刺激巨核細胞生長和分化的組合物及方法

2023-10-07 23:10:24 4

專利名稱：刺激巨核細胞生長和分化的組合物及方法
技術領域：
本發明涉及一種新的蛋白質(本文同義地稱作Mpl配體或MGDFs)，該蛋白質刺激巨核細胞生長並增加巨核細胞分化或成熟，最終引起血小板數目增加。本發明還涉及從天然來源中獲取均質形式的所述蛋白質並且通過重組遺傳工程技術產生所述蛋白質的方法。
另一方面，廣義地說本發明涉及一類新的MGDF衍生物(其中MGDF分子結合在一種水溶性聚合物上)，以及製備這類分子的方法。本發明還涉及MGDF分子結合到一個或多個聚乙二醇(「PEG」)基團上的MGDF衍生物，以及它們的製備方法。
背景技術：
本發明涉及至少兩個主要的研究領域。第一個領域涉及巨核細胞的發育以及由此引起的血小板生成；第二個領域涉及一個生長因子受體族的多肽成員，本文稱為Mpl受體及其配體。以下將概括說明每個研究領域的情況A.從巨核細胞生成血小板血小板是一種對防止出血和血液凝結起關鍵性作用的循環細胞。巨核細胞是血小板的細胞源，並且由一種能夠產生所有造血細胞譜系的共同骨髓前體細胞所生成。所述的共同前體細胞是已知的多能性幹細胞或PPSC。
巨核細胞祖代細胞體系是這樣確定的，即基於在體外培養系統中對適當的生長因子反應時巨核細胞(MK)集落出現的時間和大小。巨核細胞暴發形成單元(BFU-MK)是最原始的巨核細胞祖代細胞。人們認為BFU-MK最終產生了大量的巨核細胞集落形成單元(CFU-MK)，它是分化程度更高的MK祖代細胞。
隨著MK細胞不斷地分化，它們不再具有有絲分裂能力卻獲得了核內複製能力。核內複製(或核內有絲分裂)是在沒有細胞分裂時的細胞中的核分裂現象。核內複製最終造成多倍體MK。MK進一步成熟導致產生具有血小板特徵的胞質細胞器及膜組分。
經尚未明確解釋的過程，由成熟的MK生成了血小板，人們認為所述過程是MK自然斷裂或其它機制的結果。通過觀察巨核細胞內廣泛的膜結構，已得到一種血小板形成模型，其中在細胞體內有一個分界膜系統勾劃出新生血小板輪廓。通過觀察已得到另一種血小板形成模型，巨核細胞將形成以血小板大小間隔收縮的狹長的細胞質的突。由於血液在骨髓和/或肺中流動產生壓力，血小板可能從突中斷裂下來Becker和DeBruyn稱這些細胞質的突為原血小板，以反映它們在血小板形成中其假定的前體作用(見Becker和DeBruyn，Amer.J.Anat.145183(1976))。
附

圖1表示出了巨核細胞和血小板發育過程中涉及的各種前體細胞。圖最左邊的細胞表示PPSC，圖中在PPSC右邊的其它細胞表示BFU-MK，接下來是CFU-MK。圖中位於PPSC右邊正在經歷著核內複製的細胞是一個成熟的巨核細胞。這個細胞經核內有絲分裂後變成多倍體。該圖再右邊的結構表示從成熟巨核細胞的多倍體核產生的長的細胞質的突。圖的最右邊表示由於細胞質突的斷裂產生的大量的血小板。
以下歸納了與上述巨核細胞成熟和血小板生成有關的參考文獻1.Williams N.和Levine R.F.，British Journal of Haematology52173-180(1982)；2.Levin，J.，Molecular Biology and Differentiation ofMegakaryocytes，Wiley-Liss公司出版1-10(1990)；3.Gewirtz，A.M.，The Biology of Hematopoiesis，Wiley-Liss公司出版123-132(1990)；4.Han，Z.C.等人，Int.J.Hematol.，543-14(1991)；5.Nieuwenhuis H.K.和Sixma，J.New Eng J.of Med.3271812-1813(1992)；6.Long.M.Stem Cell 1133-40(1993)。B.血小板形成的調節許多實驗室大量的數據表明可以通過體液因子調節血小板的生成。最早人們並沒有正確認識這個生物過程的複雜性而現在人們發現許多人體生長因子都具有這種能力。
巨核細胞的調節發生在多細胞水平上。許多細胞因子通過擴張祖代細胞池來增強血小板的生成。第二組體液因子作為成熟因子作用於分化程度較高的細胞以促進其核內複製。另外，出現了兩條獨立的、用來調節這些過程的生物反饋環。
數個譜系非特異性的造血因子對MK的成熟起了重要作用。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，白細胞介素-3(IL-3)，IL-6，IL-11，白血病抑制因子(LIF)和促紅細胞生成素(EPO)，通過測定它們對MK大小、數量或倍性的作用發現每種因子體外均能促進人MK的成熟。LIF、IL-6和IL-11對MK成熟的作用對IL-3具有部分地(LIF和IL-6)或全部地(IL-11)加合性。從這些參考文獻得到的數據表明細胞因子結合物是體內促進MK成熟所必不可少的因素。
以下歸納與涉及調節巨核細胞及血小板生成有關的參考文獻7.Hoffman.R.，等人，Blood Cells 1375-86(1987)；8.Murphy，M.J.，Hematology/Oncology Clinics of North America3(3)465-478(1988)；9.Hoffman.R.，Blood 74(4)1196-1212(1989)；10.Mazur，E.M.和Cohen.J.L.，Clin Pharmacol.Ther.，46(3)250-256(1989)；11.Gewirtz，A.M.和Calabretta，B.，Int.J.Cell Cloning 8267-276(1990)；12.Willams，N.，Progress in Growth Factor Reseach 281-95(1990)；13.Gordon，M.S.和Hoffman，R.，Blood 80(2)302-307(1992)；14.Hunt P.等人，Exp.Hematol.21372-281(1993)；15.Hunt P.等人，Exp.Hematol.211295-1304(1993)。
另外，還有報導(見參考文獻16)說人發育不良血清具有一種與IL-3、粒細胞集落刺激因子和存在於淋巴細胞-條件培養基中的因子截然不同的巨核細胞集落刺激活性。但是，現有技術中既未分離出也未表徵過產生這種具有所述活性的分子。16.Mazur，E.M.等人，Blood 76290-297(1990)。C.Mpl受體脊髓增生性白血病病毒(MPLV)是一種在被感染哺乳動物中可引起急性白血病的鼠複製缺陷性反轉錄病毒。人們早已發現由MPLV表達的基因由用來編碼病毒的反轉錄病毒屬包膜(或表面蛋白質膜)的部分基因組成，其中所說的基因與細胞因子受體族有關的序列相融合，受體族包括GM-CSF、G-CSF和EPO的受體。
上述MPLV基因的表達具有一種令人感興趣的生物學特性，即導致各種類型的鼠祖代細胞在增殖和末端成熟時立刻獲得生長因子不依賴性。此外，用MPLV急性轉化的某些骨髓細胞培養物中含有巨核細胞，這說明MPLV基因與巨核細胞的生長及分化之間具有一定的聯繫。
現在發現MPLV病毒基因(稱為v-Mpl)在哺乳動物細胞中有一個被稱作是細胞Mpl基因(c-Mpl)的同系物。使用v-Mpl-衍生探針克隆出相應於人c-Mpl基因的cDNA。見PCT公開申請WO 92107074(1992年4月30日公開；下文討論)。序列分析表明由c-Mpl基因產物編碼的蛋白質屬於高度保守的細胞因子受體超級族，正如同源的v-Mpl基因產物一樣。
基於通過RNAse探針保護和RT-RCR實驗在正常小鼠的骨髓、脾和胎的肝中發現了c-Mpl的表達，而在其它組織中沒有發現這一事實，認為這個細胞基因，c-Mpl，在血細胞生成中起到功能性作用。特別是c-Mpl在巨核細胞中的表達。已闡明了人細胞基因，人cMpl在CD34陽性細胞包括提純的巨核細胞和血小板中表達。CD34是一種指示早期造血祖代細胞的抗原。此外，將CD34陽性細胞暴露於與c-Mpl mRNA或信息反義的合成的寡脫氧核苷酸顯著地抑制CFU-MK巨核細胞祖代的集落形成能力，但對紅細胞或粒細胞巨噬細胞的祖代沒有任何影響。
以上資料和觀察結果表明c-Mpl編碼結合到配體上的細胞表面分子(本文稱為Mpl受體)，配體能夠激活受體，並且可能引起巨核細胞的生成和/發育。
PCT專利出版物WO 92/07074涉及到用來自人和鼠的c-Mpl基因生成的蛋白質序列。這個按上述解釋稱為受體的基因產物，至少由三個常規區域組成細胞外區、跨膜區和細胞內(或細胞質)區。這些區全部結合在一起就組成了完整的Mpl受體。該PCT出版物還提及一種受體的可溶形式，其基本上相應於成熟c-Mpl蛋白質的細胞外區。細胞內區含有一個親水區，當親水區經過跨膜區和蛋白質的細胞外區相結合時，整個蛋白質就變得凝集並且不可溶。另一方面，當c-Mpl基因產物的細胞外區從跨膜區和細胞內區中分離出來時，細胞外區就變成可溶的，因此，將該蛋白質的細胞外形式稱為該受體的「可溶形式」。
以下歸納了與上述的v-Mpl和c-Mpl受體及基因有關的參考文獻17.Wendling，F.，etal.，Leukemia 3(7)475-480(1989).
18.Wend1ing，F.，et al.，Blood 73(5)1161-1167(1989).
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24.Wend1ing，F，et al.，Blood 80246a(1993).D.對能夠刺激血小板生成的試劑的需要近來已報導在北美、西歐和日本許多醫療中心採用血小板輸注的比率不斷增長。見Gordon M.S.和Hoffman，R.，Blood 80(2)302-307(1992)。這種增長是由於醫藥技術的較大進步和更多地利用類似技術如心臟手術及骨髓、心臟和肺移植而造成的。癌症患者和HTV-1流行病的一種治療方法是劑量增強，這也造成了對血小板的急需。
血小板的使用使得有可能傳播許多出血性傳染病和異源免疫。而且，生產純化的血小板是一個花費很高且又費力的事情，結果是增加使用血小板使全部醫療費用增加。因此，迫切需要找到新的和改進的方法以生產用於人的血小板。
以下是關於增加血小板生成的現有技術的舉例US專利5,032,396報導了白細胞介素-7(IL-7)能夠刺激血小板生成。白細胞介素-7也是人們已知的淋巴細胞生成素-1，而且是一種淋巴細胞生長因子，能夠刺激骨髓中B-和T-細胞祖代的生長。PCT專利申請系列號88/03747(1988年10月19日申請)以及歐洲專利申請號88309977.2(1988年10月24日申請)公開了通過重組DNA技術生成哺乳動物的IL-7蛋白質的DNA、載體和有關的方法。記載在US專利中的資料表明IL-7可以增加正常的和亞致死輻射小鼠中的血小板循環。
US專利5,087,448公開了用白細胞介素-6處理哺乳動物可以刺激巨核細胞和血小板的增殖。重組人白細胞介素-6是一種分子量為26,000具有多種生物活性的糖蛋白。該專利所記載的資料表明IL-6具有體外增加巨核細胞集落的作用。
以上提及的專利都沒有涉及到本發明所說的Mpl配體。
雖然有以上文獻，但仍迫切需要哺乳動物中巨核細胞和/或血小板的新的刺激因子。E.關於化學性修飾之MGDF的背景隨著重組DNA技術大幅度地進步，目前人們可以大量生產出適當形式的用於治療的蛋白質。這種蛋白質的化學衍生物有效地阻斷了蛋白水解酶與蛋白質骨架本身的物理性接觸從而阻止其降解作用。其它優點還包括在某種情況下它可以增加治療性蛋白質的穩定性和循環時間並且降低致免疫性。然而，值得注意的是人們無法預測到某個特定蛋白質的修飾作用的效果。關於描述蛋白質修飾和融合蛋白質的綜述文章是Francis，Focus on Growth Factors 34-10(1992年5月)(Mediscript，Mountview Court，Friern Barnet Lane，LondonN20，OLD，UK出版)。
聚乙二醇(「PEG」或「peg」)是一種已用來製備治療性蛋白質產物的這樣一種化學成分。例如Adagen是一種允許用來治療許多結合性免疫缺陷性疾病的腺苷脫氨酶藥物；聚乙二醇化的(pegylated)過氧化歧化酶在臨床實驗中已用於治療頭部受傷；聚乙二醇化的α幹擾素已經通過了肝炎治療I期臨床實驗測試；有報導說聚乙二醇化的糖腦苷酯酶和聚乙二醇化的血紅蛋白正處於預臨床測試階段。對某些蛋白質而言，聚乙二醇的結合可以使其受到保護避免了蛋白水解酶的作用，見Sada等人，J.Fermentation Bioengineering 71137-139(1991)，另外和某些聚乙二醇部分結合的方法也是已知的。見US專利No 4,179,337，Davis等人「Non-Immunogenic Polypeptides」，1979年12月18日公開以及US專利4,002,531，Royer「ModifyingEnzymes with Polythylene Glycol and Product Produced Thereby」，1992年1月11日公開。有關綜述，見Abuchowski等Enzymes as Drugs(J.S.Holcerberg和J.Roberts，eds pp.367-383(1981))。
用來修飾蛋白質的其它可溶性聚合物有，例如乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環、聚-1，3，6-三氧雜環己烷、乙烯/馬來酸酐共聚物以及聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)。
對於聚乙二醇，人們使用了許多將聚乙二醇分子與蛋白質相連接的方法。一般地，聚乙二醇分子通過一個在蛋白質上的活性基團結合到蛋白質上。對於那些如賴氨酸殘基或N-末端上的氨基基團，這種連接是很方便的事情。例如Royer(上述US專利4,002,531)記述了通過還原性烷基化將聚乙二醇分子連接到酶上。EPO 539 167(1993年4月28日公開，Wright「Peg Imidates and Protein DerivatesThereof」)記述了用PEG的亞氨酸衍生物或相關的水溶性有機聚合物修飾肽和具有游離氨基的有機化合物。US專利4,904,584(Shaw，1990年2月27日公開)涉及了蛋白質中大量賴氨酸殘基的修飾，所述的賴氨酸殘基用於經反應性氨基基團連接聚乙二醇分子。
一種經化學修飾的特定治療性蛋白質是粒細胞集落刺激因子「G-CSF」。見歐洲專利公開EP 0 401 384，EP 0 473 268和EP 0 335 423。
另一個實例是聚乙二醇化的IL-6，EP 0 442 724，標題為「Modified hIL-6」(見共同未決的U.S.S.N.07/632,070)公開了將聚乙二醇分子加到IL-6上。EP 0 154 316，(1985年9月11日公開)報導了用聚乙二醇的醛與淋巴因子反應。
由於用來修飾的每種單個蛋白質對修飾的敏感性是通過所述蛋白質的特定結構參數來確定的，所以現有技術中修飾MGDF的能力是未知的。再者，從現有技術中也無法預見到這種對每種蛋白質之生物特性的影響。由於有很多MGDF的臨床應用(正如以下所述的那樣)，人們需要一種具有改變特性的衍生MGDF產物。這種分子在體內可以具有增加的半衰期和/或活性，以及其它特性。
蛋白質分子的聚乙二醇化通常將產生化學修飾蛋白質分子的混合物。舉例來說，有五個賴氨酸殘基及一個N-末端游離氨基基團的蛋白質分子用以上方法反應會產生一種異質混合物，其中有的分子含有六個聚乙二醇部分，有的含有五個聚乙二醇部分，有的含有四個，有的含有三個，有的兩個，有的一個甚至有的沒有。而且，在帶有數個聚乙二醇部分的分子中，聚乙二醇部分可能不能連接在不同分子的相同位置上。人們常常希望獲得一種均質產物，這種產物含有基本上只有一個或數目很小(如2-3)的被修飾的蛋白質種類，這些蛋白質種類在化學部分如PEG的數量和/或位置上有變化。然而，如單-、雙-和/或三-聚乙二醇化的蛋白質種類的混合物對於給定的治療目的來說可能是合意的或可以接受的。
當開發治療性聚乙二醇化的蛋白質產物時，混合物隨不同的批次而變化是不利的。在這種開發過程中，預測生物活性是很重要的。例如，在非選擇性連接超氧化物歧化和聚乙二醇時，這個被修飾的酶的幾個部分都完全失活了(P.McGoff et al.，Chem Pharm.Bull.363079-3091(1988)，Rose et al.，Bioconjugate Chemistry2154-159(1991))也報導了把連接基團碳醯肼選擇性地連接到蛋白質底物(胰島素)的C-末端羧基基團上。如果治療性蛋白質的組成隨不同批次而不同，那麼，就不會有如此的預測性。一些聚乙二醇部分在某些位置上結合得不如在其它位置上穩定，而且所述部分會因此從蛋白質中分離出來。當然，如果所述部分是隨機連接上去的且因此也會隨機分離出來，就不能準確預測治療性蛋白質的藥代動力學。
另外，非常理想的是衍生的MGDF產物，其中聚合物部分和MGDF部分之間沒有任何聯接部分。用上述的方法存在的一個問題是它們在蛋白質和聚乙二醇分子之間一般需要一個聯接部分。這些聯接部分可以是抗原性的，這在研製治療性蛋白質時是不利的。
一種涉及無聯接基團的方法在Francis等人的「Stability ofProtein Pharmaceuticalsin vivo pathways of degradation andstrategies for protein stabilization」((Eds.Ahern.，T.和Manning，M.C.)Plenum，New York，1991)中有詳述。另外，Delgado等人「Coupling of PEG to Protein By Activation with TresylChloride，Applications In Immunoaffinity Cell Preparation」，InFisher et al.，e#.，Separtions Using Aqueous Phase Systems，Applications Cell Biology and Biotechnology，plenum出版，N.Y.，N.Y.1989 pp.211-213中涉及使用tresyl氯化物這使聚乙二醇部分和蛋白質部分之間沒有聯接基團，由於使用tresyl氯化物會產生有毒的副產品，因此用這種方法去生產治療學產品是困難的。
Chaow等人在Bioconjugate Chem.5133-140(1994)中報導了用單甲氧基聚乙二醇(「MePEG glycol」)醛通過還原性烷基化作用修飾CD4免疫黏附蛋白。作者報導了50％的CD4-Ig通過N-末端α-氨基的選擇性反應而被MePEG修飾(出處同上，p137)。還報導了被修飾的CD4-Ig(到蛋白質gpl20)的體外結合能力以與MePEG化反應程度有關的比率降低(出處同上)。
因此人們需要MGDF衍生物，更確切地說，需要聚乙二醇化的MGDF。當然，還需要完成這種衍生反應的方法。
發明概述一方面，本發明提供一種新的特異性促進巨核細胞生長和/或發育的多肽(「Mpl配體」或「MGDFs」)，所述多肽基本上不含(即分離於)其它蛋白質(即，從哺乳動物來源獲取Mpl配體時的哺乳動物蛋白質)。所述蛋白質可以從天然或用其它因子誘導產生因子的細胞源中純化得到。也可以通過重組基因工程技術生產所述的蛋白質。Mpl配體可以進一步用化學方法或以上列舉技術的結合方法合成。
本發明可以從哺乳動物源中得到天然形式的Mpl配體。本文實施例部分描述了兩例從犬發育不良血漿中分離的Mpl配體。然而，其它實施例證明人源和豬源發育不良的血漿中存在著密切相關的Mpl配體。值得注意的是，無論人、豬還是犬的Mpl配體活性都被可溶形式的鼠Mpl受體特異性地抑制，證實了所有的Mpl配體(以及從其它哺乳動物源(包括鼠)得到的配體)之間無論在結構上還是在活性水平上都是緊密相關的。
本發明期望基本上用如本文所述的方法可從天然來源中分離人、豬和其它哺乳動物Mpl配體。見實施例10。因此，本發明一般包括哺乳動物Mpl配體，例如，狗、豬、人、鼠、馬、羊和兔。特別優選的Mpl配體來源於狗，豬和人。
另外，正如以下實施例部分描述的那樣，用於編碼人Mpl配體的基因已經從人胎腎和肝文庫中克隆並且測序。用以細胞為基礎的檢測方法鑑定了兩種人多肽序列具有活性(見實施例4)。這些序列在長度上有所不同，但在一大段區域的胺基酸序列上具有一致性。相同的部分與促紅細胞生成素同源。本文也把Mpl配體稱為巨核細胞生長和發育因子(MGDF)；所有關於Mpl配體的參考文獻都將適於本文稱作的MGDF而且反之亦然。其中「MGDF多肽」是指一種具有特異性刺激或抑制巨核細胞生長/或發育活性的多肽。本發明公開了這種多肽的實例。
正如以下實施例2和4檢測實驗證明的那樣，已發現本發明的Mpl配體在巨核細胞譜系中有特異性活性，能夠增進巨核細胞成熟和/或增殖。其中「特異性」是指與對很多其它類型細胞相比，多肽對巨核細胞顯示出相對較高程度的生物活性。人們希望對巨核細胞有刺激作用的那些多肽通過巨核細胞的成熟和分化的刺激作用具有刺激血小板生成的體內活性。
兩種來自犬源的優選的Mpl配體在非還原條件下經十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，分別具有約25KD和31KD的表觀分子量。經相同的純化處理，可以提純這兩種蛋白質，純化處理方法如下實施例所詳述。
兩種優選的人配體，MGDF-1和MGDF-2，在長度上分別具有332和173個胺基酸，不包括21個胺基酸的推定的信號肽。附圖11和12列出了這些序列以及第三個相關分子，MGDF-3。
本發明的又一個方面是從哺乳動物源，優選的是從全血、血清或血漿中，分離並純化本發明的Mpl配體或其片段的方法。特別優選的原料是發育不良的血液、血清或血漿。通過一種方法，涉及用例如鈷-60的放射源在大約400-800拉德的輻射程度下輻射哺乳動物使其發育不良，可以得到發育不良的血液、血清或血漿。下面實施例1引證的文獻舉證的那樣，這種方法是公知技術。對人而言，可以從經過放射治療(如癌症治療)的患者體內獲得被輻射的血液、血清或血漿。
此外，將發育不良血液、血清或血漿進行純化處理。本發明提出的純化方法包括以下關鍵步驟外源凝集素親和層析和Mpl受體親和層析。以上所說步驟每一步都能使來自犬發育不良血漿中的25和31KD蛋白質純化大約300-500倍。其它標準的蛋白質純化方法，如以下詳述的那些方法，可以包括在以上所述的過程中以進一步純化本發明的Mpl配體。
另一方面，本發明包括編碼哺乳動物Mpl配體蛋白質表達的聚核苷酸。所述DNA序列可以包括一種如本文所述的編碼哺乳動物Mpl配體蛋白質表達的分離的DNA序列。該DNA序列還可以包括位於Mpl配體編碼序列側翼的5′和3′哺乳動物非編碼序列。DNA序列還可以編碼氨基末端的信號肽。可以用任何公知的方法製備所述的序列，包括完全的或不完全的化學合成方法。可以優化密碼子以便在用於表達的宿主細胞(例如，E.coli或CHO細胞)中進行表達。
本發明還涉及一種重組DNA分子，每種分子含有載體DNA和編碼哺乳動物Mpl配體的DNA序列。DNA分子提供與調節序列有效相連的Mpl配體DNA，其中的調節序列能夠支配Mpl配體在所選宿主細胞中的複製和表達。本發明還涉及用所述DNA分子轉化的宿主細胞(例如，細菌、哺乳動物、昆蟲、酵母或植物細胞)，用於表達重組Mpl配體蛋白質。
本發明的另一方面是應用本發明的DNA分子和轉化的細胞，提供一種新的生成重組哺乳動物Mpl配體蛋白質或其肽片段的方法。在該方法中，在允許重組DNA表達的適宜條件下，培養用DNA序列轉化的細胞系，所述DNA序列編碼與適當的能夠控制蛋白質表達的調節或表達控制序列有效相連的Mpl配體蛋白質或其片段(或上述的重組DNA分子)的表達。這種要求保護的方法可以用許多已知的細胞作為用於表達蛋白質的宿主細胞。到目前為止，優選的用於生產Mpl配體的細胞系是哺乳動物細胞系(如CHO細胞)和細菌細胞(如E.coli.)。
若用E.coli生產Mpl配體，由於表達產物的產率比較高，所以優選的方法是使用將被表達之蛋白質N-末端上的Met和Lys殘基。特別優選的表達產物是總共具有165個胺基酸的Met-Lys人MGDF(即，Met-2-Lys-1(1-163)MGDF)(從成熟蛋白質的第一個胺基酸開始計數)。純化在如E.coli細菌細胞中被表達的產物後，可以用如二肽酶(組織蛋白酶C)處理去除末端的Met-Lys殘基。
接著用適宜的常規方法從宿主細胞、細胞溶解產物或培養基中分離被表達的Mpl配體蛋白質。可以用與從發育不良血漿中分離Mpl配體相同的純化步驟或其變化方法來處理條件培養基。(見實施例7)。
本發明還涉及重組Mpl配體蛋白質。所述蛋白質基本上不含其它哺乳動物物質，尤其是蛋白質。本發明Mpl配體蛋白質以包括一種或多種本文所述的物理、生化、藥理或生物學活性為特徵。
本發明還涉及一種化學修飾的MGDF及其製備方法和這種成分的用途，所述修飾的MGDF含有一個與至少一種水溶性聚合物結合的MGDF蛋白質部分。具體地說，本發明包括化學修飾的MGDF，其中所述MGDF類與反應性聚乙二醇分子反應，以使PEG與MGDF結合。這種結合可以用本文所討論的聚乙二醇化反應來完成，例如，醯基化作用或烷基化作用。與PEG的醯基化或烷基化反應在主要產物為單聚乙二醇化或多聚乙二醇化產物的條件下完成。多聚乙二醇化作用一般包括PEG結合到Lys殘基的ε-氨基基團上，另外，還包括在多肽的N末端進行的聚乙二醇化反應。優選的單聚乙二醇化反應包括PEG結合到蛋白質N-末端的α-氨基基團上，這種單聚乙二醇化反應的產率和均一性可通過一類選擇性修飾MGDF蛋白質部分的N-末端殘基的α-氨基的還原性烷基化作用來提高，從而使水溶性聚合物部分選擇性地結合到蛋白質N-末端上。這樣本發明提供了基本上均質的聚合物/MGDF蛋白質共軛物分子製品，以及(假設用聚乙二醇)具有直接連在蛋白質部分上的聚乙二醇部分的聚乙二醇化MGDF蛋白質分子的製備。
本發明的另一方面是提供一種藥物組合物，該組合物含有治療有效量的已分離的天然產生的或重組的Mpl配體和藥物學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其中的Mpl配體可用水溶性聚合物如聚乙二醇衍生化。所述的藥物組合物可以用在治療以巨核細胞和/或血小板缺乏以及Mpl配體體內缺乏為特徵的疾病或失調的方法中。還可以預防性地用來改善預料到的巨核細胞或血小板缺乏(例如，由於外科手術造成的)。
因此，本發明的Mpl配體可以用來治療再生障礙性貧血，例如可以增強那些血小板生成損傷患者的血小板的生成(例如愛滋病患者或經過化學治療的患者)。Mpl配體可以治療血液失調例如血小板減少症。Mpl配體可以用於骨髓移植患者的輔助性治療。這些患者可以是人，也可以是其它的哺乳動物。人們還希望來自一種物種的Mpl配體可以適用於另外一種物種。
因此，更進一步地說，本發明的另一方面是一種給患者施用治療有效量的上述治療組合物而治療由血小板缺少引起的這種和其它病理學疾病的方法。這些治療方法可以包括同時或依次地施用Mpl配體、有效量的至少一種其它巨核細胞集落刺激因子，細胞因子(如EPO)、可溶性Mpl受體、促紅細胞生成素、白細胞介素、生長因子或抗體。
本發明還提供了直接抗(即與具有反應性)哺乳動物Mpl配體或配體片段的抗體(如多克隆的、單克隆的、人化的和重組的)以及抗體片段。因此，就這一方面，本發明包括能夠分泌這些抗體的細胞(例如，單克隆抗體時的雜交瘤)以及生產抗體的方法和抗體在診斷或治療過程中的應用。
本發明還涉及一種檢測體液中是否存在Mpl配體的方法。這種檢測可以使用抗體，所述抗體以單個抗體形式或「夾層」形式特異性地識別Mpl配體。這種檢測可以測定患者是否需要外部施用Mpl配體和/或測定損傷患者是否可能患有血小板缺乏症或失調。這種檢測可以在某種試劑盒中進行，所述試劑盒包括陽性對照和陰性對照、抗體、以及其它標準試劑盒成分。
考慮了以下詳述的本發明優選實施例後，可以看出本發明的其它方面和優點。
附圖的簡要描述在瀏覽了附圖後，本發明的許多特徵和優點將是顯而易見的，其中附圖1描述了巨核細胞和血小板的發育和成熟的概況。
附圖2說明了可溶性鼠Mpl受體基本上完全抑制來自輻射狗(「發育不良犬」或「APK9」)的血漿以誘導巨核細胞發育的能力。在實施例2中描述了對巨核細胞發育的檢測。
附圖3表示通過外源凝集素親和和Mpl受體親和層析方法從APK9富集的活性(「Mpl配體」)刺激1A6.1細胞的生長，而可溶性鼠Mpl受體阻斷其生長。
附圖4概括了從發育不良的犬血漿中純化犬Mpl受體25和31kd形式所涉及的純化步驟。
附圖5表示用反相HPLC(RP-HPLC)純化Mpl配體。組分21含有高度純化的31kd Mpl配體；組分22含有31kd和25kd Mpl配體；組分23含有高度純化的25kd Mpl配體。
附圖6表示在含有25和/或31kd Mpl配體蛋白的反相HPLC(C4柱)組分中，Mpl配體活性的比較。
附圖7表示從CD34篩選的外周血細胞培養物中產生的巨核細胞的數目，所述的外周血細胞用APK9，Mpl配體和各種其它因子刺激。
附圖8表示從CD34篩選的外周血細胞培養物中產生的總白細胞的數目，所述的外周血細胞用APK9，Mpl配體和各種其它因子刺激。
附圖9表示在CD34篩選的外周血細胞培養物中產生的巨核細胞的百分比，所述的外周血細胞用APK9，Mpl配體和各種其它因子刺激。
附圖10表示人IL-3與Mpl配體誘導的巨核細胞發育無關。
附圖11表示人MGDF-1和MGDF-2的cDNA和推測的胺基酸序列。
附圖12表示人MGDF-3的cDNA和推測的胺基酸序列。
附圖13表示來自犬源(A)和鼠源(B)的MGDF-1和MGDFs(Mpl配體)之間的比較。
附圖14表示用單甲氧基-聚乙二醇的N-羥琥珀醯亞胺基(NHS)活性酯醯化MGDF以得到多聚乙二醇化的產物的實例。
附圖15是用單甲氧基-聚乙二醇醛進行非特異性還原烷基化MGDF以得到多聚乙二醇化的產物的實例。
附圖16是用單甲氧基-聚乙二醇醛進行N-末端殘基的α-氨基的位點特異性還原烷基化MGDF以得到基本上單聚乙二醇化的產物的實例。
附圖17表示用MW 20 kDa MePEG的活化衍生物製備的MePEG-MGDF共軛物的篩析(SEC)HPLC分析。
A.用MePEG(PEG 11)的NHS酯通過MGDF醯化而製備的多-MePEG-MGDF共軛物，B.用MePEG醛(PEG 20)通過MGDF烷基化而製備的多-MePEG-MGDF共軛物，C.用MePEG醛(PEG 16)通過MGDF烷基化而製備的多-MePEG-MGDF共軛物。
附圖18表示用重組人MGDF處理的小鼠的血小板計數空心(open)菱形＝CHO-衍生的22-353MGDF；空心圓＝未聚乙二醇化的E.coli 22-184 MGDF(即.1-163 MGDF)；實心(closed)圓＝聚乙二醇化的E.coli 22-184 MGDF。
附圖19表示r-HuMGDF的純化流程圖。
附圖20表示在鼠卡鉑(carboplatin)模型中，r-HuMGDF(E.coli 1-163)對血小板計數的影響。在0天，給Balb/c小鼠腹膜內注射單劑量的卡鉑(1.25mg/小鼠)。只注射賦形劑的組不接受卡鉑。24小時後，給卡鉑-處理的動物每天皮下注射賦形劑或100ug/kg的r-HuMGDF以進行以後的研究。(每組，n＝10；在每個時間點，飼養5隻動物)。
附圖21表示在輻射處理的小鼠中，r-HuMGDF(E.coli 1-163)對血小板計數的影響。在0天，用500拉德的γ-射線(銫源)輻射Balb/c小鼠。只注射賦形劑的組不接受輻射。24小時後，給輻射處理的動物每天皮下注射賦形劑或100ug/kg的r-HuMGDF以進行以後的研究。(每組，n＝8；在每個時間點，飼養4隻動物)。
附圖22表示在輻射和卡鉑結合處理的小鼠中，r-HuMGDF(E.coli1-163)對血小板計數的影響。在0天，用500拉德的γ-射線(銫源)輻射Balb/c小鼠並注射卡鉑(1.25mg/小鼠)。24小時後，給綜合處理的動物每天皮下注射賦形劑或100ug/kg的r-HuMGDF以進行以後的研究。沒有r-HuMGDF支持，大多數動物在該研究中都不能存活。在對照組中，8隻動物中的1隻存活。在處理組中，所有8隻動物全部存活。
附圖23表示在恆河猴中，r-HuMGDF(E.coli 1-163)對輻射誘導的血小板減少症的作用。使恆河猴經受輻射(700cGy Co-80)。從輻射後24小時開始，連續18天皮下施用r-HuMGDF(n＝3)或人血清白蛋白(n＝9)(各25ug/kg/天)。用電子血細胞分析儀進行血細胞分析。每個符號代表平均值(+/-均值標準誤差)。
附圖24表示在卡鉑和輻射處理的小鼠中，聚乙二醇化的和糖基化的r-HuMGDF對血小板計數的影響。按照附圖22所完成的研究的描述，使小鼠經受卡鉑和輻射結合處理。從損傷後24小時開始，每天皮下注射按說明製備的r-HuMGDF(50ug/kg/天)。在指明的天數，用電子細胞計數器(Sysmex，Baxter)取血細胞計數。
附圖25表示含有E.coli優選密碼子的重組人MGDF，胺基酸1-163的合成基因序列。
發明詳述一旦考慮了詳細說明本發明實踐的下列描述，那麼，本發明的其它方面和優點對於本領域專業人員來說是顯而易見的。
本發明提供的新的哺乳動物巨核細胞生長促進，和/或血小板產生因子(稱為Mpl配體)是基本上不含其它蛋白類物質的均質蛋白質。優選的，所述蛋白質無其它蛋白質，達到約90％，更優選的，無其它蛋白質達到約95％，且最優選的，無其它蛋白質＞＝98％。經重組技術可以生產這些蛋白質，以便能大量生產可用於治療的純的，活性的Mpl配體。另外，從哺乳動物發育不良的血液，血漿或血清，或從分泌或表達Mpl配體的哺乳動物細胞系中也可以得到均質的所述蛋白質。此外，可以化學合成Mpl配體或其活性片段。
總的來說，本發明所用的「Mpl配體」是指本文公開的Mpl配體以及下文更詳細描述的其活性片段和變異體。
在非還原條件下，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定，來自犬源的兩個優選Mpl配體的表觀分子量為25kd和31kd。這兩種蛋白質均用下文實施例部分詳細描述的方法純化。因此，例如這兩個Mpl配體均結合小麥精外源凝集素並固定Mpl受體。25kd形式包括下列胺基酸序列Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-Pro-Asp-Ile-Tyr(SEQ ID NO1).31kd形式包括下列胺基酸序列Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His(SEQ ID NO2).在SEQ ID NOS1和2中，「Xaa」胺基酸不是很肯定的，但預期是Cys、Ser、Thr或(可能性很小)Try。
從上述序列可以看出，31kd配體含有至少部分25kd形式。具體地說，31kd的前21個胺基酸與25kd蛋白質的完全相同。該證據，特別是在本文的Mpl配體活性檢測中，兩種蛋白質均有活性的事實可以得出這樣的結論這兩種蛋白質從結構和活性上講，是非常相近的。可能該蛋白質的31kd形式與25kd的差異在於，C-末端序列不同，糖基化不同，和/或編碼該蛋白質之基因的拼接不同。
除上述序列信息外，在最後純化步驟(用反相HPLC)前，於25kd帶定序期間，確定另一序列。發現在非還原條件，而不是還原條件下，該序列與25kd帶有關，這表明，它是25kd蛋白質裂解成兩部分(例如用蛋白酶)的結果，這兩部分是通過二硫鍵連在一起的。該序列是Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gly-Ala-Val-Ala-Leu(SEQ ID NO3)儘管不清楚在25kd蛋白質序列中SEQ ID NO3的精確位置，但是與其它細胞因子，例如促紅細胞生成素類比支持了在25kd蛋白質胺基酸編號114的周圍的可能性。應該指出，這是可能的，儘管未證實，SEQ ID NO3也在31kd蛋白質中，而且也可能從胺基酸編號114周圍開始。該序列的情況將在實施例7中進一步討論。
綜合上述，自從開始犬配體的純化實驗以來，已經克隆了編碼犬配體的基因。結果是已經確定該犬配體的全部胺基酸序列是列於FIG.13A中的序列。以分子量計算為基礎，預測25kd和31kd犬配體是示於FIG.13A的全長配體的C-末端加工形式。另外，已經得到鼠mMpl配體，序列示於FIG.13B。
所述純化配體的特徵是在實施例2的人巨核細胞檢測中其比活性為至少約5.7×109巨核細胞單位/mg。巨核細胞單位的定義是用在實施例2描述的檢測中，可以產生與1μl APK9標準對照一樣多的巨核細胞的物質的數量。
所述純化的配體的特徵還在於在實施例4的Mpl-依賴性細胞生長檢測中比活性至少為約6.9×109個細胞生長單位/mg。「細胞生長單位」指在實施例4的檢測中，使200 1A6.1細胞生長所需的配體的數量。下列表1表示根據本發明製備的實際純化之犬Mpl配體的活性的其它特定計算值。
表1Mpl1A6.1檢測 人Meg檢測配體 (單位/mg) (單位/mg)31kd6.52×1095.7×10925kd10.5×10914×109總結上述資料，本發明的一些示例性的Mpl配體特徵在於有下列一種或多種生物化學和生物學特性(a)所述Mpl配體是從犬的發育不良的血漿中分離的；(b)在非還原條件下，用12-14％十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的所述Mpl配體的表觀分子量約為25kd或31kd；
(c)該Mpl配體含有下列胺基酸序列對於25kd蛋白質來說是SEQ ID NO1，對於31kd蛋白質來說是SEQ ID NO2，(d)另外，Mpl配體還含有胺基酸序列SEQ ID NO3(特別是對於25kd蛋白質來說)；(e)Mpl配體與小麥精外源凝集素結合；(f)Mpl配體與固定化的可溶性鼠Mpl受體結合；(g)可溶性Mpl受體體外可以抑制Mpl配體活性；和(h)在pH為約8-9時，Mpl配體與陰離子交換柱結合。
本發明優選的Mpl配體的生物學活性通過其在實施例2的巨核細胞生長促進檢測中，特異性刺激巨核細胞生長和發育的能力來說明。在該檢測中，Mpl配體在8天的培養期間刺激人外周血CD34+(即通過免疫吸附篩選的CD-34細胞)的分化。用特異性的抗-血小板抗原抗體染色鑑定巨核細胞，然後顯微計數。Mpl配體還刺激因子依賴性細胞系，1A6.1的生長。不存在Mpl配體時，細胞會死亡。與Mpl配體培養2天後，估測1A6.1細胞數。
上述Mpl配體有上述表1中所述的特異性活性。
已經確定Mpl的來源是發育不良哺乳動物的血液、血漿或血清。但是，該配體源不限於所述的已知源並可以包括其它哺乳動物體液，從中得到的細胞等。
從哺乳動物源純化天然Mpl配體是以兩個關鍵的純化步驟為基礎(a)外源凝集素親和層析，優選的是使用小麥精凝集素；和(b)固定化的Mpl受體親和層析。
對蛋白質的進一步純化來說，也可以包括其它步驟，例如，離子交換層析，凝膠過濾層析，和反相層析。
從犬發育不良血漿獲得Mpl配體的實際所用的純化技術包括下列步驟(見實施例7)(a)外源凝集素親和層析(特別優選的是小麥精凝集素層析)；(b)可溶性Mpl受體(Mpl-X)親和層析(優選的是使用固定化的鼠Mpl-X)；(c)離子(陰離子或陽離子)交換層析(優選的是陽離子交換層析；特別優選的是用Mono Q柱)(d)在離解條件下，凝膠過濾層析(優選的是用Superdex 200加SDS)；和(e)反相層析(優選的是用C-4柱)。
對發育不良血液，血清或血漿或哺乳動物Mpl配體的其它源(例如細胞或組織源)使用上述純化步驟，可以得到均質的哺乳動物Mpl配體(包括人配體)。這些步驟並無特定的順序，但所列的順序是優選的。培養可生產Mpl配體的細胞(或)組織源的方法是本領域專業人員熟知的，並且可以採用，例如可以用來擴大起始物質的供給。
經重組技術也可以生產Mpl配體或其一個或多個肽片段。為了得到特定Mpl配體的DNA序列，還原純化的Mpl配體物質，並用蛋白酶例如胰蛋白酶任選地消化。分離酶促後的片段並用常規技術測序。另外，作為本文實施例中的舉證，以可得到的蛋白質量為基礎，可以將完整的純化蛋白質直接測序達到可能的程度，然後，在下列方法中類似於測序的胰片段可以使用測序區。用遺傳密碼子合成寡核苷酸探針以預測編碼測序的片段胺基酸序列的所有可能的序列。優選的是，生產數個簡併序列作為探針。用這些探針鑑定Mpl配體基因以篩選哺乳動物基因組文庫或其它源。另外，可以用來自Mpl配體細胞源的mRNA以得到用探針可篩選的cDNA文庫，從而鑑定編碼Mpl配體多肽的cDNA。此外，用適宜的引物，可以用PCR技術擴增cDNA序列。
用這些探針篩選基因組文庫，得到DNA克隆。為了得到全長的克隆，可以用以得到的DNA序列為基礎的探針再篩選文庫並與全長Mpl配體DNA序列雜交。
通過將全長人基因組克隆亞克隆到表達載體中，將其轉染到COS細胞中，從這些轉染的COS細胞製備cDNA文庫，通過雜交篩選Mpl配體cDNA，也可以得到人Mpl配體的cDNA。一旦鑑定了完整的cDNA，便可將其或其編碼Mpl配體活性片段的任何部分導入各種表達載體的任一之中以得到Mpl配體或其一個或多個片段的表達系統。
通過使用重組技術，得到了編碼Mpl配體多肽的優選DNA序列。本發明還包括這些DNA序列，它們不含編碼其它蛋白質的DNA序列(即是分離的)，但編碼有Mpl配體活性(例如巨核細胞生長和/或發育)之Mpl配體多肽的表達。這些DNA序列包括編碼所有或一個Mpl配體片段的那些序列和優選的，在嚴格條件下與cDNA序列雜交的那些序列(參見，T.Maniatis et al.，Molecular Cloning(A laboratoryManual)；Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，p387-389)。
舉例性的嚴格的雜交條件是於62-67℃在4 X SSC中雜交，然後於62-67℃用0.1 X SSC洗滌約1小時。另外，舉例性的嚴格的雜交條件是於40-45℃在45-55％甲醯胺，4 X SSC中雜交。
在鬆弛的雜交條件下與Mpl配體序列雜交並編碼具有Mpl配體生物學特性之Mpl配體肽的DNA序列也編碼本發明的新的Mpl配體多肽。所述的鬆弛嚴格雜交條件例如是4 X SSC，40-45℃。或在40-45℃用30-40％甲醯胺雜交。例如，與Mpl配體之序列有顯著同源性區域(例如糖基化或二硫鍵合位點)，且編碼有一種或多種Mpl配體生物學特性的DNA序列明顯編碼Mpl配體多肽，即使所述的DNA序列並不能與Mpl配體序列嚴格雜交。
本發明也包括編碼Mpl配體肽的DNA序列的等位變異體(在種群中天然發生的鹼基改變，這種改變可以或不會導致胺基酸的改變)，還包括其類似物或其衍生物。類似地，本發明還包括編碼Mpl配體多肽但在密碼子使用上不同的DNA序列，所述的密碼子使用上的不同是由於遺傳密碼的簡併性或由為提高活性、半衰期或由其編碼之多肽的產生而進行的點突變或誘導 修飾而引起的Mpl配體DNA序列的變異。
採用下文實施例11所述的克隆方法，產生本文公開的人蛋白質MGDF-1、MGDF-2、MGDF-3的胺基酸和cDNA序列。MGDF-1是圖11所示的胺基酸22-353並含有332個胺基酸。MGDF-2是MGDF-1的截斷的部分，如圖11中所示的胺基酸22-195。因此MGDF-2含有174個胺基酸。MGDF-3是圖12所示的胺基酸22-289，含有268個胺基酸。在本文公開的每個MGDF中，包括信號肽的分子，在圖11和12中是胺基酸1-21，也是本發明多肽的一部分，但優選的是除去該部分以表現巨核細胞生長和發育活性。總之，MGDF 1-3定義如下MGDF-1胺基酸 22-353 圖.11MGDF-2胺基酸 22-195 圖.11MGDF-3胺基酸 22-289 圖.12。
在本文的試驗中，MGDF-1和MGDF-2是有活性的，而MGDF-3沒有活性。
以本文所列的活性為基礎，假設在體內，人MGDF是以含有可變的C-末端胺基酸之基本無活性或活性較低的前體多肽而被表達的。在裂解了C-末端胺基酸(以及信號肽)後，分子的加工形式保留了活性或變得活性更高。從上述假設看，為了表現出其活性，認為MGDF-1需要加工(例如，用蛋白酶裂解)。MGDF-1的截斷形式(MGDF-2)具有活性的事實支持了該假設。
在下文實施例4的細胞檢測中，來自用MGDF-1基因轉染的人腎293細胞(Invitogen)的條件培養基有活性。另一方面，在其它細胞系，例如，32D細胞中，該分子沒有活性。假設這意味著293細胞可以加工MGDF-1分子，可能通過截斷，以致於主要產生活性的該分子是一種截斷形式，而32D細胞不能加工該分子。
從上述假設看，截斷上述MGDF-1序列(圖11)可產生不同的活性分子。在細胞因子家族，例如促紅細胞生成素(EPO)中，保守的結構特徵包括四個α-螺旋群和四個Cys。對於MGDF-1序列，Cys172是這些進化保守和功能必需結構中最重要的C-末端元素。因此，優選的MGDF-1截斷變異體是含有胺基酸173-353(與信號肽裂解一起)C-末端截斷的任何分子。優選的，MGDF-1序列除去了其C-末端的50-185位胺基酸，特別優選的是從C末端除去了90-172位胺基酸。按本文公開的，認為信號肽是21個胺基酸長；但是，基於MGDF-1序列，信號肽可以有23個胺基酸。因此，還特別包括對應於本文所列的，但從圖11或12的位置24開始的多肽。
下列是特別優選的可有活性(即，促進巨核細胞/或血小板生長的能力；或對天然受體的抑制/刺激能力)的MGDF-1變異體MGDF-4胺基酸 22-172 圖11MGDF-5胺基酸 22-177 圖11MGDF-6胺基酸 22-191 圖11MGDF-7胺基酸 22-198 圖11MGDF-8胺基酸 22-265 圖11MGDF-11 胺基酸 22-184 圖11
在一些克隆中，不存在MGDF-1序列中的胺基酸133-136，以致於相應於上述，但其中丟失了這些胺基酸(C末端胺基酸數有4個的差異)的序列也是有活性的。
在一個克隆中，在位置192有一個終止密碼子，發現在圖11中的位置191上Ala殘基代替了Thr殘基。因此，本發明包括在位置191上Ala代替了Thr的MGDF變異體分子。
由於該序列是在序列中的第5外顯子內拼接的，所以，MGDF-3是由除去本文所稱的IVS-5(間插序列-5)序列而產生的。由於IVS-5的5′末端在密碼子內，因此它的除去會在剩餘的MGDF序列中產生框移，在MGDF-3的位置160到分子的末端均可以發生。
在轉染到293細胞中並在實施例4的以細胞為基礎的檢測中檢測了所得條件培養基的活性後發現MGDF-3本身沒有活性。顯然，與MGDF-1不同，293細胞不能將MGDF-3加工成活性形式。但是，基於與MGDF-1有關的上述截斷假設，截斷MGDF-3的C末端胺基酸可能也會產生活性。例如，截斷MGDF-3的C末端的40-102胺基酸可能產生活性。優選的，除去50-90胺基酸。兩個特別優選的MGDF-2變異體是MGDF-9 22-179 圖12MGDF-1022-190 圖12在本文公開的所有Mpl配體中，包括上述舉例的MGDF，在其N-末端可以有甲硫氨醯殘基，特別是當在細菌宿主中表達所述的多肽時。
通過已知的常規化學合成方法，也可以產生Mpl配體多肽。用合成方法構建本發明多肽的方法是本領域專業人員熟知的。依據與Mpl配體多肽共有的一級、二級或三級結構和構型特徵，合成構建的Mpl配體多肽可以具有與此共有的Mpl配體生物學特性。因此，在治療和免疫過程中，可以用它們作為生物學活性或免疫取代物取代天然的、純化的Mpl配體多肽。
本領域專業人員用已知技術，可以修飾肽或編碼Mpl配體的DNA序列。在Mpl配體中的所需修飾可以包括編碼序列中的所選胺基酸殘基的取代，插入或缺失。用於所述取代、插入或缺失的誘變技術是本領域專業人員熟知的(參見，U.S.專利4,518,584)。在1-20胺基酸中的保守改變是優選的。優選的肽可以通過蛋白水解酶，或直接的化學合成得到。本發明Mpl配體多肽和多核苷酸的含義包括所述的變異體。
Mpl配體多肽序列的特定突變可能涉及糖基化位點(例如，Ser，Thr，或Asn)的修飾。沒有糖基化或只有部分糖基化是由於在任何Asn-連接的糖基化識別位點或在通過加入O-連接的碳水化合物修飾的分子的任何位點的取代或缺失而引起的。Asn-連接的糖基化識別位點包括由適宜的細胞糖基化酶特異識別的三肽序列。這些三肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中，Xaa可以是除Pro以外的任何胺基酸。在糖基化識別位點的第一或第三中的一個或兩個胺基酸位置上不同胺基酸的取代或缺失(和/或在第二位置上的胺基酸缺失)導致修飾三肽序列的非糖基化。所述改變核苷酸序列的表達得到在此位點非糖基化的變異體。MGDF的其它類似物/衍生物本領域專業人員用本文公開的方法，也可以製備可以保留全部或部分MGDF(Mpl配體)活性的MGDF(Mpl配體)序列的其它類似物和衍生物。本發明也包括所述的修飾物。
更具體地說，本發明還包括化學修飾的MGDF組合物以及製備和使用它們的方法。本發明公開的內容表明，可以修飾MGDF並提高其特性。
一方面，本發明涉及一種MGDF產物，它含有與至少一種水溶性聚合物部分相連的MGDF產物。
另一方面，本發明涉及一種MGDF產物，其中所述MGDF蛋白質與至少一個聚乙二醇分子相連。
另一方面本發明涉及經一醯基或烷基鍵與至少一個聚乙二醇分子相接的MGDF分子。
通過本領域已知的任何聚乙二醇化反應，可以完成MGDF的聚乙二醇化。參見例如Focus on Growth Factors 3(2)4-10(1992)；EP 0 154 316；EP 0 401 384；以及涉及聚乙二醇化的本文公開的其它文獻。優選的，用有反應性的聚乙二醇分子(或類似反應性的水溶性聚合物)經醯基化反應或烷基化反應完成聚乙二醇化。現在，更詳細地討論用聚乙二醇衍生的這些優選方法。醯基化通過醯基化的聚乙二醇化通常涉及聚乙二醇(PEG)的活性酯衍生物與MGDF蛋白質反應。可以用任何已知或隨後發現的反應性PEG分子完成MGDF的聚乙二醇化。優選的活化的PEG酯是進行N-羥琥珀醯亞胺(「NHS」)酯化的PEG。如本文所用的，「醯基化」非限定性地包括在MGDF和水溶性聚合物如PEG之間的下列類型的鍵醯胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯等。參見Bioconjugate Chem.5133-140(1994)。可以從聚乙二醇化領域已知的或隨後研製的任何反應條件中選擇反應條件，但是應避免使待修飾的MGDF失活的條件，例如，溫度、溶劑和pH。下文將討論通常使MGDF聚乙二醇化的反應條件。在圖14中描述了與單甲氧基PEG的NHS酯的舉例性反應。
經醯基化的聚乙二醇化通常會產生多-聚乙二醇化的MGDF產物，其中賴氨酸ε-氨基經醯基連接鍵而被聚乙二醇化。優選的，連接鍵是醯胺。優選的還有，所得的產物基本上只是(例如，＞＝95％)單，二，三-聚乙二醇化的。但是，依據所用的特定反應條件一般會形成一定數量的一些有較高聚乙二醇化程度(直到最大數目的MGDF Lysε-胺基酸基團加上一個在MGDF氨基末端的α-氨基)的種類，如果需要，用標準純化技術(包括透析、鹽析、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析和電泳)可以從混合物中分離更純的聚乙二醇化種類，特別是未反應的種類。烷基化通過烷基化的聚乙二醇化通常涉及在還原劑存在的條件下，PEG的末端醛衍生物與蛋白質例如MGDF的反應。與上述討論的醯基化一樣，反應條件描述如下。
經烷基化的聚乙二醇化也可以得到多-聚乙二醇化的MGDF。在圖15中列出了為得到多聚乙二醇化產物的舉例性的與MGDF的還原性烷基化反應。另外，人們可以控制本文的反應條件以有利於基本上只在MGDF-末端α-氨基上聚乙二醇化(即單聚乙二醇化種類)。在圖16中列出了舉例性的與MGDF的還原性烷基化反應，以得到單聚乙二醇化的產物。在單聚乙二醇化或多聚乙二醇化的情況下，PEG基團優選的經-CH2-NH-基與蛋白質相接。特別對於-CH2-基，本文將該類型的鍵稱為「烷基」鍵。
經還原性烷基化的衍生作用得到單聚乙二醇化的產物，它利用了MGDF衍生中不同類型一級氨基(Lys對N-末端)的不同反應性。反應在一定的pH(見下文)下完成的，所述的pH使人們可以利用Lys殘基的ε-氨基和蛋白質N-末端殘基的α-氨基之間pKa的差異。用所述的選擇性衍生作用，可以控制含有反應性基因(例如醛)的水溶性聚合物與蛋白質的連接與聚合物的共軛主要發生在蛋白質的N-末端，而對其它反應性基團(例如Lys側鏈氨基)沒有發生明顯的修飾。在一個重要的方面，本發明提供了基本上均質的單聚合物/MGDF蛋白質共軛物分子(意思是聚合物分子基本上僅在一個位置(即＞＝95％)連接的MGDF蛋白質)的製品。更具體地說，如果使用聚乙二醇，本發明還提供了可能缺乏抗原連接基團，但是具有與MGDF蛋白質直接結合的聚乙二醇分子的聚乙二醇化的MGDF蛋白質。
因此，在優選的方面，本發明涉及聚乙二醇化的MGDF，其中PEG基經醯基或烷基連接。按上述討論的，所述產物可以是單聚乙二醇化或多聚乙二醇化(例如，含有2-6，優選的2-5個PEG)的。通常在胺基酸的α或ε氨基位置上PEG與蛋白質相接，但是，PEG基也可以考慮與蛋白質上任何氨基相接，所述的氨基有足夠反應性以便在適宜的反應條件下與PEG基相接。
從水溶性聚合物或其混合物中，可以選擇在醯基化和烷基化方法中所用的聚合物分子。所選的聚合物應是水溶性的，以便它所相接的蛋白質在含水環境(例如生理環境)中不會沉澱。應修飾所選的聚合物以使其具有一個反應基團，例如適於醯基化的一個活性酯或適於烷基化的一個醛，優選地以便按本發明提供的方法控制聚合的程度。優選的反應性PEG醛是水溶性的聚乙二醇丙醛或其單C1-C10烷氧或芳氧基衍生物(見美國專利5,252,714)。聚合物可以是帶側鏈或不帶側鏈的。優選的，對於末端產物製品的治療用途來說，聚合物是藥物可接受的。水溶性聚合物可以選自例如，聚乙二醇、單甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧化乙烯化的多元醇(如，甘油)和聚乙烯醇。對於醯基化反應來說，所選的聚合物應有一個反應性酯基。對於本發明的還原性烷基化來說，所選的聚合物應有一個醛基。通常，不從天然存在的糖基殘基中選擇水溶性聚合物，原因在於，這些常常更常規地是由哺乳動物重組表達系統製備的。聚合物可以是任何分子量的，並且可以是帶側鏈或不帶側鏈的。
本發明所用的特別優選的水溶性聚合物是聚乙二醇，縮寫為PEG。如本文所用使的，聚乙二醇是包括用於衍生其它蛋白質的任何形式的PEG，例如，單-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。
如本文所使用的，MGDF包括本文所述的任何各種形式的MGDF。例如，全長或截斷的，糖基化的或非糖基化形式的MGDF均包括在內。下列是將被衍生的優選的MGDF分子(在每種情況下，數字指根據圖11的胺基酸編號)MGDF-1 胺基酸 22-353 圖11MGDF-2 胺基酸 22-195 圖11MGDF-4 胺基酸 22-172 圖11MGDF-11胺基酸 22-184 圖11MGDF-12胺基酸 27-353 圖11MGDF-13胺基酸 27-195 圖11MGDF-14胺基酸 27-172 圖11MGDF-15胺基酸 27-184 圖11上述優選的種類可以是糖基化的、非糖基化的或去糖基化的，優選是非糖基化的。可以用細菌(例如，E.coli)或哺乳動物(例如，CHO)細胞重組產生。
下列是本發明化學衍生化分子特別優選的一組(在每種情況下，它們是經醯基或烷基相接的單-或多-(例如，2-4個)PEG部分)
聚乙二醇化的MGDF-11聚乙二醇化的MGDF-4聚乙二醇化的MGDF-2。
通常，化學衍生作用可以在用於使生物活性物質與活化的聚合物分子反應的任何條件下完成。製備聚乙二醇化MGDF的方法通常包括步驟(a)在MGDF可與一個或多個PEG基相連的條件下，將MGDF多肽與聚乙二醇(例如，PEG的反應性酯或醛衍生物)反應，和(b)獲得反應產物。一般地說，以已知的參數和所需的結果為基礎，逐個確定醯基化反應的最佳反應條件。例如，PEG蛋白質比例越大，多聚乙二醇化產物的百分比越大。
生產基本上均質的單-聚合物/MGDF蛋白質共軛物分子群的還原性烷基化通常含有以下步驟(a)在還原烷基化條件下，在使所述MGDF蛋白質氨基末端的α-氨基選擇性修飾的pH下，將MGDF蛋白質與反應性PEG分子反應；和(b)得到反應產物。
對於基本上均質的單-聚合物/MGDF蛋白質共軛物分子群，還原性烷基化反應條件是使水溶性聚合物部分與MGDF之N-末端選擇性連接的條件。所述的反應條件通常給出Lys氨基和N-末端α-氨基之間的pKa差異(pKa是50％氨基質子化，50％未質子化的pH)。pH還影響聚合物與所用蛋白質的比例。通常，如果pH較低，就需要較大過量的聚合物∶蛋白質比(即，反應性N-末端α-氨基越少，為得到最佳條件所需的聚合物越多)。如果pH較高，聚合物∶蛋白質比就不需太大(即，反應性基團越多，所需的聚合物分子越少)。對於本發明的目的來說，pH一般在3-9，優選的3-6的範圍內。
另一重要的考慮是聚合物的分子量。通常，聚合物的分子量越大，可連接到蛋白質上的聚合物分子數越少。相似的，在優化這些參數時，應考慮聚合物的分支情況。一般地說，分子量越大(或分支越多)，聚合物∶蛋白質比例越高。總之，對於本文的聚乙二醇化反應來說，優選的平均分子量是約2kDa至約100kDa(術語「約」是指±1kDa)。優選的平均分子量是約2kDa到約50kDa，特別優選的是約12kDa到25kDa。水溶性聚合物與MGDF蛋白質的比例一般為1∶1到100∶1，優選的是(對於多聚乙二醇化來說1∶1到20∶1和(對於單聚乙二醇化來說)1∶1到5∶1。
使用上述條件，還原性烷基化將會使聚合物與任何在氨基末端有α-氨基的MGDF蛋白質選擇性相連，並且提供基本上均質的單聚合物/MGDF蛋白質共軛物製品。本文所用的術語「單聚合物/MGDF蛋白質共軛物」是指一種組合物，它含有一個與MGDF蛋白質分子相連的聚合物分子。單聚合物/MGDF蛋白質共軛物優選的在N-末端有一個聚合物分子，但在Lys氨基側基上沒有。該製品優選的有大於90％的單聚合物/MGDF蛋白質共軛物，更優選的為大於95％的單聚合物/MGDF蛋白質共軛物，其餘的是未反應的可觀察量的分子(即沒有聚合物部分的蛋白質)。下列實施例提供至少為約90％的單聚合物/MGDF蛋白質共軛物和約10％未反應的蛋白質的製品。單聚合物/MGDF蛋白質共軛物有生物活性。
對於本發明的還原性烷基化來說，還原劑在水溶液中應是穩定的，並且優選的是僅還原在還原性烷基化開始時形成的Schiff鹼。優選的還原劑可以選自硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、二甲胺甲硼烷、三甲胺甲硼烷和吡啶甲硼烷。特別優選的還原劑是氰基硼氫化鈉。
其它反應參數，如溶劑、反應時間、溫度等以及純化產物的方法可以基於公開的與蛋白質與水溶聚合物衍生有關的資料來逐個確定(參見本文引述的文獻)。在下列實施例部分，給出了詳細的舉證。
可以通過醯基化和/或烷基化方法來選擇製備聚合物/蛋白質共軛物，而且本文所提供的優點就是可以選擇在混合物中所含的單聚合物/蛋白質共軛物的比例。因此，如果需要，可以製備具有不同數目(即，二-，三-，四，等)的相連的聚合物分子的不同蛋白質的混合物，並且與用本發明的方法製備的單聚合物/蛋白質共軛物結合，而且有具有預定比例的單聚合物/蛋白質共軛物。
下文的實施例描述了經醯基化和烷基化的化學修飾的MGDF製品和聚乙二醇化的MGDF製品。因此，本發明的其它方面涉及這些製品。
通常，通過施用本發明的聚合物/MGDF可以減輕或調節的病症包括上述一般有關MGDF分子的那些病症。但是，本文公開的聚合物/MGDF分子與非衍生的分子相比，還可以有其它活性，提高的或降低的活性，或其它特徵。
本發明另一方面還提供了含有上述化學修飾的MGDF分子的藥物組合物。所述的藥物組合物可以含有有關非衍生MGDF分子的本文所述的任何成分。
隨著進一步的研究，會提供在不同患者中治療不同病症的適當劑量水平，而本領域專業人員根據治療內容，受者的年齡和一般健康情況可以確定適當的劑量。一般來說，劑量在0.01μg/kg體重(只計算蛋白質的質量，而不考慮化學修飾物)到300μg/kg(以相同的方法計算)之間。優選的劑量通常是5μg/kg體重到100μg/kg體重之間，特別優選的是10μg/kg體重到75μg/kg體重之間。
本發明還提供生產MGDF(即，Mpl配體)多肽或其活性片段的方法。本發明的方法之一涉及將編碼Mpl配體多肽的cDNA導入表達載體以得到Mpl配體的表達系統。用載體轉染所選的宿主細胞，然後培養。因此本發明的方法包括培養適宜的細胞或細胞系，所述的細胞或細胞系已用表達時編碼Mpl配體多肽的DNA序列轉染，所述的表達在已知調節序列的控制下。調節序列包括啟動子片段，終止子片段和在適當的宿主細胞中指導/控制蛋白質表達的其它適宜的序列。然後通過本領域專業人員熟知的適當方法從培養基(或細胞，如果是細胞內表達)中回收，分離並純化表達的因子。另外，也可以用US專利5,272,071中公開的方法得到本發明的聚核苷酸/多肽。
適宜的細胞或細胞系可以是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或3T3細胞。適宜哺乳動物宿主細胞的選擇、和轉化、培養、擴增、篩選以及產物產生和純化方法是本領域熟知的(參見例如，Gething and Sambrook，Nature 293620-625(1981)，或Kaufmanet al.，Mol.Cell.Biol.，5(7)1750-1759(1985)或Howley et al.，U.S.專利4,419,446)。其它適宜的哺乳動物細胞系是猴COS-1和COS-7細胞系和CV-1細胞系。其它的宿主細胞實例包括靈長目細胞系和嚙齒類細胞系，包括轉化的細胞系。正常的二倍體細胞，原始組織體外培養衍生的細胞株，以及原始移出物均是適宜的。候選細胞可以對於所選的基因是基因型缺陷的或可以含有顯性作用的選擇基因。其它適宜的哺乳動物細胞系包括但不限於HeLa、小鼠L-929細胞、得自Swiss，Balb-c或NIH小鼠的3T3細胞系，BHK或HaK倉鼠細胞系。
本發明中類似適用的宿主細胞是細菌細胞。例如，在生物技術領域作為宿主細胞已知的各種E.coli菌株(例如，HB101、DH5α、DH10和MC1061)。在該方法中也可以使用枯草芽孢桿菌，假單孢菌屬、其它桿菌屬、鏈球菌屬等的各種菌株。
也可以用本領域已知的許多酵母細胞菌株作為宿主表達本發明多肽。另外，如果需要，在本發明的方法中也可以使用昆蟲細胞作為宿主。(參見，Miller et al.，Genetic Engineering 8277-298(1986)和其中引述的參考文獻)。
本發明還提供用於表達新的Mpl配體多肽的方法中的重組分子或載體。這些載體含有Mpl配體DNA序列並且只含有該序列或該序列和編碼本發明Mpl配體多肽(帶或不帶信號肽)或其活性片段的其它序列的結合。另外，摻入上述修飾序列的載體也是本發明的實施方案，而且在生產Mpl配體多肽中是有用的。本發明方法所用的載體還含有與本發明DNA編碼序列有效結合的並且能夠指導其在所選的宿主細胞中複製並表達的所選的調節序列。
一種載體是pXM，特別適用於在COS細胞中表達(Y.C.Yang et al.，Cell 473-10(1986))。特別適於在哺乳動物細胞(例如，CHO細胞)中表達的另一載體是pEMC2B1。用本領域專業人員熟知的技術可以合成本文描述的哺乳動物細胞表達載體。用已知方法可以從天然來源得到或合成載體的組分(例如，複製子，選擇基因，增強子，啟動子等)。(參見Kaufman et al.，J.Mol.Biol.159511-521(1982)；和Kaufman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82689-693(1985))。另外，載體DNA可以包括全部或部分的牛乳頭病毒基因組(Lusky et al.，Cell 36391-401(1984))並在細胞系如C127小鼠細胞中作為穩定的附加基因元件複製。這些載體轉染到適宜的宿主細胞中後，就可以表達Mpl配體多肽。
也可以將本領域已知的用於哺乳動物、昆蟲、酵母、真菌和細菌表達的許多其它適宜的表達載體用於該目的。
用本發明方法和組合物治療的病症是出現巨核細胞/血小板缺乏或將來預期會巨核細胞/血小板缺乏(例如因計劃的手術)的那些病症。所述病症一般是體內活性Mpl配體缺乏(暫時性或永久性)的結果。血小板缺乏的一般術語是血小板減少症，因此本發明的方法和組合物一般用於治療血小板減少症。
血小板減少症(血小板缺乏)可以因各種原因而存在，包括化療和用各種藥物的治療、輻射治療、外科手術、偶然失血以及其它的特別疾病。與血小板減少症有關並且可以根據本發明進行治療的舉例性的具體疾病是再生障礙性貧血、突發性血小板減少症、導致血小板減少症的轉移瘤、全身的紅斑狼瘡、脾大、Fanconi氏綜合症、維生素B12缺乏症、葉酸缺乏症、May-Hegglin異常、Wiskott-Aldrich綜合症和陣發性夜間血紅蛋白尿。愛滋病的某些治療也會導致血小板缺乏症(例如，AZT)。某些傷口癒合紊亂也會因血小板數的增加而受益。
對於預期的血小板減少症，例如，由於未來的手術，可以在需要血小板的數天或數小時前施用本發明的Mpl配體。對於緊急情況，例如偶然並且大量的失血，可以與血液或純化的血小板一起施用Mpl配體。
如果發現某些細胞類型表達Mpl受體，則本發明的Mpl配體在刺激某些細胞類型而不是巨核細胞方面也會有用。本發明也包括與表達Mpl受體的所述細胞有關的病症，所述病症對Mpl配體的刺激敏感。
在本文所列的活性檢測中本身沒有活性的MGDF分子可以作為體外或體內Mpl受體的調節劑(例如抑制劑或刺激劑)。
在治療上述疾病時，可以將本發明的多肽單獨使用或與其它細胞因子、可溶的Mpl受體、造血因子、白細胞介素、生長因子或抗體結合使用。
因此，本發明的另一方面是用於治療上述病症的治療組合物。所述的組合物含有治療有效量的Mpl配體多肽或其治療有效量的其片段以及藥物學可接受的載體。載體物質可以是用於注射的水，優選的用溶液劑中常用的其它物質補充以施用於哺乳動物。典型的，以組合物的形式進行Mpl配體治療，所述的組合物含有純化的蛋白質和一種或多種藥物學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。中性的緩衝鹽或與血清白蛋白混合的鹽是適宜的載體實例。優選的，用適宜的賦形劑(例如，蔗糖)將產物配製成凍乾產品。按需要也可以包括其它的標準載體，稀釋劑和賦形劑。其它的舉例性組合物是Tris緩衝液(pH8.0)和乙酸鹽緩衝液(pH5.0)，在每種情況下還可以包括山梨醇。
可以不經腸道全身施用本發明組合物。另外，可以經靜脈內或皮下施用該組合物。當全身施用時，本發明所用的治療組合物可以是無熱源的，非腸道可接受的水溶液。適當考慮pH、等滲性、穩定性的所述藥物學可接受的蛋白質溶液的製備方法包括在現有技術之內。
在治療所述疾病時涉及的劑量範圍由主治醫生考慮改變藥物作用的各種情況(例如，患者的年齡，病症，體重，性別和飲食，感染的嚴重性，給藥的時間和其它臨床因素)來確定。通常，每天的範圍應在每公斤體重0.1-1000μg Mpl配體蛋白質或其片段。
在治療除了血小板缺乏外，還以其症狀為特徵的疾病時，可以將本發明的治療方法，組合物和多肽單獨使用或與其它細胞因子、可溶的Mpl受體、造血因子、白細胞介素、生長因子或抗體結合使用。預期Mpl配體分子與一般的造血刺激劑(例如 IL-3或GM-CSF)結合，在治療某些形式的血小板減少症時是有用的。其它巨核細胞刺激因子(即meg-CSF)、幹細胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)或有巨核細胞刺激活性的其它分子也可以與Mpl配體一起使用。用於所述共施用的舉例性細胞因子或造血因子包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子(CSF-1)、GM-CSF、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、α-幹擾素(IFN-α)、IFN-β或IFN-γ。還可以同時或依次施用有效量的可溶的哺乳動物Mpl受體，一旦巨核細胞達到成熟形式，所述的受體似乎可以使巨核細胞斷裂成血小板。因此，預期施用Mpl配體(以增加成熟巨核細胞的數目)，然後施用可溶的Mpl受體(以使配體失活，然後使成熟的巨核細胞生產血小板)是刺激血小板生成特別有效的方法。可以調整上述的劑量以補償治療組合物中的所述其它組分。用常規方法可以監測接受治療患者的改善情況。
這些新多肽的其它用途是研製通過標準方法產生的抗體。因此，也考慮了與本發明Mpl配體反應的抗體以及所述抗體的反應性片段。抗體可以是多克隆的、單克隆的、重組的、嵌合的、單鏈和/或雙特異性的等。抗體片段可以是對本發明Mpl配體有反應性的任何片段，例如，Fab、Fab′等。本發明還提供了雜交瘤，即通過已知技術，將Mpl配體或其片段作為抗原提供給所選的哺乳動物，然後將動物細胞(例如，脾細胞)與某些癌細胞融合以產生不死的細胞系，這些產生雜交瘤。本發明還包括用於產生所述細胞系的方法以及抗全部或部分人Mpl配體多肽的抗體。
抗體可用於治療，例如抑制Mpl配體與其受體的結合。還可以將所述抗體用於體內和體外診斷目的，例如用標記形式檢測體液中的Mpl配體。
用下列實施例更詳細地說明本發明。另外，這些實施例提供了本發明優選的實施方案，但不限定其範圍，除非特別說明。在下列實施例中所述許多過程中的標準方法或適宜的改變的方法在許多熟知的分子生物學手冊中均有，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987)和Ausubel et al.，(Eds)，Current Protocols in MolecularBiology，Greene associates/Wiley Interscience，New York(1990)。
實施例1營養不良的犬血漿按下列文獻，除給受試對象使用450拉德的全體輻射外，製備肝素化營養不良的犬血漿(「APK9」)或正常犬血漿(「NK9」)1 Mazur，E.and South，K.Exp.Hemato l.131164-1172(1985).2 Arriaga，M.，South，K.，Cohen，J.L.，and Mazur，E.M。Blood69486-492(1987)。3 Mazur，E.，Basilico，D.，Newton，J.L.Cohen，J.L.，Charland，C.Sohl，P.A.，and Narendran，A.Blood 761771-1782(1990).
實施例2人巨核細胞試驗試驗APK9和分離的APK9刺激來自CD34+祖代細胞之人巨核細胞發育的能力。按所述方法(Hokom，M.H.，Choi，E.，Nichol，J.L.，Hornnkohl，A.，Arakawa，T，and Hunt，P.Molecular Biology ofHaematopoiesis 315-31，1994)從外周血細胞中分離CD34-選擇的細胞，然後在下列培養基中培養用1％穀氨醯胺Pen-strep(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)和10％肝素化的貧血小板，人AB血漿補充的Isocove′s改性的Dulbecco′s培養基(IMDM；GIBCO，Grand Island，NY)。該培養基還包括2-巰基乙醇(10-4M)、丙酮酸(110μg/ml)、膽固醇(7.8μg/ml)、腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷、2-脫氧胞苷、2-脫氧腺苷、2-脫氧鳥苷(各10μg/ml，Sigma)；人重組胰島素(10μg/ml)、人轉鐵蛋白(300μg/ml)、大豆脂類(1％，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、人重組鹼性成纖維細胞生長因子(2ng/ml，Genzyme，Cambrdge，MA)；人重組表皮生長因子(15ng/ml)，血小板衍生的生長因子(10ng/ml，Amgen，Inc.，Thousnd Oaks，CA)。將CD34-選擇的細胞以2×105/ml培養基，終體積為15μl，放在Terasaki-型微滴定板(Vanguard，Inc.，Neprune，NJ)中。將細胞在保溼箱的5％二氧化碳氣中於37℃培養8天，用1％戊二醛直接固定在培養孔中，與單克隆抗體混合物(抗-GPIb，抗-GPIIb，(Biodesign)和抗-GPIb(Dako，Carpinteria，CA))一起溫育。用鏈黴抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶檢測系統(HistoMark，Kirkegaard and Perry)使免疫反應顯色。為藍色的巨核細胞以100X用反相顯微鏡計數。結果表示為每孔的巨核細胞數平均值+/-平均值的標準誤差(SEM)。在某種情況下，用「巨核細胞單位/ml」表示數據，將待測樣品誘導巨核細胞發育的程度表示為該實驗的陽性APK9對照。一個單位定義為與1μl APK9標準產生相同數目巨核細胞的物質的量。如果可用5-10ug/ml MPL-X(可溶的Mpl受體)阻斷Mpl配體，那麼活性被認可。
已經表明APK9含有在該系統中刺激人巨核細胞發育的因子。與10％NK9溫育8天的CD34-選擇細胞只有可忽略數量的藍色巨核細胞，而與10％APK9溫育8天的CD34-選擇細胞有大量藍色的巨核細胞。
圖2表明將濃度逐漸增加的MPl-X加到人巨核細胞培養系統中後，對巨核細胞發育的阻斷逐漸增加。Mpl-X濃度大於5μg/ml時，完全抑制。在該實驗中，用5％APK9刺激CD34-選擇細胞。這表明與Mpl-X(假設的Mpl配體)相互作用的活性對於人巨核細胞發育是必需的，而且意味著在APK9中存在Mpl配體。
本文還進一步指出，在APK9中存在對於人巨核細胞發育必需的Mpl配體活性。將APK9(135ml)在Iscove′s培養基中稀釋6倍，然後用於Mpl-X親和柱。收集未結合的物質(流出)，在檢測前，濃縮到原體積。用10ml 1M的NaCl洗脫結合的物質，透濾20％的收集物，濃縮4倍用於檢測。單獨在培養基中培養的CD34-選擇細胞並未發育成巨核細胞。在5％APK9(與用於柱的收集物相同)中溫育的細胞發育成每孔48+/-8巨核細胞。與10％未結合物質溫育的細胞未發育成巨核細胞。與10％洗脫收集物溫育的細胞發育成每孔120+/-44巨核細胞。在檢測中，用5μg/ml Mpl-X基本上完全抑制柱載樣和洗脫收集物的活性。
實施例3將鼠或人Mpl受體轉染到鼠細胞系中A 鼠Mpl受體將全長鼠Mpl受體cDNA亞克隆到含有轉錄啟動子的表達載體中，所述的啟動子得自Moloney鼠肉瘤病毒的LTR。將5μg的該構建體和1μg的選擇標記質粒pWLNeo(Stratagene)共電穿孔(co-electroporated)到IL-3依賴的鼠細胞系中(32D，克隆23；Greenberger et al.，PNAS 802931-2936(1983))。將細胞培養5天以從過程中回收，然後在含800ug/ml遺傳黴素(G418，Sigma)和1ng/ml鼠IL-3的選擇培養基中培養。將存活的細胞分成2×105細胞的池，然後培養直到長出可用於進一步分析的群體。用多克隆免抗肽血清通過FACS分析檢測6個群體Mpl受體的表面表達。選一個群體用與上述相同的抗肽血清進行FACS分類。通過在10％APK9和遺傳黴素中生長，篩選一個母本細胞系克隆。在APK9中篩選35天後，將細胞保持於1ng/ml鼠IL-3中。用一個亞克隆進行該部分的工作。B人Mpl受體將全長人Mpl受體序列(Vigon，I.，et al.，PNAS 895640-5644(1992))亞克隆到含有Moloney鼠肉瘤病毒啟動子的表達載體(與鼠受體的載體相同)中。用CaPO4哺乳動物轉染盒(Stratagene)將6μg該構建體和6μg的兩性反轉錄病毒包裝構建體(Landau，N.R.，Littman，D.R.，J.Virology 665110-5113(1992))轉染到3×106293細胞中。2天後，再轉染相同的細胞，4天後再轉染。最後一次轉染後的第二天，將293細胞與IL-3依賴的鼠細胞系(32D，克隆23；Greenberger et al.，PNAS 802931-2936(1983))共培養。24小時後，取出32D細胞，並在BSA梯度(Path-o-cyte；MilesInc.)上分帶。用1ng/ml鼠IL-3擴展細胞，然後在20％APK9中選擇生長。通過使用多克隆免抗肽血清的FACS根據細胞表面表達的受體將細胞分類。然後將這些細胞用於檢測。
實施例4Mpl配體的1A6.1試驗衝洗1A6.1細胞除去培養物中的IL-3，然後重鋪(1000細胞/15μl總體積/孔)在Terasaki型微滴定盤的αMEM(Gibco)中，所述的αMEM用10％胎牛血清(FCS)，遺傳黴素(800μg/ml)和1％青黴素/鏈黴素(Gibco)以試驗樣品的1∶1系列稀釋液補充。48小時後，經顯微鏡確定每孔的活細胞數。將1單位活性定義為可以使每孔產生200個活細胞的活性量。活性被定義為由Mpl配體產生的結果，如果它能被試驗中包含的5-10μg/ml Mpl-X完全阻斷。APK9中Mpl配體活性平均為4400+/-539單位/ml發育不良血清。除非有其它說明，Mpl配體活性單位由1A6.1試驗確定。
基本上按用1A6.1細胞相同的方法進行用人Mpl受體基因(實施例3B)轉染的細胞的試驗。
實施例5證明Mpl配體存在於小鼠，狗，豬和人源的發育不良的血漿或血清中Mpl配體存在於小鼠，狗，豬和人源的發育不良的血漿或血清中(表2)。從預輻射和輻射12天後(500拉德)的BDF小鼠中收集血漿。用1A6.1試驗測試血漿，試驗表現出2000單位/ml活性，該活性基本上可以由Mpl-X(10μg/ml)完全抑制。輻射後的小鼠血漿在人巨核細胞檢測中也是陽性的，其活性為1833單位/ml。從預輻射和輻射(450拉德)10天後的狗收集血漿。用1A6.1試驗和人巨核細胞試驗測試血漿。在這兩個試驗中均檢測到活性且由Mpl-X(10μg/ml)完全抑制。從預輻射和輻射(450拉德)10天後的豬收集血漿。用1A6.1試驗和人巨核細胞試驗測試血漿。與在發育不良犬血漿中所見到的相比，在這兩個試驗中均有Mpl配體活性(用10μg/ml Mpl-X可抑制)。獲得了發育不良的人的血清。從骨髓移植患者收集該物質。用1A6.1試驗檢測6個患者中獲得的血清，試驗表現出903單位/ml活性，其中88％是由Mpl配體產生的(用10μg/ml Mpl-X可抑制)。再用人巨核細胞試驗測試14個發育不良患者的血清。作為一組，它們有用10μg/ml Mpl-X可完全抑制的基本活性，941巨核細胞單位/ml，包括鼠IL-3資料以說明1A6.1檢測的特異性。儘管重組細胞因子誘導細胞系的生長，但不會被10μg/ml Mpl-X抑制。
表2種 1A6.1細胞試驗(單位/ml) 人巨核細胞試驗(巨核細胞單位/ml)介質 +Mpl-X 介質 +Mpl-X正常小鼠 0+/-0 0+/-0 0+/-00+/-0發育不良小鼠 2000 0 1833 未做正常犬0+/-0 0+/-0 0+/-00+/-0發育不良犬4400+/-539 0+/-0 792+/-1280+/-0正常豬0+/-0 0+/-0 0+/-00+/-1發育不良豬3866+/-11360+/-0 1284+/-182 10+/-10正常人0+/-0 0+/-0 0+/-00+/-0發育不良人903+/-64 114+/-33941+/-1780+/-0鼠IL3 6000+/-565 6000+/-565未做 未做實施例6Mpl配體刺激1A6.1細胞生長和人巨核細胞發育Mpl配體(外源凝集素和親和層析後富集至少約100,000倍；見實施例7)以劑量依賴方式刺激1A6.1細胞系的生長和人巨核細胞的發育，所述的巨核細胞來自CD34選擇的外周血細胞。由於在這兩個試驗中Mpl-X完全阻斷活性，如圖2和3所示，活性歸因於Mpl配體。
本發明人已經表明，在Mpl配體(在這種情況下，100單位/ml，9天)中培養時，FACS純化的外周血細胞CD34+細胞可以發育成表型正常的成熟巨核細胞。這證實純化的Mpl配體對巨核細胞具有和對天然APK9相同的作用。而且，本實驗使用與CD34-選擇的細胞(一般僅含30-50％CD34+)不同的純化的CD34+細胞(100％CD34+)。
實施例7純化犬Mpl配體I.概述純化對Mpl受體表現出預測之配體活性的蛋白質(25kd和31kd)。用小麥精凝集素(WGA)親和層析，Mpl受體親和層析，陰離子交換層析，凝膠過濾層析和C4反相HPLC，從被輻射狗的血漿中純化所述蛋白質。見圖4有關該純化過程的圖示。已將25kd和31kd Mpl配體高度純化達到明顯的均質性，而且已確定其含有本文公開的胺基酸序列。II.方法A.澄清血清於4℃將來自被輻射狗(見實施例1)的凍血漿(共20升)過夜解凍；在置於冷室之前，將較大的瓶子在室溫解凍數小時。以11,000xg離心6小時，除去不溶的物質。用含0.01％疊氮化鈉的磷酸鹽緩衝鹽水，pH7.3(PBS/疊氮化物)稀釋血漿，然後通過1.2μm濾器過濾。澄清過程主要是使起始物質稀釋約2倍。
B.小麥精凝集素親和層析所有的操作均於4℃完成。將澄清的血漿(分兩批)用於用PBS/疊氮化物平衡的固定的小麥精凝集素柱(1升，10×12cm，EYLaboratories)。上樣後，用PBS/疊氮化物從柱上洗掉未結合的物質，然後，用20mM Tris-HCl(pH8)中的0.5M NaCl洗滌。用0.35MN-乙醯氨基葡糖(GlcNAc)，0.5MNaCl，20mM Tris-HCl，pH8洗脫由WGA柱結合的Mpl配體活性物。在洗出物或洗滌組分中檢測不到Mpl配體活性。
C.Mpl受體親和層析使用可溶的鼠Mpl受體(Mpl-X)，它相當於Mpl受體的全部細胞外區減去位置483上的Trp(見Vigon，et al，82607-2615(1993))。為了優化Mpl配體與Mpl-X受體親和柱的結合，用膜超濾器(10,000分子量截斷，YM-10，Amicon)和由隨後的稀釋液調整到0.2M的NaCl濃縮WGA洗脫池。將濃縮的WGA池以0.9ml/分的洗速用於20ml m-Mpl-X(鼠Mpl可溶受體)/CNBr活化的瓊脂糖凝膠柱(2.6×4.2cm，1.5mg m-Mpl-X/ml樹脂)。用40ml PBS/疊氮化物以1.5ml/分洗滌該柱，然後用10mM Tris-HCl，1MNaCl，1mM CHAPS，pH8.0進行高鹽洗滌(405ml)。然後用20mM CAPS，1M NaCl，5mM CHAPS，pH10.5洗脫該柱。收集適宜的組分，將Tris加至各組分中以中和pH。
Mpl-X受體親和柱洗脫圖的SDS-PAGE和在280nm的吸收值表明，較早的蛋白質峰在組分1-4，而在組分5後洗脫出主要的Mpl配體活性。
D.單-O陰離子交換層析將來自數個Mpl-X受體親和柱的純度最高的組分收集在一起，將其濃縮，然後對20mM Tris-HCl，5mM CHAPS，pH8.7透濾以達到58.5ml的終體積。用在280nm的吸收值估測該池的蛋白質濃度為0.12mg/ml(共約7mg蛋白質)。將該池以0.5ml/分上樣於用20mMTris-HCl，5mM CHAPS，pH8.7平衡的Mono Q HR 5/5柱(Pharmacia)。用在27分鐘內使在相同緩衝液中的NaCl達0.36M的線性梯度洗脫該柱。然後用6分鐘達0.54M NaCl的梯度洗滌該柱，最後用0.9M NaCl洗滌。收集1ml組分。
Mono Q柱的洗脫圖表明，在洗出物和洗滌組分中，沒有檢測到Mpl配體，但有可忽略不計的蛋白質。大部分Mpl配體活性在組分5-7中，處於NaCl梯度的開始階段。在組分8-10觀察到「肩部」活性，然後在組分11-15中又觀察到第二個主峰。
在活性組分中，用SDS-PAGE(非還原)觀察到明顯的25kd帶。該帶的密度直接與組分中的Mpl配體活性相對應。在組分3和4中沒有該帶(沒有活性)。在組分5和6中明顯(1A6.1活性峰)。而在組分11-14有相似的、厚染色帶(1A6.1活性峰)。在組分15和16的池中，該帶很淡，這與在組分16中活性明顯很低相一致。
E.凝膠洗脫實驗用Mono Q組分5和6或Mono Q組分13和14的等分樣品進行凝膠洗脫實驗。為了完成這些實驗，製成組分5和6(各6μl)或13和14(各7.5μl)的池，與SDS-PAGE樣品緩衝液(非還原的)混合，然後用於12％SDS凝膠。完成電泳後，切下所需的帶(1mm)，然後用剃刀鋒將切下的帶切成小片。將小片轉移到1.5ml含0.5ml PBS/5mM CHAPS的微離心管中，於4℃緩慢攪拌過夜。第二天離心試管，取出一份，將樣品對用BSA為載體蛋白補充的Iscove′s培養基透濾。用透濾的樣品進行檢測。
結果表明可以觀察到Mpl配體活性的兩個峰。一個峰相當於凝膠的25kd區，而第二個Mpl配體活性峰在31kd區。
F.Superdex 200凝膠過濾將來自Mono Q陰離子交換柱組分13-16和來自第二個Mono Q分級分離的兩個等同組分混合在一起，然後用膜超濾裝置(Centricon-10，Amicon)濃縮。加入SDS達到0.1％的終濃度，將樣品注射到Superdex 200 HR 10/30(Pharmacia)柱上。用50mM Tris-HCl，0.1％SDS，pH7.5以0.3ml/分的流速平衡該柱，然後於室溫下操作。1分鐘收集一次組分。結果表明樣品中的大多數蛋白質洗脫到組分32-40中，而Mpl配體活性是在組分42-46中檢測到的。分析組分SDS-PAGE表明，在活性組分中有明顯的25kd帶。
G.C4反相HPLC用一膜超濾器(Microcon-10，Amicon)濃縮合在一起的Superdex200組分43-46或僅僅組分42。將濃縮的池分別用於1×100mm C4反相微孔柱(SynChropak RP-4)。用0.04％TFA水溶液(A緩衝液)平衡該柱；B緩衝液是在80％乙腈中的0.035％TFA。注射樣品後，在4分鐘內完成到45％的線性梯度，然後在40分鐘完成到75％的線性梯度。流速是75μl/分。在圖5中列出了組分42的純化結果。在組分21-23中有明顯的Mpl配體活性。在非還原和還原條件下，在14％聚丙烯醯胺凝膠上分析這些組分。組分21含有一個31kd帶；組分23含有一個寬25kd帶；而組分22在25kd和31kd區均含帶。值得注意的是較早的凝膠洗脫實驗已表明這些區均有Mpl配體活性。在非還原凝膠的所有組分中，均有一個小的高分子量帶，但在還原凝膠中沒有。
H.25kd和31kd Mpl配體的N-末端序列分析對含有活性的C4-HPLC組分完成N-末端序列分析。上述報導了確定的這些蛋白質的序列。除相當於25kd帶的主要序列(至少佔總樣品的90％)外，定序檢測兩個小序列(與上述部分G中描述的小汙染帶有關)。與已知序列的比較表明小序列是犬Ig重鏈和kappa鏈。如果需要，用另一純化步驟，例如優選的另一凝膠過濾步驟進一步大量還原這些微小雜質。
I.比較在C4純化組分中的Mpl配體活性圖6表示的數據說明在來自C4 RP-HPLC層析步驟的組分22和23中的活性基本上是相同的。組分22含有25和31kd帶的混合物，而組分23隻含有25kd帶。將每一組分的等分樣品稀釋1∶45000。稀釋的組分對1A6.1細胞生長的刺激作用基本相同(組分22，5400細胞/孔；組分23，6000細胞/孔)。將稀釋的組分與濃度逐漸增加Mpl-X溫育。所述的組分對Mpl-X抑制的敏感性基本相同.並且用7-1.4μg/ml均可完全抑制。這表明在各組分中的活性蛋白質是具有相同生物活性的Mpl配體。
實施例8比較Mpl配體與其它因子對巨核細胞發育的作用已報導許多重組因子或有機化合物如佛波醇肉豆蔻乙酸酯(PMA)都能影響巨核細胞生長或發育。因此，要研究這些因子對CD34-選擇外周血細胞的作用。按說明將人重組白細胞介素3(IL-3，1-2ng/ml)、幹細胞因子(SCF，50ng/ml)、白細胞介素6(IL-6，25ng/ml)、促紅細胞生成素(EPO，1單位/ml)、白血病抑制因子(LIF，10ng/ml)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，25ng/ml，Amgen，Inc.)、白細胞介素11(IL-11，25ng/ml，R+D Systems，Minneapolis，MN)；佛波醇肉豆蔻乙酸酯(PMA，10-10M，Sigma)加到培養基中。所用的Mpl配體為275單位/ml，APK9為5％(相當於220單位/m1)。合起來檢測時所用因子的濃度與單個檢測時所用的相同。培養8天後，將細胞直接固定在孔中，對巨核細胞染色(每種條件下，n＝6孔)，或計數總細胞數(每種條件下，n＝3孔)。數據以平均值+/-SEM表示。
圖7表示APK9和Mpl配體導致每孔達到最大的巨核細胞數。IL-3也會影響巨核細胞發育，特別是與SCF合用時。IL-6、IL-11或EPO單獨或與IL-3合用時，對巨核細胞數沒什麼影響。PMA、LIF和GM-CSF也沒什麼影響。圖8中的數據來自相同的實驗，表明每孔中所發現的總細胞數(「細胞構成」)。APK9和Mpl配體對細胞構成沒什麼影響，而IL-3和SCF影響適中。SCF與IL-3合用時影響最大。用圖7和8中所列的數據計算每孔中巨核細胞的百分比，如圖9所列。顯然，使每培養孔中巨核細胞百分比最大的因子是Mpl配體，APK9中的活性成分。這說明了Mpl配體對巨核細胞的特異性。
實施例9Mpl配體的巨核細胞促進活性與人IL-3無關當用作實施例2所述培養基的補充物時，Mpl配體刺激人巨核細胞的發育。儘管IL-3不是培養基的組分，但在培養基中的正常人血漿中，它以不可檢測的低水平存在。然而，即使存在，IL-3也與Mpl配體-誘導的巨核細胞生成無關。圖10對此作了說明。在14,900巨核細胞單位/ml的人巨核細胞檢測中，2ng/ml的IL-3有活性。用抗-IL-3(3.3μg/ml；Genzyme，Cambridge，MA)抑制了97％的該活性。用抗-IL-3不能抑制8203meg單位/ml的Mpl配體。
實施例10分析豬Mpl配體I.概述用WGA親和層析、Mpl受體親和層析、離子交換層析和C4反相HPLC表徵來自輻射豬血漿之有Mpl配體活性的蛋白質。通過從SDS-聚丙烯醯胺凝膠切片中洗脫，也可以表徵該活性。
層析柱 評註WGA親和柱用4.4×106單位回收3.4×106單位Mpl受體柱用2.7×106單位回收2.4×106單位Mono S離子交換 用2.4×106單位pH6.0 回收4.4×106單位C4反相HPLC 回收組分23-25的活性凝膠洗脫實驗 兩種活性明顯不同，一種在約18kd，另一種在約28kd。
實施例11克隆/人Mpl-配體，人MGDF下面列舉了兩種方法I.第一種克隆方法A.產生人MGDF探針以犬蛋白質的氨基末端序列為基礎，設計多種簡併PCR引物。用不同的引物對以擴增來自人基因組DNA的MGDF基因。使用意義引物5′GCN CCN CCN GCN TGY GA 3′(SEQ ID NO4)(編碼犬蛋白質(SEQ ID NO1)的前5個胺基酸)和反義引物5′GCA RTG YAACAC RTG NGA RTC 3′(SEQ ID NO5)(編碼SEQ ID NO1的16-21胺基酸)擴增40個循環後，使PCR產物在TBE緩衝液的2.0％瓊脂糖上展開。
從瓊脂糖凝膠上切下63bp帶，用相同的引物再擴增。將PCR產物克隆在PCR II載體(Invitrogen，San Diego)中。用DNA定序篩選不同的菌落。以編碼與犬MGDF蛋白質相似之肽的質粒DNA用作產生放射性探針以篩選cDNA文庫的源。由基因片數編碼的AA序列如下Ala-Pro-Pro-A1a-Cys-Asp-Leu-Arg-Va1-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Va1-Leu-His(SEQ ID NO6)用含人MGDF的瓊脂糖帶經熱PCR產生探針。100μl典型的PCR反應含下列組成；模板DNA 2-3μl5′引物(SEQ ID NO4)1μl，20pmoles3′引物(SEQ ID NO5)1μl，20pmoles
10×緩衝液 10μldATP(0.1mM) 2μldGTP(10mM) 2μldCTP(0.1mM) 2μldCTP，p32(10uc/μl)5μldATP，p32(10uc/μl)5μlTaq DNA聚合酶 0.5μl，2.5單位水 77μl總體積 100μl擴增條件如下開始加熱94℃2分退火53℃30秒延伸72℃30秒變性94℃30秒用Perkin Elmer GeneAmp System 9600擴增40個循環。
通過推進柱(push column)(Stratagene，San Diego)純化產物。用閃爍計數器計數1μl探針。將含1-3百萬計數/ml的探針加到雜交混合物中。B.構建胎肝文庫從Clontech實驗室購買人胎肝polyA+RNA。用約4μg的RNA進行cDNA合成，其中用隨機六聚物5′GTA CGC GTT CTA GAN NNN NNT 3′(SEQ ID NO7)引發，該六聚物與一含Xba I位點的寡聚物相連。
用Gibco-BRL方法產生雙鏈cDNA。將Eco RI-Bst XI銜接物(Invitrogen，San Diego)與雙鏈cDNA相連，然後用限制酶Xba I消化。在S500 Sephacryl柱(Life Technologies，Inc.)上按大小選擇cDNA。將大於400bp的cDNA與已用EcoRI和Xba I消化的哺乳動物表達載體v19.8(Martin，F.，Cell 63203-211)(1990))相連。轉化感受態細胞，將所得的cDNA文庫分成7個各100,000 cDNA的池。C.篩選入文庫從Clontech購買在λgt 11中的人胎腎文庫，滴定度為650百萬pfu/ml。用經PCR產生的探針(見上文)篩選約2百萬噬菌斑。於56℃在6×SSC，5×Denhardt，0.1％SDS，100μg/ml單鏈鮭精DNA中雜交，15小時。
篩選多輪。從單個噬菌斑擴增DNA，然後與編碼SEQ ID NO6胺基酸7到13的內引物5′AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3′(SEQID NO8)雜交以鑑定真陽性。D.cDNA末端的3引物快速擴增從Clontech購買來自人胎腎和胎肝的聚腺苷酸化的RNA。用寡核苷酸5′TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3′(ESQ IDNO9)作為引物反轉錄1μg RNA。
用Gibco-BRL cDNA合成盒(Life Technologies.Ine.，Cat.#18267-013)得到第一條cDNA鏈。終體積為30μl。加入500mMEDTA達到10mM的終濃度，從而終止反應並保持於-20℃。
為了開始RCR，每個反應用0.5μl cDNA作為模板。用引物SEQ IDNO9和競爭寡核苷酸5′TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTTTT-P 3′(SEQ ID NO10)作為反義引物，用編碼SEQ ID NO6之胺基酸5到11的寡核苷酸5′TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3′(SEQID NO11)作為意義引物。於94℃溫育2分鐘後，用下列過程擴增40個循環94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 30秒，用Perkin ElmerGeneAmp System 9600擴增。
用編碼SEQ ID NO6之胺基酸8到14的有義引物5′GAG TCC TCAGTA AAC TGC TTC GT 3′(SEQ ID NO12)完成嵌套。而用SEQ IDNO9和SEQ ID NO10作為反義引物。擴增40個循環，於65℃退火。使PCR產物在0.8％瓊脂糖凝膠上展開，然後在UV光下攝影。可看見在0.8到1.2kb周圍的帶。
然後將PCR產物克隆在載體PCR II(Invitrogen)中。撿出單個菌落，用Qiagen盒Cat # 12143和12145分離噬菌體。用載體引物進行雙鏈染料引發的定序。用各種類型的GCG軟體分析序列。E.5′和3′引物延伸為了分離全長MGDF基因序列，用不同的胎肝文庫池作為模板進行3′和5′引物延伸。為了擴增cDNA的5引物，用約20ng的各池cDNA作模板。使用編碼SEQ ID NO6胺基酸12到17的MGDF特異性反義引物5′GGA GTC ACG AAG CAG TTT AC 3′(SEQ ID NO13)和5′載體v19.8有義引物5′CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3′(SEQ ID NO14)。擴增30個循環，於53℃退火。用編碼SEQ ID NO6之胺基酸1到6的反義引物5′GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3′(SEQ ID NO15)和載體引物SEQ ID NO14嵌套30個循環。
為了引物擴增MGDF cDNA的3′末端，使用反義載體引物5′GGCATA GTC CGG GAC GTC G 3′(SEQ ID NO16)和編碼SEQ ID NO6之胺基酸1到6的MGDF特異性引物5′TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3′(SEQ ID NO17)。擴增30個循環，於58℃退火。
用MGDF引物SEQ ID NO12和載體引物SEQ IDNO16嵌套擴增30個循環。在1、7和8號池中有特定的帶，將克隆在PCR II載體中。純化並定序來自單個菌落的純化質粒DNA。F.分離人MGDF的全長克隆由於是用部分MGDF序列引發和嵌套，因此許多開始的克隆缺少氨基末端部分的MGDF。用從上述5引物延伸實驗得到的引物5′CCA GGAAGG ATT CAG GGG A 3′(SEQ ID NO18)作有義引物。載體引物SEQID NO16作反義引物。擴增35個循環，於58℃退火。用含Sal I位點的MGDF特異性引物5′CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3′(SEQ ID NO19)和載體引物(SEQ ID NO15)嵌套30個循環。將PCR產物克隆在PCR II載體中並測序。II.第二種克隆方法A.克隆犬MGDF N-末端cDNA以前述的犬MGDF N-末端胺基酸序列為基礎，設計簡併的寡核苷酸引物並用其在聚合酶鏈反應(PCR)中作引物擴增MGDF-編碼cDNA序列。用Chomzynski和Sacchi的異硫氰酸胍法(Biochem.162156-159(1987))從犬腎樣品製備總RNA。使用MOMULV反轉錄酶，隨機引物-銜接物5′GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNN NNT 3′(SEQID NO20)製備第一條cDNA鏈，然後在隨後的PCR中用其作模板。
對0.5μl，約50ng cDNA，用引物A 5′GCN CCN CCN GCN TGYGA 3′(SEQ ID NO4)(編碼SEQ ID NO1之胺基酸1-6的有義鏈引物)和引物B 5′GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3′(SEQ IDNO5)或引物C 5′GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3′(SEQ IDNO21)完成PCR，所述引物B或C是反義鏈引物，編碼在5′末端有3個額外核苷酸之SEQ ID NO1的胺基酸16-21，所述的額外核苷酸可提高退火的穩定性。用Taq聚合酶完成35到45個循環的PCR，直到瓊脂糖凝膠電泳分析上有明顯的產物帶。對於最初兩個循環的PCR，於37℃進行2分鐘的再退火步驟；其餘的循環是於50℃再退火1分鐘。在每個反應中均觀察到多產物帶。用巴斯德吸管的端部收集含有約為預期大小(66bp)的凝膠部分，然後再用相同的引物對進行擴增。按製造商的說明將DNA產物克隆到載體PCR II(Invitrogen)中。對三個克隆進行測序，發現一個編碼閱讀框架，一個編碼預期的犬MGDF序列，一個是殘基1-21。用該方法得到了唯一的犬MGDFcDNA序列，含有密碼子6的第3個核苷酸到密碼子15的第3個核苷酸之區域。用這些克隆之一作模板製備標記的犬MGDF cDNA探針。B.從人胎肝構建cDNA文庫通過將組織溶解於5.5M硫氰酸胍，然後經CsTFA(Pharmacia)離心純化從人胎肝(International Institute for the Advancementof Medicine，Exton，PA)分離RNA。用寡核苷酸(dT)25 dynabeads(Dyna l，按製造商的說明)篩選多腺苷酸的RNA。除使用不同的接頭銜接物5′TTG GTG TGC ACT TGT G 3′(SEQ ID NO22)和5′CACAAG TGC ACA CCA ACC CC 3′(SEQ ID NO23)外，用於cDNA合成的Superscript質粒系統(Life Technologies，Inc.)從該RNA生產雙鏈cDNA。按大小選擇後，將該cDNA直接插入哺乳動物表達載體pBCB(pBCB得自質粒Rc/CMV，Invitrogen，含有puc 19骨架，CMV啟動子和BGH多腺苷酸位點)的Bst XI和Not I位點。將連接的DNA電穿孔到電感受態細菌菌株10 B(Life Technologies，Inc.，)中。C.篩選MGDF的人胎肝cDNA文庫將人胎肝文庫濾膜複製物與放射性標記的犬MGDF N-末端cDNAPCR產物於64℃雜交18小時(5x SSPE，2x Denhardt′s，0.05％焦磷酸鈉，0.5％ SDS，100μg/ml酵母tRNA溶解產物和100μg/ml變性的鮭精DNA)。於64℃用5x SSPE，0.5％ SDS衝洗濾膜，然後暴露過夜。分離與該探針雜交的兩個不同的克隆，然後分析。D.表達人MGDF cDNA克隆將從MGDF cDNA克隆純化的DNA轉染到293 EBNA細胞(Invitrogen)中。在100μl無DMEM的血清中，將1.5μg DNA與7.5μl Lipofectamine(Life Technologies，Inc.，)混合。於室溫溫育20分鐘後，將DNA-Lipofectamine混合物加到400μl DMEM，1％血清(Fetal CloneII)中的5×105細胞/孔(每平方Greiner盤24孔)中，然後於37℃溫育6小時。將500μl DMEM，20％血清(Fetal Clone II)加到細胞中。將培養基抽吸16小時後，加入500μl DMEM，1％血清(FetalClone II)。72小時後，收集條件培養基，通過0.22μm旋轉濾器離心。分析條件培養基的MGDF生物活性。III.人MGDF克隆的描述和活性以上述的克隆策略為基礎，得到圖11(MGDF-1和MGDF-2SEQ ID NO24、25和26、27)和圖12(MGDF-3；SEQ ID NO28、29)中所示的人cDNA克隆。圖中的每個序列均含有推測的信號序列胺基酸1-21，因此，在每種情況下，成熟蛋白質均從胺基酸21開始。
在下列表3和4列出了用MGDF1-3進行上述實施例4A的細胞-為基礎之試驗而得出的活性試驗的結果。在表3中，培養2天後，收集用各構建體轉染之293 EBNA細胞的條件培養基，然後對1A.61細胞(32D/鼠-MPL+)+/-10μg/ml鼠-MPL-X進行試驗。在表4中，培養4天後，收集用各構建體轉染之293 EBNA細胞的條件培養基，然後對32D/鼠-MPL+細胞(實施例3A)和32/人-MPL+細胞(實施例3B)進行檢測。正如可以看到的，發現人MGDF-1和MGDF-2，而不是MGDF-3對表達鼠和人Mpl形式的細胞有活性。表達人MPL受體的細胞系對人MGDF-1和MGDF-2的反應比表達鼠Mpl受體的細胞系更強烈。
表3U/ml U/ml克隆(-鼠-MPL-X)(+鼠-MPL-X)培養基0 0PBCO(對照質粒)0 0MGDF-112,800 800MGDF-1(重複) 12,800 566MGDF-24525 400MGDF-2(重複) 12800 1131MGDF-30 0MGDF-3(重複) 0 0APK9對照 4400+/-400 0表4U/ml U/ml克隆32D/鼠-MPL+ 32D/人-MPL+MGDF-1 1600 25,600MGDF-2 6400 50,000MGDF-2(重複)6400 50,000-100,000下列表5表明可溶的人mpl受體(人-MPL-X)基本上完全抑制人MGDF-1和MGDF-2對32D/人-MPL+細胞(實施例3B)的活性。人-MPL-X以產生蛋白質之CHO細胞收集的條件培養基存在。將CHO人-MPL-X條件培養基濃縮120倍，然後以6.6％加到培養基中。來自對照CHO培養基的條件培養基對檢測沒有影響。除3天後估測活細胞外，按實施例4B所述進行檢測。
表5U/ml U/ml克隆 (-人-MPL-X) (+人-MPL-X)MGDF-1 530 0MGDF-2 270 0人巨核細胞檢測MGDF-1和MGDF-2而不是MGDF-3誘導來自外周血CD34選擇細胞之巨核細胞的形成。除外周血細胞是CD34一選擇的而不是分選的，而且在7天後收集培養物外，基本按實施例2中所述完成表6中的實驗。以20％終體積+/-30μg/ml鼠-MPL-X使用來自各293 EBNAMGDF構建體的條件培養基，以6％終體積使用APK9對照。
表6巨核細胞/孔 巨核細胞/孔克隆(-鼠-MPL-X)(+鼠-MPL-X)載體 00對照APK9 100+/-3 0對照MGDF-1 142+/-48 17+/-2MGDF-2 100+/-3 6+/-2MGDF-2 86+/-10 0重複MGDF-3 2+/-20
實施例12下列實施例描述合成12種不同的聚乙二醇化的MGDF分子，PEG9-PEG 12和PEG 14-PEG 21。在每種情況下，聚乙二醇化的MGDF分子是E.coli衍生的MGDF-11(胺基酸22-184，從信號肽的開始編號或胺基酸1-163，從成熟蛋白質的開始編號)。在下列表7-10中詳細總結了所有的聚乙二醇化種類。1 2.1 通過用活化的MePEG衍生物使MGDF醯基化製備聚-MePEG-MGDF共軛物製備聚-MePEG(20 KDa)-MGDF共軛物(PEG 11)將在0.1M BICINE緩衝液，pH8中的冷(4℃)MGDF(2.5mg/ml)加到過量10倍摩爾的固體MePEG丙酸琥珀醯亞胺酯(succinimidylpropionate)(MW 20 KDa)(Shearwater Polymers，Inc.)中。緩慢攪拌溶解聚合物，於室溫進一步完成反應。
通過使用Superdex 200 HR 10/30柱(Phamacia Biotech)的大小排阻(SEC)HPLC，用0.1M磷酸鈉緩衝液pH6.9以0.7ml/分洗脫來監測反應過程中蛋白質的修飾程度。
在30分鐘時，由SEC HPLC分析反應混合物表明在反應混合物中，沒有游離的蛋白質。此時，通過加入無菌水而使反應混合物中蛋白質濃度降到1mg/ml，加入數滴0.5M乙酸使混合物的pH調整到4。
由使用SP Sepharose HP(Pharmacia，Biotech)離子交換樹脂的離子交換層析從過量的MePEG和其它反應副產品中分離MePEG-MGDF共軛物。
將反應混合物上樣(2.5mg/ml樹脂)到柱上。用3倍柱體積的起始緩衝液A(20mM磷酸鈉，pH7.2，15％甘油)洗脫未反應的MePEG。其後，用在10倍體積終止緩衝液B(在緩衝液A中的1MNaCl)中的0％到30％之線性梯度洗脫MePEG-MGDF共軛物。在280nm監測洗脫物。收集含聚-MePEG-MGDF共軛物的組分，然後濃縮並無菌過濾。
用依次結合的TSK-GEL G4000SWXL和G2000SWXL凝膠過濾柱，經HPLC分析純化的聚-MePEG-MGDF共軛物。用280nm的UV吸收值檢測蛋白質。BIO-RAD凝膠過濾標準作為球蛋白分子量標記物。
正如圖17A中所見到的，HPLC SEC表明在製備中兩個主要組分(約2∶1)的洗脫位置分另相當於370.9KDa和155.0KDa球蛋白的。見下列表8。
類似地，用MW＝6-50KDa MePEG的琥珀醯亞胺酯使MGDF醯基化而製備共軛物PEG 9，PEG 10和PEG 12。表7歸納了在這些製備中所用的主要反應參數。
表8列出了這些共軛物的HPLC SEC分析結果。12.2 通過用MePEG醛使MGDF還原性烷基化而製備聚-MePEG-MGDF共軛物製備聚-MePEG(20 KDa)-MGDF共軛物(PEG 20)向含20mM NaCNBH3的100mM磷酸鈉pH5中冷(4℃)攪拌的MGDF溶液(2ml，2.5mg/ml)中加入過量10倍摩爾的單甲氧基-聚乙二醇醛(平均分子量20KDa)，於相同的溫度下繼續攪拌反應混合物。
通過使用Superdex 200 HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)，用0.1M磷酸鈉緩衝液pH6.9以0.7ml/分洗脫的SEC HPLC來監測反應過程中蛋白質的修飾程度。
16小時後，SEC HPLC分析表明，已被修飾的蛋白質佔開始量的90％以上，此時，用無菌水稀釋反應混合物而使反應混合物中蛋白質的濃度達1mg/ml，pH調整到4(0.5M乙酸)。
通過使用SP Sepharose HP(Pharmacia Biotech)離子交換樹脂的離子交換層，從過量的MePEG和其它反應副產品中分離MePEG-MGDF共軛物。
將反應混合物上樣(2.5mg/ml樹脂)於柱上，然後用3倍體積的起始緩衝液A(20mM，磷酸鈉，pH7.2，15％甘油)洗脫未反應的MePEG。此後，用在10倍柱體積之終止緩衝液B(在緩衝液A中的1MNaCl)中0％到30％的線性梯度洗脫MePEG-MGDF共軛物。於280nm監測洗脫物。收集含聚-MePEG-MGDF的組分，然後將其濃縮並無菌過濾。
使用依次結合之TSK-GEL G4000SWXL和G2000SWXL凝膠過濾柱的HPLC SEC分析純化的聚-MePEG-MGDF共軛物。用280nm的UV吸收值檢測蛋白質。BIORAD凝膠過濾標準作球蛋白分子量標記物。
正如圖17B中看到的，HPLC SEC表明在製備中，兩個主要組分(佔總量的52％和47％)的洗脫位置分別相當於359.4KDa和159.3KDa球蛋白的位置。見表8。
類似地，通過用MW＝6-25KDa的MePEG醛使MGDF還原性烷基化而製備共軛物PEG 18、PEG 19和PEG 21。表7歸納了在這些製備中所用的主要反應參數。
表8列出了這些共軛物之HPLC SEC分析結果。12.3 製備在N-末端α-氨基殘基帶連接位點的單甲氧基-聚乙二醇-MGDF共軛物製備單-MePEG(20KDa)-MGDF共軛物(PEG 16)向含20mM NaCNBH3的100mM磷酸鈉pH5中的冷的(4℃)、攪拌的MGDF溶液(2ml，2.5mg/ml)中加入過量5倍摩爾的甲氧基聚乙二醇醛(MePEG)(平均分子量為20KDa)，於相同的溫度下繼續攪拌反應混合物。
通過使用Superdex 200 HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)，用0.1M磷酸鈉緩衝液pH6.7，以0.7ml/分洗脫的SEC HPLC監測反應過程中蛋白質的修飾程度。
16小時後，SEC HPLC分析表明，已被修飾的蛋白質佔開始量的90％以上。此時，用無菌水稀釋反應混合物而使反應混合物中蛋白質的濃度達1mg/ml，反應混合物的pH調整到4(0.5M乙酸)。
通過使用SP Sepharose HP(Pharmacia Biotech)離子交換樹脂的離子交換層析，從過量的MePEG和其它反應副產品中分離單一MePEG(20KDa)-MGDF共軛物。
將反應混合物上樣(2.5mg/ml樹脂)於柱上，然後用3倍柱體積的起始緩衝液A(20mM磷酸鈉，pH7.2，15％甘油)洗脫未反應的MePEG。此後，用在20倍柱體積中0％到25％終止緩衝液B(在緩衝液A中的1M NaCl)線性梯度洗脫MePEG-MGDF共軛物。於280nm監測洗脫物。收集含聚-MePEG-MGDF共軛物的組分，將其濃縮並無菌過濾。
通過使用4-20％預製(precast)梯度凝膠(NOVEX)的SDS-PAGE確定單一MePEG-MGDF共軛物的均質性。有一個相應於46.9KDa蛋白質位置的主要帶。
通過依次使用TSK-GEL G4000SWXL和G2000SWXL凝膠過濾柱的HPLC SEC分析純化的聚-MePEG-MGDF。用在280nm的UV吸收值監測蛋白質。BIO-RAD凝膠過濾標準作球蛋白質分子量標記物。
正如圖17C中所見，SEC HPLC表明在製備中的一個主要組分，其洗脫位置相當於181.1KDa球蛋白的位置。見表9。
類似地，通過用MW＝6-25KDa的MePEG醛的MGDF還原性烷基化而製備單一MePEG-MGDF共軛物PEG 14、PEG 15和PEG 17。在這些製備中所用的主要反應參數總結於表7中。
表9列出了這些共軛物的HPLC SEC分析結果。
表7MGDF修飾反應參數的總結代碼 還原性MePEG 反應條件類型分子量MGDF pH 溫度 時間 摩爾比濃度 ℃小時 MePEG/MGDFmg/mlPEG 9 NHS 6kDa 2.58 r.t. 0.5 15酯PEG 10NHS 6kDa 2.58 r.t. 0.5 10酯PEG11 NHS 20kDa 2.58 r.t. 0.5 10酯PEG 12 NHS 50kDa 2.58 r.t. 0.5 5酯PEG 14 ALDEHY 6kDa 2.55 4℃ 165DEPEG 15 ALDEHY 12kDa2.5 5 4℃ 165DEPEG 16 ALDEHY 20kDa2.5 5 4℃ 165DEPEG 17 ALDEHY 25kDa2.5 5 4℃ 1610DEPEG 18 ALDEHY 6kDa 5 5 4℃ 1610DEPEG 19 ALDEHY 12kDa 5 5 4℃ 1610DEPEG 20 ALDEHY 20kDa 5 5 4℃ 1610DEPEG 21 ALDEHY 25kDa 5 5 4℃ 1610DE
表8由SEC HPLC總結聚-MePEG-MGDF特徵代碼 反應性MePEG 由SEC確定的表觀組分量分子量 ％PEG 9NHS 6kDa 87.9 75酯 52.7 25 (肩部)PEG 10 NHS 6kDa 69.2 14 (肩部)酯 42.9 86PEG 11 NHS 20kDa 370.968酯 155.032PEG 12 NHS 50kDa 865.653酯 368.047PEG 18 ALDEHY6kDa 84.6 60DE 41.5 40PEG 19 ALDEHY12kDa 218.459DE 106.741PEG 20 ALDEHY20kDa 359.452DE 159.347PEG 21 ALDEHY25kDa 450.554DE 218.446
表9單MePEG-MGDF共軛物的表觀分子量代碼反應性MePEG 由SEC確定的表觀 由SDS PAGF確定的分子量kDa 表觀分子量kDa類型 分子量PEG14 ALDEHY6kDa 44.5 27.7DEPEG 15 ALDEHY12kDa 104.738.3DEPEG16 ALDEHY20kDa 181.146.9DEPEG 17 ALDEHY25kDa 226.455.5DE12.4 通過與甲氧基聚(乙二醇)醛使MGDF還原性烷基化而製備DiMePEG(12KDa)-MGDF共軛物(PEG 22)用下列方法得到本文稱為PEG 22的純化分子。將5倍過量的甲氧基聚乙二醇醛(MePEG，即OHC-(CH2)2O-(CH2-CH2O)n-CH3；其中n＝使分子時約為12KDa的重複單元)(Shearwater Polymers)於5℃加到100mM乙酸鈉，pH5.0的2.5mg/mlMGDF(E.Coli衍生的1-163)溶液中。混合10分鐘後，加入充足的氰基硼氫化鈉(Aldrich)以使其在反應混合物中達到20mM的濃度。
在約5℃，將該混合物攪拌16小時。攪拌結束時，加入充足的純比水、USP以使MGDF的濃度達1mg/ml。將該混合物通過0.2μm的真空濾器。用該方法製備了90mg反應產物。將少量的1.0M一鹼價磷酸鹽和1N的氫氧化鈉溶液加到反應產物混合物中以得到10mM磷酸鹽，pH6.8溶液。
在陽離子交換柱上純化共軛物。製備40ml的SP-Sepharose高效柱，床高7.5cm。用平衡緩衝液(10mM磷酸鹽，pH6.8，含15％甘油)平衡該柱。以2.2mg/ml樹脂，0.15柱體積(CV)/分使柱上樣。然後用平衡緩衝液洗滌直到達到基線。用10倍柱體積從緩衝液A(20mM磷酸鹽，pH7.2，含15％甘油)到緩衝液B(緩衝液A加0.3M NaCl)的線性梯度洗脫該柱。流速一直保持在0.15CV/分。在280nm監測洗脫物。
使組分在SDS-PAGE凝膠上層析，收集含DiPEG共軛物的組分，然後通過0.2μm裝置過濾。
實施例13聚乙二醇化之MGDF分子的生物活性A.PEG-9-PEG 12和PEG 14-PEG-21測量用重組人MGDF處理之小鼠的血小板計數，結果列於圖18。以圖上標明的濃度將CHO-衍生的22-353(空菱形)，非聚乙二醇化的E.coli 22-184(空心圓)和聚乙二醇化的E.coli 22-184(實心圓)MGDF皮下注射給正常Balb/c小鼠，每天一次，共5天。最後一次注射24小時後，收集切割尾靜脈小截面的試驗出血。用Sysmex電子血細胞分析儀(Baxter Diagnostics，Inc.，Irvine，CA)進行血細胞分析。數據表示為4隻動物的平均值+/-SEM。其它血細胞參數，如總白細胞計數或紅細胞計數不受該處理的影響。
按上述檢測其它形式的重組人MGDF。在下列表10中列出了以標明形式之r-HuMGDF處理小鼠的血小板計數，劑量為50μg/kg/天或10μg/kg/天。數據為4隻動物的平均值，標準誤差用斜體字。
表10

表10的關鍵在下列每種情況下，如上述實施例所述，聚乙二醇化的MGDF分子是E.coli衍生的MGDF-11(胺基酸22-184，從信號肽的開始編號或胺基酸1-163，從成熟蛋白質的開始編號)。名稱聚乙二醇化PEG的平 用於合成的反應性均分子量 反應性PEG分子PEG 9 多聚乙二醇化的 6KDa MePEG的NHS酯PEG 10 多聚乙二醇化的 6KDa MePEG的NHS酯PEG 11 多聚乙二醇化的 20KDaMePEG的NHS酯PEG 12 多聚乙二醇化的 50KDaMePEG的NHS酯PEG 14 單聚乙二醇化的 6KDa MePEG的醛PEG 15 單聚乙二醇化的 12KDaMePEG的醛PEG 16 單聚乙二醇化的 20KDaMePEG的醛PEG 17 單聚乙二醇化的 25KDaMePEG的醛PEG 18 多聚乙二醇化的 6KDa MePEG的醛PEG 19 多聚乙二醇化的 12KDaMePEG的醛PEG 20 多聚乙二醇化的 20KDaMePEG的醛PEG 21 多聚乙二醇化的 25KDaMePEG的醛基線計數在正常動物中未施用任何物質。
清楚地表明，重組人MGD)F的聚乙二醇化對該分子增加受體動物中的血小板計數沒有不利影響，而且事實上對E.coli產物22-184活性的增加與用CHO-衍生的22-353分子所見到的一樣大或者大於後者。B.PEG-22圖24中列出了使用PEG-22的結果。值得注意的是，用PEG-22的血小板計數正常化比用全長CHO衍生的MGDF，PEG-16或PEG-17早數天。
實施例14在E.coli中表達重組人MGDF(1-163)
為了在E.coli中表達r-HuMGDF，用優選的E.coli密碼子化學合成編碼成熟蛋白質前163個胺基酸的序列。另外，將編碼胺基酸Met和Lys的DNA序列加到該基因的5′末端。因此，由該序列編碼的r-HuMGDF蛋白質從Met-Lys開始，有165個胺基酸長。該基因的序列列於圖25。
用數步合成r-HuMGDF(1-163)基因。首先用優選的E.coli密碼子化學合成代表該基因連接片段的互補寡核苷酸(60-70bp長)。在合成過程中，將胺基酸Met和Lys的密碼子放在成熟基因的5′末端，將終止密碼子放在該基因的3′末端。另外，限制酶xba I和Hind III的切割位點分別在該基因的5′和3′末端的頂端，合成的核糖體結合位點在離起始Met適當距離的上遊。第二步，將各基因片段的互補寡核苷酸退火。第三，用聚合酶鏈反應擴增這些單個的合成基因片段。第四，將擴增的片段亞克隆到適當的載體中。第五，確定亞克隆片段的序列。第六，將單個片段連在一起，然後亞克隆到適當的載體中，重構建全長r-HuMGDF(1-163)基團。最後，確定重構建基因的序列。
分別位於5′和3′末端之xba I和Hind III限制位點測翼的合成r-HuMGDF基因片段含有核糖體結合位點，ATG起始密碼子，編碼成熟Met-Lys r-HuMGDF蛋白質的序列和終止密碼子。
將上述片段克隆到乳糖誘導表達載體pAMG 11的xba I和Hind III位點。pAMG 11載體是一種有pR 100-衍生的複製原點的低拷貝數質粒。用PCR重疊的寡核苷酸誘變進行一系列的定點鹼基改變，從質粒pCFM 1656(ATCC # 69576，於1994年2.24保藏)可以得到表達質粒pAMG 11。從緊接著質粒複製啟動子PcopB 5′的Bgl II位點(質粒bp # 180)開始，進而到質粒複製基因，鹼基對改變如下pAMG 11bp# 在pCFM 1656的bp 改變成在pAMG 11中的bp# 204 T/AC/G# 428 A/TG/C# 509 G/CA/T# 617 - -插入兩個G/C bp# 679 G/CT/A# 980 T/AC/G# 994 G/CA/T# 1004 A/TC/G# 1007 C/GT/A# 1028 A/TT/A# 1047 C/GT/A# 1178 G/CT/A# 1466 G/CT/A# 2028 G/Cbp缺失# 2187 C/GT/A# 2480 A/TT/A# 2499-2502AGTG GTCATCAC CAGT# 2642 TCCGAGCbp缺失AGGCTCG# 3435 G/CA/T# 3446 G/CA/T# 3643 A/TT/A# 4489-4512- -插入bpsGAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAGCTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC(SEQ ID NOS30，31)並用下列寡核苷酸取代特有Aat II和Cla I限制位點間的DNA序列AatII(#4358)5′CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT-3′TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA--GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3′-CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5′ClaI(#4438)(SEQ ID NOS32，33)由合成的乳糖-誘導的啟動子，如Ps4啟動克隆在pAMG 11中之r-HuMGDF的表達，所述啟動子有下列序列5′GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA--ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3′(SEQ ID NO34)Ps4啟動子由乳糖阻遏物(LacI)，F.coli LacI基因的產物抑制。
隨後，將pAMG 11-r-HuMGDF質粒轉化到含LacIq等位基因的E.coli K-12菌株中。LacIq等位基因是在LacI啟動子內的突變，可以提高LacI的表達，並對Ps4啟動子的蛋白質表達有更嚴格的控制。因此，在該菌株中，沒有乳糖時，LacI抑制了r-HuMGDF的表達。一旦加入乳糖，與Ps4啟動子上操縱子位點結合的LacI蛋白質被還原，然後從Ps4開始轉錄r-HuMGDF。在本實施例中所用的E.coli宿主細胞於1994年11月30日以ATCC # 69717保藏號在ATCC保藏。
用pAMG 11-r-HuMGDF質粒轉化E.coli宿主ATCC #69717，然後使其按下列發酵描述生長。將E.coli菌株接種到Luria肉湯中，然後於30℃培養約12小時。再將細胞無菌轉移到含批量培養基(20g/L酵母提取物；3.4g/L檸檬酸；15g/L K2HPO4；15ml Dow P2000；5g/L葡萄糖；1g/L MgSO4·7H2O，5.5ml/L痕量金屬，5.5ml/L維生素)的發酵罐中。持續批量培養過程直到培養物在600nm的光密度達到5.0±1.0。從第一補充培養基(700g/L葡萄糖；6.75g/LMgSO4·7H2O)開始補料過程。每一新過程每隔2小時調整補料速度。當培養物在600nm的光密度達到20-25小時，開始加入第二補料培養基(129g/L trypticase腖；258g/L酵母提取物)。第二補料培養基保持在一恆定的流速，而同時繼續調整第一補料培養基。整個發酵過程中的溫度保持在約30℃。必要時加入酸和鹼以使培養物的pH保持在7。通過調整發酵罐中的攪拌和空氣-輸入得氧氣-輸入率而保持所需溶解的氧水平。當培養物在600nm的光密度達到57-63時，開始加入第三補料培養基。以恆定的流速將第三補料培養基(300g/L乳糖)加到發酵罐中；不再繼續加入第一補料培養基，同時將第二補料培養的流速數變到一新的恆定速度。開始加入第三補料培養基後，發酵持續約10小時。在發酵結束時，將培養物急冷到15±5℃。離心收集細胞。包裝所得的膏狀物並於＜-60℃貯存。
按如下方法純化在上述E.coli中生產的重組MGDF。將1800g細胞膏懸於約18升的10mM EDTA中，然後以15,000psi通過一高壓勻漿器。離心破碎的細胞懸浮液，將顆粒重懸於10升10mM EDTA中。離心懸浮液，將200g顆粒溶解於2升10mM Tris，8M鹽酸胍，10mM DTT.5mMEDTA，pH8.7中。將該溶液緩慢稀釋到200升10mM CAPS，3M脲，30％甘油，3mM胱胺，1mM Cys，pH10.5中。
於室溫將稀釋溶解緩慢攪拌16小時，然後將pH調整到6.8。澄清調整了pH的溶液，然後用於2升用10mM磷酸鈉，1.5M脲，15％甘油，pH6.8平衡的CM Sepharose柱。上樣後，用10mM磷酸鈉，15％甘油，pH7.2洗滌該柱。用0到0.5M氯化鈉，10mM磷酸鈉，pH7.2洗脫MGDF。
濃縮CM洗脫物，用10,000分子量截斷膜，10mM磷酸鈉pH6.5替換緩衝液。於室溫用組織蛋白酶C(500∶1摩爾比)處理約2mg/ml的濃縮溶液。
然後將溶液上樣到用10mM磷酸鈉、15％甘油，pH7.2平衡的SP高效Sepharose柱上。上樣後，用0.1到0.25M氯化鈉，10mM磷酸鈉，pH7.2梯度洗脫MGDF。
將硫酸銨加到來自SP高效柱的洗脫物中。將洗脫物上樣到用10mM磷酸鈉，0.6M硫酸銨，pH7.2平衡的1.6升Phenyl Toyopearl柱上。用0.6到0M到硫酸鈉，10mM磷酸鈉，pH7.2的梯度洗脫MGDF峰。
濃縮Phenyl Toyopearl洗脫物，用10,000分子量截斷膜將緩衝液換成10mM Tris，5％山梨醇，pH7.5。
實施例15r-HuMGDF(E.coli 1-163)的體內生物特性在齧齒動物中評估如實施例14製備的r-HuMGDF(E.coli 1-163)的生物效率。正常的，用增加劑量的r-HuMGDF皮下注射雌Balb/c小鼠，連續5天。劑量範圍在15μg/kg/天到1500μg/kg/天，最後一次注射24小時後，用電子細胞計數器(Sysmex，Baxter)測量血細胞計數。隨細胞因子濃度的對數增加，血小板計數線性增加。在該系統中，用1500μg/kg/天血小板計數增加到300％基線值。用該處理不影響其它血細胞參數，如白或紅血細胞計數或血細胞比容。
從皮下注射了6天300μg/kg/天r-HuMGDF(E.coli 1-163)的大鼠中收集血小板，然後評估對ADP反應的聚集能力。數據表明來自被處理動物的血小板與來自對照動物的血小板對於血小板激動劑ADP的敏感性相同。
再評估r-HuMGDF消除與化療和/或輻射相關的血小板減少症的能力。在這些研究中，使用引起極度血小板減少症的化療劑，卡珀。在開始研究時，用1.25mg卡珀皮下注射Balb/c小鼠。24小時後，用100μg/kg/天r-HuMGDF(E.coli 1-163)或賦形劑每天注射小鼠以進行剩下的研究。第9天末，在用r-HuMGDF處理的小鼠中，血小板計數降到賦形劑處理之小鼠中正常值的約15％，但仍在基線(見圖20)。為了進行輻射研究，使小鼠經1個500拉德劑量的γ-輻射(銫源)。這是一個亞致死量，在11天末，會使血小板計數減少90％。直到21天，血小板計數都不能恢復到正常值。從第1天到20天，給輻射小鼠每天(100μg/kg/天)施用一次r-HuMGDF(E.coli 1-163)後，血小板計數降低的程度較低，而且比用賦形劑處理的小鼠恢復到基線更快(圖21)。為了在極端和延長的血小板減少症模式中檢測r-HuMGDF，將卡珀和輻射結合起來應用(圖22)。在該情況下，血小板計數降到極低的水平(正常值的3-5％)，在這種情況下，大多數動物(7/8)不能存活。然而，以100μg/kg/天皮下每天注射r-HuMGDF來處理這些動物以進行長期研究，血小板減少症明顯消除，計數恢復到基線的速度更快，而且所有r-HuMGDF處理的動物(8/8)均存活。
再在恆河猴中評估r-HuMGDF。給正常恆河猴皮下注射2.5或25μg/kg/天10天(0-9天)。在較低的劑量組中，在12天，血小板計數增加了400％，而在較高劑量組，也在12天，增加了700％。停止注射後，在25-30天，血小板計數恢復到正常。白細胞計數和紅細胞計數不受這種處理的影響。
在嚴重血小板減少症的靈長目模型中，檢測r-HuMGDF(E.coli1-163)(圖23)。使動物經輻射(700拉德，Co源)，在15天，血小板計數降低到正常值的1-2％。在35-40天，血小板計數恢復到正常。相反，在用r-HuMGDF(25μg/kg/天)每天處理的輻射動物中的血小板計數隻降到正常值的10％，而且未降到20,000/μl(血小板減少患者中進行血小板輸注的觸發點)以下。在20天，用r-HuMGDF處理的動物中恢復到計數也更快。
來自嚙齒類和靈長類的這些體內數據完全支持r-HuMGDF(E.coli1-163)是一種有效的治療劑的概念，它有能力明顯影響臨床相關的血小板減少症。
實施例16CHO細胞培養生產r-HuMGDF 1-332的方法從轉染的中國倉鼠卵巢細胞獲得糖基化的r-HuMGDF，所述細胞表達在適當啟動子下並與編碼可擴增之選擇標記DHFR的基因相連的MGDF 1-332之cDNA。在CHO細胞中用於表達MGDF的適當啟動子是SRα(見Mol.Cell.Biol.8466-472(1988)和WO 91/13160(1991))。用於在CHO細胞中表達MGDF的適宜載體是pDSRα2。(見WO 91/14363(1990))。在標準細胞培養基中，舉證性CHO細胞系可以產生10-20mg/L分泌的MGDF，但也可以提高到25到≥100mg/L。為了用典型的細胞系產生MGDF，用含有等比例Dulbecco′s 改性的Eagle′s培養基(DMEM)和Ham′s F12(DMEM/F12，Gibco)(用5-10％胎牛血清(FBS)或透析的胎牛血清和氨甲蝶呤(MTX)補充)(如果需要，典型的MTX濃為200-600nM)的培養基，用粘附生長模式在懸浮液或組織培養器中傳代擴大培養以保持選擇壓力。該培養基應用額外的非必需胺基酸(NEAA′s)和穀氨醯胺補充。在特定的分裂密度，通過稀釋成有起始細胞密度的較大體積而擴大培養的接種(分裂)密度1-4×105細胞/ml和最大密度～1×106細胞/ml之間，懸浮培養物容易增殖。
為了在旋轉瓶中產生MGDF，必須用置於控制環境中(37℃±1℃)的磁攪拌旋轉器或一種安裝的被控制的攪拌生物反應器系統得到適宜體積和細胞密度的懸浮培養物。應以1.5-3×107細胞/瓶的起始密度接種旋轉瓶(如850cm3Falcon旋轉瓶)並以在3-4天得到匯合單層的適宜量用其它生長培養基(含5-10％FBS，1×NEAA和1×L-Gln的DMEM/F 12)。應用NaHCO3將生長培養基適當地將pH從6.9緩衝到7.2，用60到90mmHg的分壓以CO2平衡。瓶子應用10％CO2/空氣充氣並於37±1℃在旋轉器(～1rpm)上培養3-4天。在匯合時，通過傾倒或抽吸生長培養基，用等滲緩衝液如Dulbecco′s磷酸緩衝鹽(D-PBS)，50-100ml/瓶洗滌各瓶，然後加入適當體積用NEAA′s和L-Gln和硫酸銅補充的碳酸氫鹽-緩衝的無血清DMEM/F 12(1∶1)(200-300ml/瓶)而將旋轉瓶移到無血清生產培養基中以便共價聚集最小(1-20μM)。瓶子應用10％CO2/空氣充氣並於37±1℃在旋轉器(～rpm)上培養6±1天，或者直到代謝活性使葡萄糖水平降到0.5g/L以下和/或pH水平低於6.6。通過從瓶中傾倒或抽吸來收集條件培養基，按上述用新鮮的無血清生產培養基替換以進行其他收集。這可以直到細胞不再保持無血清生產並且從旋轉瓶上脫落。通過0.45μm和/或0.2μm濾器(Sartorius SartobranpH或Pall)進行一端堵死的微過濾而純化收集的條件培養基。應將過濾的條件培養基冷卻到4℃，然後或者於4℃暫時貯存或者立刻用橫向交叉的超濾系統(即Filtron YM-50)濃縮並透析到低離子強度。應在4℃進行超濾和透濾以使蛋白質的降解作用最小。進行層析純化前，應用緩衝的水溶液(即10mM K3PO4，pH6.8)透析條件培養基。
最好用可以揭示樣品中聚集的，單體和蛋白水解的MGDF相對數量的非還原SDS-PAGE Western印跡監測條件培養基中產物的質量。
從CHO細胞生產MGDF的另一種方法是使用將MGDF表達到無血清培養基如Gibco S-SFM II的細胞系。通過在含最小或無血清補充物的培養基中連續傳代而使用細胞。如果發現細胞系可保持生長在生產足夠量分泌之MGDF的培養基中，在逐漸增加的培養體積中經連續傳代而按比例擴大接種培養，然後接種適宜的生產容器(一種裝有儀器的、控制的攪拌箱生物反應器)並在最佳生長條件(pH、營養、溫度、氧、切變物)下使培養物增殖到其最大可存活密度。在最佳生產點(經實驗測量產物數量的質量而確定的)從生物反應器中收集培養物，通過微米規模的深度過濾或亞微米的橫向交叉微濾而從條件培養基中除去細胞。如果用深度過濾，在按上述濃縮和透析前，應用亞微米-端堵死的過濾將培養基進一步澄清。
已一般性並以優選的實施方案描述了本發明，應理解參照上述描述，本領域專業人員可以有所改變。因此，本發明的權利要求覆蓋了所有的改變。它們均在本發明權利要求範圍內。
另外，為說明本發明背景，而引述的文獻和其他資料，特別是提供了與其實施有關的其他詳細內容的文獻均引入本文作為參考。
序列表(1)一般資料(i)申請人Bartley，Timothy D.
Bogenberger，Jakob M.
Bosselman，Robert A.
Hunt，PamelaKinstler，Olaf B.
Samal，Babru B.
(ii)發明名稱刺激巨核細胞生長和分化的組合物及方法(iii)序列數34(iv)通訊地址(A)收件人Amgen Inc.
(B)街道1840 Dehavilland Drive(C)城市Thousand Oaks(D)州California(E)國家USA(F)郵編91320-1789(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release # 1.0，Verion # 1.25(vi)當前申請的資料(A)申請號(B)申請日
(C)分類號(viii)代理人/代理機構資料(A)姓名Cook，Robert R，(C)查詢/提要號A-290-C(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度31胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp1 5 10 15Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gln Xaa Pro Asp Ile Tyr20 25 30(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度21胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp1 5 10 15Ser His Val Leu His20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度17胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO3Thr Gln Lys Glu Gln Thr Lys Ala Gln Asp Val Leu Gly Ala Val Ala1 5 10 15Leu(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GCNCCNCCNG CNTGYGA 17(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特徵
(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GCARTGYAAC ACRTGNGART C21(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特徵(A)長度21胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp1 5 10 15Ser His Val Leu His20(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO7GTACGCGTTC TAGANNNNNN T21(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTT29(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特徵(A)長度20個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特徵(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14CCTTTACTTC TAGGCCTG18(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19(2)SEQ ID NO16的資料
(i)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GGCATAGTCC GGGACGTCG 19(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT 24(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO21GCARTGYAAN ACRTGNGART C21(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特徵(A)長度16個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO22TTGGTGTGCA CTTGTG 16(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO23CACAAGTGCA CACCAACCCC 20(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特徵(A)長度1342個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置99..1094(xi)序列描述SEQ ID NO24CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT113Ser Pro Ala Pro Pro1 5GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val10 15 20CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr25 30 35CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr40 45 50CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu55 60 65CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys70 75 80 85CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu90 95 100GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg105 110 115ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His120 125 130CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr135 140 145CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr150 155 160 165TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG 641Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu170 175 180TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT 689Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu185 190 195CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC 737Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn200 205 210CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA 785Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile215 220 225CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC 833His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg230 235 240 245AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC 881Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly250 255 260TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT 929Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His265 270 275CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC 977Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro280 285 290ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA 1025Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro295 300 305ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC 1073Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser310 315 320 325CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA 1124Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly330TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT1184TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA1244ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA1304CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA1342(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特徵(A)長度332胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO25Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1 5 10 15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val20 25 30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu35 40 45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu50 55 60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65 70 75 80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln85 90 95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu100 105 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe115 120 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu130 135 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145 150 155 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn165 170 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr180 185 190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile195 200 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly210 215 220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225 230 235 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly245 250 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser260 265 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu275 280 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro290 295 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305 310 315 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325 330(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特徵(A)長度1342個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置99..621(xi)序列描述SEQ ID NO26CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT113Ser Pro Ala Pro Pro1 5GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val10 15 20CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr25 30 35CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr40 45 50CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu55 60 65CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys70 75 80 85CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu90 95 100GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg105 110 115ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His120 125 130TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr135 140 145CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr150 155 160 165TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG 641Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu170TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG701CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA761ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT821GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC881TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA941CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC1001CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC1061TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA 1121GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG 1181ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG 1241GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA 1301ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A 1342(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特徵(A)長度174胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO27Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1 5 10 15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val20 25 30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu35 40 45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu50 55 60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65 70 75 80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln85 90 95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu100 105 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe115 120 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu130 135 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145 150 155 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu165 170(2)SEQ ID N028的資料(i)序列特徵(A)長度1164個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置97..894(xi)序列描述SEQ ID NO28AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG 60GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT 114Ser Pro Ala Pro Pro Ala1 5TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT 162Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu10 15 20CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT 210His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro25 30 35GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG 258Val Leu Lau Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln40 45 50ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG 306Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu55 60 65 70CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC 354Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu75 80 85TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG 402Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly90 95 100GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC 450Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr105 110 115ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG 498Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu120 125 130CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT GTT GGA GAC AAA CTT CAC TGC CTC 546Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu135 140 145 150AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT GAA GTG GCA GCA GGG ATT CAG 594Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile Gln155 160 165AGC CAA GAT TCC TGG TCT GCT GAA CCA AAC CTC CAG GTC CCT GGA CCA 642Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro Gly Pro170 175 180AAT CCC CGG ATA CCT GAA CAG GAT ACA CGA ACT CTT GAA TGG AAC TCG 690Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser185 190 195TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG CAG GAC CCT AGG AGC CCC GGA CAT 738Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg Ser Pro Gly His200 205 210TTC CTC AGG AAC ATC AGA CAC AGG CTC CCT GCC ACC CAA CCT CCA GCC 786Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gln Pro Pro Ala215 220 225 230TGG ATA TTC TCC TTC CCC AAC CCA TCC TCC TAC TGG ACA GTA TAC GCT 834Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val Tyr Ala235 240 245CTT CCC TCT TCC ACC CAC CTT GCC CAC CCC TGT GGT CCA GCT CCA CCC 882Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro250 255 260CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT 931Pro Ala Ser265CTAAACACAT CCTACACCCA CTCCCAGAAT CTGTCTCAGG AAGGGTAAGG TTCTCAGACA 991CTGCCGACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTTCCC TGCAGGGCGC CCCTGGGAGA 1051CAACTGGACA AGATTTCCTA CTTTCTCCTG AAACCCAAAG CCCTGGTAAA AGGGATACAC 1111AGGACTGAAA AGGGAATCAT TTTTCACTGT ACATTATAAA CCTTCAGAAG CTA1164(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特徵(A)長度265個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO29Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1 5 10 15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val20 25 30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu35 40 45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu50 55 60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65 70 75 80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln85 90 95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu100 105 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe115 120 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly130 135 140Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu145 150 155 160Val Ala Ala Gly Ile Gln Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn165 170 175Leu Gln Val Pro Gly Pro Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg180 185 190Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp195 200 205Pro Arg Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro210 215 220Ala Thr Gln Pro Pro Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser225 230 235 240Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro245 250 255Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser260 265(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO30GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特徵(A)長度80個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO32CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特徵(A)長度86個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO33CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特徵(A)長度89個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO34GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT89
權利要求
1.一種人MGDF多肽，它能特異性促進人巨核細胞的生長和發育，基本上不含其它人蛋白質。
2.根據權利要求1的多肽，其中所述的多肽包括附圖11的22-172位上的胺基酸。
3.根據權利要求2的多肽，其中所述的多肽包括附圖11的22-195位上的胺基酸。
4.根據權利要求3的多肽，含有MGDF-2的胺基酸序列。
5.根據權利要求1的多肽，其中所述的多肽包括附圖11的22-353位上的胺基酸。
6.根據權利要求5的多肽，具有MGDF-1的胺基酸序列。
7.根據權利要求2的多肽，所述的多肽具有選自MGDF-4，MGDF-5，MGDF-6，MGDF-7和MGDF-8的胺基酸序列。
8.根據權利要求1的多肽，其中所述的多肽含有附圖11的22-184位上的胺基酸。
9.根據權利要求1的多肽，其中所述的多肽還含有在其N-末端上的Met-Lys序列。
10.根據權利要求1的多肽，其中所述的多肽包括附圖11的22-184位上的胺基酸，並且還包括在其N-末端上的Met-Lys序列。
11.根據權利要求1的多肽，其中所述的多肽包括附圖11的22-353位上的胺基酸，並且還包括在其N-末端上的Met-Lys序列。
12.根據權利要求1的多肽，其中所述的多肽還包括附圖11的1-21位上的胺基酸。
13.一種編碼人MGDF多肽的分離的聚核苷酸。
14.根據權利要求13的分離的聚核苷酸，它編碼按照權利要求1-12中任一權項的人MGDF多肽。
15.根據權利要求14的分離的聚核苷酸，它是一種DNA序列。
16.根據權利要求15的DNA序列，它是一種cDNA序列。
17.根據權利要求16的cDNA序列，它具有如附圖11或12所示的序列。
18.一種含有權利要求15的DNA序列的DNA載體。
19.根據權利要求18的載體，其中所述的DNA序列有效地與一種表達控制DNA序列相連。
20.一種用權利要求15的DNA序列穩定轉化或轉染的宿主細胞。
21.根據權利要求20的宿主細胞，它表達由所述的DNA序列編碼的所述MGDF多肽。
22.一種生產人MGDF多肽的方法，所述方法包括在合適的培養基中培養如權利要求21的宿主細胞並且從所述的細胞或所述的培養基中分離所述的MGDF多肽。
23.根據權利要求22的生產人MGDF多肽的方法，其中所述的宿主細胞是E.coli細胞。
24.根據權利要求22的生產人MGDF多肽的方法，其中所述的宿主細胞是CHO細胞。
25.一種與權利要求1-12中任一權項的人MGDF多肽有反應性的抗體。
26.一種根據權利要求25的單克隆抗體。
27.一種根據權利要求25的重組抗體。
28.一種藥物組合物，含有如權利要求1-12中任一權項的人MGDF多肽和藥物可接受的稀釋劑、輔劑或載體。
29.根據權利要求28的在水溶液中的藥物組合物。
30.根據權利要求28的凍幹形式的藥物組合物。
31.一種治療患有人MGDF多肽缺乏症的患者的方法，該方法包括給所述的患者施用有效量的如權利要求1-12中任一權項的人MGDF多肽。
32.一種治療患有血小板減少性病症的患者的方法，該方法包括給所述的患者施用有效量的如權利要求1-12中任一權項的人MGDF多肽。
33.根據權利要求32的方法，其中所述的病症包括再生障礙性貧血、自發性血小板減少症、及由藥物或輻射治療引起的血小板減少症。
34.一種增加需要提高成熟巨核細胞數量的患者的成熟巨核細胞數量的方法，該方法包括給所述的患者施用有效量的如權利要求1-12中任一權項的人MGDF多肽。
35.一種增加需要提高血小板數量的患者的血小板數量的方法，該方法包括給所述的患者施用有效量的如權利要求1-12中任一權項的人MGDF多肽。
36.一種MGDF衍生物，包括結合在至少一種水溶性聚合物上的如權利要求1-12中任一權項的MGDF多肽。
37.根據權利要求36的MGDF衍生物，其中所述的MGDF多肽選自MGDF-1、MDGF-2、MGDF-4、MGDF-11、MGDF-12、MGDF-13、MGDF-14和MGDF-15。
38.根據權利要求36的MGDF衍生物，其中所述的MGDF多肽是在細菌細胞中重組產生的。
39.根據權利要求36的MGDF衍生物，其中所述的水溶性聚合物是藥物學可接受的。
40.根據權利要求36的MGDF衍生物，其中所述的水溶性聚合物選自葡聚糖、聚[N-乙烯基-吡咯烷酮]、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇、聚乙烯醇和其混合物。
41.根據權利要求36的MGDF衍生物，其中所述的水溶性聚合物是聚乙二醇。
42.根據權利要求41的MGDF衍生物，其中所述的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇。
43.根據權利要求41的MGDF衍生物，其中所述的聚乙二醇通過醯基或烷基鍵與所述的MGDF多肽相連。
44.含有權利要求1-12中任一權項的胺基酸序列的聚乙二醇化的(pegylated)MGDF多肽。
45.根據權利要求44的聚乙二醇化的MGDF多肽，含有附圖11的22-184位上的胺基酸的胺基酸序列。
46.根據權利要求45的聚乙二醇化的MGDF多肽，其中聚乙二醇基與其N-末端相連。
47.根據權利要求46的聚乙二醇化的MGDF多肽，其中聚乙二醇基的平均分子量為10-50KDa。
48.根據權利要求47的聚乙二醇化的MGDF多肽，其中所述的MGDF多肽是在E.coli中產生的。
49.含有權利要求1-12中任一權項的胺基酸序列的單聚乙二醇化的(monopegylated)MGDF多肽。
50.含有與兩個水溶性聚合物分子共價相連的權利要求1-12中任一權項的MGDF多肽的MGDF衍生物。
51.根據權利要求50的MGDF衍生物，其中所述的水溶性聚合物均是聚乙二醇。
52.根據權利要求51的MGDF衍生物，其中所述的MGDF多肽含有附圖11的22-184位上的胺基酸，而且所述的聚乙二醇的平均分子量為5-25KDa。
53.將水溶性聚合物與權利要求1-12中任一權項的MGDF多肽相連的方法，其中所述的水溶性聚合物有一個反應性醛基，所述的方法包括(a)在還原性烷基化條件下，在使所述MGDF多肽的N-末端α-氨基呈反應性的足夠的酸性pH下，將所述的MGDF多肽與水溶性聚合物接觸；和(b)分離與至少一種水溶性聚合物相連的所述MGDF多肽。
54.將水溶性聚合物與權利要求1-12中任一權項的MGDF多肽相連的方法，其中所述的水溶性聚合物有一個反應性酯基，所述的方法包括(a)在所述MGDF多肽通過醯基鍵與水溶性聚合物相連的條件下，將所述的MGDF多肽與水溶性聚合物接觸和(b)分離與至少一種水溶性聚合物相連的所述MGDF多肽。
55.根據權利要求53或54的方法，其中所述的聚合物是藥物學可接受的。
56.根據權利要求53或54的方法，其中所述的水溶性聚合物選自葡聚糖、聚(N-乙烯基-吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇和聚乙烯醇。
57.根據權利要求53或54的方法，其中所述的水溶性聚合物是聚乙二醇。
58.根據權利要求53的方法，其中所述的pH在約3和約9之間。
59.根據權利要求53的方法，其中所述的還原性烷基化條件是用氰基硼氫化鈉作為還原劑。
60.將聚乙二醇分子與如權利要求1-12中任一權項的MGDF多肽相連的方法，其中所述的聚乙二醇分子有一個反應性醛基，所述的方法包括(a)在還原性烷基化條件下，在使所述MGDF多肽的N-末端α-氨基呈反應性的足夠的酸性pH下，將所述的MGDF多肽與水溶性聚合物接觸；和(b)獲得聚乙二醇化的MGDF多肽。
61.根據權利要求60的方法，其中所述的聚乙二醇分子的分子量為2-100KDa。
62.用權利要求60的方法生產的聚乙二醇化的MGDF多肽產物。
63.如權利要求1-12中任一權項的MGDF多肽的基本上均質的製品，在所述MGDF多肽N-末端的α-氨基上單聚乙二醇化。
64.根據權利要求63的製品，其中用平均分子量為5-50KDa的聚乙二醇分子使所述的MGDF多肽單聚乙二醇化。
65.一種藥物組合物，含有如權利要求41-49、51或52中任一權項的聚乙二醇化的MGDF多肽和藥物學可接受的稀釋劑，賦形劑或載體。
66.一種藥物組合物，含有(a)根據權利要求63的基本上均質的單聚乙二醇化的MGDF多肽製品，所述的單聚乙二醇化的MGDF多肽由具有分子量為5-50KDa的聚乙二醇組成，所述的聚乙二醇僅在MGDF多肽的N-末端經烷基鍵與MGDF相連；和(b)藥物學可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。
67.含有附圖11的22-184位上的胺基酸的單聚乙二醇化的MGDF多肽。
68.根據權利要求67的單聚乙二醇化的MGDF多肽，其中聚乙二醇基與所述多肽的N-末端相連。
69.根據權利要求68的單聚乙二醇化的MGDF多肽，其中所述的聚乙二醇基的平均分子量為2-100KDa。
70.根據權利要求67、68或69的單聚乙二醇化的MGDF多肽，其中所述的MGDF多肽已在E.coli中產生。
71.將水溶性聚乙二醇與含有附圖11的22-184位上的胺基酸的MGDF多肽相連的方法，該方法包括在MGDF多肽可與聚乙二醇相連的條件下，將MGDF多肽與聚乙二醇接觸以得到單聚乙二醇化的MGDF多肽。
72.根據權利要求71的方法，其中在還原性烷基化條件下，於使所述MGDF多肽的N-末端α-氨基呈反應性的足夠的酸性pH下，將聚乙二醇與MGDF多肽相連。
73.根據權利要求71或72的方法，其中用平均分子量為2-100KDa的聚乙二醇將MGDF多肽單聚乙二醇化。
74.根據權利要求73的方法，其中MGDF多肽是通過從一種多肽上裂解掉Met-2-Lys-1而得到的，這一種多肽由編碼這一種多肽的DNA在E.coli細胞中表達得到，這一種多肽含有附圖11的22-184位上的胺基酸並在其N-末端有Met-Lys序列。
75.根據權利要求73的方法，其中所述的MGDF經以下步驟製備a.在E.coli中表達編碼含有附圖11的22-184位上的胺基酸和其N-末端Met-Lys序列之多肽的DNA，b.分離表達的多肽，和c.從分離的多肽中裂解Met-2-Lys-1。
76.含有如權利要求69之單聚乙二醇化的MGDF多肽和藥物學可接受的稀釋劑、輔劑或載體的藥物組合物。
77.根據權利要求76的在水溶液中的藥物組合物。
78.根據權利要求76的凍幹形式的藥物組合物。
79.治療患有人MGDF多肽缺乏症的患者的方法，該方法包括給所述的患者施用有效量的如權利要求69的單聚乙二醇化的MGDF多肽。
80.治療患有血小板減少性病症的患者的方法，包括給所述患者施用治療有效量的如權利要求69的單聚乙二醇化的MGDF多肽。
81.根據權利要求80的方法，其中所述的病症選自再生性障礙性貧血，自發性血小板減少症，及因藥物或輻射治療而引起的血小板減少症。
82.一種增加需要提高成熟巨核細胞數量的患者成熟巨核細胞數量的方法，包括給所述患者施用有效量的如權利要求69的單聚乙二醇化的MGDF多肽。
83.一種增加需要提高血小板數量的患者血小板數量的方法，包括給所述患者施用治療有效量的如權利要求69的單聚乙二醇化的MGDF多肽。
全文摘要
本發明公開了稱為巨核細胞生長和發育因子(MGDFs，一般也稱為Mpl配體)的新蛋白質，它們有刺激巨核細胞生長並促進巨核細胞分化或成熟的生物活性，最終產生血小板；本發明也公開了含有與水溶性聚合物(如聚乙二醇)相連的MGDF分子的MGDF衍生物及其製備方法；本發明還公開了從天然來源得到均質MGDF和用重組遺傳工程技術從哺乳動物(包括人)產生它們的方法。
文檔編號C07K16/24GK1137757SQ95190628
公開日1996年12月11日 申請日期1995年3月30日 優先權日1994年3月31日
發明者T·D·巴利, J·M·波根堡格, R·A·波塞曼, P·亨特, O·B·金斯勒, B·B·沙馬爾 申請人:安姆根有限公司