一種利用小型簡易生物反應器培養人參不定根生產人參皂苷的方法

2023-10-08 07:06:44 1

專利名稱：一種利用小型簡易生物反應器培養人參不定根生產人參皂苷的方法
技術領域：
本發明專利涉及利用一種小型簡易生物反應器，人工室內培養人參不定根，並從中提取人參皂苷的技術，屬農業生物技術領域。
背景技術：
人參(Panax ginseng C. A. May.)為五加科(Araliaccae)人參屬名貴中藥植物，是我國傳統的名貴中藥材，被譽為藥中之王。人參化學成分複雜，其中主要藥用成分為各種人參皂苷，其製品及皂苷提取物具有廣闊的世界市場。但人參5 6年栽培的漫長周期使各項管理技術、土地、病蟲、農殘等問題成為栽培人參難以跨越的障礙。因此，利用生物反應器規模化培養細胞成為解決上述問題的有效方法之一。生物反應器具有工作體積大、單位 體積生產能力高、物理和化學條件控制方便、隨時隨地規模化生產等許多優點。目前，人參細胞生物反應器規模化培養已獲得成功[Liu S等，Process Biochem, 1998, 33 (I) =69-79,FuruyaT等，Planta Med，1983，48 :83_87]。但有研究認為，人參不定根和毛狀根中的人參阜苷含量比愈傷組織(細胞)中多[Yu Kff, Chungbuk National University, Korea, 2000,博士論文]。因此，人參不定根生物反應器培養更引人注目。韓國該方面的研究處於世界領先地位，Choi等報導了利用500L生物反應器規模化培養人參不定根的中試研究結果[ChoiSE 等 Plant Cell Tissue Organ Cult，2000，62 :187-193.]。而我國對人參不定根生物反應器擴大培養的技術研究卻相對較少。例如，樸炫春等報導了利用5L氣升式生物反應器培養人參不定根的生長周期，但未測定其皂苷的累積[樸炫春等，林業科技，2007，32 (6)54-56]。黃滔等優化了搖瓶培養人參不定根系統，還未進行生物反應器培養[黃滔等，中國中藥雜誌，2010,35(1) :13-17] 0本發明通過一種簡單的小型玻璃生物反應器(3 10L)，確定小規模培養人參不定根和生產人參阜苷的方法；目的是提供一種更加簡單、室內大量人工培養人參不定根的方法，為大規模培養人參不定根生產人參皂苷，提供技術參數，或為大規模生產提供人參不定根種子培養方法；或為進行小規模培養人參不定根生產人參皂苷提供技術支持。

發明內容
首先將人參不定根在含有3. 0mg/L IBA的1/2SH固體培養基中大量繁殖。然後將人參不定根切成Icm長，接種在裝有I. 5L 1/2SH (加有3. 0mg/L IBA和20g/L蔗糖)培養基、總體積為3L的生物反應器內進行暗培養。定期取材測定不定根鮮重和乾重、生長量及3種人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)，繪製不定根生長和皂苷累積的動態曲線，確定其生長周期以及最佳收穫時間為7周。然後，在總體積為3L的生物反應器中加入含有20g/L蔗糖的1.5L 1/2SH培養基(加有3. 0mg/L IBA)，接種8g人參不定根段。培養7周後收穫，其不定根人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)及產量最高，分別為5. 16mg/g，30. 7Imgo按照上面的蔗糖濃度，在總體積為5和10L的生物反應器中[分別裝有3和6L 1/2SH培養基(加有3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖)]，初始接種人參不定根的鮮重分別為15和30g時，培養7周後它們壓、15分鐘))後使用的。培養環境為常規組織培養室(溫度24 26°C，光照強度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，溼度60% 70% )的。本發明的優越特徵I、小型生物反應器的結構簡單，便於操作2、利用小型生物反應器培養人參不定可以在人為控制條件下，隨時隨地生產人參不定根3、小型生物反應器培養人參不定根無任何細菌病毒、重金屬汙染，安全4、小型生物反應器生產的人參不定根中的人參皂苷Rgl和Re含量與大田栽培的人參含量相差不大


圖I生物反應器示意圖a.薄膜空氣濾器；b.玻璃罐體；c.空氣噴頭；d.空氣流量計；e.空氣壓力泵；f.進氣口 ；g.出氣口。圖2標準品(A)、生物反應器培養人參不定根(B)和栽培4年人參根(C)中人參皂苷 Rgl、Re、Rbl 的 HPLC 圖譜圖3人參不定根的生物反應器增殖培養A.繼代的人參不定根；B.人參不定根在生物反應器培養；C. B中乾燥的人參不定根圖4 3L生物反應器中不定根生長(A)和皂苷累積⑶的動態曲線
具體實施例方式實例I確定小型生物反應器內人參不定根收穫周期I)小型玻璃生物反應器所用小型生物反應器為總體積3、5和IOL的氣升式小型玻璃生物反應器自己開發，北京玻璃儀器公司定製。2)人參不定根材料人參不定根的生物反應器培養都在溫度為(25±2)°C培養室中進行暗培養。人參不定根最初從韓國江原道野生山參(Panax ginseng C. A. May.)的鬚根(由韓國江原大學山林科學學院崔龍義教授鑑定)在1/2SH+3. Omg/L IBA+20g/L蔗糖+3. Og/L脫乙醯吉蘭糖膠(Gelrite)的固體培養條件下誘導而來，然後多次繼代增殖。3)三種人參皂苷(Rgl、Re、Rbl)的分析方法人參皂苷採用超聲提取精密稱取I. Og樣品粉末，IOmL 80%甲醇浸泡過夜，次日以80%甲醇室溫超聲提取3次，每次IOmL提取30min，合併提取液。80°C水浴減壓蒸乾溶齊U，以20%乙腈溶解並定容至一定體積，搖勻，以O. 45 μ m微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。人參皂苷的高效液相色譜(HPLC)分析方法流動相為乙腈水按表I進行線性梯度洗脫(v/v);流速1.0mL/min，柱溫25°C，檢測波長203nm，進樣量20yL。利用上述條件分析3種人參皂苷標品(Rgl、Re、Rbl)和樣品。3種人參皂苷的保留時間分別為Rgl 23. 46min, Re 24. 45min, Rbl 37. 25min。它們的回歸曲線和回歸係數分別為Rgl y = 4273. 8x+31641, R2 = O. 9991 ；Re y = 5602. 4x+47471, R2 = 0. 9994 ；Rbl y =4529. 9x+13221, R2 = O. 9994。表I乙腈/水流動相梯度表(v/v)
時間乙腈水
O 13208013 3020 - 2580 — 75
30 3525 - 4075 — 60
35 4040 - 2060 - 80人參阜苷產量的計算方法人參阜苷產量(mg)=人參阜苷含量(mg/g) X人參不 定根生長量(g)4) 3L生物反應器培養人參不定根將增殖的人參不定根切成Icm長，接種在裝有I. 5L 1/2SH (加有3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖)培養基、總體積為3L的生物反應器內進行暗培養。初始接種量(鮮重)為Sg。重複3 4個生物反應器。每周取材I次，置於(60±1)1的烘箱中乾燥4811後稱量乾重，計算不定根生長量不定根生長量(g)=最終收穫不定根鮮/乾重(g)_初始接種不定根鮮/重(g)及3種人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)，繪製不定根生長和皂苷累積的動態曲線，從中確定其生長周期以及最佳收穫時間為7周。實例2確定培養基中合適的蔗糖濃度在總體積為3L的生物反應器中加入含有不同濃度蔗糖(20、40和60g/L)的I. 5L1/2SH培養基(加有3. Omg/L IBA)，接種8g人參不定根段。每個處理重複3次。培養7周後收穫，統計及測定人參不定根的生長及皂苷的累積如表2。蔗糖濃度為40g/L時，人參不定根的生長量達到最大值7. 30g，比蔗糖濃度為60g/L時的生長量略高，而遠高於20g/L蔗糖濃度時不定根最低的生長量5. 95g。人參皂苷含量隨蔗糖濃度的增加而降低，蔗糖濃度最低(20g/L)時，皂苷含量達到最大值5. 16mg/g。20和40g/L濃度蔗糖下，人參皂苷產量沒有顯著差異，但都比60g/L蔗糖濃度下人參皂苷產量高。從節省的角度考慮培養應該選用20g/L的蔗糖濃度。表2培養基中蔗糖濃度對人參不定根生長和人參皂苷累積的影響
~鹿糖濃度人參不定根生長量/人參皂苷含量人參皂苷產量
(g/L)(乾重，g)(mg/g)(mg)
205.95 + 0. 14 c5. 16 + 0.04 a30. 71±0. 14 a
407. 30±0. 13 a4. 21±0. 04 b30. 77±0. 11 a
607.00±0.15b3.90±0.05c27.95土0.50 b注運用Duncan多重比較,相同字母為相差不顯著(P < 0. 05)。下同。實例3確定生物反應器內人參不定根的最佳初始接種量
總體積為5和IOL的生物反應器中[分別裝有3和6L 1/2SH培養基(加有3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖)]，初始接種人參不定根的鮮重分別為10、15、20g和20、25、30g，每個處理重複3次。培養7周後收穫，不定根的生長量和皂苷累積情況統計如表3和表4。5L生物反應器中不定根的生長量隨初始接種量的增加而增加。低接種量(IOg)時，不定根生長量最低，為6. 21g ;中等及較高水平的接種量(15和20g)均對不定根的生長更為有利，但兩者間差距不顯著(9. 29和9. 36g)。人參皂苷含量在高接種量(20g)時明顯降低(4. 42mg/g);較低及中等接種量(10和15g)時人參皂苷的含量較高，且差異不顯著(5. 25和5. 16mg/g)。在5L生物反應器中，中等水平的初始接種量(15g)最有利於人參皂苷的生產，其產量最高(48. 25mg)，遠高於低接種量時人參皂苷的最低產量(32. 64mg)。表3 5L生物反應器中初始接種量對人參不定根和人參皂苷累積的影響
權利要求
1.一種利用小型簡易生物反應器(3 10L)培養人參不定根生產人參阜苷的方法,其特徵在於 長度約I. Ocm、鮮重8g的人參不定根培養在裝有2. OL 1/2SH培養基的3L反應器內培養，該培養基含3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖。人參不定根生長和 三種人參皂苷(Rgl、Re、Rbl)累積的最佳收穫期為7周；3L生物反應器中，相同培養基中含20g/L、40g/L兩個蔗糖濃度對人參和三種人參皂苷累積較佳；5和IOL生物反應器內最佳初始量分別為15和30g。
全文摘要
本發明提供了一種利用小型玻璃生物反應器(3～10L)培養人參不定根的方法。首先將長度約1.0cm的人參不定根培養在裝有2.0L 1/2SH培養基的3L反應器內培養，該培養基含3.0mg/L IBA和20g/L蔗糖。定期分析人參不定根的生長和三種人參皂苷(Rg1、Re、Rb1)的累積，確定了人參不定根在生物反應器內的最佳收穫周期為7周。3L生物反應器培養基中三種蔗糖濃度(20g/L、40g/L、60g/L)中，20g/L、40g/L兩個濃度的蔗糖對人參不定根的人參不定根的生長和皂苷的累積優於60g/L蔗糖，兩者無顯著差別，但從節約角度考慮，應該選擇20g/L蔗糖濃度用於生產。該濃度下，人參皂苷含量和產量分別為5.16mg/g、30.71mg。5和10L生物反應器內在初始接種量分別為10、15、20g和20、25、30g中，最佳量分別為15和30g，其不定根的生長量分別為9.29和19.17g，皂苷含量分別為5.16和4.58mg/g。生物反應器內培養7周的人參與栽培4年的人參相比，人參皂苷Rg1和Re含量相差不大；栽培人參中Rb1的含量遠高於生物反應器中培養得人參不定根中的含量。本發明可為人參不定根的小規模和進一步擴大化培養提供技術支持和參數，也可以作為大規模生產提供人參不定根種子生產方法。
文檔編號A01H4/00GK102898493SQ20111021456
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者李玉花, 由香玲, 譚嘯, 代金玲, 吳昊 申請人:東北林業大學, 李玉花, 由香玲