
1291]圖108 :mAbdAb抑制人IL-13結合人IL_13Ra 2的能力。
1292]圖 109 :PascoH-616 的 SEC 曲線。
1293]圖 110 :PascoH-TVAAPS_616 的 SEC 曲線。
1294]圖111 :PascoH-616的SDS PAGE[El =非還原性條件，E2 =還原性條件]。
1295]圖112 :PascoH-TVAAPS-616 的 SDS PAGE[A =非還原性條件，B =還原性條件]。
1296]圖 113 在人 IL-13ELISA 中純化的 PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616 的結合。
1297]圖114 在TF-I細胞生物測定中mAbdAb中和人IL-13。
1298]圖114a 在TF-1細胞生物測定中mAbdAb中和獼猴IL-13。
1299]圖115 除去 GS 的 PascoH-474 抑制 IL-4 活性。
1300]圖116 除去 GS 的 PascoH-474 抑制 IL-13 活性。
1301]圖 117 :586-TVAAPS-210 抑制 IL—4 活性。[1302]圖118:586-TVAAPS-210 抑制 IL-13 活性。[1303]圖119帕考珠單抗抑制IL-4活性。[1304]圖120:D0M9-112-210 抑制 IL-4 活性。[1305]圖121抗-IL13mAb抑制IL-13活性。[1306]圖122:D0M10-53-474 抑制 IL-13 活性。[1307]圖123在IL-4全血測定中對照mAb和dAb的活性。[1308]圖124在IL-13全血測定中對照mAb和dAb的活性。[1309]圖125通過針對TNF及EGFR 二者的ELISA評估在給藥後不同時間點的藥物殘留濃度。[1310]圖126通過針對TNF及VEGF 二者的ELISA評估在給藥後不同時間點的藥物殘留濃度。[1311]圖127通過針對ILlRl及VEGF 二者的ELISA評估在給藥後不同時間點的藥物殘留濃度。[1312]圖128純化的 DMS4010 的 SDS-PAGE。[1313]圖129純化的DMS4010的SEC曲線。[1314]圖130:DMS4010 的抗-EGFR 效價。[1315]圖131抗-VEGF受體結合測定。[1316]圖132雙重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的藥代動力學曲線。[1317]圖133純化的DMS4011的SDS-PAGE分析。[1318]圖134純化的DMS4011的SEC曲線。[1319]圖135:DMS4011 的抗-EGFR 效價。[1320]圖136在抗-VEGF受體結合測定中的DMS4011。[1321]圖137純化的樣品DMS4023和DMS4024的SDS-PAGE分析。[1322]圖138:DMS4023 的 SEC 曲線。[1323]圖139:DMS4024 的 SEC 曲線。[1324]圖140 :mAbdAb DMS4023 的抗-EGFR 效價。[1325]圖141在抗-VEGF受體結合測定中的DMS4023和DMS4024。[1326]圖142純化的DMS4009的SDS-PAGE分析。[1327]圖143:DMS4009 的 SEC 曲線。[1328]圖144 :mAbdAb DMS4009 的抗-EGFR 效價。[1329]圖145抗-VEGF受體結合測定中的DMS4009。[1330]圖146純化的DMS4029的SDS-PAGE分析。[1331]圖147:DMS4029 的 SEC 曲線。[1332]圖148 :mAbdAb DMS4029 的抗-EGFR 效價。[1333]圖149在基於IL-13細胞的中和測定中的DMS4029。[1334]圖150純化的樣品DMS4013和DMS4027的SDS-PAGE分析。[1335]圖151:DMS4013 的 SEC 曲線。[1336]圖152:DMS4027 的 SEC 曲線。[1337]圖153 :mAbdAb DMS4013 的抗-EGFR 效價。1338]圖154 在抗-VEGF受體結合測定中的DMS4013。
1339]圖155 在重組人IL-12ELISA中的BPC1616的結合。
1340]圖156 在重組人IL-18ELISA中的BPC1616的結合。
1341]圖157 在重組人IL-4ELISA中的BPC1616的結合。
1342]圖 158 在重組人 IL-4ELISA 中的 BPC1008、1009 和 BPC1010 的結合。
1343]圖159 在重組人IL-5ELISA中的BPC1008的結合。
1344]圖 160 在重組人 IL-13ELISA 中的 BPC1008U009 和 BPC1010 的結合。
1345]圖 161 在重組人 c-MET ELISA 中的 BPC1017 和 BPC1018 的結合。
1346]圖162 在重組人VEGF ELISA中的BPC1017和BPC1018的結合。
1347]圖 163 :PascoH-TVAAPS-546 的 SEC 曲線。
1348]圖 164 :PascoH-TVAAPS-567 的 SEC 曲線。
1349]圖 165 :PascoH-TVAAPS-546 的 SDS PAGE [A =非還原性條件，B =還原性條件]。
1350]圖 166 :PascoH-TVAAPS-567 的 SDS PAGE [A =非還原性條件，B =還原性條件]。
1351]圖167 在TF-I細胞生物測定中對人IL-13的中和數據。
1352]圖168 在TF-I細胞生物測定中對獼猴IL-13的中和數據。
1353]圖169 在人IL-4ELISA中含有備選同種型的mAbdAb的結合。
1354]圖170 在人IL-13ELISA中含有備選同種型的mAbdAb的結合。
1355]圖 171 在重組人 EGFR ELISA 中 BPC1818 和 BPC1813 的結合。
1356]圖 172 在重組人 VEGFR2ELISA 中 BPC1818 和 BPC1813 的結合。
1357]圖 173 在 IL-13ELISA 中抗-IL5mAb-抗-IL13dAb 的結合。
1358]圖 174 在 IL-5ELISA 中抗-IL5mAb-抗-IL13dAb 的結合。
1359]圖 175 在重組人 VEGFR2ELISA 中 BPC1812 的結合。
1360]圖176 在重組人EGFR ELISA中BPC1812的結合。
1361]圖 177 在人 IL-13ELISA 中 mAbdAb 的結合。
1362]1.結構域抗體
1363]SEQ ID NO 1 = D0M9-155-25
1364]DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGffGPPTFGQGTKVEIKR
1365]SEQ ID NO 2 = D0M9-155-147
1366]DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGffGPPTFGQGTKVEIKR
1367]SEQ ID NO 3 = D0M9-155-154
1368]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGffGPPTFGQGTKVEIKR
1369]SEQ ID NO 4 = D0M9-112-210
1370]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS
1371]SEQ ID NO 5 = D0M10-53-474
1372]GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 60 = D0M9-155-147 的 DNA 序列(蛋白質=SEQ IDNO 2)GACATCCAGATGACCCAATCACCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTtG CCGGGCAAGTCGCCCCATtAGCGACTGGTTACATtGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATC GCCTGGGCGtCCTCGTTGTACGAGGGGGtCCCATCACGtTTCAGTGGCAGTGGGTCGGGGACAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCTGCAACCCGAAGATTTCGCTACGTACTACTGTTTGCAGGAGGGGTGGGGTCCTCCGACGTTC GGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGSEQ ID NO 61 = D0M9-155-154 的 DNA 序列(蛋白質=SEQ IDNO 3)GACATCCAGATGACCCAATCACCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTG CCGGGCAAGTCGCCCCATTAGCGACTGGTTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATC GCCTGGGCGTCCAGCTTGCAGGGGGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGGTCGGGGACAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCTGCAACCCGAAGATTTCGCTACGTACTACTGTTTGCAGGAGGGGTGGGGTCCTCCGACGTTC GGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
1377]2.接頭
1378]SEQ ID NO 6 = G4S 接頭
1379]GGGGS
1380]SEQ IDNO :7=接頭
1381]TVAAPS
1382]SEQ IDNO :8=接頭
1383]ASTKGPT
1384]SEQ IDNO :9=接頭
1385]ASTKGPS
1386]SEQ ID NO 10 =接頭
1387]EPKSCDKTHTCPPCP
1388]SEQ ID NO :11 =接頭
1389]ELQLEESCAEAQDGELDG
1390]3.單克隆抗體
1391]SEQ ID NO :12 =抗-人 IL 13mAb(H 鏈)
1392]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRV TITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGKSEQ ID NO 13 =抗-人 IL13mAb (L 鏈)DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISDRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[1395]SEQ ID NO 14 =帕考珠單抗(H 鏈)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 15 =帕考珠單抗(L 鏈)DIVLTQSPSSLSASV⑶RVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO 65 =美泊利單抗(H 鏈)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNSALMSRLSI SKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 66 =美泊利單抗(L 鏈)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNVHSFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO :67 =抗-人 IL_18mAb (H 鏈)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRV TMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLYKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGKSEQ ID NO :68 =抗-人 IL_18mAb (L 鏈)DIQMTQSPSSVSASV⑶RVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC4.雙特異性 mAbdAb注意，序列「粗體」文字的下劃線部分對應於接頭。「GS」胺基酸殘基(其DNA編碼 序列用作BamHI克隆位點)不以「粗體」文字表示，但下劃線。SEQ ID NO 16 = 586H-25 (H 鏈)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K^gDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKRSEQ ID NO :17 = 586H-147(H 鏈)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K^gDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKRSEQ ID NO 18 = 586H_154(H 鏈)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K^gDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKRSEQ ID NO 19 = 586H_210(H 鏈)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 20 = 586H-G4S-25 (H 鏈)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV 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PascoL-TVAAPS-474 (L 鏈)DIVLTQSPSSLSASV⑶RVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAP SGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 57 = PascoL-ASTKG-474 (L 鏈)DIVLTQSPSSLSASV⑶RVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASTKG PTGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEffVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 58 = PascoL-EPKSC-474 (L 鏈)DIVLTQSPSSLSASV⑶RVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR
161EAKVQWKVDNALQSGNSQESV／EQDSKDS／YSLSS／L／LSKADYEKHKVYACEV／HQGLSSPV／KSFNRGEC旦￡絲巨，塑絲工旦工，￡￡，￡巨巨GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAwYDMGwV尺QA屍GKGLEwVSS工DwHGEVTYYADSVKGRF／I SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYwGQGTLVTVSS[1495] SEQ工D N。59一PascoL—ELQLE一474(L鏈)[1496] D工VLTQSPSSLSASVGDRVT工TCKASQSVDYDGDSYMNwYQQKPGKAPKLL工YAASNLESG工PSRFSGSGSG／DF／F／ISSLQPED工ATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVE工KRTVAAPSVF工FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV／EQDSKDS／YSLSS／L／LSKADYEKHKVYACEV／HQGLSSPV／KSFNRGEC旦LQL旦旦巨，A旦AQ塑巨旦L塑巨巨巨GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAwYDMGwV尺QA屍GKGLEwVSS工DwHGEVTYYADSVKGRF／I SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYwGQGTLVTVSS[1497] 巨細胞國王[1498] SEQ工D N。62一工L一4(白介素一4)[1499] HKCDITLQEI工KTLNSLTEQKTLCTELTVTD工FAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKD[1500] TRCLGATAQQFHRHKQL工RFLKRLDRNLwGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKT工MREKY[1501] SKCSS[1502] SEQ工D N。63一工L—13(白介素一13)[1503]GPVPPSTALREL工EELVN工TQNQKAPLCNGSMVwS工NLTAGMYCAALESL工NVSGCSA工EKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTK工EVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN[1504] 巨值號莊型[1505] SEQ工D N。64一哺乳動物胺基酸信號序列[1506] MGWSCI工LFLVATATGVHS[1507] zI巨E二1旦結合，塑旦[1508] SEQ工D 80一VH CDR3[1509] w工LYYGRSKwYFDV[15]0] SEQ工D 8l—VH CDR2[15]]]N工NPNNGGTNYNQKFKD[15]2] SEQ工D 82一VH CDRl[15]3] DYYMN[15]4] SEQ工D 83一VL CDRl[15]5]RSSQS工VQSNGDTYLE[1516] SEQ工D 84一備選VL CDR2[15]7] RISNRFS[15]8] SEQ工D 85一VL CDR3[15]9] FQGSHVPY／[1520] SEQ工D 86一VL CDR2[1521] RVSNRFS[1522] 旦三掛晝性mAl)d叢GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGffVRQAPGKGLEffVSffllSSGTETYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 70 = IL18mAb-G4S-D0M10-53_474 (L 鏈)DIQMTQSPSSVSASV⑶RVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGVQL LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 71 = IL-5mAb-G4S_D0M9-112-210 重鏈QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNNSALMSRLS ISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGG SEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 72 = IL-5mAb-G4S-D0M10-53_474 輕鏈DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKS SQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRF SGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNVHSFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGG GGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS 9.雙重靶向的抗-TNF/ 抗-EGFR mAbdAbSEQ ID NO :73 =抗-TNFmAb (L 鏈)DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO :74 =抗-TNFmAb-D0M16-39_542 (H 鏈)EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTG
163DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKR10.雙重靶向的抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAbSEQ ID NO :75 =抗-TNFmAb-DOMl5-26-593 (H 鏈)EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTG EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS11.雙重靶向的抗-IL1R1/抗-VEGF dAb-延伸的IgGSEQ ID NO 76 = DOM 15-26_593_VH 假體(H 鏈) EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSY GAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 77 = D0M4-130-54_Vk 假體(L 鏈)DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQDIYLNLDWYQQKPGKAPKLLINFGSELQSGVPSRFSGSGYGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQPSFYFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSY LNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPNTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC12.三重靶向的抗-TNF/ 抗-EGFR/ 抗-VEGF mAbdAbSEQ ID NO 78 = DOM 15-26-抗-TNFmAb (H 鏈)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLS CAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 79 = DOM 16-39-542-抗-TNFmAb (L 鏈)[1548]DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSGYGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNY LAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO 87 =除去 GS 的 586H_210(H 鏈)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 88 =除去 GS 的 586H-TVAAPS-210 (H 鏈)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV 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ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
165GKASTKGPSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGffVRQAPGKGLEffVSffllSSGTETYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 91 =除去 GS 的 PascoH_474(H 鏈)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 92 =除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 (H 鏈)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVA APSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 93 =兩個 GS 都除去的 PascoH-ASTKGPT-474 (H 鏈)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAST KGPTGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEffVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 94 =兩個 GS 都除去的 PascoH-ASTKGPS-474 (H 鏈)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAST KGPSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 95 =除去第二個 GS 的 PascoH-ASTKGPS-474 (H 鏈)[1566]QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSA STKGPSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEffVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 96 =除去第二個 GS 的 PascoH-ASTKGPT-474 (H 鏈)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSA STKGPTGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEffVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS
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183GCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGA TTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCA AGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAA CAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGA GCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGT CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGSEQ ID NO: 173CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGTAC CGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGCTG GGAGTGATCTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGACTGAGCATCAACAAGGACAAC AGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCC CTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAG GGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTG 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186GACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCT GCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGACATCCAGA TGACCCAGAGCCCTTCAAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGTGGATC GGCAACCTGCTGGACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCTTCCTGCA GAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTACGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCG AGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCCAACCCTGCCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGTACCAAGGTGGAAATC AAACGGSEQ ID NO: 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189CCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGGATCCACGGTGGCCGCCCCCAGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGT CTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTAT CCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATAC ATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGA ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCGAGCSEQ ID NO: 190DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSTVAAPSE VQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 191QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNSALMSRLSI SKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 192 :586H-ASTKG_210 重鏈CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAG GCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGG CACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGATGAGA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATC TACGACGACTACCACTACGACGACTACTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGC CAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCT GCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCAC CCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTG ACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACA GCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTG TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTAC ACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAG CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCG ATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCAGCCAGCAC CAAGGGCCCCACGGGATCCGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGC
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194[1793]SEQ ID NO 209 =PascoH IgG4PE_GS_474 重鏈QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSGVQL LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 210 抗-人 IL13mAb 輕鏈GACATCGTGATGACCCAGTCTCCTCTGAGCCTCCCCGTGACCCCCGGCGAACCAGCCAGCATCTCCTGC AGAAGCAGCCAGAACATCGTGCACATCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAAAAGCCCGGCCAGAGCCC CAGGCTGCTGATCTACAAGATCAGCGACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCG ACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGACGACGTGGGCATCTACTACTGCTTCCAGGGCAGCCACGTCCCC 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TCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG AGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAA CGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCC CCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATG ATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCT GCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAG AGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCT GCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGSEQ ID NO 214 美泊利單抗輕鏈GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCACTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGC AAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCC CCCCAAGCTGCTGATCTATGGCGCCTCCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCAGACAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCA CCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGTCCACAGCTTC CCCTTCACCTTCGGCGGGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCC CAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGG TGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCC ACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGAC CCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCSEQ ID NO 215 :PascoH_474 重鏈[1806]CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGA GGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGA GCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTAT GATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGAC CTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 216 :PascoH-TVAAPS_474 重鏈CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG
197TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGA GGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCG GCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGC TTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGA CTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACA CCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCC GGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO 217 :PascoL_474 輕鏈
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTTCCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGGGTGACC ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTAC CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAGTCA GGCATTCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACAATCAGC AGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCTCCC ACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTGGATCC GGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCC CCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTAC GCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAG GACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO 218 :PascoL-TVAAPS_474 輕鏈
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTTCCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGGGTGACC ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTAC CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAGTCA GGCATTCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACAATCAGC AGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCTCCC ACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCACCGTG GCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCC[1840] GGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATG [1841 ] GGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCC TGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :219 :IL-5mAb-G4S-D0M9-112_210 重鏈CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACTCTGACCTGCACC GTGAGCGGCTTCAGCCTGACCTCCTACAGCGTCCACTGGGTGAGGCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGG CGTGATCTGGGCAAGCGGCGGCACCGACTACAACAGCGCCCTGATGAGCAGGCTCTCCATCAGCAAGGACACCAGCC GGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCCACCTATTACTGCGCCAGGGACCCTCCC TCTAGCCTGCTGAGGCTGGACTACTGGGGCAGGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACT TCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG AGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAA CGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCC CCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATG ATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCT GCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAG AGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCT GCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGGCGGCGGATCCGAAGTGCAGCTCCTGG AGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAAC TTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGA GACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAG GGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :220 :IL-5mAb-G4S-D0M10-53_474 輕鏈GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCACTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC [1851 ] TGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTATGGCGCCTCCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCAGACAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGTCCACAGCTTCCCCTTCACCTTCGGCGGGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTG[1857]CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC[1858]CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGT[1859]GAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC[1860]GGCGGCGGCGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGC[1861]GGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGC[1862]TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGG[1863]GAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGC[1864]AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTAC[1865]TGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGG[1866]GCCAGGGCACCCTGGTGACT[1867]GTGAGCAGC[1868]SEQ ID NO 221 :586H_210 重鏈(除去 GS)[1869]CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAG
GCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGG CACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGATGAGA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATC TACGACGACTACCACTACGACGACTACTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGC CAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCT GCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCAC CCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTG ACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACA GCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTG TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTA CACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGC GATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTC CGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGAAGTGCAGCTCC TGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGG AACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCAC CGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGC AGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGA CAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 222 :586H-TVAAPS_210 重鏈(除去 GS)CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAG GCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGG CACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGATGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATC TACGACGACTACCACTACGACGACTACTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCTAGCGC CAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCT GCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCAC CCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTG ACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACA GCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTG TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTA CACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGC GATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTC CGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCC CCTCGGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCT AGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTG GATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCA AGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGC AGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGC
1872
1873
1874
1875
1876
1877
1878
1879
1880 1881 1882
1883
1884
1885
1886
1887
1888
1889
1890
SEQ ID NO 223 :PascoH_474 重鏈(除去 GS)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
201GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC
ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT
GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC
ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGA
GGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTC
GCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCC
AGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACC
ATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAG
GACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGC
CAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC
SEQ ID NO 224 :PascoH-TVAAPS_474 重鏈(除去 GS)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG
ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG
CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG
TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG
GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG
GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC
AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC
GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG
TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC
AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG
ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG
CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA
GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC
CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC
TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC
AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC
AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC
AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC
ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT
GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC
ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAG
CTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC
GCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAG
GGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGC
GTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATG[1930]AACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 225 :PascoH-ASTKGPT_474 重鏈(除去第二個 GS)CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG [1941 ]TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT [1951 ]GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCAGCCAGCACCAAGGGCCCCACGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :226 在 C-末端用 TVAAPSGS 接頭與 D0M15-26-593 融合的抗-IGF-1R 抗體HOLO的重鏈CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC
203CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTgTAaCgTgAACcACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGG GATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCT AGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGA GATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCA AGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGG AAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO :227 :IGFlRmAb-GS-D0M15-26_593 重鏈CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTgTAaCgTgAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCC TGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAG GCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGC AGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGC CAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO 228 抗-IGF-1R 抗體重鏈CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC 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205HOLO的輕鏈GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGC AGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCC CCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCG ACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCC TACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG CGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGC AGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCA CCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCG GCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCC ATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTA CTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACT CTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACT CTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO 231 抗-IGF-1R 抗體輕鏈GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGC AGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCC CCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCG ACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCC TACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG CGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGC AGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCA CCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCSEQ ID NO 232 抗-IGFlR 重鏈-GS-TLPCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
206AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGACGGCGGCGGCA TTAGGAGGAGCATGAGCGGCACCTGGTACCTGAAGGCCATGACCGTGGATAGGGAGTTCCCCGAGATGAACCTGGAG AGCGTGACCCCCATGACACTGACCCTGCTCAAGGGCCACAACCTGGAGGCCAAGGTCACCATGCTGATCTCAGGCAG GTGCCAGGAGGTGAAGGCAGTGCTGGGCAGGACCAAGGAGAGGAAGAAGTACACCGCCGACGGGGGCAAGCACGTGG CCTATATCATCCCCAGCGCCGTGAGGGACCACGTGATCTTCTACAGCGAGGGCCAGCTCCACGGAAAGCCCGTGAGA GGCGTGAAGCTGGTGGGCAGGGACCCCAAGAACAACCTGGAGGCCCTGGAGGACTTCGAAAAAGCCGCAGGCGCCAG GGGCCTGTCCACTGAGAGCATCCTGATCCCTAGGCAGAGCGAGACCTGCAGCCCCGGCSEQ ID NO :233 抗-IGFlR 重鏈-GS-CTOl adnectinCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGGTGGCCG CCACCCCCACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTACTACAGGATCACCTACGGCGAG ACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAGCC CGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCA TCAACTACAGGACCSEQ ID NO 234 抗-IGF IR 重鏈-TVAAPSGS-TLPCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC
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210GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC 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212CGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGT CTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCT GCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAG AGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG TACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCT GCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAGAGATCCGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCA GCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAAC AGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTA CACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGA CCSEQ ID NO 243 愛必妥輕鏈GACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTCAGCTGC CGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAA 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214TACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGC CACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGC TGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACGTCGACCGGTGACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTG AGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTCAGCTGCCGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCA GCAGCGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGTCCATCAGCGGCATCCCCAGCCGGTTCA GCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGATATCGCCGACTACTACTGC CAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAG CGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCT ACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAG CAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGT GTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCSEQ ID NO 248 (PascoH-616 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重鏈CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG
217[2082]CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGTGTTCCCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGAAGGGGGGCAAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :253 :PascoH-546_ 重鏈CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGA GGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCG GAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGTGTTCCCCTGGTATGATATG GGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGAAGGGGGGCAAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCC TGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGC ACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :254 :PascoH-TVAAPS-567_ 重鏈CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGTGTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 255 (PascoH_567_ 重鏈)CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG[2138]GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAA 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重鏈CAGGTGCAGCTCGTCCAGTCTGGGGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTATACCTTCATCGACTACGAGATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGGCAGGGCCTGGAGTGGATGGG CGCCATCGACCCAGAGACCGGAGGCACGGCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGACGGGTCACCATGACAACCGATACCA GCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGCGCAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCGGTGTACTACTGTACGCGCATCCTG CTCTACTACTACCCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAG TCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA CGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA 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220GGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAASEQ ID NO 257 抗 IL-5 重鏈-G4S-dAb474-TVAAPSGS_dAb210CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACTCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCTCCTACAGCGTCCACTGGGTGAGGCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGCAAGCGGCGGCACCGACTACAACAGCGCCCTGATGAGCAGGCTCTCCATCAGCAAGGACACCAGCCGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCCACCTATTACTGCGCCAGGGACCCTCCCTCTAGCCTGCTGAGGCTGGACTACTGGGGCAGGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGGCGGCGGATCTGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTG[2199]GGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 258 抗 CD-20 重鏈-TVAAPSGS-dAbl54-TVAAPSGS_dAb474CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTCGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCCGGCAACGGCGACACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTCTGGGGCGCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG [2211 ]ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATTACCTGCAGGGCCAGCAGGCCCATCAGCGACTGGCTGCACTGGTACCAACAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCGCCTGGGCCAGCAGCCTGCAGGGAGGCGTGCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACCATCTCTTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGAGGGCTGGGGGCCCCCTACTTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 259 抗 CD-20 重鏈-TVAAPSGS-dAb210-TVAAPSGS_dAb474CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATG
222[2238]TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTCGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCCGGCAACGGCGACACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTCTGGGGCGCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCTGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 260 抗 cMET 5D5v2 重鏈(hole)-GS_dAb593GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCC GCTAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGCTCCACTGGGTCAGGCAGGCCCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGG CATGATCGACCCCAGCAACAGCGACACCAGGTTCAACCCCAACTTCAAGGACAGGTTCACCATCAGCGCCGACACTAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCACCTACAGG AGCTACGTCACCCCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACT TCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG AGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAA CGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCC CCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATG ATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCT GCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAG AGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG GTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCT GCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCG GCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATG ATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTA CGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTC TGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTG GTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO 261 抗 cMET 5D5v2 重鏈(knob)-GS_dAb593TGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO 262 抗 cMET 5D5v2 輕鏈[2294]GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCAGTGGGAGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGTACACCAGCAGCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCACCAGGGAGTCAGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACTCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACTACGCCTATCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCSEQ ID NO : 263 抗 cMET 5D5V2 IgG4 重鏈(UNIBODY)-GS_dAb593GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGCTCCACT GGGTCAGGCAGGCCCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCATGATCGACCCCAGCAACAGCGACACCAGGTTCAACCCCAACTTCAAGGACAGGTTCACCATCAGCGCCGACACTAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCACCTACAGG [2311 ]AGCTACGTCACCCCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGAC
225[2333]TATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO 264 抗 cMET 5D5V2 重鏈(hole)GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGCTCCACTGGGTCAGGCAGGCCCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCATGATCGACCCCAGCAACAGCGACACCAGGTTCAACCCCAACTTCAAGGACAGGTTCACCATCAGCGCCGACACTAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCACCTACAGGAGCTACGTCACCCCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGSEQ ID NO 265 抗 cMET 5D5v2 重鏈(knob)TGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGSEQ ID NO 266 抗 cMET 5D5v2IgG4 重鏈(UNIBODY)[2372]GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGCTCCACTGGGTCAGGCAGGCCCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCATGATCGACCCCAGCAACAGCGACACCAGGTTCAACCCCAACTTCAAGGACAGGTTCACCATCAGCGCCGACACTAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCACCTACAGGAGCTACGTCACCCCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGSEQ ID NO :267 :PascoH IgG2_GS_474 重鏈CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACAC CTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCCC CCTGCCCTGCCCCTCCTGTGGCCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGC CGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGC TGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCC ATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGA AATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCC TGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGG GTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGA CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGG CCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTG GTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 268 :PascoH IgG4_GS_474 重鏈CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACAC CTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCA GCTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC AGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGC TCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGA AGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTAC AGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAG GCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGC TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGC CGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :269 :PascoH IgG4PE_GS_474 重鏈CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG
228CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACAC CTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCC CCTGCCCTGCCCCCGAGTTCGAGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC AGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGC TCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGA AGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTAC AGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAG GCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGC TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGC CGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 270 抗 IL-4 重鏈-GS-抗 TNF_a adnectinCAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGA GGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGTGAGCGACGTGCCAAGGG ACCTCGAGGTGGTGGCAGCCACTCCCACCTCTCTGCTGATCAGCTGGGACACACACAACGCCTACAACGGCTACTAC AGGATCACCTACGGAGAGACCGGCGGCAATAGCCCCGTGAGGGAGTTCACCGTGCCCCACCCCGAGGTGACCGCCAC CATTAGCGGCCTGAAGCCCGGCGTGGACGATACCATCACCGTCTACGCCGTGACCAACCACCACATGCCCCTGAGGA TCTTCGGCCCCATCAGCATCAACCATAGGACC
229
權利要求
抗原結合構建體，所述抗原結合構建體包含連接到一個或多個表位結合結構域的蛋白質骨架，其中所述抗原結合構建體具有至少兩個抗原結合位點，其中至少一個來自表位結合結構域，並且其中至少一個來自配對的VH/VL結構域。
2.抗原結合構建體，所述抗原結合構建體包含至少一個包含兩個或更多個式I結構的 同型二聚體 其中X代表包含重鏈恆定結構域2和重鏈恆定結構域3的抗體恆定區；R1、R4、R7和R8代表獨立選自表位結合結構域的結構域；R2代表選自重鏈恆定結構域1和表位結合結構域的結構域；R3代表選自配對的VH和表位結合結構域的結構域；R5代表選自輕鏈恆定結構域和表位結合結構域的結構域；R6代表選自配對的VL和表位結合結構域的結構域；η代表獨立選自以下的整數0、1、2、3和4 ；m代表獨立選自以下的整數0和1 ；其中重鏈恆定結構域1與輕鏈恆定結構域相連接；並且其中存在至少一個表位結合結構域；當R3代表配對的VH結構域時，R6代表配對的VL結構域，由此兩個結構域一起能夠結 合抗原。
3.權利要求2的抗原結合構建體，其中R6代表配對的VL並且R3代表配對的VH。
4.權利要求3的抗原結合構建體，其中R7和R8中的任一個或兩個代表表位結合結構域。
5.權利要求2-4中任一項的抗原結合構建體，其中R1和R4中的任一個或兩個代表表 位結合結構域。
6.權利要求2-4中任一項的抗原結合構建體，其中存在R4。
7.權利要求2-6中任一項的抗原結合構建體，其中R1R7和R8代表表位結合結構域。
8.權利要求2-6中任一項的抗原結合構建體，其中R1R7和R8、和R4代表表位結合結構域。
9.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中至少一個表位結合結構域為dAb。
10.權利要求9的抗原結合構建體，其中所述dAb為人dAb。
11.權利要求9的抗原結合構建體，其中所述dAb為駱駝dAb。
12.權利要求9的抗原結合構建體，其中所述dAb為鯊魚dAb(NARV)。
13.權利要求1-8中任一項的抗原結合構建體，其中至少一個表位結合結構域源自選 自以下的骨架CTLA-4 (Evibody)；脂質運載蛋白；源自蛋白A的分子，例如蛋白A的Z-結構 域(Affibody，SpA)、A-結構域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白，例如 GroEl 和 GroES ；轉 鐵蛋白(trans-body)；錨蛋白重複蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結構域(四連凝集 素)；人Y-晶體蛋白和人泛素(affilin) ；PDZ結構域；人蛋白酶抑制劑蠍毒素kimitz型 結構域；和纖連蛋白(adnectin)。
14.權利要求13的抗原結合構建體，其中所述表位結合結構域來源於選自Affibody、 錨蛋白重複蛋白(DARPin)和adnectin的骨架。
15.權利要求1-8中任一項的抗原結合構建體，其中所述表位結合結構域選自dAb、 Affibody、錨蛋白重複蛋白(DARPin)和 adnectin。
16.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中所述結合構建體對不止一種抗原 具有特異性。
17.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中所述第一結合位點對抗原上的第 一表位具有特異性，所述第二結合位點對同一抗原上的第二表位具有特異性。
18.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中所述抗原結合構建體能夠結合 IL-13。
19.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中所述抗原結合構建體能夠結合兩 種或更多種選自IL-13、IL-5和IL-4的抗原。
20.權利要求19的抗原結合構建體，其中所述抗原結合構建體能夠同時結合IL-13和 IL-4。
21.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中所述抗原結合構建體能夠結合兩 種或更多種選自VEGF、IGF-IR和EGFR的抗原。
22.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中所述抗原結合構建體能夠結合TNF。
23.權利要求22的抗原結合構建體，其中所述抗原結合構建體能夠結合TNF和IL1-R。
24.權利要求1或9-23中任一項的抗原結合構建體，其中所述蛋白質骨架為Ig骨架。
25.權利要求24的抗原結合構建體，其中所述Ig骨架為IgG骨架。
26.權利要求25的抗原結合構建體，其中所述IgG骨架選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。
27.權利要求1或9-26中任一項的抗原結合構建體，其中所述蛋白質骨架包括單價抗體。
28.權利要求25-27中任一項的抗原結合構建體，其中所述IgG骨架包含抗體的所有結 構域。
29.權利要求9-12或15-28中任一項的抗原結合構建體，其中所述抗原結合構建體包 含四個結構域抗體。
30.權利要求29的抗原結合構建體，其中兩個結構域抗體對同一抗原具有特異性。
31.權利要求29的抗原結合構建體，其中所有結構域抗體對同一個抗原具有特異性。
32.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中至少一個單一可變結構域通過接 頭直接連接到Ig骨架，所述接頭包含1-150個胺基酸。
33.權利要求32的抗原結合構建體，其中至少一個單一可變結構域通過接頭直接連接 到Ig骨架，所述接頭包含1-20個胺基酸。
34.權利要求33的抗原結合構建體，其中至少一個表位結合結構域通過接頭直接連接 到所述Ig骨架，所述接頭選自以下任一種SEQ ID N0:6-ll中所述的接頭或「GS」或其任 思組合。
35.前述權利要求中任一項的抗原結合構建體，其中至少一個表位結合結構域結合人 血清白蛋白。
36.權利要求21-33中任一項的抗原結合構建體，所述抗原結合構建體包含在輕鏈的 N-末端連接到Ig骨架的表位結合結構域。
37.權利要求21-33中任一項的抗原結合構建體，所述抗原結合構建體包含在重鏈的 N-末端連接到Ig骨架的表位結合結構域。
38.權利要求21-33中任一項的抗原結合構建體，所述抗原結合構建體包含在輕鏈的 C-末端連接到Ig骨架的表位結合結構域。
39.權利要求21-33中任一項的抗原結合構建體，所述抗原結合構建體包含在重鏈的 C-末端連接到Ig骨架的表位結合結構域。
40.權利要求1或2的抗原結合構建體，所述抗原結合構建體具有4個抗原結合位點並 能夠同時結合4個抗原。
41.用於藥物的前述權利要求中任一項的抗原結合構建體。
42.用於製備治療癌症或諸如哮喘、風溼性關節炎或骨關節炎等炎性疾病的藥物的前 述權利要求中任一項的抗原結合構建體。
43.治療罹患癌症或諸如哮喘、風溼性關節炎或骨關節炎等炎性疾病的患者的方法，所 述方法包括給予治療量的前述權利要求中任一項的抗原結合構建體。
44.用於治療癌症或諸如哮喘、風溼性關節炎或骨關節炎等炎性疾病的前述權利要求 中任一項的抗原結合構建體。
45.編碼權利要求1-40中任一項的抗原結合構建體的重鏈的多核苷酸序列。
46.編碼權利要求1-40中任一項的抗原結合構建體的輕鏈的多核苷酸。
47.經轉化或轉染的重組宿主細胞，所述宿主細胞包含一個或多個編碼前述權利要求 中任一項的抗原結合構建體的重鏈和輕鏈的多核苷酸序列。
48.用於製備權利要求1-40中任一項的抗原結合構建體的方法，所述方法包括培養權 利要求47的宿主細胞和分離所述抗原結合構建體的步驟。
49.藥用組合物，所述藥用組合物包含權利要求1-38中任一項的抗原結合構建體和可 藥用載體。
全文摘要
本發明涉及抗原結合構建體、製備所述構建體的方法及所述構建體的用途，所述抗原結合構建體包含連接一個或多個表位結合結構域的蛋白質骨架，其中所述抗原結合構建體具有至少兩個抗原結合位點，其中至少一個來自表位結合結構域，其中至少一個來自配對的VH/VL結構域。
文檔編號C07K16/24GK101932608SQ200880126310
公開日2010年12月29日 申請日期2008年11月28日 優先權日2007年11月30日
發明者A·路易斯, C·阿什曼, F·海珊, J·H·艾利斯, L·耶斯珀斯, M·A·奧雷基亞, M·N·伯登, M·斯圖爾德, P·A·漢布林, R·M·德威爾德特, R·夏, S·J·克萊格, T·巴圖萬加拉 申請人:葛蘭素集團有限公司