一種生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法及其專用菌株的製作方法

2023-10-05 18:33:39 1

專利名稱：一種生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法及其專用菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中一種生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法及其專用菌株。
背景技術：
利用環糊精葡萄糖基轉移酶(cyclodextrin glucanotransferase，CGTase)可將來源豐富、價格低廉的澱粉類物質轉化成β-環糊精(β-CD)。β-CD及其衍生物做為添加劑或包埋材料在食品、醫藥、農藥及環保領域用途廣泛且具有無毒副作用、包埋用量大的特點。我國β-CD的生產雖有20多年的歷史，但由於生產菌種酶產量不高及β-CD生產成本過高而導致其應用受到限制，因此，選育CGTase高產菌是我國酶製劑研究的一項重要任務。優良的菌種是提高CGTase活力的關鍵，而適宜的生產方法和培養條件是發揮優良菌種性能、獲得高產酶量的保證。環糊精葡萄糖基轉移酶可由嗜鹼芽孢桿菌發酵生產，但目前微生物發酵生產環糊精葡萄糖基轉移酶的產量不高，且發酵時間較長。
離子注入誘變育種是近年來興起的一種新型誘變育種方法，已在農作物及工業微生物菌種的誘變育種領域取得豐碩成果(汪秀峰，吳敬德。離子注入改良水稻廣親和系02428[J]。安徽農業大學學報，1999，26(4)423-426；桑金隆，竺莉紅，李孝輝。離子注入誘變選育之江菌素產生菌[J]。科技通報，2002，18(1)63-66)。注入離子對生物體的作用是集能量沉積、動量傳遞、質量沉積和電荷的中和與交換於一體的聯合作用(餘增亮，霍裕平。離子注入生物學研究述評[J]。安徽農業大學學報，1994，21(3)221-225)。離子注入對生物細胞既存在著直接作用又存在著間接作用，注入離子的動量傳遞產生了對細胞的直接作用，其能量沉積顯示著對細胞的間接作用。已有研究表明質量沉積作用能誘導注入的生物分子或細胞內生成新產物(邵春林，餘增亮。低能離子輻照的刺激效應模型[J]。核技術，1996，19(6)321-325)。生物大分子中不乏氮元素，因此氮離子注入對生物體的誘變作用是多重性的，它與γ-射線或紫外線誘變有所不同，是損傷及修復同時進行的一種複合誘變。

發明內容
本發明的目的是提供一種生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法及其專用菌株。
本發明所提供的生產環糊精葡萄糖基轉移酶的菌株是嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)HA-1，已於2004年12月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC № 1278。
該菌株的細胞呈杆狀，直徑小於1μM，孢囊膨大，中生或次端生芽孢，革蘭氏染色陽性，菌落圓滑呈黃橙色，好氧，在pH值8.5-9.5條件下生長良好。
本發明所提供的生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法，是由嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278發酵得到的。
其中，所述嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的發酵培養基包括玉米粉或玉米澱粉1.5％-2.5％，蛋白質含量≥40％的玉米漿5.0％-6.5％；所述百分含量除玉米漿為體積百分含量外，其餘均為質量百分含量。所述玉米粉或玉米澱粉的質量百分含量優選為1.5％-2.0％，蛋白質含量≥40％的玉米漿的體積百分含量優選為5.0％-5.5％。
為了提高環糊精葡萄糖基轉移酶的產量，所述發酵培養基還包括質量百分含量為0.2％的K2HPO4，質量百分含量為0.02％的MgSO4·7H2O。
所述發酵的起始pH為8.5-9.5，優選為8.6-9.2，可用Na2CO3調節。
所述嗜鹼芽孢桿菌HA-1 CGMCC № 1278的培養溫度可為27℃-29℃。
所述發酵的通氣量可為0.8-1.2m3/m3/min，優選為1m3/m3/min。
本發明的嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278產酶水平高、發酵時間短，且產酶具有傳代穩定性，10L發酵罐中發酵24h產酶活力(酶產量)可達到6100U/ml(是原始出發菌株的2倍以上)；5000L發酵罐中發酵20.5h產酶活力可達到6875U/mL。本發明的方法及其專用菌株將在環糊精葡萄糖基轉移酶的生產中發揮重要作用，具有廣闊的工業應用前景。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規方法；所提到的百分含量如無特別說明均為質量百分含量。
實施例1、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的獲得培養基平板分離及斜面培養基(％)可溶性澱粉2％；聚蛋白腖0.5％；酵母浸膏0.5％；K2HPO40.1％；MgSO4·7H2O0.02％；瓊脂3％；滅菌後加入無菌Na2CO3調pH至8.5-9.5。
發酵培養基2.5％玉米粉；5％(V/V)玉米漿(蛋白質的質量百分含量≥40％，購自新鄉澱粉廠)；0.1％K2HPO4；0.02％MgSO4·7H2O；滅菌後加入無菌Na2CO3調pH至8.5-9.5。
將固體培養基上生長36h的嗜鹼芽孢桿菌C(購自鄭州市醫藥科技開發中心)製成菌懸液，取0.1ml均勻塗布於滅菌的平皿，置於28℃培養箱中培養。挑單菌落於平面固體培養基上，待菌長出後，挑選相對菌小圈(澱粉水解圈)大的菌落製成菌懸液，取0.1ml均勻塗布於滅菌的平皿中心一薄層，無菌風乾後立即進行誘變處理先進行γ-誘變(0.5Gy)，然後依次進行能量30kev劑量如下的氮離子注入誘變2×1015個氮離子/cm2、1×1015個氮離子/cm2、兩輪5×1015個氮離子/cm2、2×1015個氮離子/cm2、1×1016個氮離子/cm2及5×1015個氮離子/cm2的氮離子注入誘變。注入後立即用無菌水洗脫菌斑，稀釋(10-1-10-2)後塗皿，置於28℃培養箱中培養。挑單菌落於固體平板培養基上，待菌落長出後，視菌落周圍透明圈(澱粉水解圈)的大小進行初篩，挑選相對菌小圈大的菌落接種於斜面，28℃培養1d後挖塊接種於裝有30ml發酵培養基的250ml三角瓶中，在200rpm搖床上發酵1-2d，測定發酵液酶活力，進行復篩。參照文獻(張樹政.酶製劑工業[M].北京科學出版社，1984.549)的方法測定酶活力，具體方法如下取10μl樣品(對照不加樣品)，加入0.2ml pH9.0的0.2M甘氨酸-氫氧化鈉緩衝溶液，0.2ml 0.2％馬鈴薯澱粉溶液(空白不加馬鈴薯澱粉溶液)，40℃反應10min後加入0.5ml 0.5M醋酸終止反應，加入3ml 0.005％碘液顯色，在700nm處測定吸光值(A)，以吸光值下降10％的酶量為1個單位。
計算公式 結果表明嗜鹼芽孢桿菌C經自然分離得到的產酶活性(酶產量)較高的0-4菌株38h的產酶活性為2500U/mL，然後對該菌株進行γ-誘變，得到的產酶活性較高的02-1-29菌株40h的產酶活性為3633U/mL；再對02-1-29菌株進行能量為30kev，劑量2×1015個氮離子/cm2的離子誘變，得到的產酶活性較高的02-2-500菌株41h的產酶活性為7129U/mL；再對02-2-500菌株進行能量為30kev，劑量1×1015個氮離子/cm2的離子誘變，得到的產酶活性較高的02-3-209菌株46h的產酶活性為4067U/mL；再對02-3-209菌株進行能量為30kev，劑量5×1015個氮離子/cm2的離子誘變，得到的產酶活性較高的02-4-417菌株40h的產酶活性為6371U/mL；再對02-4-417菌株進行能量為30kev，劑量5×1015個氮離子/cm2的離子誘變，得到的產酶活性較高的02-5-71菌株(24h的酶活性為2012U/mL，41h的產酶活性為5805U/mL)；再對02-5-71菌株進行能量為30kev，劑量2×1015個氮離子/cm2的離子誘變，對篩選得到的產酶活性較高的菌株再進行能量為30kev，劑量1×1016個氮離子/cm2的離子誘變，再對由該劑量篩選得到的產酶活性較高的菌株進行能量為30kev，劑量5×1015個氮離子/cm2的離子誘變，得到一株酶活性較高的菌株-HA-1菌株，其24h的酶活性為4185U/mL，其41h的酶活性為6500U/mL。以上均為搖瓶發酵結果。
對以上篩選得到的菌株結合遺傳穩定性確定最佳菌株，02-2-500雖產酶活力較高，但此菌株傳代不穩定，F2代產酶又下降至02-1-29水平。對此菌株繼續進行氮離子注入誘變，得到02-3-209，此菌株產酶活力雖然不是同期最高者，但其29hr產酶2487U/ml，為同期復篩中最高者，故以此菌株作為出發株又進行一輪氮離子注入誘變，得到02-4-417，此菌株來自於5×1015個氮離子/cm2劑量誘變，40hr產酶活性6371U/ml為同期最高，但同樣具有傳代不穩定的特點，再次以此菌株作為出發株進行新一輪氮離子注入誘變，得到02-5-71，該菌株也來自於5×1015個氮離子/cm2劑量誘變，41hr產酶活性5805U/ml為同期最高。02-5-71菌株具有較好的傳代穩定性，與F1代相比較，F2、F3、F4、F5代的產酶活性分別是F1代的96.66％、103.02％、99.11％、101.46％。為了得到發酵時間較短，且產酶活性較高的菌株，再對02-5-71菌株進行能量為30kev，劑量2×1015個氮離子/cm2的離子誘變、篩選，能量為30kev，劑量1×1016個氮離子/cm2的離子誘變、篩選，及能量為30kev，劑量5×1015個氮離子/cm2的離子誘變、篩選，得到一株產酶活性較高且發酵時間較短的菌株-HA-1菌株，其24h的產酶活性為4185U/mL，其41h的酶活性為6500U/mL。HA-1菌株具有較好的傳代穩定性，與親代相比較，F1、F2、F3、F4、F5代的產酶活性分別是親代的108％、110％、98％、111％、107％。
實施例2、發酵條件的篩選應用正交實驗法製成四因素三水平正交表L9(34)進行HA-1菌株和02-5-71菌株發酵條件的篩選表1 02-5-71菌株實驗因素水平表 表2 02-5-71菌株一級發酵39h正交設計實驗數據

表3 應用營養物不同比例搭配配方HA-1菌株發酵結果

以含有K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％的培養基中玉米粉、玉米漿百分含量及發酵的pH、溫度為考察因素，各取3個水平(表1)，確定02-5-71菌株的適宜發酵條件。由斜面菌種直接接種於含30ml發酵培養基的250ml三角瓶中，02-5-71菌株200rpm一級發酵39h，以發酵液酶活力為考察指標，結果如表2所示，表明4個考察因素中發酵溫度及培養基中玉米漿含量對發酵產酶影響較大。發酵液的酸鹼度對菌種產酶影響較大，pH小於8或大於10產酶量均較低，為了進一步確定最佳pH，實驗選擇pH8.5-9.5作為正交實驗的其中一因素三水平，結果表明，pH在8.5、9、9.5三個水平雖然極差最小，但發現02-5-71菌株pH為9時產酶較高，經正交法篩選的02-5-71菌株的適宜發酵條件為玉米粉2％，玉米漿(蛋白質的質量百分含量≥40％，購自新鄉澱粉廠)5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，初始pH9，培養溫度28℃；在此發酵液配方的基礎上進一步優化HA-1菌株的適宜發酵配方，搖瓶發酵結果如表3所示，表明HA-1菌株的適宜發酵配方為玉米粉1.5％-2.5％，玉米漿(蛋白質的質量百分含量≥40，購自新鄉澱粉廠)5.0％-6.5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，滅菌後用無菌的Na2CO3調初始pH為8.6-9.0。以上除玉米漿為體積百分含量外，其餘均為質量百分含量。培養溫度27℃-29℃。
應用HA-1菌株的適宜發酵培養基配方玉米粉2.0％，玉米漿(蛋白質的質量百分含量≥40％，購自新鄉澱粉廠)5.0％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％)在種齡為23-26h、接種量8％、初始pH8.9-9.0、培養溫度27-29℃、裝罐量75％、通氣量(每分鐘通入發酵罐的空氣體積與發酵罐中發酵液體積的比值)為1m3/m3/min的發酵條件下，於10L發酵罐中發酵24小時，0-4菌株、02-5-71菌株與HA-1菌株產酶活力分別為2600U/ml發酵液、3573U/ml發酵液和6100U/ml發酵液。
在培養基中添加無機鹽的研究表明添加K2HPO4(0.2％)和MgSO4·7H2O(0.02％)對發酵產酶有利，不加此兩種無機鹽或添加其它無機鹽將導致酶大幅度減產或不產酶。因此這兩種無機鹽在菌種發酵產酶中非常關鍵。
實施例3、利用嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278生產環糊精葡萄糖基轉移酶將嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278菌種接入300L種子罐(培養基為玉米粉2％，玉米漿(蛋白質的質量百分含量≥40％，購自孟州金玉米有限公司)5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，滅菌後加入無菌的Na2CO3溶液將培養基的pH調到8.6))，27-29℃培養24h後以5％的接種量接入5000L發酵罐(培養基玉米粉2.3％，玉米漿(蛋白質的質量百分含量≥40％，購自孟州金玉米有限公司)5.6％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，滅菌後加入無菌的Na2CO3溶液將培養基的pH調到8.8)中，通氣量(每分鐘通入發酵罐的空氣體積與發酵罐中發酵液體積的比值)為1m3/m3/min，27-29℃培養，結果表明在5000L發酵罐中發酵20.5h產酶活力就可達到6875U/mL。
權利要求
1.嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278。
2.一種生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法，是由嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278發酵得到的。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的發酵培養基包括玉米粉或澱粉1.5％-2.5％，蛋白質含量≥40％的玉米漿5.0％-6.5％；所述百分含量除玉米漿為體積百分含量外，其餘均為質量百分含量。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基中玉米粉或玉米澱粉的質量百分含量為1.5％-2.0％，蛋白質含量≥40％的玉米漿的體積百分含量為5.0％-5.5％。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基還包括質量百分含量為0.2％的K2HPO4，質量百分含量為0.02％的MgSO4·7H2O。
6.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基起始pH為8.5-9.5。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基起始pH為8.6-9.2。
8.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的培養溫度為27℃-29℃。
9.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於所述發酵的通氣量為0.8-1.2m3/m3/min。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述發酵的通氣量為1m3/m3/min。
全文摘要
本發明公開了一種生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法及其專用菌株。本發明所提供的嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA－1 CGMCC № 1278可用於發酵生產環糊精葡萄糖基轉移酶。嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA－1 CGMCC №1278產酶水平高、發酵時間短，且產酶具有傳代穩定性，10L發酵罐中發酵24h產酶活力(酶產量)可達到6100U/ml；5000L發酵罐中發酵20.5h產酶活力就可達到6875U/ml。本發明的方法及其專用菌株將在環糊精葡萄糖基轉移酶的生產中發揮重要作用，具有廣闊的工業應用前景。
文檔編號C12P21/02GK1796541SQ200410102569
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月27日 優先權日2004年12月27日
發明者王雁萍, 秦廣雍, 段宇珩, 許平輝, 陳林海, 李宗偉, 蘇明傑, 談重芳, 李宗義, 霍裕平 申請人:鄭州大學