截短的actriib-fc融合蛋白的製作方法

2023-10-08 04:37:39

專利名稱：截短的actriib-fc融合蛋白的製作方法
截短的ACTRI IB-FC融合蛋白相關申請的交叉參考本申請要求保護2009年6月12日提交的美國臨時申請序列號61/268，420,2009年11月3日提交的61/280，543的權益。這些申請通過引用以其整體結合到本文中。
背景技術：
轉化生長因子(TGF-P)超家族含有各種生長因子，它們共有共同的序列元件和結構基序。已知這些蛋白質在脊椎動物和無脊椎動物兩者中對多種細胞類型發揮生物作用。該超家族的成員在圖式形成和組織特化的胚胎發育期間發揮重要功能，可影響各種分化過程，包括脂肪形成、肌發生、軟骨發生、心臟發生、血細胞生成、神經發生和上皮細胞分化。該家族由不同命名的蛋白表示，即激活素和抑制素、TGF-^、生長和分化因子(GDF)和骨形態發生因子(BMP)。還已知該家族的其它成員例如Nodal和Lefty。通過操控TGF-3家族成員的活性，常常可引起生物體的重大生理改變。例如Piedmontese和Belgian Blue牛品種在GDF8(亦稱為肌肉生長抑制素(myostatin))基因中攜帶引起肌肉質量明顯增加的功能缺失突變。Grobet等，Nat Genet. 1997，17 (I) :71_4。此外，在人中，GDF8的無活性等位基因與肌肉質量增加和據報導的異常強度有關。Schuelke等，N Engl J Med 2004，350 :2682-8。肌肉、骨、脂肪、軟骨和其它組織方面的變化可通過激動或拮抗由適合的TGF-3家族成員介導的信號轉導來實現。因此，存在對起TGF-P超家族成員的信號轉導的有效調節劑作用的物質的需要。發明簡述在某些方面，本公開內容提供新型的ActRIIB多肽，特別是氨基端和羧基端截短物和序列改變物。在一個實施方案中，描述了包含人ActRIIB(SEQ ID N0:1)的胺基酸25-131的多肽或其變體。這樣的多肽被證實在治療多種病症特別是與肥胖症、胰島素抵抗和其它代謝病症相關的病症中具有出人意料的功效。本文公開的ActRIIB多肽可用於在患者中產生各種所需作用，包括例如增加瘦體重、減少白色脂肪質量、增加褐色脂肪質量、減少血清甘油三酯、減少血清胰島素水平或減少血清游離脂肪酸水平。本文公開的ActRIIB多肽可用於治療多種病症或病況，包括肌肉和神經肌肉病症(例如肌營養不良、肌萎縮側索硬化(ALS)和肌肉萎縮)、脂肪組織病症(例如肥胖症、脂肪性肝病)、代謝病症(例 如2型糖尿病、胰島素抵抗、代謝症候群)、神經變性病症和老年相關的肌肉消耗(musclewasting)(肌肉衰減症候群(sarcopenia))、前列腺癌治療(例如雄激素剝奪治療)以及與多種癌症相關的惡病質。ActRIIB多肽的實例包括SEQ ID NO :8中所述的人ActRIIB-Fc融合蛋白，其在本文中描述為ActRIIB(25-131)-hFc。在某些方面，本公開內容提供來源於ActRIIB的新型多肽(被稱作ActRIIB多肽)。在一些實施方案中，多肽可選自以下多肽，其包含其中胺基酸序列由SEQ ID N08的序列組成的胺基酸序列或者在不超過1、2、3、4或5個胺基酸位置處不同於SEQ ID NO 8的胺基酸序列；通過SEQ ID NO :4的核酸或在嚴格條件下與其互補序列雜交的核酸在哺乳動物細胞中表達產生的多肽；通過SEQ ID NO 6的核酸或在嚴格條件下與其互補序列雜交的核酸在哺乳動物細胞中表達產生的多肽。本文公開的多肽可包含來源於ActRIIB的部分和一個或多個異源部分，其中來源於ActRIIB的部分可包含由SEQ ID NO :I胺基酸25-131的序列組成的胺基酸序列或在不超過I、2、3、4或5個胺基酸位置處不同於SEQ ID N0:1胺基酸25-131的序列的胺基酸序列。異源部分可包含免疫球蛋白的恆定結構域、免疫球蛋白的Fe結構域或者，特別地，人IgGl的Fe結構域(術語「人IgGl」應理解為包括與在人中使用相容的這類Fe的變體)。ActRIIB多肽可包含來源於ActRIIB的部分，其包含由SEQID NO :1的胺基酸25-131的序列組成的胺基酸序列。本文公開的ActRIIB多肽可為氨基端具有序列ETR的那些。本文公開的ActRIIB多肽可導致小鼠的瘦體重在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著增加。瘦組織質量的平均增加可為至少1、2、3、4或5或更多克。本文公開的ActRIIB多肽可導致高脂飲食餵飼的小鼠的脂肪質量在以IOmg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著減少。脂肪質量的平均減少可為5、7、10、15或更多克。本文公開的ActRIIB多肽可導致高脂飲食餵飼的小鼠的血清甘油三酯水平在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著減少。血清甘油三酯的平均減少可為至少50、75、100、125或150或更多mg/dl。本文公開的ActRIIB多肽可導致高脂飲食餵飼的小鼠的血清游離脂肪酸水平在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著 減少。游離脂肪酸的平均減少可為至少500、750、1000或更多的微摩爾/dl游離脂肪酸。本文公開的ActRIIB多肽可導致高脂飲食餵飼的小鼠的血清胰島素水平在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著減少。血清胰島素的平均減少可為至少0. 5、1、1. 5、2或更多ng/ml胰島素。本文所用術語「統計上顯著的」一般是指p值或者> 0. 05，但顯著性的其它衡量可被認可用於統計檢驗的各種類型，並且在這樣的情況下，術語「統計上顯著的」應使用用於評價數據顯著性的最廣泛使用的公式。ActRIIB多肽可包含至少一個N聯糖，並且可包含兩個、三個或更多個N聯糖。此類多肽還可包含0聯糖。ActRIIB多肽可在以適於患者應用的方式糖基化蛋白的多種細胞系中產生，所述細胞系包括工程改造的昆蟲細胞或酵母細胞以及哺乳動物細胞例如COS細胞、CHO細胞、HEK細胞和NSO細胞。ActRIIB多肽可形成共價或非共價的二聚體，包括同二聚體。一般而言，Fe融合蛋白易於形成共價連接的同二聚體。任一種前述多肽可摻入藥物製劑中。在某些方面，本文公開的ActRIIB多肽結合ActRIIB配體，例如⑶F8、⑶F11、激活素、BMP7、⑶F3或nodal。ActRIIB多肽任選以少於10微摩爾或少於I微摩爾、100納摩爾、10納摩爾、I納摩爾或0. I納摩爾的Kd結合ActRIIB配體。與天然存在的ActRIIB多肽相t匕,本文公開的ActRIIB多肽在胺基酸序列中(例如在配體結合域中)可包括1、2、3、4、5個或更多個改變。胺基酸序列的改變可例如改變所述多肽的糖基化(當在哺乳動物、昆蟲或其它真核細胞中產生時)，或者與天然存在的ActRIIB多肽相比，改變所述多肽的蛋白酶剪切。ActRIIB多肽可為融合蛋白，其具有來源於ActRIIB的胺基酸序列(例如ActRIIB的配體結合域或其變體)作為一個結構域和一個或多個提供所需性質(例如藥代動力學改進、更容易純化、靶向特定組織等)的額外的結構域。例如，融合蛋白的結構域可提高以下性質中的一種或多種體內穩定性、體內半衰期、攝取/給予、組織定位或分布、蛋白質複合體的形成、融合蛋白的多聚化和/或純化。ActRIIB融合蛋白可包含免疫球蛋白Fe結構域(野生型或突變型)或血清白蛋白。在某些實施方案中，ActRIIB-Fc融合物包含位於Fe結構域和胞外ActRIIB結構域之間相對鬆散的接頭。該鬆散接頭可相當於ActRIIB胞外域的C端的大約15個胺基酸的鬆散區(「尾巴」)，或者其可為介於5和15、20、30、50個或更多個胺基酸之間相對缺乏二級結構的人工序列。接頭可富含甘氨酸和脯氨酸殘基，並可含有例如蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重複序列(例如TG4或SG4重複序列)。在SEQ ID NO 8的多肽的情形中，採用短的柔性接頭似乎是有利的，例如1、2、3、4或5個甘氨酸殘基，任選帶有一個或多個小殘基例如丙氨酸、蘇氨酸或絲氨酸。融合蛋白可包含純化亞序列，例如表位標籤、FLAG標籤、聚組氨酸序列和GST融合物。任選ActRIIB多肽包含一個或多個選自以下的修飾胺基酸殘基糖基化胺基酸、聚乙二醇化胺基酸、法尼基化胺基酸、乙醯化胺基酸、生物素化胺基酸、與脂質部分綴合的胺基酸和與有機衍生劑綴合的胺基酸。在某些方面，ActRIIB多肽可作為藥物製劑配製。優選藥物製劑是無致熱原的(意指無致熱原至由控制用於治療應用的產品質量的規章所要求的程度)。藥物製劑還可包含一種或多種其它的化合物，例如用於治療ActRII相關病症的化合物。在某些方面，本公開內容提供編碼ActRIIB多肽的核酸。這樣的核酸可包含SEQID NO 4的73-396核酸序列或在嚴格條件下與SEQ ID NO 4的核苷酸73-396的互補序 列雜交的核酸序列。核酸可為包含SEQ ID NO :4序列的核酸。這樣的核酸可包含SEQ ID NO 6的73-396核酸序列或在嚴格條件下與SEQ ID NO 6的核苷酸73-396的互補序列雜交的核酸序列。核酸可為包含SEQ ID NO :6序列的核酸。在某些方面，可在哺乳動物細胞系中表達ActRIIB蛋白，所述哺乳動物細胞系適當介導ActRIIB蛋白的天然糖基化以減少患者不利免疫應答的可能性(包括獸醫患者的可能性)。已成功利用人和CHO細胞系，預期其它常見的哺乳動物表達載體將是有用的。因此，本公開內容提供包含任一種本文公開的核酸的培養細胞。此類細胞可為哺乳動物細胞，包括CHO細胞、NSO細胞、HEK細胞和COS細胞。其它細胞可依據預期患者的物種來選擇。其它細胞公開於本文中。培養細胞應理解為意指在實驗室或其它人工條件(例如冷凍或培養基中)中保持並且不為活的生物體的一部分的細胞。在某些方面，本公開內容提供用於製備ActRIIB多肽的方法。這類方法可包括在合適的細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中表達本文公開的任何核酸(例如SEQ IDNO :4或6及嚴格條件下與其雜交的核酸)。這類方法可包括a)在適於表達ActRIIB多肽的條件下培養細胞，其中所述細胞用ActRIIB表達構建體轉化；和幻回收如此表達的ActRIIB多肽。ActRIIB多肽可利用用於從細胞培養物中獲得蛋白質的任何熟知技術和本文所述技術作為未加工部分、部分純化部分或高度純化部分回收。在某些方面，本公開內容提供用於治療具有與肌肉丟失或肌肉生長不足相關的病症的受試者的方法。此類方法可包括向受試者給予有效量的任一種前述ActRIIB多肽或其藥物製劑。在某些方面，本公開內容提供用於增加有需要的受試者的瘦質量或降低有需要的受試者的瘦質量丟失速度的方法。此類方法可包括向受試者給予有效量的任一種前述ActRIIB多肽或其藥物製劑。在某些方面，本公開內容提供用於減少受試者的體脂肪含量或降低受試者的體脂肪含量增加速度的方法。此類方法可包括向受試者給予有效量的任一種前述ActRIIB多肽或其藥物製劑。在某些方面，本公開內容提供用於治療受試者的與非所需體重增加相關的病症的方法。此類方法可包括向受試者給予有效量的任一種前述ActRIIB多肽或其藥物製劑。在某些方面，本公開內容提供用於治療受試者的代謝病症的方法。此類方法可包括給予受試者有效量的任一種前述ActRIIB多肽或其藥物製劑。適於治療的患者可具有一個或多個以下特徵高血清甘油三酯水平；高游離脂肪酸水平；或高血清胰島素水平。代謝病症的實例包括2型糖尿病、代謝症候群、胰島素抵抗和肥胖症。在某些方面，本文公開的ActRIIB多肽可用於治療具有與肌肉丟失或肌肉生長不足相關的病症的受試者的方法。此類病症包括肌肉萎縮、肌營養不良、肌萎縮側索硬化(ALS)以及肌肉消耗病症(例如惡病質、厭食、DMD症候群、BMD症候群、AIDS消耗症候群、肌營養不良、神經肌肉疾病、運動神經元疾病、神經肌肉接頭的疾病和炎性肌病)。方法可包括給予有需要的受試者有效量的ActRIIB多肽。在某些方面，本文公開的ActRIIB多肽可用於以下方法，該方法用於減少體脂肪含量或降低體脂肪含量的增加速度，以及用於治療與非所需體重增加相關的病症，例如肥 胖症、非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)、心血管疾病、癌症、高血壓、骨關節炎、中風、呼吸問題和膽囊疾病。這些方法可包括給予有需要的受試者有效量的ActRIIB多肽。在某些特定方面，本文公開的ActRIIB多肽可用於用於治療⑶F8的異常活性相關的病症的方法。此類病症包括代謝病症，例如2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、代謝症候群(例如X症候群)、以及創傷(例如燒傷或氮不平衡)誘發的胰島素抵抗；脂肪組織病症(例如肥胖症)；肌營養不良(包括杜興肌營養不良)；肌萎縮側索硬化(ALS);肌肉萎縮；器官萎縮；虛弱；腕管症候群；充血性阻塞性肺病；肌肉衰減症候群、惡病質和其它肌肉消耗症候群；骨質疏鬆症；糖皮質激素誘發的骨質疏鬆症；骨質減少；骨關節炎；骨質疏鬆症相關的骨折；由長期的糖皮質激素治療引起的低骨量、性腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏症、繼發性甲狀旁腺功能亢進、營養缺乏和神經性厭食症。所述方法可包括給予有需要的受試者有效量的ActRIIB多肽。在某些方面，本公開內容提供用於鑑定刺激組織(例如骨、軟骨、肌肉和脂肪)生長的物質的方法。所述方法包括a)鑑定與ActRIIB多肽競爭結合ActRIIB多肽的配體結合域的試驗物質jPb)評價所述物質對組織生長的作用。在某些方面，本公開內容提供用於拮抗細胞中ActRIIB多肽或ActRIIB配體(例如⑶F8、⑶F11、激活素、⑶F3、BMP7和Nodal)的活性的方法。所述方法包括將細胞與ActRIIB多肽接觸。任選ActRIIB多肽或ActRIIB配體的活性通過ActRIIB/ActRIIB配體複合體介導的信號轉導來監測，例如通過監測細胞增殖。所述方法的細胞包括成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞和肌肉細胞。在某些方面，本公開內容提供ActRIIB多肽在製備用於治療如本文所述的病症或病況的藥物中的用途。附圖簡述圖I顯示了 ActRIIB(25-131)-hFc的全長未加工的胺基酸序列(SEQ ID NO 3)。TPA前導序列(殘基1-22)和雙重截短的ActRIIB胞外域(殘基24-131，使用基於SEQ IDNO 1的天然序列的編號)各自用下劃線表示。突出顯示的是通過測序揭示為成熟融合蛋白的N端胺基酸的穀氨酸，其位於相對於SEQ ID NO 1的25位。圖2顯示了編碼ActRIIB(25-131)_hFc的核苷酸序列(編碼鏈顯示在頂部，SEQ ID勵4，互補鏈顯示在底部3』-5』，5已0 ID NO :5)。編碼TPA前導序列的序列(核苷酸1_66)和編碼ActRIIB胞外域的序列(核苷酸73-396)用下劃線表示。還顯示了 ActRIIB (25-131)的相應胺基酸序列。圖3顯示了編碼ActRIIB (25-131)-hFc的備選核苷酸序列(編碼鏈顯示在頂部，SEQ ID NO :6，互補鏈顯示在底部3』-5』，SEQ ID NO :7)。該序列賦予最初轉化體中較大水平的蛋白表達，使細胞系發預成為更快的過程。編碼TPA前導序列的序列(核苷酸1-66)和編碼ActRIIB胞外域的序列(核苷酸73-396)用下劃線表示，並且突出顯示E⑶的野生型核苷酸序列中的取代(見圖2)。還顯示了 ActRIIB(25-131)的相應胺基酸序列。圖4顯示了用ActRIIB (25-131)-hFc治療四周對小鼠中瘦組織質量的作用。溶媒是Tris緩衝鹽水(TBS)。數據為平均值(n = 10隻/組)土SEM。'通過非配對t檢驗對比TBS的P < 0. 01。ActRIIB(25-131)-hFc治療以明顯的劑量依賴方式增加瘦組織質量。圖5顯示了用ActRIIB(25-131)-hFc治療四周對小鼠中胸肌肌肉質量的作用。溶媒為Tris緩衝鹽水(TBS)。數據為平均值(n = 10隻/組)土SEM。*, P < 0. 05 ；**, P < 0. 01，通過非配對t檢驗對比TBS得到。ActRIIB(25-131)-hFc治療以明顯的劑量依賴方式增加胸肌肌肉質量。圖6顯示了 ActRIIB(25-131)-hFc治療對小鼠握力的作用。溶媒為Tris緩衝鹽水(TBS)。數據為平均值(n = 10隻/組)。**,通過非配對t檢驗對比TBS的P < 0. 01。ActRIIB(25-131)-hFc治療以劑量依賴方式增加握力。圖7顯示了用ActRIIB (25-131)-hFc治療四周對雄激素剝奪的小鼠模型中瘦組織質量的作用。溶媒為Tris緩衝鹽水(TBS)。睪丸切除(ORX)或假手術小鼠的數據為平均值(n = 10 只 / 組)土SD。***，對比 TBS 對照的 P < 0. 001。ActRIIB(25-131)-hFc 與其全長相對物ActRIIB (20-134) -mFc同樣有效地增加瘦組織質量。圖8顯示了 ActRIIB(25-131)-hFc在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對瘦組織質量的作用。溶媒為Tris緩衝鹽水(TBS)。數據為平均值(n = 9-10隻/組)。_，對比TBS對照的P < 0. 001。在高脂飲食餵飼的小鼠中ActRIIB (25-131)-hFc有效增加瘦組織質量。圖9顯示了 ActRIIB(25-131)-hFc在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對脂肪質量的作用。溶媒為Tris緩衝鹽水(TBS)。數據為平均值(n = 9-10隻/組)土SD。％P < 0. 05 ；***，P < 0. 001 (對比TBS對照)。與溶媒相比，ActRIIB(25-131)-hFc治療12周在高脂飲食餵飼的小鼠中減少約一半脂肪質量。

圖10描述了作為飲食和ActRIIB (25-131) -hFc治療60天的函數的小鼠血清甘油三酯濃度。數據為平均值土SEM. _，P < 0.001。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB (25-131)-hFc減少甘油三酯的濃度超過50%，從而使甘油三酯正常化至標準飲食對照中觀察到的水平。圖11描述了作為飲食和ActRIIB(25-131)-hFc治療60天的函數的小鼠血清游離脂肪酸(FFA)濃度。數據為平均值土SEM. _，P <0.001。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB (25-131) -hFc減少FFA濃度接近55%，從而使FFA正常化至標準飲食對照中觀察到的水平。圖12描述了作為飲食和ActRIIB(25-131)-hFc治療60天的函數的小鼠血清高密度脂蛋白(HDL)濃度。數據為平均值土SEM. ***, P < 0. 001。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB (25-131)-hFc減少HDL濃度接近50%，從而使HDL正常化至標準飲食對照中觀察到的水平。圖13描述了作為飲食和ActRIIB(25-131)-hFc治療60天的函數的小鼠血清低密度脂蛋白(LDL)濃度。數據為平均值土SEM.% P < 0.05。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc 減少 LDL 濃度超過 40%。圖14描述了作為飲食和ActRIIB(25-131)-hFc治療60天的函數的小鼠血清胰島素濃度。數據為平均值土SEM.' P <0.01。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB (25-131) -hFc減少胰島素濃度超過60%，從而使胰島素正常化至標準飲食對照中觀察到的水平。 圖15描述了作為飲食和ActRIIB(25-131)-hFc治療60天的函數的小鼠血清脂連蛋白濃度。ELISA測定檢測了所有主要的寡聚同種型(總脂連蛋白)，數據為平均值+ SEM.**, P < O. 01 ;***，P < 0.001。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc 增加脂連蛋白濃度超過75 %，甚至顯著地提高脂連蛋白至高於在標準飲食對照中觀察到的水平。圖16顯示了在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中通過用ActRIIB(25-131)-hFc治療60天在附睪白色脂肪組織內誘發的產熱組織學變化。所有的顯微圖像以相同的放大率顯示。蘇木精和曙紅(H&E)染色提示ActRIIB (25-131)-hFc減少脂滴大小並誘導多房脂肪細胞簇(箭頭)(褐色脂肪的特徵)的能力。不相鄰切片的免疫染色揭示在多房脂肪細胞和單房脂肪細胞中均有UCPl的廣泛胞質誘導(綠色螢光)。圖17顯示了 ActRIIB(25-131)-hFc治療60天在飲食誘發的肥胖症小鼠模型中對附睪白色脂肪中的UCPlmRNA水平的影響。通過逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)得到的呈相對單位(RU)的數據，為平均值土SEM ；n = 6-7隻/組；*，P < O. 05。ActRIIB(25-131)-hFc導致編碼褐色脂肪的這種選擇性標記的mRNA 60倍增加，因此提示該白色脂肪庫內產熱能力的上調。圖18顯示了作為飲食和ActRIIB (25-131)-hFc治療60天的函數的小鼠附睪白色脂肪中脂連蛋白mRNA水平。呈相對單位(RU)的RT-PCR數據，為平均值土 SEM ；n = 7隻/組廣，P < O. 05。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc增加脂連蛋白mRNA水平超過60 %，從而有利於這些小鼠中循環脂連蛋白的濃度的提高。圖19顯示了 ActRIIB (25-131)-hFc治療60天在飲食誘發的肥胖症小鼠模型中對脂肪性肝沉積(肝脂肪變性)的作用。用Oil Red O染色的肝切片(所有以相同的放大率顯示)揭示了在高脂飲食條件而非對照條件下顯著的脂質沉積。箭頭指示許多密集脂滴中的一些，其被染成亮紅色但在黑白圖像中難以辨別。ActRIIB (25-131) -hFc抑制此類脂滴的形成並很大程度上將肝組織的外觀恢復至標準飲食餵飼的小鼠的肝組織外觀。圖20顯示了 ActRIIB (25-131)-mFc治療35天在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對腹部脂肪的分布的作用。內臟和皮下脂肪庫通過涵蓋了脊髓節段T13-L5的顯微計算機斷層掃描術(顯微CT)在體內檢測和區分。N = 4隻/組；比例尺=5mm。相對於高脂飲食餵飼的對照，ActRIIB(25-131)-mFc治療減少腹部脂肪的內臟和皮下脂肪庫兩者的體積。圖21顯示了 ActRIIB (25-131)-mFc治療60天在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對通過顯微CT測定的內臟脂肪體積的作用。數據為平均值土SEM ；n = 4隻/組廣％ P<O. 001。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ACtRIIB(25-131)-mFC相對於溶媒減少內臟脂肪體積超過60%。圖22顯示了 ActRIIB (25-131)-mFc治療60天在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對通過顯微CT測定的腹部皮下脂肪的體積的作用。數據為平均值土SEM ；n = 4隻/組；***, P < O. 001。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB(25-131)-mFc相對於溶媒減少皮下脂肪的體積近60%。圖23顯示了在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中作為飲食和ACtRIIB(25-131)-mFC治療60天的函數的肩胛間褐色脂肪庫雙側對的圖。高脂飲食增加庫的大小並減淡庫的顏色，而ActRIIB (25-131)-mFc極大地逆轉了這些變化。圖24顯示了 ActRIIB (25-131)-mFc治療60天在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對肩胛間褐色脂肪的質量的作用。組合的左邊庫和右邊庫的數據為平均值土SEM;_，p <O. 001。ActRIIB(25-131)-mFc逆轉了高脂飲食對該褐色脂肪庫的質量的作用。圖25描述了 ActRIIB (25-131)-mFc治療60天在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對通過顯微CT測定的肩胛間褐色脂肪密度的作用。數據(平均值土SEM)以基於骨礦物質羥磷灰石(HA)的正值和水的零值的標準化單位表示；因此，脂肪值為負值，而白色脂肪的值通常接近-120。'p <0.01。ActRIIB(25-131)-mFc完全逆轉了高脂飲食對該褐色脂肪庫的密度的作用。圖26描述了 ActRIIB(25-131)-mFc治療對衰老小鼠模型中通過核磁共振(NMR)分析在多個時間點測定的瘦組織質量的作用。數據為10-15隻小鼠/組/時間點的平均值；_，相對於同一時間點的溶媒的P < O. 001。在給藥7周後，用ActRIIB (25-131)-mFc治療的衰老小鼠的瘦組織質量從基線增加了近20%，相比之下溶媒治療的對照的值基本不變。圖27描述了 ActRIIB(25-131)-mFc治療在衰老小鼠模型中對多個時間點確定的前肢握力的作用。數據為13-15隻小鼠/組/時間點的平均值廣，相對於同一時間點的溶媒的P < O. 01。用ActRIIB(25-131)-mFc治療的小鼠顯示在研究期間握力增加的整體趨勢，相比之下溶媒對照在相同間隔內觀察到握力下降。圖28描述了 ActRIIB(25-131)-mFc治療8周對衰老小鼠模型中通過雙能X線吸收測定法(DEXA)測定的骨礦物質密度的作用。數據為平均值土SEM ；*, P < O. 05。用ActRIIB (25-131)-mFc治療的衰老小鼠(η = 10)中的骨礦物質密度相對於溶媒治療的對照(η = 14)顯著增加。圖29描述了 ActRIIB (25-131)-mFc治療對衰老小鼠模型中通過NMR分析在多個時間點測定的全身脂肪質量的作用。數據為10-15隻小鼠/組/時間點的平均值。_，相對於同一時間點的溶媒的P < O. 001。給藥7周後，用ActRIIB (25-131)-mFc治療的衰老小鼠中的脂肪質量表現出自基線減少的百分比超過溶媒治療的對照的減少幅度的兩倍。圖30描述了 ActRIIB(25-131)-mFc治療8周在衰老小鼠模型中對血清胰島素濃度的作用。數據為平均值土SEM ；*, P < O. 05。用ActRIIB(25-131)-mFc治療的衰老小鼠(η = 10)中的胰島素濃度相對於溶媒治療的對照(η = 14)減少超過40%。圖31描述了 ActRIIB(25-131)-mFc治療8周對循環糖化血紅蛋白(AlC)濃度的作用。數據為平均值土SEM ；n = 5-6 只 / 組;**，P < O. 01。ActRIIB(25-131)-mFc 顯著減少糖化血紅蛋白(在長時間內的平均血糖濃度的廣泛認可的指示物)的濃度。
圖32描述了 ActRIIB(25-131)-hFc治療5周在癌症惡病質的小鼠模型中對通過NMR分析測定的瘦組織質量的作用。數據為平均值土SEM ;_，P <0.001。在植入腫瘤的小鼠中，溶媒治療(η = 7)與瘦組織質量的7%丟失相關，而ActRIIB(25-131)-hFc治療(η =12)導致瘦組織質量從基線增加27%。詳述I.綜述在某些方面，本公開內容涉及ActRIIB多肽。本文所用術語「ActRIIB」是指來源於任何物種的IIB型激活素受體(ActRIIB)蛋白和ActRIIB相關蛋白的家族。ActRIIB家族的成員通常均是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的區的配體結合胞外域、跨膜結構域和具有預測的絲氨酸/蘇氨酸激酶特異性的胞質結構域組成。術語「ActRIIB多肽」用於指包含ActRIIB家族成員的任何天然存在的多肽及其保持有用活性的任何變體(包括突變型、片段、融合物和肽模擬物形式)的多肽。例如ActRIIB 多肽包括來源於任何已知ActRIIB序列、具有以下序列的多肽，所述序列與ActRIIB多肽序列有至少約80%同一性、優選至少85%、90%、95%、97%、99%或更大同一性。人ActRIIB前體具有以下胺基酸序列，其中信號肽用下劃線表示，胞外域用黑體字表示，潛在的N聯糖基化位點加框表示(SEQ ID NO 1) (NM_001106，512aa)。MTAPffVALALLffGSLffPG SGRGEAETRECIYYNANWELERTgQSGLERCEGEQDKRLHCyaswrSSssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcne RFTHLPE
AGGPEVTYEPPPTAPT LLTVLAYSLLPIGGLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLLQFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETMSRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEPGKPP⑶THGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIKDHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKESSIActRIIB多肽可包含ActRIIB蛋白的任何天然存在的胞外域及其保持有用活性的任何變體(包括突變型、片段和肽模擬物形式)。例如，ActRIIB蛋白的胞外域與配體結合且一般是可溶的。信號序列可為ActRIIB的天然信號序列，或者來自另ー蛋白的信號序列例如組織纖溶酶原激活物(TPA)信號序列或蜜蜂蜂毒肽(honey bee melatin,HBM)信號序列。在某種程度上，本公開內容提供新型ActRIIB多肽，其經截短使得來源於ActRIIB的部分來自SEQ ID NO :1的胺基酸25-131。如本文所示，該類型的多肽當作為Fe構建體ActRIIB (25-131)-hFc給予吋，促進瘦體重(主要是肌肉)的形成和脂肪質量的丟失，同時還對代謝參數例如血清甘油三酷、血清游離脂肪酸和血清胰島素水平具有顯著的所需作用。值得注意的是，ActRIIB(25-131)-hFc對這些代謝參數的作用比相關蛋白ActRIIB(20-134)的作用大得多。這些數據在以下的實例中示出。TGF-β信號由I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚複合體介導，所述受體在配體刺激時磷酸化並激活下遊Smad蛋白(Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. I 169-178)。這些I型和II型受體均為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的區的配體結合胞外域、跨膜結構域和具有預測的絲氨酸/蘇氨酸特異性的胞質結構域組成。I型受體是信號轉導所必需的；11型受體是結合配體和表達I型受體所必需的。I型和II型激活素受體在配體結合後形成穩定的複合體，導致I型受體被II型受體磷酸化。
兩種相關的II型受體ActRIIA和ActRIIB已被鑑定為激活素的II型受體(Mathews 和 Vale，1991，Cell 65 :973-982 ;Attisano 等，1992，Cell 68:97-108)。除激活素之外，ActRIIA和ActRIIB可在生物化學上與若干其它的TGF-β家族蛋白(包括ΒΜΡ7、Nodal、GDF8 和 GDFlI)相互作用(Yamashita 等，1995，J. Cell Biol. 130 :217-226 ；Lee 和McPherron,2001,Proc. Natl. Acad. Sci. 98 :9306-9311 ;Yeo 和 Whitman,2001,Mol. Cell 7 949-957 ；0h 等，2002，Genes Dev. 16 :2749-54)。在某些實施方案中，本發明涉及用主題ActRIIB多肽(例如ActRIIB-Fc多肽)拮抗ActRIIB受體的配體(也被稱作ActRIIB配體)。因此，本發明的組合物和方法可用於治療與ActRIIB受體的一種或多種配體的異常活性相關的病症。ActRIIB受體的示例性配體包括ー些TGF- β家族成員，例如激活素、Nodal、⑶F3、⑶F8、⑶Fll和BMP7。激活素是ニ聚多肽生長因子並屬於TGF-β超家族。有三種激活素(Α、Β和ΑΒ)，其為兩個緊密相關的β亞基的同ニ聚體/異ニ聚體(βΑβΑ、βΒβΒ和βΑβΒ)。在TGF-β超家族中，激活素是獨ー無ニ且多功能的因子，其可在卵巢和胎盤細胞中刺激激素產生、支持神經元細胞存活、視細胞類型積極或消極地影響細胞周期進程並至少在兩棲類胚胎中誘導中胚層分化(DePaolo 等，1991, Proc SocEp Biol Med. 198 :500-512 ；Dyson 等，1997, CurrBiol. 7 :81-84 ；ffoodruff, 1998，Biochem Pharmacol. 55 :953-963)。此外，從刺激的人單核細胞白血病細胞中分離的紅細胞分化因子(EDF)被認為與激活素A相同(Murata等，1988，PNAS，85 :2434)。據提示激活素A在骨髓中充當紅細胞生成的天然調節劑。在若干組織中，激活素信號轉導被其相關的異ニ聚體抑制素所拮抗。例如，在垂體的促卵泡激素(FSH)的釋放期間，激活素促進FSH的分泌和合成，而抑制素防止FSH的分泌和合成。可調節激活素的生物活性和/或與激活素結合的其它蛋白包括下述的促濾泡素抑制素(FS)、促濾泡素抑制素相關蛋白(FSRP)、α 2巨球蛋白、Cerberus和內皮聯蛋白。骨形態發生蛋白7(BMP7)，也被稱作成骨蛋白_1 (0P_1)，眾所周知其誘導軟骨和骨形成。此外，BMP7調節一系列生理過程。值得注意的是，BMP7近期已被鑑定為褐色脂肪細胞分化的關鍵促進劑(Tseng等，2008，Nature 454:1000-1004)。在該研究中，BMP7的基因缺損導致鼠胚胎中褐色脂肪的缺乏和UCPl的接近完全缺少。此外，在小鼠中通過腺病毒給予使BMP7表達上調増加褐色脂肪質量和能量消耗。與激活素相似，BMP7與II型受體ActRIIA和ActRIIB結合。然而，BMP7和激活素招募截然不同的I型受體至異ニ聚體受體複合體。觀察到的主要BMP7I型受體為ALK2，而激活素僅結合ALK4 (ActRIIB)。BMP7和激活素引發截然不同的生物應答和活化不同的Smad途徑(Macias-Silva等，1998，J BiolChem. 273 :25628-36)。生長和分化因子3 (⑶F3)，也被稱作Vgl-相關2，在胚胎發育中具有重要作用並且在成年期期間還涉及脂肪形成。簡而言之，⑶F3在白色脂肪組織中的表達與體重或肥胖症相關(Weisberg 等，2003，J Clin Invest 112 :1796-1808)，並且腺病毒介導的⑶F3的過表達加重高脂飲食條件下野生型小鼠中觀察到的肥胖的增加(Wang等,2004, BiochemBiophys Res Commun 321 :1024-1031)。重要的是，⑶F3基因缺損的小鼠當保持標準飲食時是健康且基本正常的，但當保持高脂飲食時免受肥胖症並表現出增加的基礎代謝率(Shen等，2009，Mol Endocrinol 23 :113-123)。綜上，這些發現提示⑶F3特異地涉及飲食誘發的肥胖症和更一般地涉及肥胖的調節。Nodal蛋白在中胚層和內胚層誘導和形成以及軸結構例如心臟和胃在早期胚胎發生中的隨後組構中發揮作用。已被證明在發育的脊椎動物胚胎中椎組織主要有利於脊索和脊索前板的軸結構，雖然其招募周圍的細胞形成非軸的胚胎結構。Nodal似乎通過I型和II型受體兩者和已知為Smad蛋白的細胞內效應物來信號轉導。近來的研究支持了以下概念ActRIIA 和 ActRIIB 充當 Nodal 的 II 型受體(Sakuma 等，Genes Cells. 2002，7 :401-12)。據提示Nodal配體與它們的輔因子(例如cripto)相互作用以激活激活素I型和II型受體，其磷酸化Smad2。Nodal蛋白涉及對早期脊椎動物胚胎關鍵的許多事件，包括中胚層形成、前圖式形成(anterior patterning)和左右軸特化。實驗證據證實，Nodal信號轉導激活pAR3-Lux，其為之前顯示對激活素和TGF-β特異響應的螢光素酶報導分子。然而，Nodal 無法誘導PT1X2-LUX，其特異地對骨形態發生蛋白響應的報導分子。近來的研究結果提供了直接的生化證據=Nodal信號轉導由激活素-TGF-β途徑Smad——Smad2和Smad3兩者介導。進一步的證據顯示，胞外cripto蛋白為Nodal信號轉導所必需，使其有別於激活素或TGF-β信號轉導。生長和分化因子8 (⑶F8)也被稱為肌肉生長抑制素。⑶F8是骨骼肌肉質量的負調節劑。GDF8高表達於發育中的骨骼肌和成年骨骼肌中。轉基因小鼠中GDF8的無效突變特徵在於骨骼肌的顯著肥大和增生(McPherron等，Nature，1997，387 :83-90)。骨骼肌質量的類似增加在牛(Ashmore 等，1974, Growth, 38 :501-507 ； Swat I and 和 Kieffer, J. Anim. Sci.，1994,38 :752-757 ；McPherron 和 Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1997,94 :12457-12461 ；和 Kambadur 等，Genome Res. ,1997,7 :910-915)和引人注目的人(Schuelke 等，N EnglJ Med 2004;350:2682-8)的⑶F8的天然存在突變中明顯。研究還顯示在人中與HIV感染相關的肌肉消耗伴隨著⑶F8蛋白表達的增加(Gonzalez-Cadavid等，PNAS, 1998,95 14938-43)。另外，GDF8可調節肌肉特異酶(例如肌酸激酶)的產生並調節成肌細胞的增殖(WO 00/43781)。⑶F8前肽可非共價地結合成熟的⑶F8結構域二聚體，使其生物活性失活(Miyazono 等(1988)J. Biol. Chem.，263 :6407-6415 ；ffakefield 等(1988)J.Biol. Chem.，263 ；7646-7654 ;和 Brown 等(1990) Growth Factors, 3 :35-43)。結合 GDF8 或結構上相關的蛋白並抑制其生物活性的其它蛋白包括促濾泡素抑制素和潛在地促濾泡素抑制素相關蛋白(Gamer 等(1999) Dev. Biol.，208 :222-232)。生長和分化因子11(⑶F11)，也被稱為BMP11，為分泌蛋白(McPherron等，1999，Nat. Genet. 22 =260-264)。⑶Fll在小鼠發育期間表達於尾芽、肢芽、上頜弓和下頜弓以及背根神經節(Nakashima等，1999，Mech. Dev. 80 :185-189)。GDFll在中胚層和神經組織兩者的圖式形成中發揮獨特作用(Gamer等，1999，Dev Biol.，208 :222-32)。GDFll被證明為發育中的雞肢的軟骨發生和肌發生的負調節劑(Gamer等，2001，Dev Biol. 229 :407-20)。⑶Fll在肌肉中的表達也表明其以與⑶F8類似的方式調節肌肉生長的作用。另外，⑶Fll在腦中的表達表明GDFll也可具有與神經系統的功能相關的活性。有趣的是，發現GDFll抑制嗅上皮的神經發生(Wu等，2003，Neuron. 37 :197-207)。因此，GDFll可能在疾病(例如肌病和神經變性疾病(例如肌萎縮側索硬化))的治療中具有體外和體內應用。在某些方面，本發明涉及將某些ActRIIB多肽用於一般地在與ActRIIB活性相關的任何過程中拮抗ActRIIB配體的信號轉導。任選本發明的ActRIIB多肽可拮抗一種或多種ActRIIB受體的配體，例如激活素、Nodal、⑶F8、⑶Fll和BMP7，並因此可用於其它病症的治療。因此，本發明考慮利用ActRIIB多肽治療或預防與ActRIIB或ActRIIB配體的異常活性相關的疾病或病況。ActRIIB或ActRIIB配體涉及許多重要的生物過程的調節。由於其在這些過程中的關鍵功能，它們可作為治療幹預的所需靶標。例如ActRIIB多肽(例如ActRIIB-Fc多肽)可用於治療人或動物的病症或病況。此類病症或病況的實例包括但不限於代謝病症，例如2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、代謝症候群(例如X症候群)、以及創傷(例如燒傷或氮不平衡)誘發的胰島素抵抗；脂肪組織病症(例如肥胖症)；肌肉和神經肌肉病症例如肌營養不良(包括杜興肌營養不良)；肌萎縮側索硬化(ALS);肌肉萎縮；器 官萎縮；虛弱；腕管症候群；充血性阻塞性肺病；肌肉衰減症候群、惡病質和其它肌肉消耗症候群。其它的實例包括骨質疏鬆症，特別在老年女性和/或絕經後女性中；糖皮質激素誘發的骨質疏鬆症；骨質減少；骨關節炎；和骨質疏鬆症相關的骨折。另外的實例包括由長期的糖皮質激素治療引起的低骨量、性腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏症、繼發性甲狀旁腺功能亢進、營養缺乏和神經性厭食症。這些病症和病況在以下的「示例性治療應用」中論述。如所提及的，本文公開的截短的ActRIIB多肽似乎對代謝參數具有特別有益的作用。在本發明的上下文以及在使用各個術語的具體上下文中，用於本說明書的術語一般具有其在本領域的一般含義。下文或本說明書其它部分論述某些術語，以在描述本發明的組合物和方法以及如何製備和使用所述組合物和方法時，對從業人員提供額外的指導。術語任何用法的範圍或含義從使用術語的具體上下文來看將是顯而易見的。「約」和「大約」總的來講應意指給定測量的性質或精度，對所測定的量的可接受的誤差度。示例性誤差度通常在給定值或值的範圍的20 %、優選IO %、更優選5 %內。或者，特別是在生物系統中，術語「約」和「大約」可意指在給定值的數量級以內、優選5倍以內、更優選2倍以內的值。本文給出的數值的量是近似值，除非另有說明，意指在未明確表示時可表示術語「約」或「大約」。
本發明的方法可包括將序列彼此進行比較的步驟，包括野生型序列與一個或多個突變型(序列變體)比較。這類比較通常包括多聚體序列的比對，例如應用本領域熟知的序列比對程序和/或算法(例如BLAST、FASTA和MEGALIGN等)。技術人員可容易理解的是，在其中突變含有殘基插入或缺失的這類比對中，序列比對可在不含插入殘基或缺失殘基的多聚體序列中引入「空位」(通常用破折號或「A」表示)。在所有其語法形式和拼法變化中的「同源的」，是指具有「共同進化起源」的兩種蛋白質之間的關係，包括來源於同一生物物種超家族的蛋白質以及來源於不同生物物種的同源蛋白質。這類蛋白質(及其編碼核酸)具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的一樣，不論就百分比同一性而言，或者就特定殘基或基序和保守位置的存在情況而論。在所有其語法形式中的術語「序列相似性」是指可能有或沒有共同進化起源的核酸或胺基酸序列之間的同一性或一致性程度。然而，在普通用法以及在本申請中，術語「同源的」當用副詞(例如「高度地」)修飾時，可以是指序列相似性，並且可與共同進化起源有關或無關。2. ActRIIB 多肽在某些方面，本發明涉及ActRIIB多肽(例如ActRIIB-Fc多肽)，具體地由包含SEQ ID NO :1的胺基酸25-131的多肽示例的截短形式及其變體。任選所述片段、功能變體和修飾形式具有其相應野生型ActRIIB多肽相似或相同的生物學活性。例如本發明的ActRIIB變體可結合ActRIIB配體(例如激活素A、激活素AB、激活素B、Nodal、⑶F8、⑶Fll或BMP7)並抑制其功能。任選ActRIIB多肽調節組織(例如骨、軟骨、肌肉或脂肪)的生長或代謝參數例如甘油三酷、游離脂肪酸或胰島素。ActRIIB多肽的實例包括人ActRIIB前體多肽(SEQ ID NO 1)和Fe融合蛋白例如SEQ ID No. 3和8。可依照以下指導作出對這些多肽的變化。ActRIIB多肽的胺基酸編號基於SEQ ID NO :1的序列，不論是否使用天然前導序列。本公開內容鑑定了 ActRIIB的功能活性部分和變體。本申請人確定具有由Hilden 等(Blood. 1994年4月15日；83(8) =2163-70)公開的序列的Fe融合蛋白(其在SEQ IDNO 1的胺基酸64的相應位置上具有丙氨酸(ム64))，對激活素和60 -11具有相對低的親和力。通過比較，在64位具有精氨酸(R64)的同一 Fe融合蛋白對激活素和⑶F-II具有低納摩爾至高微微摩爾範圍的親和力。因此，具有R64的序列用作本公開內容中人ActRIIB的野生型參考序列。Attisano 等(Cell. 1992 年 I 月 10 日；68(1) :97-108)顯示了 ActRIIB 胞外域的C端的脯氨酸節(proline knot)的缺失減少受體對激活素的親和力。P129和P130的突變基本上不減少配體結合。ActRIIB 配體結合袋由殘基 Y31、N33、N35、L38 到 T41、E47、E50、Q53 到 K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78 到 N83、Y85、R87、A92 和 E94 到 FlOl 來界定。在這些位置，預期保守突變將是耐受的，儘管K74A突變是良好耐受的，R40A、K55A、F82A和L79位的突變亦是如此。R40在非洲蟾蜍(Xenopus)中為K，提示該位置的鹼性胺基酸將是耐受的。Q53在牛ActRIIB中為R而在非洲蟾蜍ActRIIB中為K，因此在此位置包括R、K、Q、N和H在內的胺基酸將是耐受的。因此ActRIIB蛋白可為以下蛋白，其包含胺基酸25-131並包含配體結合袋中不超過1、2、5、10或15個保守胺基酸改變和配體結合袋中在40、53、55、74、79和/或82位的O個、ー個或多個非保守改變。此類蛋白可保持與SEQ ID NO: I的胺基酸25-131的序列多於80%、90%、95%或99%的序列同一性。結合袋外的位點(在該處的變異性可以是特別良好耐受的)，包括胞外域的氨基端和羧基端(如上所示)以及42-46位和65-73位。65位從天冬醯胺向丙氨酸的改變(N65A)實際上改進A64背景的配體結合，並因此預期對R64背景的配體結合不具有不利影響。該改變在A64背景中很可能剔除N65的糖基化，因此證明該區的明顯改變很可能是耐受的。雖然R64A改變耐受不佳，但R64K是良好耐受的，因此另ー種鹼性殘基例如H可在64位被耐受。ActRIIB在接近所有脊椎動物之中是良好保守的，其中大段胞外域是完全保守的。與ActRIIB結合的許多配體也是高度保守的。因此，來自不同脊椎動物生物體的ActRIIB序列的對比提供可改變的殘基的見識。因此，有活性的人ActRIIB可在相應位置包含來自另ー種脊椎動物ActRIIB的序列的一個或多個胺基酸，或者可包含與人或其它脊椎動物序列中的殘基相似的殘基。以下實例闡述了這種界定有活性的ActRIIB變體的方法。L46在非洲蟾蜍ActRIIB中為繳氨酸,因此該位置可被改變並任選可被改變成另ー疏水殘基例如V、I或F,或者非極性殘基例如A。E52在非洲蟾蜍中為K,提示該位點可耐受很多改變,包括極性殘基例如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y以及很可能的A。T93在非洲蟾蜍中為K，提示該位置耐受寬廣的結構改變，其中偏愛極性殘基例如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y。F108在非洲蟾蜍中為Y，因此Y或其它的疏水基團例如I、V或L應為耐受的。Elll在非洲蟾蜍中為K，提示該位置處耐受帶電殘基，包括D、R、K和H以及Q和N。Rl 12在非洲蟾蜍中為K，提示該位置處耐受鹼性殘基，包括R和H。119位的A保守性相對差，並在嚙齒類動物中表現為P和在非洲蟾蜍中表現為V，因此基本上任何胺基酸在該位置上應是耐受的。另外的N聯糖基化位點(N-X-S/T)可添加至ActRI IB多肽，並且可相對於ActRIIB(R64)-Fe形式增加ActRIIB-Fc融合蛋白的血清半衰期。NX(T/S)序列的實例見42-44 (NQS)和65-67 (NSS)，儘管後者在64位的R的情況下可能不被有效糖基化。N-X-S/T序列一般可在配體結合袋之外的位置引入。對於非內源性N-X-S/T序列的引入特別合適的位點包括胺基酸 20-29、20-24、22-25、109-134、120-134 或 129-134。N-X-S/T 序列還可引入在ActRIIB序列和Fe或其它的融合組分之間的接頭。此類位點可以最小努力通過在針對預先存在的S或T的正確位置中引入N來引入，或者通過在預先存在的N對應的位置 處引入S或T來引入。因此，產生N聯糖基化位點的所需改變為A24N、R64N、S67N(可能與N65A 改變結合)、E106N、R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112S 和 R112T。因為糖基化給予的保護，預測被糖基化的任何S可改變成T，而不產生免疫原性位點。同樣，預測被糖基化的任何T可改變成S。因此考慮改變S67T和S44T。同樣，在A24N變體中，可利用S26T改變。因此，ActRIIB變體可包含ー個或多個另外的非內源性N聯糖基化共有序列。所述變化可以不同方式結合。此外，ActRIIB中存在常常有益於保守性的胺基酸位置。這些包括64位(鹼性胺基酸)、80位(酸性或疏水胺基酸)、78位(疏水的，並且特別地色氨酸)、37位(酸性，並且特別地天冬氨酸或穀氨酸)、56位(鹼性胺基酸)、60位(疏水胺基酸，特別地苯丙氨酸或酪氨酸)。可為保守所需要的其它位置如下52位(酸性胺基酸)、55位(鹼性胺基酸)、81位(酸性)、98位(極性或帶電，特別是E、D、R或K)。在某些實施方案中，為了諸如提高治療功效或穩定性(例如離體保存期限和體內蛋白水解降解抗性)等目的，本發明考慮通過修飾ActRIIB多肽的結構來產生功能變體。修飾的ActRIIB多肽還可通過例如胺基酸取代、缺失或添加來產生。例如，有理由預期，亮氨酸被異亮氨酸或纈氨酸單獨置換、天冬氨酸被穀氨酸單獨置換、蘇氨酸被絲氨酸單獨置換，或者胺基酸被結構上相關的胺基酸進行類似置換(例如保守突變)將不會對所得分子的生物活性產生重大影響。保守置換是發生在其側鏈上是相關的胺基酸家族內的置換。可通過評價變體ActRIIB多肽以類似於野生型ActRIIB多肽的方式在細胞中產生反應的能力，或者以與野生型相似的方式與一種或多種配體例如激活素、GDF-Il或肌肉生長抑制素結合的能力，來容易地確定ActRIIB多肽的胺基酸序列的改變是否產生功能同源物。在某些特定的實施方案中，本發明考慮在ActRIIB多肽的胞外域(也被稱作配體結合域)中作出突變，使得變體(或突變型)ActRIIB多肽具有改變的配體結合活性(例如結合親和力或結合特異性)。在某些情況下，此類變體ActRIIB多肽對特定配體具有改變的(提高或減少的)結合親和力。在其它情況下，變體ActRIIB多肽對其配體具有改變的結合特異性。
在某些實施方案中，本發明考慮ActRIIB多肽的特定突變以改變多肽的糖基化。可選擇這類突變，使得引入或剔除一個或多個糖基化位點，例如0聯糖基化位點或N聯糖基化位點。天冬醯胺連接的糖基化識別位點一般包含被合適的細胞糖基化酶特異性識別的三肽序列，即天冬醯胺-X-蘇氨酸(其中「X」為任何胺基酸)。還可通過添加ー個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基至野生型ActRIIB多肽的序列(對於0聯糖基化位點)，或者用ー個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基取代野生型ActRIIB多肽的序列來作出改變。在糖基化識別位點第一或第三胺基酸位置的一個或兩個上的各種胺基酸取代或缺失(和/或在第二位置上的胺基酸缺失)在修飾三肽序列上導致非糖基化。在ActRIIB多肽上增加糖部分的數目的另ー種方法是將糖苷與ActRIIB多肽化學偶聯或酶促偶聯。根據所採用的偶聯方式，可將糖連接至(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基；(c)游離巰基，例如半胱氨酸的巰基；(d)游離羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(e)芳族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基；或(f)穀氨醯胺的醯胺基。這些方法參見1987年9月11日公布的WO87/05330 以及 Aplin 和 Wriston(1981)CRC Crit. Rev. Biochem.，第 259-306 頁，通過引用結合到本文中。可用化學方法和/或酶方法實現ActRIIB多肽上存在的ー個或多個糖部分的脫去。化學去糖基化可包括例如將ActRIIB多肽暴露於化合物三氟甲烷磺酸或等同化合物中。這種處理導致除連接糖(N-こ醯葡糖胺或N-こ醯半乳糖胺)以外的大部分或所 有糖被切割，同時保持胺基酸序列完整。化學去糖基化另參見Hakimuddin等(1987)Arch.Biochem. Biophys. 259 52 和 Edge 等(1981) Anal. Biochem. 118 :131。ActRIIB 多妝上的糖部分的酶促切割可通過使用各種內切糖苷酶和外切糖苷酶完成，參見Thotakura等(1987)Meth. Enzymol. 138 :350。適當時,可根據所採用的表達系統類型，調整ActRIIB多肽的序列，因為哺乳動物、酵母、昆蟲和植物細胞均可引入可受所述肽的胺基酸序列影響的不同糖基化模式。一般而言，用於人的ActRIIB蛋白可在提供適當糖基化的哺乳動物細胞系(例如HEK293或CHO細胞系)中表達，雖然預期其它的哺乳動物表達細胞系也是有用的。本公開內容還考慮產生變體、特別是數套ActRIIB多肽的組合變體包括任選截短變體的方法；組合突變型庫尤其可用於鑑定功能變體序列。篩選這類組合文庫的目的可以是產生例如具有改變的性質(例如改變的藥代動力學或改變的配體結合)的ActRIIB多肽變體。下面提供各種篩選測定法，這類測定法可用來評價變體。例如，可針對與ActRIIB多肽結合的能力篩選ActRIIB多肽變體，以防止ActRIIB配體與ActRIIB多肽結合。還可以在基於細胞的測定法或體內測定法中測試ActRIIB多肽或其變體的活性。例如，可對ActRIIB多肽變體對成骨細胞或前體中參與骨產生的基因的表達的作用進行評價。這可根據需要在一種或多種重組ActRIIB配體蛋白(例如BMP7)存在下進行，可以轉染細胞以產生ActRIIB多肽和/或其變體，任選ActRIIB配體。同樣，可將ActRIIB多肽給予小鼠或其它動物，並可評價ー種或多種骨性質，例如密度或體積。還可以評價骨折的癒合速度。類似地，可在肌細胞、脂肪細胞和神經元細胞中通過例如上述測定法檢測ActRIIB多肽或其變體對這些細胞的生長的任何影響的活性。這類測定法是本領域眾所周知和常規的。此類細胞系中可採用SMAD響應性報告基因以監測對下遊信號轉導的影響。可以製備相對於天然存在的ActRIIB多肽具有選擇性潛能的組合衍生的變體。此類變體蛋白，當從重組DNA構建體表達時，可用於基因療法方案中。同樣，誘變可產生與相應的野生型ActRIIB多肽相比胞內半衰期十分不同的變體。例如，對於蛋白水解降解或者導致天然ActRIIB多肽破壞或以其它方式失活的其它過程，經改變的蛋白質可更穩定或更不穩定。可利用這類變體和編碼所述變體的基因，以通過調節ActRIIB多肽的半衰期改變ActRIIB多肽水平。例如，短的半衰期可產生更短暫的生物作用，並且當作為誘導型表達系統的部分時，短的半衰期可允許更嚴格控制細胞內的重組ActRIIB多肽水平。在某些實施方案中，除天然存在於ActRIIB多肽中的任何修飾以外，本發明的ActRIIB多肽還可包含翻譯後修飾。這類修飾包括但不限於こ醯化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和醯化。因此，修飾的ActRIIB多肽可含有非胺基酸成分，例如聚こニ醇、脂質、多糖或單糖和磷酸酷。可按照本文有關其它ActRIIB多肽變體方面所述，測試這類非胺基酸成分對ActRIIB多肽的功能性的影響。如果ActRIIB多肽在細胞中通過切割ActRIIB多肽的新生形式產生，則翻譯後加工對於蛋白質的正確摺疊和/或功能亦可為重要的。對於這類翻譯後活性，不同的細胞(例如CHO、HeLa, MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有特定的細胞機器和特有機制，可選擇不同的細胞以確保ActR IIB多肽的正確修飾和加工。在某些方面，ActRIIB多肽的功能變體或修飾形式包括具有ActRIIB多肽的至少一部分和ー個或多個融合結構域的融合蛋白。這類融合結構域的眾所周知的實例包括但不限於聚組氨酸、Glu-Glu、穀胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重鏈恆定區(例如Fe)、麥芽糖結合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可選擇融合結構域以提供所需性質。例如，ー些融合結構域特別可用於通過親和層析法分離融合蛋白。為了親和純化的目的，使用用於親和層析法的相關基質，例如穀胱甘肽綴合樹脂、澱粉酶綴合樹脂和鎳綴合樹脂或鈷綴合樹脂。這類基質的許多種可以「試劑盒」形式獲得，例如Pharmacia GST純化系統和可與(HIS6)融合配偶體一起使用的QIAexpress 系統(Qiagen)。作為另ー個實例，可選擇融合結構域以促進ActRIIB多肽的檢測。這類檢測結構域的實例包括各種螢光蛋白(例如GFP)以及「表位標籤」，其通常是短肽序列，可獲得其特異性抗體。易獲得其特異性單克隆抗體的眾所周知的表位標籤包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc標籤。在一些情況下，融合結構域具有例如因子Xa或凝血酶的蛋白酶切割位點，其允許相關蛋白酶部分消化融合蛋白，從而從中釋放重組蛋白。然後，可通過隨後的層析分離，從融合結構域分離出釋放的蛋白質。在某些優選的實施方案中，ActRIIB多肽與體內穩定ActRIIB多肽的結構域(「穩定劑」結構域)融合。所謂「穩定」意指延長血清半衰期的任何方法，不論這是否是因為破壞減少、腎清除率降低或其它藥代動力學作用。已知與免疫球蛋白的Fe部分的融合物賦予多種蛋白質所需要的藥代動力學性質。同樣，與人血清白蛋白的融合物可賦予所需要的性質。可選擇的融合結構域的其它類型，包括多聚化(例如ニ聚化、四聚化)結構域和功能結構域(賦予其它生物功能，例如進ー步刺激肌肉生長)。作為具體實例，本發明提供包含與Fe結構域(例如SEQ ID NO 9)融合的胞外(例如結合GDF8的)結構域的融合蛋白作為GDF8拮抗劑。THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*任選Fe結構域在例如Asp-265、賴氨酸322和Asn_434殘基上具有ー個或多個突變。在某些情況下，與野生型Fe結構域相比，具有這些突變的ー個或多個(例如Asp-265突變)的突變型Fe結構域與Fe Y受體結合的能力降低。在其它情況下，與野生型Fe結構域相比，具有這些突變的ー個或多個(例如Asn-434突變)的突變型Fe結構域與MHC I類相關Fe受體(FcRN)結合的能力提高。要理解的是，融合蛋白的不同組分可以與所需功能性一致的任何方式排列。例如，可將ActRIIB多肽置於異源結構域的C端，或者，可將異源結構域置於ActRIIB多肽的C端。ActRIIB多肽結構域和異源結構域在融合蛋白中不一定鄰接，在任一結構域的C端或N端或者在結構域之間可包括其它結構域或胺基酸序列。在某些實施方案中，本發明的ActRIIB多肽含有能夠穩定ActRIIB多肽的ー種或多種修飾。例如，這類修飾延長ActRIIB多肽的體外半衰期、延長ActRIIB多肽的循環半衰期或降低ActRIIB多肽的蛋白水解降解。這類穩定修飾包括但不限於融合蛋白(包括例如包含ActRIIB多肽和穩定劑結構域的融合蛋白)、糖基化位點的修飾(包括例如糖基化位點加至ActRIIB多肽上)和糖部分的修飾(包括例如從ActRIIB多肽中脫去糖部分)。在融合蛋白的情況下，ActRIIB多肽與穩定劑結構域(例如IgG分子(例如Fe結構域))融合。 本文使用的術語「穩定劑結構域」不僅僅是指融合蛋白的情況下的融合結構域(例如Fe)，而且還包括非蛋白質修飾(例如糖部分)或非蛋白質聚合物(例如聚こニ醇)。在某些實施方案中，本發明可獲得ActRIIB多肽的分離和/或純化形式，其與其它蛋白酶分離或者基本上不含其它蛋白質。在某些實施方案中，本發明的ActRIIB多肽(未修飾或修飾的)可通過各種本領域已知的技術產生。例如，此類ActRIIB多肽可利用標準的蛋白質化學技術(例如描述於以 F又獻中的技術Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag,Berlin (1993)和Grant G. A.(編輯)，Synthetic Peptide A User' s Guide, W. H. Freeman和Company, New York (1992))來合成。另外，自動肽合成儀是市售的(例如AdvancedChemTech Model 396 ；Milligen/Biosearch 9600)。或者，ActRIIB 多肽、其片段或變體可利用本領域眾所周知的各種表達系統(例如大腸桿菌、中國倉鼠卵巣細胞、COS細胞、杆狀病毒)重組產生(亦參見以下)。在另ー個實施方案中，修飾或未修飾的ActRIIB多肽可通過利用例如蛋白酶(例如胰蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、膜凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或配對的鹼性胺基酸轉化酶(PACE))消化天然存在或重組產生的全長ActRIIB多肽來產生。計算機分析(利用市售軟體，例如 MacVector、Omega、PCGene、Molecular Simulation, Inc.)可用於鑑定蛋白酶剪切位點。或者，可例如通過本領域已知的標準技術例如通過化學裂解(例如溴化氰、羥胺)從天然存在或重組產生的全長ActRIIB多肽產生此類ActRIIB多肽。3 編碼ActRIIB多肽的核酸在某些方面，本發明提供編碼本文公開的任何ActRIIB多肽的分離核酸和/或重組核酸。例如，SEQ ID NO :4編碼ActRIIB (25-131)-hFc前體多肽，而SEQ ID NO :6編碼相同蛋白質但具有備選序列，SEQ ID No. 4和6各自的核苷酸73-396編碼所編碼蛋白質的ActRIIB衍生部分。主題核酸可呈單鏈或雙鏈。這類核酸可以是DNA或RNA分子。這些核酸可用於例如用於製備ActRIIB多肽的方法中。例如，以下序列編碼天然存在的人ActRIIB前體多肽(SEQ ID NO 2) (NM_001106的核苷酸 5-1543，1539bp)atgacggcgccctgggtggccctcgccctcctctggggatcgctgtggcccggctct
gggcgtggggaggctgagacacgggagtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagagcggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgaaggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcccccaccctgctcacggtgctggcctactcactgctgcccatcgggggcctttccctcatcgtcctgctggccttttggatgtaccggcatcgcaagcccccctacggtcatgtggac atccatgaggaccctgggcctccaccaccatcccctctggtgggcctgaagccactgcagctgctggagatcaaggctcgggggcgctttggctgtgtctggaaggcccagctcatgaatgactttgtagctgtcaagatcttcccactccaggacaagcagtcgtggcagagtgaacgggagatcttcagcacacctggcatgaagcacgagaacctgctacagttcattgctgccgagaagcgaggctccaacctcgaagtagagctgtggctcatcacggccttccatgacaagggctccctcacggattacctcaaggggaacatcatcacatggaacgaactgtgtcatgtagcagagacgatgtcacgaggcctctcatacctgcatgaggatgtgccctggtgccgtggcgagggccacaagccgtctattgcccacagggactttaaaagtaagaatgtattgctgaagagcgacctcacagccgtgctggctgactttggcttggctgttcgatttgagccagggaaacctccaggggacacccacggacaggtaggcacgagacggtacatggctcctgaggtgctcgagggagccatcaacttccagagagatgccttcctgcgcattgacatgtatgccatggggttggtgctgtgggagcttgtgtctcgctgcaaggctgcagacggacccgtggatgagtacatgctgccctttgaggaagagattggccagcacccttcgttggaggagctgcaggaggtggtggtgcacaagaagatgaggcccaccattaaagatcactggttgaaacacccgggcctggcccagctttgtgtgaccatcgaggagtgctgggaccatgatgcagaggctcgcttgtccgcgggctgtgtggaggagcgggtgtccctgattcggaggtcggtcaacggcactacctcggactgtctcgtttccctggtgacctctgtcaccaatgtggacctgccccctaaagagtcaagcatctaa以下序列編碼人可溶性(胞外)ActRIIB多肽(SEQ ID NO 10) (348bp)。tctgggcgtggggaggctgagacacgggagtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagagcggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgaaggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcccccacc在某些方面，編碼ActRIIB多肽的主題核酸還理解為包括SEQ ID NO :4或6的變體的核酸。變體核苷酸序列包括因一個或多個核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因變體；並且因此，包括不同於SEQ ID NO :4或6中指定的編碼序列的核苷酸序列的編碼序列。在某些實施方案中，本發明提供與SEQ ID N0:4或6有至少80%、85%、90%、95%99%或100%同一性的分離核酸序列或重組核酸序列，以及尤其是其來源
於ActRIIB (核苷酸73-396)的那些部分。本領域普通技術人員應理解的是，與SEQ ID NO:4或6互補的核酸序列以及SEQ ID NO :4的變體也在本發明的範圍內。在另外的實施方案中，本發明的核酸序列可被分離、重組和/或與異源核苷酸序列融合，或者存在於DNA文庫中。在其它實施方案中，本發明的核酸還包括以下核苷酸序列，其在高嚴格條件下與SEQ ID NO :4或6所指定的核苷酸序列、SEQ ID NO :4或6的互補序列或者其片段(例如核苷酸73-396)雜交。如上所述，本領域的普通技術人員應容易地理解的是，可以改變促進DNA雜交的適當嚴格性條件。本領域的普通技術人員應容易地理解的是，可以改變促進DNA雜交的適當嚴格性條件。例如，可在6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)下於約45°C進行雜交，接著2. Ox SSC於50°C洗滌。例如，可從約2. Ox SSC於50°C的低嚴格性到約0. 2xSSC於50°C的高嚴格性選擇洗滌步驟的鹽濃度。另外，洗滌步驟的溫度可從室溫(約22°C)下的低嚴格性條件提高到約65°C下的高嚴格性條件。溫度和鹽兩者均可改變，或者可保持溫度或鹽濃度恆定，而改變另ー個變量。在一個實施方案中，本發明提供在6x SSC於室溫的低嚴格性條件下雜交接著2xSSC於室溫洗滌的核酸。 因遺傳密碼簡併而不同於SEQ ID NO :4或6所示核酸的分離核酸也在本發明的範圍內。例如，用不止ー個三聯體標示多個胺基酸。限定同一胺基酸的密碼子或同義密碼子(例如CAU和CAC是組氨酸的同義密碼子)，可導致不影響蛋白質的胺基酸序列的「沉默」突變。然而，預期在哺乳動物細胞中可存在確實引起主題蛋白質胺基酸序列改變的DNA序列多態性。本領域技術人員應理解的是，由於天然等位基因變化所致，在給定物種的個體之間，可存在編碼特定蛋白質的核酸的一個或多個核苷酸(多至約3-5%的核苷酸)的這些變化。任何和所有這類核苷酸變化和所得胺基酸多態性也在本發明的範圍內。在某些實施方案中，在表達構建體中，本發明的重組核酸可與一個或多個調節核苷酸序列有效連接。調節核苷酸序列一般可適於用於表達的宿主細胞。本領域已知用於各種宿主細胞的許多類型的合適表達載體和合適調節序列。所述ー個或多個調節核苷酸序列通常可包括但不限於啟動子序列、前導序列或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始序列和終止序列、翻譯起始序列和終止序列及增強子或激活物序列。本發明考慮本領域已知的組成型啟動子或誘導型啟動子。啟動子可以是天然存在的啟動子或將不止一種啟動子的元件組合的雜合啟動子。表達構建體可存在於細胞的附加體例如質粒上，或者表達構建體可插入染色體中。在優選的實施方案中，表達載體含有選擇標記基因以供轉化宿主細胞的選擇。選擇標記基因是本領域眾所周知的並且可隨所採用的宿主細胞而改變。在本發明的某些方面，在包含編碼ActRIIB多肽並與至少ー個調節序列有效連接的核苷酸序列的表達載體中提供主題核酸。調節序列是本領域公認的，並被選擇來直接表達ActRIIB多肽。因此，術語調節序列包括啟動子、增強子和其它表達調控元件。示例性的調節序夕lJ參見Goeddel ；Gene Expression Technology Methods in Enzymology, AcademicPress, San Diego, CA(1990)。例如，控制DNA序列表達的各種表達調控序列的任一種當與DNA序列有效連接時，可用於這些載體以表達編碼ActRIIB多肽的DNA序列。這類有用的表達調控序列包括例如SV40的早期啟動子和晩期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細胞病毒立即早期啟動子、RSV啟動子、Iac系統、trp系統、TAC或TRC系統、其表達受I7RNA聚合酶指導的17啟動子、噬菌體\的主要操縱基因和啟動子區、fd外殼蛋白的調控區、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶啟動子(例如Pho5)、酵母a-交配因子啟動子、杆狀病毒系統的多角體(polyhedron)啟動子和已知控制原核細胞或真核細胞或其病毒的基因表達的其它序列及其各種組合。應當理解的是，表達載體的設計可取決於以下因素，例如待轉化的宿主細胞的選擇和/或欲表達的蛋白質類型。此外，還應考慮載體拷貝數、控制該拷貝數的能力和由所述載體編碼的任何其它蛋白質例如抗生素標記的表達。本發明的重組核酸可通過將克隆的基因或其部分連接到適於在原核細胞、真核細胞(酵母、禽、昆蟲或哺乳動物)或兩者中表達的載體中來產生。用於產生重組ActRIIB多肽的表達載體包括質粒和其它載體。例如，合適的載體包括用於在原核細胞(例如大腸桿菌)中表達的以下類型的質粒pBR322衍生質粒、pEMBL衍生質粒、pEX衍生質粒、pBTac衍生質粒和pUC衍生質粒。ー些哺乳動物表達載體既含有利於載體在細菌中繁殖的原核序列，又含有在真核細胞中表達的一個或多個真核轉錄單元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2_dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo 和 pHyg 衍生載體是適於轉染真 核細胞的哺乳動物表達載體的實例。這些載體中的一些用來源於細菌質粒(例如PBR322)的序列修飾，以利於在原核細胞和真核細胞兩者中複製和進行藥物抗性選擇。或者，可使用諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-I)或埃巴病毒(pHEBo、pREP衍生物和p205)等病毒衍生物在真核細胞中瞬時表達蛋白質。其它病毒(包括反轉錄病毒)表達系統的實例可見下面基因療法遞送系統的描述。用於質粒製備和宿主生物轉化中的各種方法是本領域眾所周知的。對於原核和真核細胞兩者的其它合適的表達系統以及通用重組方法，參見Molecular CloningA Laboratory Manual,弟 2 版，Samorook,Fritscn 和 Maniatis 編輯(Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989) 16和17章。在某些情況下,可能需要通過利用杆狀病毒表達系統來表達重組多肽。這類杆狀病毒表達系統的實例包括PVL衍生載體(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生載體(例如pAcUWl)和pBlueBac衍生載體(例如含P -gal的 pBlueBac III)。在優選的實施方案中，可設計在CHO細胞中產生主題ActRIIB多肽的載體，例如Pcmv-Script 載體(Stratagene, La Jolla, Calif. )、pcDNA4 載體(Invitrogen, Carlsbad,Calif.)和pCI-neo載體(Promega, Madison, Wise.)。顯然，可使用主題基因構建體在培養基中繁殖的細胞中使主題ActRIIB多肽表達，例如產生蛋白質(包括融合蛋白或變體蛋白)以便純化。本發明還涉及用重組基因轉染的宿主細胞，所述重組基因包括一種或多種主題ActRIIB多肽的編碼序列(例如SEQ ID N0:4或6)。宿主細胞可以是任何原核細胞或真核細胞。例如，可在細菌細胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細胞(例如利用杆狀病毒表達系統)、酵母或哺乳動物細胞中表達本發明的ActRIIB多肽。其它合適的宿主細胞為本領域技術人員所知。因此，本發明還涉及產生主題ActRIIB多肽的方法。例如，可將用編碼ActRIIB多肽的表達載體轉染的宿主細胞培養在合適的條件下以允許表達ActRIIB多肽。可使ActRIIB多肽分泌並從細胞和含有ActRIIB多肽的培養基的混合物中分離出來。或者，可將ActRIIB多肽保持在胞質或在膜部分中並將細胞收穫、裂解並分離蛋白。細胞培養物包括宿主細胞、培養基和其它副產品。用於細胞培養的合適培養基是本領域眾所周知的。可採用本領域已知的用於純化蛋白質的技術，包括離子交換層析法、凝膠過濾層析法、超濾法、電泳以及使用對ActRIIB多肽的特定表位有特異性的抗體進行免疫親和純化，將主題ActRIIB多肽從細胞培養基、宿主細胞或兩者中分離出來。在優選的實施方案中，ActRIIB多肽是含有促進其純化的結構域的融合蛋白。在另ー個實施方案中，編碼純化前導序列(例如重組ActRIIB多肽的所需部分的N端上的聚- (His)/腸激酶切割位點序列)的融合基因，可允許使用Ni2+金屬樹脂通過親和層析法對表達的融合蛋白進行純化。純化的前導序列隨後可通過腸激酶處理除去，得到純化的 ActRIIB 多肽(例如參見 Hochuli 等(1987) J. Chromatography 411 :177 ;以及Janknecht 等，PNAS USA 88 :8972)。製備融合基因的技術是眾所周知的。基本上，編碼不同多肽序列的各種DNA片段的連接按照常規技術進行，採用用於連接的平端或交錯端，限制性內切酶消化以提供合適 末端，適當時補平黏性末端，鹼性磷酸酶處理以避免不需要的連接，並進行酶促連接。在另一個實施方案中，融合基因可通過常規技術合成，包括自動DNA合成儀。或者，可使用在兩個連續基因片段之間產生互補突出端的錨定引物進行基因片段的PCR擴增，所述基因片段隨後可退火得到嵌合基因序列(參見例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel 等編輯，John Wiley & Sons :1992)。5.示例性治療應用在某些實施方案中，本發明的組合物(例如ActRIIB多肽)可用於治療或預防與ActRIIB多肽和/或ActRIIB配體(例如⑶F8)的異常活性有關的疾病或病況。這些疾病、病症或病況一般在本文被稱作「 ActRIIB相關病況」。在某些實施方案中，本發明提供通過給予有需要的個體治療有效量的如所上述的ActRIIB多肽治療或預防所述個體的方法。這些方法尤其g在動物(並且更特別地，人)的治療和預防性治療。本文使用的「預防」病症或病況的治療藥是指以下化合物，其在統計樣本中，與未治療對照樣品相比，減少治療樣品中的病症或病況的發生，或者與未治療對照樣品相比，延緩病症或病況的ー種或多種症狀發作或者降低病症或病況的ー種或多種症狀的嚴重程度。本文所用術語「治療」包括指定病況的預防或者病況一旦確立便改善或根除病況。ActRIIB/ActRIIB配體複合體在組織生長及早期發育過程例如各種結構的正確形成或者一種或多種發育期後能力包括性發育、垂體激素的產生和骨和軟骨的形成中發揮重要作用。因此，ActRIIB相關病況包括異常的組織生長和發育性缺陷。此外，ActRIIB相關病況包括但不限於細胞生長和分化的病症例如炎症、變態反應、自身免疫性疾病、傳染性疾病和腫瘤。用於治療的示例性病況包括神經肌肉病症(例如肌營養不良和肌肉萎縮)、充血性阻塞性肺病(和與CCffD相關的肌肉消耗)、肌肉消耗症候群、肌肉衰減症候群、惡病質、月旨肪組織病症(例如肥胖症)、2型糖尿病和骨變性疾病(例如骨質疏鬆症)。其它的示例性病況包括肌肉變性病症和神經肌肉病症、組織修復(例如傷ロ癒合)、神經變性疾病(例如肌萎縮側索硬化)、免疫學病症(例如與淋巴細胞的異常增殖或異常功能相關的病症)以及肥胖症或與脂肪細胞的異常增殖相關的病症。在某些實施方案中，本發明的組合物(例如，ActRIIB-Fc多肽)用作肌營養不良治療的一部分。術語「肌營養不良」是指特徵在於骨骼肌和有時為心肌和呼吸肌的逐漸衰弱和惡化的一組變性性肌肉疾病。肌營養不良為特徵在於以肌肉的微觀變化開始的進行性肌肉消耗和衰弱的遺傳病。隨著肌肉隨時間推移退化，人的肌力下降。可用包含主題ActRIIB多肽的方案治療的示例性肌營養不良包括杜興肌營養不良(DMD)、貝克爾肌營養不良(BMD)、埃-德肌營養不良(EDMD)、肢帶肌營養不良(LGMD)、面肩胛肱骨肌營養不良(FSH或FSHD)(又稱為Landouzy-Dejerine)、強直性營養不良(MMD)(又稱為Steinert病)、眼咽肌營養不良(OPMD)、遠端肌營養不良(DD)和先天性肌營養不良(CMD)。杜興肌營養不良(DMD)最先被法國神經學家Guillaume Benjamin AmandDuchenne在19世紀60年代描述。貝克爾肌營養不良(BMD)以最先在20世紀50年代描述DMD的該變體的德國醫生Peter Emil Becker來命名。DMD是男性最常見的遺傳病之一，3500個男孩中就有一個受其影響。當位於X染色體短臂的肌養蛋白基因斷裂時就會發生DMD。由於男性只攜帯X染色體的一個拷貝，他們僅具有肌養蛋白基因的ー個拷貝。沒有肌養蛋白蛋白時，肌肉在收縮和鬆弛周期期間容易受損。雖然在疾病早期肌肉通過再生補償，但之後肌肉祖細胞無法跟上持續傷害並且健康的肌肉被無功能的纖維脂肪組織所替代。 BMD由肌養蛋白基因的不同突變引起。BMD患者具有一些肌養蛋白，但其要麼量不足，要麼質量差。具有一些肌養蛋白使患BMD的那些人的肌肉免受如患DMD的人的肌肉那樣嚴重或快速地變性。例如，近來的研究證明阻斷或消除體內⑶F8(ActRIIB配體)的功能可有效地治療DMD和BMD患者的至少某些症狀。因此，主題ActRIIB多肽可充當⑶F8抑制劑(拮抗劑)並組成阻斷DMD和BMD患者的體內⑶F8和/或ActRIIB的功能的備選方法。該方法由本文所示的數據所確證並支持，其中ActRIIB-Fc蛋白在肌營養不良的小鼠模型中顯示出增加肌肉質量。類似地，在需要肌肉生長的其它疾病情況中主題ActRIIB多肽提供増加肌肉質量的有效方法。例如，ALS，也稱為Lou Gehrig病(運動神經元疾病)是ー種慢性、無法醫治並且不可阻擋的攻擊運動神經元的CNS病症，運動神經元為連接腦與骨骼肌的CNS組分。在ALS中，運動神經元惡化並最終死亡，儘管人腦正常地保持完全有功能且活躍，但移動的命令永遠不會到達肌肉。患ALS的大多數人在40-70歲。衰弱的第一運動神經元通向手臂或腿。患ALS的那些人可能在行走方面有困難，他們可能掉東西、跌倒、ロ齒不清並且無法控制地笑或哭。最終四肢肌肉從不被使用向萎縮進行。該肌肉的衰弱使人衰弱並且人將需要輪椅或變得無法下床。自疾病發病3-5年，大多數ALS患者死於呼吸衰竭或呼吸器輔助的併發症如肺炎。該方法由本文所示的數據所確證並支持，其中ActRIIB-Fc蛋白顯示改善ALS小鼠模型的外型、肌肉質量和壽命。ActRIIB多肽誘導的肌肉質量增加也可有益於遭受肌肉消耗疾病的那些。Gonzalez-Cadavid等(見上文)報導，⑶F8的表達與人的無脂肪質量呈負相關並且⑶F8基因的表達增加與患AIDS消耗症候群的男性的體重減少相關。通過抑制AIDS患者中⑶F8的功能，即使不能完全根治但可緩解AIDS的至少某些症狀，因此顯著改善AIDS患者的生活質量。由於⑶F8 (ActRIIB配體)功能的丟失還與無營養攝入縮減的脂肪丟失相關(Zimmers等,見上文；McPherron和Lee,見上文),主題ActRIIB多肽還可用作治療藥用於減緩或阻止肥胖症和II型糖尿病的發展。該方法由本文所示的數據所確證並支持，其中ActRIIB-Fc蛋白顯示出改善肥胖小鼠的代謝狀態。在 某些實施方案中，本發明的組合物(ActRIIB多肽)用作代謝症候群(也被稱作X症候群和胰島素抵抗症候群)的治療的一部分，該症候群是增加罹患心血管疾病和II型糖尿病的風險的病症和風險因素的組合。大多數患者為年長、肥胖、久坐的並具有一定程度的胰島素抵抗。向心性(腹部或內臟)肥胖是該症候群的重要特徵。在相關實施方案中，本發明的ActRI IB多肽和其它組合物可用作治療11型糖尿病(也被稱作非胰島素依賴型糖尿病或成年發病型糖尿病)的一部分，該疾病的特徵在於在胰島素抵抗和相對胰島素缺乏的背景下升高的血糖。糖尿病中複雜和多因素代謝改變常導致許多器官、最重要地心血管系統的損傷和功能障礙。II型糖尿病往往與肥胖症(腹部或內臟肥胖)、高血壓、高膽固醇和代謝症候群相關。II型糖尿病的重要風險因素包括老化、高脂飲食和久坐的生活方式。在其它相關實施方案中，本發明的ActRIIB多肽和其它組合物可用於治療動脈粥樣硬化的一部分，其是其中由於脂肪沉積(常被稱作斑)的累積使血管壁增厚的慢性炎症。動脈粥樣硬化的風險因素包括衰老、糖尿病、異常脂蛋白血症、肥胖症(腹部肥胖)和久坐的生活方式。ActRIIB多肽也可用於脂肪代謝障礙(lipodystrophic disorder),其易於與代謝症候群相關。嚴重的胰島素抵抗可由脂肪代謝障礙的遺傳形式和獲得性形式兩者引起，包括在後一種情況下在抗反轉錄病毒療法治療的患者中的人免疫缺陷病毒(HIV)相關的脂肪代謝障礙。癌症厭食-惡病質症候群屬於癌症中最衰弱並威脅生命的方面。癌症厭食-惡病質症候群中的進行性體重減輕是許多類型癌症的共有特徵並且不僅是生活質量低下和化療反應不佳的原因，而且也是具有比無體重減輕的可比擬腫瘤患者短的生存時間的原因。與厭食、脂肪和肌肉組織消耗、心理壓カ以及較低的生活質量相關的是，惡病質來自於癌症和宿主之間的複雜相互作用。它是癌症患者死亡的最普遍原因之一井佔死亡的80%。其是影響蛋白質、糖和脂肪代謝的代謝紊亂的複雜實例。腫瘤產生直接和間接異常兩者，導致厭食和體重減輕。目前，沒有控制或逆轉該過程的治療。癌症厭食-惡病質症候群影響細胞因子的產生、脂質動員因子和蛋白質水解誘導因子的釋放並改變中間代謝。儘管厭食常見，但僅食物攝入減少並不能作為癌症患者中所見的身體組成改變的原因，並且增加營養攝入並不能逆轉該消耗症候群。癌症患者如果在6個月內發生大於5%的病前體重的非自主體重減輕，應懷疑惡病質。由於發現成年小鼠中⑶F8的全身過表達誘發與人惡病質症候群中所見類似的深度的肌肉和脂肪丟失(Zimmers等，見上文)，主題ActRIIB多肽作為藥物組合物可有益地用於預防、治療或緩解其中需要肌肉生長的惡病質症候群的症狀。在其它實施方案中，本發明提供誘導骨和/或軟骨形成、防止骨丟失、増加骨礦化或防止骨去礦化的方法。例如本發明中鑑定的主題ActRIIB多肽和化合物在人和其它動物中在治療骨質疏鬆症和癒合骨折以及軟骨缺陷方面具有應用。ActRIIB多肽可用於診斷為亞臨床低骨密度的患者，作為針對骨質疏鬆症的形成的保護措施。在ー個具體的實施方案中，本發明的方法和組合物可在人和其它動物的骨折和軟骨缺陷的癒合中具有醫療用途。主題方法和組合物還可在閉合性和開放性骨折復位術以及改進人工關節固定方面具有預防用途。由成骨劑(osteogenic agent)誘導的從頭骨形成有助於先天性、創傷誘發的或腫瘤切除術誘發的顱面缺陷的修復，並且也可用於美容整形手木。此外，本發明的方法和組合物可用於治療牙周病以及其它的牙齒修復過程。在某些情況下，主題ActRIIB多肽可提供吸引成骨細胞、刺激成骨細胞生長或誘導成骨細胞祖細胞分化的環境。本發明的ActRIIB多肽還可用於治療骨質疏鬆症。此外，ActRIIB多肽可用於軟骨缺損修復和骨關節炎的預防/逆轉。在另ー個特定實施方案中，本發明提供用於修復骨折及與軟骨和/或骨缺陷或牙周病相關的其它病況的治療方法和組合物。本發明還提供用於傷ロ癒合和組織修復的治療方法和組合物。傷ロ的類型包括但不限於燒傷、切口和潰瘍。參見例如PCT公布號W084/01106。此類組合物包含與藥學上可接 受的溶媒、載體或基質混合的治療有效量的至少ー種本發明ActRIIB多肽。在另ー個特定實施方案中，本發明的方法和組合物可用於引起骨丟失的病況，例如骨質疏鬆症、甲狀旁腺功能亢進、庫欣病(Cushing’s disease)、甲狀腺毒症、慢性腹瀉狀態或吸收不良、腎小管性酸中毒、慢性腎衰竭或神經性厭食症。許多人知道作為女性，體重輕和過著久坐生活方式是骨質疏鬆症(導致骨折風險的骨礦物質密度丟失)的風險因素。然而，骨質疏鬆症還可由長期使用某些藥物引起。由藥物或另ー種醫學病況引起的骨質疏鬆症被稱為繼發性骨質疏鬆症。在稱為庫欣病的病況中，由機體產生的過量皮質醇引起骨質疏鬆症和骨折。與繼發性骨質疏鬆症有關的最普通的藥物是皮質留類，像由腎上腺天然產生的激素皮質醇一祥起作用的藥物類別。雖然骨骼發育需要適當水平的甲狀腺激素(其由甲狀腺產生)，但過量的甲狀腺激素可隨時間減少骨質量。當患有腎病的人(特別是經歷透析的人)攝入高劑量含有鋁的抗酸劑時，可導致骨丟失。可引起繼發性骨質疏鬆症的其它藥物包括用於預防癲癇發作的苯妥英(Dilantin)和巴比妥類；甲氨蝶呤(Rheumatrex,Immunex, Folex PFS),—種用於某些形式的關節炎、癌症和免疫疾病的藥物；環孢菌素(Sandimmune, Neoral)，一種用於治療ー些自身免疫性疾病和抑制器官移植患者的免疫系統的藥物；促黃體激素釋放激素激動劑(Lupron、Zoladex)，用於治療前列腺癌和子宮內膜異位症；肝素(Calciparine、Liquaemin),—種抗凝藥；以及消膽胺(Questran)和考來替泊(Colestid)，用於治療高膽固醇。齦疾病導致骨丟失，因為我們口腔中這些有害的細菌迫使我們的機體抵禦它們。細菌在齦線下產生毒素和酶，導致慢性感染。在其它的實施方案中，本發明提供用於調節動物中體脂肪含量和用於治療或預防與其相關的病況並且特別地，與其相關的損害健康的病況的組合物和方法。依照本發明，調節(控制)體重可指減少或増加體重、降低或提高重量増加的速度、或者降低或提高體重減輕的速度，並且還包括積極保持體重，或者不顯著改變體重(例如針對可以其它方式増加或減少體重的外部影響或內部影響)。本發明的一個實施方案涉及通過給予有需要的動物(例如人)ActRIIB多肽來調節體重。在ー個特定的實施方案中，本發明涉及用於減少動物的脂肪質量和/或減少動物的脂肪質量的増加並且更特別地，用於治療或緩解處於肥胖症風險中或患有肥胖症的患者的肥胖症的方法和化合物。在另ー個特定實施方案中，本發明涉及用於治療不能増加或保持重量的動物(例如患消耗症候群的動物)的方法和化合物。此類方法對於增加體重和/或質量、或減少重量和/或質量丟失、或者改善與非所需的低(例如不健康的)體重和/或質量相關的病況或由非所需的低體重和/或質量引起的病況是有效的。7.藥物組合物在某些實施方案中，將本發明的化合物(例如ActRIIB多肽)與藥學上可接受的載體一起配製。例如，ActRIIB多肽可單獨給予或作為藥物製劑(治療組合物)的組分給予。主題化合物可以用於人或獸藥的任何適宜的方式配製用於給藥。在某些實施方案中，本發明的治療方法包括局部、全身或者以植入物或裝置局部給予組合物。當給藥時，用於本發明的治療組合物當然是無致熱原的生理學上可接受的形式。另外，組合物可以黏性形式合意地裝入膠囊或注射，用於遞送至靶組織部位(例如骨、軟骨、肌肉、脂肪或神經元)，例如具有組織損傷的部位。局部給藥可適用於傷ロ癒合和組織修復。還可任選包含在上述組合物中的除ActRIIB多肽之外的治療上有用的物質，可作為備選或另外與本發明方法的主題化合物(例如ActRIIB多肽)同時或序貫給予。
在某些實施方案中，本發明的組合物可包含基質，其能夠將ー種或多種治療化合物(例如ActRIIB多肽)遞送到靶組織部位，為發育組織提供結構，並且最好能夠被吸收進體內。例如，基質可提供慢釋的ActRIIB多肽。這類基質可以形成目前用於其它植入醫學應用的材料。基質材料的選擇取決於生物相容性、生物降解能力、機械性能、美容外觀和界面性質。主題組合物的具體應用將界定適當的製劑。組合物可能的基質可以是生物可降解的和化學上確定的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它可能的材料是生物可降解的和生物學上明確限定的，例如骨或真皮膠原。其它基質由純的蛋白質或胞外基質組分組成。其它可能的基質是非生物可降解的和化學上確定的，例如燒結羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其它陶瓷。基質可由任何上述類型的材料的組合組成，例如聚乳酸和羥磷灰石或膠原和磷酸三鈣。生物陶瓷可在組成方面改變，例如呈鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽，並進行加工以改變孔徑、顆粒大小、顆粒形狀和生物降解能力。在某些實施方案中，本發明的方法可以例如以下形式ロ服給予膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用調味基料，一般為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)、散剤、顆粒劑，或者作為水性液體或非水性液體中的溶液劑或混懸劑、或作為水包油或油包水液體乳劑、或作為酏劑或糖漿劑、或作為軟錠劑(使用惰性基料，例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)和/或作為漱ロ劑等，各自含有預定量的物質作為活性成分。藥齊胚可作為大丸剤、藥糖劑或糊劑給予。在ロ服給藥的固體劑型(膠囊劑、片劑、丸剤、糖衣丸、散剤、顆粒劑等)中，可將ー種或多種本發明的治療化合物與一種或多種藥學上可接受的載體混合，例如檸檬酸鈉或磷酸ニ鈣和/或以下的任ー種(I)填充劑或增充劑，例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或矽酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚こ烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)溼潤劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、藻酸、某些矽酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，例如石蠟；(6)吸收促進劑，例如季銨化合物；(7)潤溼齊U，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酷；(8)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土； (9)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態聚こニ醇、十二烷基硫酸鈉及其混合物；和(10)著色劑。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可包含緩衝劑。在使用諸如乳糖或牛奶糖以及高分子量聚こニ醇等賦形劑的軟充填和硬充填明膠膠囊劑中，相似類型的固體組合物也可用作填充劑。用於ロ服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除活性成分以外，液體劑型可含有常用於本領域的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化剤，例如こ醇、異丙醇、碳酸こ酷、こ酸こ酷、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙ニ醇、1，3-丁ニ醇、油(具體地說為棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚こニ醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑以外，ロ服組合物還可包含輔料，例如潤溼劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、芳香劑和防腐剤。除活性化合物以外，混懸劑可含有助懸劑，例如こ氧基化異十八醇、聚氧こ烯山梨糖醇和失水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化招(aluminum metahydroxide)、膨潤土、瓊脂和西黃蓍膠及其混合物。本文公開的某些組合物可局部給予至皮膚或黏膜。局部製劑還可包含ー種或多種 已知有效作為皮膚或角質層的滲透促進劑的多種物質。這些物質的實例為2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、ニ甲基こ醯胺、ニ甲基甲醯胺、丙ニ醇、甲醇或異丙醇、ニ甲基亞碸和氮酮。另外的物質也可包含在內以使製劑美容上可接受。這些物質的實例為脂類、蠟、油、染料、香料、防腐剤、穩定劑和表面活性剤。角質層分離劑(例如本領域已知的那些)也可包含在內。實例為水楊酸和硫(sulfur)。局部給藥或透皮給藥的劑型包括散剤、噴霧劑、軟膏、糊劑、霜劑、洗剤、凝膠劑、溶液剤、貼劑和吸入劑。可將活性化合物在無菌條件下與藥學上可接受的載體以及與可能需要的任何防腐剤、緩衝劑或拋射劑混合。所述軟膏、糊劑、霜劑和凝膠劑除本發明的主題化合物(例如ActRIIB多肽)之外還可包含賦形劑例如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚こニ醇、矽酮、膨潤土、矽酸、滑石粉和氧化鋅或其混合物。散劑和噴霧劑除主題化合物之外可包含賦形劑例如乳糖、滑石粉、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣和聚醯胺粉或這些物質的混合物。噴霧劑可另外含有常規拋射劑，例如氯氟烴和揮發性未取代的烴，例如丁烷和丙烷。在某些實施方案中，適於胃腸外給予的藥物組合物可包含ー種或多種ActRIIB多肽以及一種或多種藥學上可接受的無菌等滲水性或非水性溶液劑、分散體、混懸劑或乳劑或者無菌粉劑(所述粉劑可在臨用前重構成用無菌注射用溶液劑或分散體)，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、使製劑與預期接受者血液等滲的溶質或者助懸劑或增稠劑。可用於本發明藥物組合物的合適水性載體和非水性載體的實例包括水、こ醇、多元醇(例如甘油、丙ニ醇、聚こニ醇等)及其合適的混合物、植物油(例如橄欖油)和注射用有機酯(例如油酸こ酷)。可通過例如使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散體的情況下通過保持所需要的粒徑，以及通過使用表面活性剤，來保持適當的流動性。本發明的組合物還可含有輔料，例如防腐剤、潤溼劑、乳化劑和分散劑。可通過加入多種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酷、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，來確保防止微生物的作用。組合物中還可能需要包含等滲劑(例如糖、氯化鈉等)。另外，可通過加入延遲吸收的物質(例如單硬脂酸鋁和明膠)，使可注射藥物形式的吸收延長。要理解的是，主治醫師在考慮修正本發明的主題化合物(例如ActRIIB多肽)的作用的各種因素後，可確定劑量方案。各種因素應視待治療的疾病而定。在某些實施方案中，本發明還提供用於體內產生ActRIIB多肽或本文公開的其它化合物的基因療法。這類療法可通過將ActRIIB多核苷酸序列引入受累於上文所列病症的細胞或組織，來達到其治療效果。可使用重組表達載體(例如嵌合病毒或膠體分散系統)實現ActRIIB多核苷酸序列的遞送。優選的ActRIIB多核苷酸序列的治療遞送是使用靶向脂質體。可用於本文教導的基因療法的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒或優選RNA病毒(例如反轉錄病毒)。優選反轉錄病毒載體是鼠或禽反轉錄病毒的衍生物。可插入單一外源基因的反轉錄病毒載體的實例包括但不限於莫洛尼鼠白血病病毒 (MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)和勞斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus, RSV)。許多其它的反轉錄病毒載體可摻入多個基因。所有的這些載體可轉移或整合選擇標記的基因，使得可鑑定和產生轉導細胞。可通過連接例如糖、糖脂或蛋白質，使反轉錄病毒載體具有靶標特異性。通過使用抗體來完成優選的打靶。本領域的技術人員應認識的是，可將特異性多核苷酸序列插入反轉錄病毒基因組或與病毒包膜連接，以供含有ActRIIB多核苷酸的反轉錄病毒載體的靶標特異性遞送。在一個優選的實施方案中，載體靶定骨、軟骨、肌肉或神經元細胞/組織。或者，可通過常規磷酸鈣轉染，將組織培養細胞用編碼反轉錄病毒結構基因gag、pol和env的質粒直接轉染。然後將這些細胞用含有目標基因的載體質粒轉染。所得細胞釋放反轉錄病毒載體到培養基中。ActRIIB多核苷酸的另ー種靶定遞送系統是膠體分散系統。膠體分散系統包括大分子複合體、納米囊、微球、珠粒和脂質型系統，包括水包油乳液、微團、混合微團和脂質體。優選的本發明的膠體系統是脂質體。脂質體是可體外和體內用作遞送載體的人工膜囊泡。RNA、DNA和完整病毒體可包封在水性內部，並以生物活性形式遞送至細胞(參見例如Fraley等,Trends Biochem. Sci. ,6 :77,1981)。使用脂質體載體的有效基因轉移方法是本領域已知的，參見例如Mannino等,Biotechniques, 6 :682,1988。脂質體的組成一般是磷脂的組合，一般與類固醇(尤其是膽固醇)組合。也可以使用其它磷脂或其它脂質。脂質體的物理特性取決於pH、離子強度和ニ價陽離子的存在情況。可用於產生脂質體的脂質的實例包括磷脂醯化合物，例如磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯こ醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經節苷脂。說明性的磷脂包括蛋黃磷脂醯膽鹼(egg phosphatidylcholine)、ニ棕櫚醯磷脂醯膽鹼和ニ硬脂醯磷脂醯膽鹼。根據例如器官特異性、細胞特異性和細胞器特異性靶定脂質體也是可行的，並且是本領域已知的。實例現對本發明進行了大致描述，通過參照下列實施例可更容易地理解本發明，包括該實施例僅用於說明本發明的某些實施方案和實施方案的目的，並無意限制本發明。實施例I.帶有備選核苷酸序列的ActRIIB (25-131)-hFc的產生為產生ActRIIB (25-131) -hFc,將帶有N端截短和C端截短的人ActRIIB胞外域(天然蛋白的殘基25-131)與TPA前導序列在N端融合，取代天然的ActRIIB前導序列，並與人Fe結構域經由最小接頭(三個甘氨酸殘基)在C端融合(圖I)。編碼該融合蛋白的核苷酸序列見圖2。申請人修飾密碼子並發現編碼ActRIIB(25-131)-hFc蛋白的變體核酸，其提供最初轉化體的表達水平的顯著改善(圖3)。該成熟蛋白具有如下的氣基酸序列(N端通過N端測序確定)(SEQ ID NO 8)ETRECIYYNA NffELERTNQS GLERCEGEQD KRLHCYASffR NSSGTIELVKKGCffLDDFNC YDRQECVATE ENPQVYFCCC EGNFCNERFT HLPEAGGPEVTYEPPPTGGG THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEffE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRffQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK胺基酸1-107 來源於 ActRIIB。表達分子利用一系列柱層析步驟來純化，包括例如任何順序的下列三種或更多種方法A蛋白層析法、Q瓊脂糖凝膠層析法、苯基瓊脂糖凝膠層析法、大小排阻層析法和陽離子交換層析法。純化可用病毒過濾和緩衝液更換來完成。實施例2. ActRIIB (25-131)-hFc結合的高親和カ配體在體外採用Biacore 儀器評價數種配體對ActRIIB (25-131)-hFc及其全長相對物ActRIIB(20-134)-hFc的親和力，並將結果總結於下表中。由於複合體極快的締合和解離，所以通過穩態親和力擬合獲得Kd值，所述極快的締合和解離阻止km和kf的精確測定。ActRIIB(25-131)-hFc以高親和カ結合激活素A、激活素B和⑶F11。有趣的是，ActRIIB (25-131) -hFc似乎顯示出比ActRIIB (20-134) -hFc對⑶F3更高的親和カ(數據未顯示)。ActRIIB-hFc形式的配體親和力
融合構建體激活素A 激活素B GDFll
(e-11)(e-11) (e-11)----
ActRIIB(20-134)-hFc1.61.23.6
'ActRIIB(25-131)-hFcL8LI~TI實施例3 :ActRIIB(25-131)-hF在體內增加肌肉質量和肌力本申請人研究了 ActRIIB(25-131)-hFc增加小鼠的肌肉質量和肌力的能力。將雄性小鼠(n = 10隻/組)用溶媒(Tris緩衝鹽水)或ActRIIB (25-131)-hFc 5個劑量之一皮下每周治療兩次。如通過全身核磁共振(NMR)掃描所測定，用ActRIIB (25-131)-hFc治療4周產生瘦組織質量明顯的劑量依賴性增加(圖4)。肌肉質量增加在研究終止時對特定肌肉(包括胸肌(圖5)、股直肌和腓腸肌)進行確證。重要的是，如通過握力所評價，與溶媒相比，肌肉質量增加伴隨著力量増加(圖6)。這些結果提供令人信服的證據ActRIIB(25-131)-hFc在體內增加肌肉質量和肌カ兩者。實施例4. ActRIIB (25-131)-hFc防止雄激素剝奪的小鼠模型中的肌肉丟失本申請人研究了 ActRIIB(25-131)-hFc防止雄激素剝奪(男性中晩期前列腺癌的標準治療幹預)的小鼠模型中的肌肉丟失的能力。對雄性小鼠(n = 10隻/組)進行睪丸切除(ORX)或假手術，並皮下用TBS溶媒、10mg/kg的ActRIIB (25-131)-hFc或10mg/kg的其全長鼠相對物ActRI IB (20-134) -mFc每周治療兩次。瘦組織質量通過全身NMR掃描確定。用ActRIIB-Fc形式的任一種治療四周的ORX小鼠表現出瘦組織質量自基線的的増加，這與在此期間內在ORX對照中觀察到的降低相比非常顯著(圖7)。在性腺完整條件下與假手術對照相比，對兩種ActRIIB-Fc形式觀察到類似的非常顯著的増加(圖7)。這些結果證實在該雄激素剝奪模型中，ActRIIB(25-131)-hFc可與其全長相對物ActRIIB(20-134)-mFc同樣有效地增加瘦組織質量(防止肌肉丟失)。實施例5. ActRIIB (25-131)-hFc改善飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中的機體組成本申請人還研究了在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中ActRIIB(25-131)-hFc增加肌肉質量和減少脂肪質量的能力。將雄性小鼠(n = 10隻/組)餵飼標準食物飲食或高脂飲食，並腹膜內用TBS溶媒或10mg/kg的ActRIIB (25-131)-hFc每周治療兩次。通過全身NMR掃描測定瘦組織質量和脂肪質量。高脂飲食的小鼠用ActRIIB(25-131)-hFc治療四周導致瘦組織質量増加超過25%，相比之下溶媒治療增加2% (圖8)。與溶媒相比，在對照飲食的小鼠中用ActRIIB (25-131)-hFc得到相似的結果(圖8)。此外，發現持續處理改善肥胖。與溶媒相比，在高脂飲食的小鼠和對照飲食的小鼠中ActRIIB(25-131)-hFc治療12周減少大約一半的脂肪質量(圖9)。 綜上，這些數據證明ActRIIB (25-131)-hFc可用於在各種條件(包括雄激素剝奪和高脂攝入)下在體內改善機體組成。實施例6. ActRIIB (25-131)-hFc使飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中的血清脂質、胰島素和脂連蛋白正常化本申請人研究了 ActRIIB (25-131)-hFc在高脂飲食餵飼的雄性小鼠中對臨床上重要的脂質、胰島素、脂連蛋白及其它代謝終點的血清濃度的影響。將十周齡C57BL/6小鼠稱重配對，並皮下用ActRIIB (25-131)-hFc (n = 10)或Tris緩衝鹽水(TBS)溶媒(n = 7)以10mg/kg每周治療兩次，持續60天。在此期間，小鼠可無限獲取含58%脂肪的飲食，代替含4. 5%脂肪的標準食物。ActRIIB(25-131)-hFc治療導致一系列顯著的代謝作用。在高脂飲食餵飼的小鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc減少病理上升高的甘油三酷、游離脂肪酸、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的血清濃度(圖10-13)，在大多數情況下使這些參數正常至標準飲食餵飼的小鼠中觀察到的水平。重要的是,ActRIIB (25-131)-hFc治療還使高脂飲食的小鼠中的胰島素濃度正常化(圖14)並使脂連蛋白的濃度明顯增加至甚至高於餵食標準飲食的小鼠(圖15)。脂連蛋白是機體組成的關鍵生物標記物，因為已知循環脂連蛋白水平與脂肪質量/肥胖症逆向變化，並且脂連蛋白增強靶組織的胰島素敏感性。ActRIIB (25-131)-hFc還減少瘦蛋白的血清濃度接近50% (P < 0.05)，瘦蛋白是肥胖情況的另ー種重要指示物。最後，如通過核磁共振(NMR)在基線和第48天所測定，前述作用伴隨著機體組成的有益改變。在高脂飲食條件下，溶媒治療的對照中的總脂肪質量在該48天期間增至3倍，ActRIIB (25-131)-hFc治療使該增加減少近40 %。至第48天，總脂肪質量在ActRIIB-Fc治療小鼠中佔體重的27%，與對照小鼠的39%成對比，而瘦組織質量在ActRIIB (25-131) -Fe治療小鼠中佔體重的59%，與對照小鼠的55%成對比。因此，最終結果是在高脂飲食條件下機體組成更健康。對於前述血清參數，ActRIIB (25-131)-hFc始終如一地優於ActRIIB (20-134)-hFc，也在該相同的研究中評價了 ActRIIB (20-134)-hFc。因此，ActRIIB(25-131)-hFc對甘油三酯水平的改善為同一劑量的ActRIIB(20-134)-hFc的接近6倍，對FFA水平的改善為其接近兩倍，對HDL水平的改善為其接近4倍，對胰島素水平的改善為其兩倍還多，和對脂連蛋白水平的改善為其接近I. 5倍。實施例7 =ActRIIB(25-131)-hFc誘導飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中白色脂肪的產熱性質在上述研究(實施例6)中，本申請人還研究了 ActRIIB(25-131)-hFc對白色脂肪組織的產熱性質的影響。在高脂飲食條件下，ActRIIB(25-131)-hFc治療引發白色脂肪組織的組織學改變和基因表達譜，其與產熱能力一致。如圖16所示，附睪白色脂肪組織學檢查表明ActRIIB(25-131)-hFc減少脂滴大小並導致多房脂肪細胞簇(其為褐色脂肪的特點)的形成。此外，該組織的免疫組化分析顯示作為ActRIIB(25-131)-hFc治療的結果，在多房脂肪細胞和單房脂肪細胞兩者中UCPl的廣泛胞質誘導(圖16)。通過定量RT_PCR(反轉錄聚合酶鏈式反應)測定，伴隨著這些組織學變化的是附睪白色脂肪中關鍵的產熱和代謝調節基因表達的顯著變化。在高脂飲食的小鼠中， ActRIIB (25-131)-hFc治療增加UCPl的mRNA水平至溶媒的60倍還多(圖17)，這是非常令人印象深刻的變化，因為相比其它小鼠品系，小鼠的該品系表現出關鍵白色脂肪庫內的UCPl和褐色脂肪細胞嚴重鈍化的誘導(Guerra等，1998，J Clin Invest 102 =412-420 ；Xue 等，2007，J Lipid Res 48:41-51)。此外，ActRIIB (25-131)-hFc 治療增加編碼沉默調節蛋白SIRT-I (沉默信息調節劑2，同源物I)的mRNA水平，沉默調節蛋白SIRT-I是能量敏感型主要調節劑(脫こ醯基酶)，其針對高脂飲食誘導的代謝損傷提供保護(Pfluger等，2008，Proc Natl Acad Sci USA 105:9793-9798)並表明為脂肪酸動員的重要控制物(Rodgers 等，2008，FEBS Lett 582:46-53)。重要的是，ActRIIB (25-131)-hFc 治療還增加編碼PGC-I a (過氧化物酶體增殖物激活受體Y輔激活物-Ia)的mRNA水平，PGC-I a是SIRT-I的充分證明的靶標，其進而控制褐色脂肪組織中線粒體生物合成和產熱能力所必需的很多基因的表達(Uldry等，2006，Cell Metab, 3 =333-341) 0值得注意的是，已顯示PGC-I a在白色脂肪細胞中的強迫表達誘導包括UCPl在內的基因表達的產熱程序，其與褐色脂肪細胞中的緊密類似(Hansen等，2006，Biochem J 398:153-168)。在本研究中，高脂飲食條件下，ActRIIB(25-131)-hFc恢復白色脂肪組織的PGC-I a基因表達到與餵食標準飲食的小鼠中的那些不可區別的水平。與治療相關的另外的變化構成白色脂肪組織中表達譜改變和有益激素和代謝作用之間的突出聯繫。因此，在附睪白色脂肪中，ActRIIB(25-131)-hFc增加編碼Foxo-I (含叉頭框的蛋白質0亞族-I)的mRNA水平，Foxo-I是既是SIRT-I的靶標又是脂連蛋白表達的關鍵誘導物的轉錄因子(Qiao 等，2006，J Biol Chem 281 :39915-39924)。與 Foxo-ImRNA的誘導一致，ActRIIB(25-131)-hFc治療升高白色脂肪中脂連蛋白mRNA的水平(圖18)，這有助於說明在這些動物中脂連蛋白的循環水平増加(圖15，實施例6)，靶組織的胰島素敏感性增強和正常化的胰島素濃度(圖14，實施例6)。總而言之，高脂飲食條件下的ActRIIB (25-131)-hFc治療導致I)與產熱能力一致的白色脂肪組織中的組織學變化和基因表達譜和2)大範圍的激素參數和代謝參數的有益改變。實施例8. ActRIIB (25-131)-hFc在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對肝和肌肉的作用
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是越來越常見的肝病，被廣泛認為是代謝症候群的肝臟表現，並且特徵在於肝臟中的脂肪積聚(脂肪變性)，往往具有有害作用。ー個NAFLD患者亞類發展成被稱為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的炎性病況，它可進一步發展為肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌(Perlemuter 等，2007, Nat Clin Pract Endocrinol Metab 3:458-469)。在上述研究(實施例6-7)中，本申請人研究了 ActRIIB(25_131)-hFc能否抑制與高脂飲食相關的肝脂肪變性。研究完成時，通過Oil Red 0染色評價，餵飼高脂飲食的小鼠的肝組織顯示大量密集的脂滴，而餵食標準飲食的小鼠沒有表現出明顯的肝脂質沉積(圖19)。儘管高脂飲食，但用ActRIIB (25-131)-hFc治療幾乎完全逆轉肝脂質沉積，並使肝組織的外觀正常化。因此，ActRIIB(25-131)-hFc是高脂飲食導致的肝脂肪變性的有效抑制劑。
ActRIIB (25-131) -hFc治療還在這種飲食誘發的肥胖症的模型中增加肌肉質量，與其它模型中的發現一致(實施例3-5)。具體而言，相對於高脂飲食對照ActRIIB(25-131)-hFc增加胸肌質量超過70% (P < 0. 001)，增加腓腸肌質量近40 %(P < 0.001)，和增加股直肌質量超過25% (P< 0.001)。如通過RT-PCR在腓腸肌組織中所確定，肌肉質量的這些變化伴隨著肌肉基因表達的變化。相對於高脂飲食對照，ActRIIB (25-131)-hFc 增加腓腸肌中 PGC-1 a mRNA 水平和 Foxo-ImRNA 水平各約 50% (P< 0. 05)。實施例9. ActRIIB (25-131)-mFc在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對內臟白色脂肪的作用內臟脂肪的積聚，與皮下脂肪相反，在心血管疾病和肥胖症相關病症例如糖尿病、高血脂、高血壓和代謝症候群的發展中起關鍵作用(Matsuzawa等，2006，FEBS Lett580:2917-2921)。由於它的位置，內臟(或腹內)脂肪已準備好通過肝門循環進入肝臟，在此其可影響代謝，促進胰島素抵抗並導致脂肪變性。因此，在與上述研究(實施例6-8)類似的研究中，本申請人研究了在高脂飲食條件下截短變體ACtRIIB(25-131)-mFC對內臟脂肪的量對比腹部皮下脂肪的量的作用。將九周齡C57BL/6小鼠用10mg/kg的ActRIIB (25-131)-mFc (n = 20)或Tris緩衝鹽水(TBS)溶媒(n = 10)經皮下治療，每周兩次，持續60天。給藥開始前7天開始，小鼠可無限獲得含58%脂肪的飲食，替代含4. 5%脂肪的標準食物。保持標準食物飲食的另ー組小鼠(n= 10)也用TBS溶媒治療並隨後作為飲食對照。對小鼠的亞群(n = 4隻/組)通過顯微CT測定脂肪體積，通過核磁共振(NMR)分析測定的該小鼠全身脂肪的百分比最接近組平均值(所有小鼠接受核磁共振分析)。內臟脂肪和腹部皮下脂肪兩者均隨著飲食和ActRIIB(25-131)-mFc治療顯著變化。研究中途(35天)得到的顯微CT圖像的三維重構證實，內臟脂肪庫和皮下脂肪庫兩者均作為高脂飲食的結果而擴大，並且ActRIIB (25-131)-mFc在很大程度上逆轉那些増加(圖20)。當在研究終結(60天)時定量分析時，與僅高脂飲食相比，ACtRIIB(25-131)-mFC對內臟脂肪(圖21)和腹部皮下脂肪(圖22)兩者的作用是非常顯著的。實施例10. ActRIIB (25-131)-mFc在飲食誘發的肥胖症的小鼠模型中對褐色脂肪性質的影響在實施例9中所述的研究中，本申請人還研究了 ActRIIB(25-131)-mFc對高脂飲食條件下肩胛間褐色脂肪庫的性質的影響。相對於標準飲食，高脂飲食在肩胛間褐色脂肪組織庫中產生若干變化，而ActRIIB (25-131)-mFc治療完全或很大程度上逆轉每ー種這些變化。具體而言，高脂飲食導致肩胛間庫的明顯擴大並使其顔色從紅色至粉紅變淺(圖23)。該飲食誘導的擴大反映棕色脂肪庫的質量的翻倍(圖24)和密度的減少(圖25)。通過顯微計算機斷層掃描術(顯微CT)在原位測定小鼠亞群(n = 4隻/組)的庫密度，通過核磁共振(NMR)分析測定的該小鼠總全身脂肪的百分比最接近組平均值(所有小鼠接受核磁共振分析)。ActRIIB (25-131)-mFc治療完全逆轉飲食誘發的褐色脂肪質量(圖24)和密度(圖25)的變化，同時在很大程度上逆轉飲食誘發的庫的大小和顔色的變化(圖23)。這些結果表明，在高脂飲食條件下，ActRIIB(25-131)-mFc很大程度上或完全地恢復可能與健康的褐色脂肪功能相關的性質，因而隨著它減少褐色脂肪庫的總體大小，改善褐色脂肪的質量實施例ll.ACtRIIB(25-131)-mFC對衰老小鼠模型中肌肉、骨、脂肪和代謝激素的影響身體組成隨衰老以可預測的方式變化。肌肉質量和肌力的正常的年齡依賴型下降，被稱作肌肉衰減症候群，從約30歲開始並在60歲之後加速(Stenholm等,2008, CurrOpin Clin Nutr Metab Care 11:693-700)。骨質量和骨強度，表現出相似的隨年齡下降，導致老年人中骨質疏鬆症的風險增加。全身脂肪質量隨著年齡而增加直至約70歲，然後絕對項下降但保持全身質量的大致恆定比例(Cartwright等，2007, Exp Gerontol 42:463-471)。基於其它模型觀察和本文所述的功效，本申請人研究了 ActRIIB(25-131)-mFc對衰老小鼠模型中肌肉、骨、脂肪和胰島素水平的影響。19個月大的雄性C57BL/6小鼠給予無限制的標準食物飲食，並用10mg/kg的ActRIIB (25-131)-mFc (n = 16)或Tris溶媒(n=15)經皮下治療，每周兩次，持續8周。作為參照系，之前發現在標準飲食條件下該小鼠品系的中位壽命預期為約27個月(Turturro等，2002, J Gerontol A Biol Sci Med Sci57 B379-389)。ActRIIB (25-131)-mFc治療在這些衰老小鼠中產生身體組成和代謝激素作用的一系列顯著變化。通過全身NMR分析測定，研究過程期間瘦組織質量在對照小鼠中基本上保持不變，而在ActRIIB (25-131)-mFc治療的小鼠中至7周時其逐步增加至幾乎高於基線20% (圖26)。與該全身作用一致，在8周時與溶媒治療對照相比，ActRIIB (25-131)-mFc還顯著增加各肌肉群的質量，包括胸肌(増加55% )、股直肌(40% )、三頭肌(40% )和腓腸肌28% )。重要的是，ActRIIB (25-131)-mFc治療改善神經肌肉功能，如通過依照已確立的萬案的目 11肢_カ測試所確定(http://jaxservices. jax. org/phenotyping/gripstrength_protocol, html)(圖 27)。在衰老小鼠中ActRIIB (25-131)-mFc治療改善若干骨相關參數。通過DEXA分析在基線和8周的時間點測定，ACtRIIB(25-131)-mFC在研究期間增加全身骨礦物質密度，而對照組基本保持不變(圖28)。另外，脛骨近端的顯微CT分析表明ActRIIB (25-131)-mFc治療8周使脛骨近端的骨體積分數與對照組相比翻了一倍(P < 0. 01)。ActRIIB(25-131)-mFc對衰老小鼠的脂肪產生重大影響。通過NMR分析在多個時間點測定，在研究期間溶媒治療的對照中全身脂肪質量逐漸下降(圖29)，與老年人中的發現一致。ActRIIB(25-131)-mFc治療加速這ー變化，引起為對照中觀察到的兩倍幅度的減少(分別為-44%對比-19% )(圖29)。至終時間點，ActRIIB(25-131)-mFc顯著降低個體附睪、腹股溝和腹膜後的白色脂肪庫的質量48-54%。有趣的是，ActRIIB(25-131)-mFc治療還減少肩胛間褐色脂肪庫的質量近45% (P < 0. 05)，與飲食肥胖症的小鼠模型中對該組織得到的結果相似(實施例10)。最後，通過在來自各個組別的代表性小鼠亞組(n=4)中的顯微CT分析所測定，ACtRIIB(25-131)-mFC減少65%腹部脂肪的內臟組分的體積(P < 0. 01)和49%腹部脂肪的皮下組分的體積(P < 0. 01)。因此，在該衰老模型中ActRIIB(25-131)-mFc強烈靶向關鍵的內臟脂肪區室。ActRIIB(25-131)-mFc還對衰老小鼠中重要的代謝激素產生有益的變化。用ActRIIB (25-131)-mFc治療八周使循環脂連蛋白濃度幾乎翻倍(P < 0. 01)並降低循環胰島素濃度超過40% (圖30)。升高的空腹胰島素濃度(高胰島素血症)是廣泛認可的胰島素抵抗的替代衡量(Weyer等，2000，Diabetes 49 :2094-2101)，並且在目前的研究中增加的脂連蛋白濃度很可能有助於改善胰島素敏感性。在該研究中，糖化血紅蛋白(AlC)濃度顯著被ActRIIB (25-131) -mFc所減少(圖31)，從而為在該衰老模型中用ActRIIB (25-131) -mFc治療改善葡萄糖調節提供額外的證據。實施例12. ActRIIB (25-131)-hFc在癌症惡病質的小鼠模型中對瘦組織的影 響惡病質是因肌肉和脂肪組織丟失所致的非所需的體重減輕。許多腫瘤與食欲不振和嚴重的肌肉丟失相關，並且表現出惡病質的患者比非惡病質患者預後差。由於結腸癌細胞系CT26在小鼠中誘導嚴重的惡病質，所以ActRIIB (25-131) -hFc在該小鼠模型中檢測對異種移植誘發的惡病質的潛在影響。八周齡BALB/c小鼠皮下注射IO6個結腸-26腺癌(CT26)細胞/小鼠。腫瘤植入兩周後，治療如下開始皮下注射IOmg/kg 的 ActRIIB (25-131)-hFc (n = 15)或 Tris 緩衝鹽水(TBS)溶媒(n = 13)，每周兩次。BALB/c小鼠的其它組不接受CT26細胞但用如上的ActRIIB (25-131)-hFc或溶媒治療。ActRIIB(25-131)-hFc治療導致體重顯著增加，這在研究期間得以保持。腫瘤植入後5周，通過NMR分析測定，溶媒治療的小鼠表現出瘦組織質量自基線的7%丟失，而用ActRIIB(25-131)-hFc治療的小鼠表現出瘦質量自基線的27%増加(圖32)。脂肪質量在組間差異不顯著。這些結果證實ActRIIB(25-131)-hFc可緩解荷瘤小鼠的惡病質並可作為用於治療癌症患者中的惡病質的有效治療。綜上，這些數據表明ActRIIB (25-131)-hFc融合蛋白可用作TGF家族配體的信號轉導的拮抗劑，以逆轉與飲食誘發的肥胖症相關的許多病理代謝改變，從而治療由高熱量攝入加劇的代謝病況。此外，ActRIIB(25-131)-hFc可用於治療與衰老或癌症惡病質相關的病理代謝變化。通過引用結合本文提及的所有出版物和專利均通過引用以其整體結合到本文中，就像每個獨立出版物或專利具體而單獨指明通過引用結合一祥。雖然論述了主題的具體實施方案，但上述說明書是說明性的而非限制性的。當回顧本說明書和隨附權利要求書時，許多變動對本領域技術人員而言將變得顯而易見。應參考權利要求書及其等同內容的整個範圍和說明書及這類變化來確定本發明的整個範圍。
權利要求
1.一種核酸,其包含在嚴格條件下與SEQ ID NO :6的核苷酸73-396的互補序列雜交的核酸序列。
2.權利要求I的核酸，其中所述核酸包含SEQID NO 6的核苷酸73-396。
3.—種核酸，其包含在嚴格條件下與SEQ ID NO 4的核苷酸73-396的互補序列雜交的核酸序列。
4.權利要求3的核酸，其中所述核酸包含SEQID NO 4的核苷酸73-396。
5.—種培養細胞，所述細胞包含權利要求1-4中任一項的核酸。
6.權利要求5的培養細胞，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
7.權利要求5的培養細胞，其中所述細胞為CHO細胞。
8.—種多肽,所述多肽選自 a.以下多肽，其包含其中胺基酸序列由SEQID NO :8的序列組成的胺基酸序列或在不超過五個胺基酸位置處不同於SEQ ID NO :8的胺基酸序列； b.通過SEQID NO :4的核酸或在嚴格條件下與其互補序列雜交的核酸在哺乳動物細胞中表達產生的多肽； c.通過SEQID NO :6的核酸或在嚴格條件下與其互補序列雜交的核酸在哺乳動物細胞中表達產生的多肽。
9.權利要求8的多肽，其中所述多肽為(a)部分的多肽。
10.權利要求8的多肽，其中所述多肽為(b)部分的多肽。
11.權利要求8的多肽，其中所述多肽為(c)部分的多肽。
12.權利要求8-11中任一項的多肽，其中所述多肽的氨基端具有序列ETR。
13.權利要求8-12中任一項的多肽，其中所述多肽導致小鼠的瘦體重在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著增加。
14.權利要求13的多肽，其中平均增加是至少2g瘦組織質量。
15.權利要求8-14中任一項的多肽，其中所述多肽導致高脂飲食餵飼的小鼠的脂肪質量在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著減少。
16.權利要求15的多肽，其中平均減少是至少5g脂肪質量。
17.權利要求8-16中任一項的多肽，其中所述多肽導致高脂飲食餵飼的小鼠的血清甘油三酯水平在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著減少。
18.權利要求17的多肽，其中平均減少是至少50mg/dl甘油三酯。
19.權利要求8-18中任一項的多肽，其中所述多肽導致高脂飲食餵飼的小鼠的血清游離脂肪酸水平在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著減少。
20.權利要求19的多肽，其中平均減少是至少500微摩爾/dl游離脂肪酸。
21.權利要求8-20中任一項的多肽，其中所述多肽導致高脂飲食餵飼的小鼠的血清胰島素水平在以10mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周後統計上顯著減少。
22.權利要求21的多肽，其中平均減少是至少lng/ml胰島素。
23.權利要求8-22中任一項的多肽，其中所述多肽包含至少一個N聯糖。
24.權利要求8-23中任一項的多肽，其中所述多肽在CHO細胞中產生。
25.權利要求8-24中任一項的多肽，其中所述多肽與權利要求8-24中任一項的第二多肽共價連接。
26.權利要求8-24中任一項的多肽，其中所述多肽與第二多肽共價連接以形成同二聚體。
27.—種包含來源於ActRIIB的部分和一個或多個異源部分的多肽，其中來源於ActRIIB的部分包含由SEQ ID NO 1的胺基酸25-131的序列組成的胺基酸序列或在不超過五個胺基酸位置處不同於SEQ ID NO 1胺基酸25-131的序列的胺基酸序列。
28.權利要求27的多肽，其中所述異源部分包含免疫球蛋白的恆定結構域。
29.權利要求27的多肽，其中所述異源部分包含免疫球蛋白的Fe結構域。
30.權利要求27的多肽，其中所述異源部分包含人IgGl的Fe結構域。
31.權利要求27-30中任一項的多肽，其中來源於ActRIIB的部分包含由SEQID NO I的胺基酸25-131的序列組成的胺基酸序列。
32.—種藥物製劑，所述藥物製劑包含權利要求8-31中任一項的多肽。
33.一種用於治療具有與肌肉丟失或肌肉生長不足相關的病症的受試者的方法，所述方法包括給予受試者有效量的權利要求32的藥物製劑。
34.一種用於增加有需要的受試者的瘦質量或降低有需要的受試者的瘦質量丟失速度的方法，所述方法包括給予受試者有效量的權利要求32的藥物製劑。
35.一種用於減少受試者的體脂肪含量或降低受試者的體脂肪含量增加速度的方法，所述方法包括給予受試者有效量的權利要求32的藥物製劑。
36.一種用於治療受試者中與非所需體重增加相關的病症的方法，所述方法包括給予受試者有效量的權利要求32的藥物製劑。
37.一種用於治療受試者的代謝病症的方法，所述方法包括給予受試者有效量的權利要求32的藥物製劑。
38.權利要求37的方法，其中所述患者具有一種或多種以下特徵 d.高血清甘油三酯水平； e.高游離脂肪酸水平；或 f.聞血清膜島素水平。
39.權利要求37或38的方法，其中所述代謝病症選自2型糖尿病、代謝症候群、胰島素抵抗和肥胖症。
全文摘要
在某些方面，本發明提供包含來源於ActRIIB的多肽的組合物，其用於調節(促進或抑制)組織例如骨、軟骨、肌肉、脂肪、褐色脂肪和/或神經元組織的生長和用於治療代謝病症例如糖尿病和肥胖症以及與任一種前述組織相關的病症。
文檔編號A61K38/17GK102656187SQ201080035960
公開日2012年9月5日 申請日期2010年6月8日 優先權日2009年6月12日
發明者J·西拉, R·庫馬 申請人:阿塞勒隆製藥公司