篩選胰島素分泌增強劑的方法

2023-10-24 06:48:37

專利名稱：篩選胰島素分泌增強劑的方法
技術領域：
本發明涉及篩選胰島素分泌增強劑的方法，且更具體地涉及螢光標記的Epac2基因、該基因轉化的細胞和利用此類細胞篩選胰島素分泌增強劑的方法。
背景技術：
硫醯脲類(下文稱作「SU劑」)廣泛用作糖尿病治療劑，己知其通過結合SU受體 (SURl)顯示其效果，所述SU受體是ATP敏感性K+通道(Katp通道)的組分和調節亞基(非專利文件1-3)。Katp通道存在於胰腺β細胞的細胞膜上並通過其打開和關閉調節待分泌的胰島素量。SU劑對所述SU受體的結合誘導胰腺β細胞表面的Katp通道關閉，這引發了細胞膜的去極化。這隨之引起電壓依賴性Ca2+通道打開以允許Ca2+流入細胞，從而增強胰島素分泌。SU劑的例子包括甲苯磺丁脲，格列本脲，氯磺丙脲，格列齊特等。多種細胞內信號參與調節胰島素分泌機制。具體地，細胞內產生的cAMP作為非常重要的信號分子行使調節胰島素分泌細胞的功能。已知在通過cAMP引起的胰島素分泌的調控機制內有兩類通路，為蛋白激酶A依賴性通路和獨立性通路。在蛋白激酶A獨立性通路中，由Epac 2介導的通路是已知的(通過cAMP直接激活交換蛋白由cAMP激活的小G蛋白Rapl的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF))(非專利文獻4-6)。cAMP直接結合激活的Epac2 有Rapl鳥嘌呤核苷酸交換活性，該活性激活Rapl，從而促進胰島素分泌。如上所述，雖然有多種調節胰島素分泌的機制，但對糖尿病治療劑(包括SU劑) 的作用機制尚未完全闡明。Epac2有一個與其結構相似的同種型(Epacl)(非專利文獻7)。Epacl有cAMP結合結構域，蓬亂蛋白(Dishevelled)，Egl_10，普列克底物蛋白(DEP)結構域(該結構域起著Epacl膜定位的作用)，Ras交換基序(REM)，和位於羧基末端的GEF結構域。除具有上述結構域外，與Epacl結構相似的Epac2還具有位於其氨基端的第二 cAMP結合結構域和與 Ras相互作用的Ras相關(RA)結構域。Epacl和Epac2都通過cAMP參與胞內信號傳輸。為了監測細胞內的通過cAMP的信號傳輸，已開發了作為螢光共振能量轉移 (FRET)傳感器的融合蛋白，該蛋白監測Epacl在活細胞內的活化，在所述蛋白內部分或全長Epacl夾在發出不同顏色螢光的兩種其他蛋白之間，即青色和黃色螢光蛋白(非專利文獻 8-10)。「FRET」是這麼一種現象，當彼此接近的兩種(供體)染料分子之一，如螢光蛋白， 被有一定波長的光(激發光)輻照以激發該染料分子時，激發能量通過電子之間的共振被轉移到接近的另一個染料分子(受體)上。根據這一現象，通過由供體吸收的光能，所述受體發出一定波長的光(螢光)。因此，所述FRET技術是一種檢測由FRET引發的螢光變化的方法。當用青色螢光蛋白(發出波長較短的螢光)的激發光(波長約440nm)照射由青色和黃色螢光蛋白和夾在它們之間的部分或全長Epacl (螢光標記Epacl)組成的融合蛋白時，該蛋白被激發，並利用部分所述激發能量發生FRET，黃色螢光蛋白也被激發並發出波長為535nm的螢光。另一方面，所述青色螢光蛋白的部分激發能量不引發FRET，但該青色螢光蛋白發出波長為480nm的螢光。因此，由所述螢光標記的Epacl發出的兩種不同波長的螢光的強度比率(535nm波長的螢光強度/480nm波長的螢光強度)取決於該分子內青色和黃色螢光蛋白的構象和之間的距離。因此，當由於一些修飾或與別的分子結合導致上述分子構象變化時，所述比例也發生相應的變化。由於螢光標記的Epacl的高級結構發生變化(如當cAMP結合該分子時)，通過FRET技術對該變化的檢測能夠檢測cAMP分子是否與Epacl 結合。因此，當用波長440nm的光照射螢光標記的Epacl時，通過檢測利用FRET技術發出的螢光強度的變化，可以檢測通過Epacl的信號傳輸是否存在。雖然如上所述已知在FRET技術中用Epacl作為傳感器(FRET傳感器)來測量信號傳輸的方法，但尚不知利用全長Epac2作為FRET傳感器的方法。已知Epac2通過cAMP依賴性、蛋白激酶A(PKA)獨立性通路介導胰島素分泌(非專利文件11和12)。Epac2最初鑑定為與SURl (Katp通道的調節亞基)相互作用的分子 (cAMP-GEF II)(非專利文獻 13)。已知SURl是SU劑的靶分子。SU劑和SURl的結合一方面引起Katp通道關閉，另一方面使電壓依賴性Ca2+通道打開，並且這就通過使Ca2+內流入β細胞來增加胰島素分泌 (非專利文件2)。對缺乏Kir6. 2基因(Katp通道亞基)的小鼠和缺乏SURl基因的小鼠的研究證明所述Katp通道的關閉是SU劑提高胰島素分泌的先決條件(非專利文件14-16)。因此認為SU劑是通過Katp通道表現出作為糖尿病治療藥物的藥理學作用。最近，Kir6. 2或SURl中的突變已證實會導致新生兒糖尿病和由Katp通道功能受損引起的各種症狀(非專利文獻17)。當胰島素注射改為口服高劑量SU劑時，發現許多此類患者的血糖控制得到改善(非專利文獻18)。此外，有臨床報告稱在SU劑中，格列齊特對患有新生兒糖尿病的患者沒有效果， 而格列本脲改善此類患者的血糖控制(非專利文件19)。這一發現表明SU劑的作用機制並不統一。因此，了解SU劑的作用機制為新生兒糖尿病患者提供適當的治療是很關鍵的。此外，澄清未知的作用機制是重要的，因為它會為開發具有不同背景因素的糖尿病患者的醫學治療新途徑以及開發此類治療的新療劑提供線索和方法。引用文獻列表非專利文獻NPL 1 =Seino S.，(1999) Annu. Rev. Physiol. 61,337-62NPL 2 =Henquin J. C.，(2000)Diabetes 49，1751-60NPL 3 =Proks P.等，(2002)Diabetes 51，S368-76NPL 4 :de Rooji J.等，(1998)Nature 396,474-7NPL 5 =Kawasaki H.等，(1998) Science 282，2275-9NPL 6 :de Rooji J.等，(2000) J. Biol. Chem. 275, 20829-36NPL 7 :Bos J. L.等，(2003)Mol. Cell. Biol. 4，733-8NPL 8 =Nikolaev V. 0.等，(2004) J. Biol. Chem. 279,37215-8NPL 9 =Dipilato L. M.等，(2004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101，16513-8NPL 10 =Ponsioen B.等，(2004)EMBO R印.5，1176-80NPL 11 =Holz G. G.等，(2004)Diabetes 53,5-13
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發明內容
技術問題在上述背景下，本發明的ー個目的是提供篩選靶向Epac2的新胰島素分泌加強劑 的方法，該方法利用與兩種螢光蛋白融合的Epac2作為傳感器。本發明的另ー個目的是提 供篩選包括SU劑在內的已知抗糖尿病藥物的方法以獲知他們如何正確使用，該方法基於 它們與Epac2的結合。解決問題的方案本發明人發現已知靶向SURl分子的SU劑的新作用機制，在所述機制內SU劑通過 結合Epac2行使作用。本發明基於上述發現並通過進一歩研究完成。因此本發明提供了如下項。1. ー種編碼螢光標記的Epac2的DNA，包含編碼發出波長彼此不同的螢光的兩種 不同螢光蛋白的兩種不同DNA和編碼Epac2的DNA，這些DNA同框融合。2.如1所述的DNA，其中所述兩種不同螢光蛋白是青色螢光蛋白和黃色螢光蛋白。3.如上述2所述的DNA，其中編碼所述青色螢光蛋白的DNA和編碼所述黃色螢光 蛋白的DNA分別與編碼Epac2的DNA的5『-和3『-末端融合。4.如上述2或3所述的DNA，其中所述青色螢光蛋白是ECFP且所述黃色螢光蛋白 是EYFP。5. ー種表達載體，其包含如上述1-4中一項所述的摻入DNA。6.如上述5所述的表達載體，其中所述表達載體用於哺乳動物細胞。7. ー種細胞，其是攜帶有如上述5或6所述的表達載體的轉化體。8.如上述7所述的細胞，其中所述細胞是哺乳細胞。9.如上述8所述的細胞，其中所述細胞不表達SURl基因。10.如上述9所述的細胞，其中所述細胞是COS細胞。11. 一種螢光標記的Epac2，其是融合蛋白，包含Epac2和與之融合的兩種不同的 螢光蛋白，其中所述兩種不同的螢光蛋白發出彼此波長不同的螢光。12. 一種螢光標記的Epac2，其是融合蛋白，包含兩種不同的螢光蛋白和Epac2，其 中所述融合蛋白在如上述7-10中任一所述的細胞內表達。13. 一種篩選胰島素分泌增強劑的方法，該方法包括步驟提供胰島素分泌增強 劑的候選化合物，使各候選化合物與如上述7-10之一所述的細胞接觸，在所述候選化合物 與所述細胞接觸前後用所述兩種不同螢光蛋白中的短波長螢光蛋白的激發光照射所述細胞以測量所述細胞中包含在螢光標記的Epac2內的所述兩種不同螢光蛋白各自發出的螢光強度，檢測所述候選化合物與所述細胞接觸前後的所述兩種不同螢光之間強度比率的變化，和篩選引起變化的候選化合物作為胰島素分泌增強劑。14. 一種篩選胰島素分泌增強劑的方法，該方法包括步驟提供胰島素分泌增強劑的候選化合物，使各候選化合物與如上述11或12所述的螢光標記Epac2接觸，在所述候選化合物與所述Epac2接觸前後用所述兩種不同螢光蛋白中的短波長螢光蛋白的激發光照射所述Epac2以測量包含在所述螢光標記的Epac2內的所述兩種不同螢光蛋白各自發出的螢光強度，檢測與所述候選化合物接觸前後的所述兩種不同螢光之間的強度比率的變化，和篩選引起變化的候選化合物作為胰島素分泌增強劑。發明的有益效果本發明能夠篩選靶向Epac2的胰島素分泌增強劑。由於目前沒有已知的靶向 Epac2的胰島素分泌增強劑，本發明可用於篩選通過新作用機制工作的抗糖尿病藥物。考慮到糖尿病的產生機制沒有完全了解，且有患者耐受當前的醫療治療，本發明的方法是有意義的。附圖簡要說明[

圖1]圖1是野生型小鼠Epac2表達載體的載體圖，pFLAG-EpaC2。[圖2]圖2是突變型小鼠Epac2表達載體的載體圖，pFLAG_Epac2G114EG244D。[圖3]圖3a是pFLAT_CMV_2的載體圖，圖北是其多克隆位點的核苷酸序列。[圖4]圖4顯示載體pECFP-Cl的基因圖和其多克隆位點的核苷酸序列。[圖5]圖5顯示載體pEYFP-Nl的基因圖和其多克隆位點的核苷酸序列。[圖6]圖6是螢光標記的小鼠Epac2和螢光標記的突變型小鼠的Epac2的二級結構示意圖=ECFP 青色螢光蛋白，EYFP 黃色螢光蛋白，A和B :cAMP結合結構域，DEP [蓬亂蛋白，Egl-10，普列克底物蛋白結構域，REM =Ras交換基序，RA =Ras相關結構域，GEF =GEF 結構域。[圖7]圖7顯示用FRET技術對8_溴-cAMP存在下的C0S-1細胞內螢光標記的小鼠Epac2的動態分析。縱軸表示R/禮值，橫軸表示加入8-溴-cAMP後的時間流逝。數據分別表示(a)螢光標記的小鼠Epac2，和(b)螢光標記的突變型小鼠Epac2。[圖8]圖8顯示SU劑對採用FRET技術動態分析MIN6細胞內螢光標記小鼠Epac2 的影響。縱軸表示R/Ro值，橫軸表示加入SU劑後的時間流逝。分別加入(a)甲苯磺丁脲和(b)格列本脲作為SU劑。[圖9]圖9顯示SU劑對採用FRET技術動態分析C0S-1細胞內螢光標記的小鼠 Epac2的影響。縱軸表示R/R。值，橫軸表示加入SU劑後的時間流逝。分別加入(a)甲苯磺丁脲，(b)格列本脲，(c)氯磺丙脲，(d)乙醯苯磺醯環己脲，(e)格列甲嗪，(f)格列齊特， 和(g)那格列奈作為SU劑。[圖10]圖10顯示氚標記的格列本脲結合小鼠Epac2的競爭特性。(a)黑色圓圈 總結合，空心圓圈100 μ M未標記格列本脲存在下的結合。縱軸表示結合的氚標記的格列本脲的放射活性(DPM)，橫軸表示氚標記的格列本脲的加入量。(b)空心圓圈未標記的格列本脲，黑色圓圈甲苯磺丁脲，空心三角形8-溴-cAMP。縱軸表示結合的氚標記的格列本脲的比例，橫軸表示競爭化合物的加入量(-log Μ)。
[圖11]圖11顯示MIN6細胞中SU劑誘導的Rapl活化情況。在各圖中，上部分表示GTP結合的Rapl的量，下部分表示Rapl總量。分別加入(a)甲苯磺丁脲，(b)格列本脲，(c)氯磺丙脲，(d)乙醯苯磺醯環己脲，(e)格列甲嗪，和(f)格列齊特。[圖12]圖12顯示在Epac2缺失胰腺β細胞內的SU劑所致的Rap1活化情況。 圖中的標記分別代表TLB 甲苯磺丁脲，CLP 氯磺丙脲，ACT 乙醯苯磺醯環己脲，GLP 格列甲嗪，和GLB:格列本脲。數據來自(a)EpaC2缺失胰腺β細胞，和(b)表達導入的小鼠 Epac2的Epac2缺失胰腺β細胞。[圖13]圖13分別顯示野生型小鼠(空心柱)和Epac2缺失小鼠(黑色柱)的胰腺β細胞分泌的胰島素量。分別加入(a)葡萄糖或KC1，(b)甲苯磺丁脲，(c)格列本脲， 和(d)格列齊特。[圖14]圖14顯示野生型小鼠(WT)和Epac2缺失小鼠(EpacIO)的血清胰島素濃度和血糖濃度。空心柱和空心圓圈表示野生型小鼠的數據，黑色柱和黑色圓圈表示Epac2 缺失小鼠的數據。(a)葡萄糖單獨給予，或(b)葡萄糖和甲苯磺丁脲一起給予。實施方式說明在本發明中，當簡單地描述「Epac2」時，表示哺乳動物Epac2，具體的指小鼠和人 Epac2，且尤其指野生型Epac2。小鼠野生型Epac2的cDNA序列示為SEQ ID N0:1，其胺基酸序列示為SEQ ID NO :2。人野生型Epac2的cDNA序列示為SEQ ID NO :3，胺基酸序列示為SEQ ID NO :4。人Epac2cDNA可通過公知的方法獲得(非專利文獻5)。小鼠和人的野生型Epac2的胺基酸序列都由1011個胺基酸殘基組成，它們彼此僅有25個胺基酸不同。且在所述不同的胺基酸中的每五個中，所述不同限於相似胺基酸對之間(一個酸性胺基酸，一個鹼性胺基酸，兩個支鏈胺基酸和一個羧基胺基酸)。因此，它們之間的同源性很高，即不低於98%。這一高同源性有力證明了它們在結構和功能上基本等同。 同時，在本發明中，當簡單地描述「Epac2」時，不僅包括自然產生的全長Epac2，還包括那些包含部分Epac2胺基酸序列的肽，該部分序列包括其cAMP結合結構域，蓬亂蛋白，Egl_10， 普列克底物蛋白(DEP)結構域(該結構域起著膜定位的作用)，Ras交換基序(REM)結構域， 位於羧基末端的GEF結構域，位於氨基末端的cAMP結合結構域，和與Ras相互作用的Ras 相關(RA)結構域。本發明中，「螢光標記的Epac2」指包含Epac2和與前者融合的兩種不同螢光蛋白的蛋白質。雖然只要融合到Epac2的螢光蛋白組合可引起FRET，這兩種不同的螢光蛋白的任意組合都可融合到Epac2上，但優選青色螢光蛋白和黃色螢光蛋白的組合，更優選 ECFP (增強型青色螢光蛋白)和EYFP (增強型黃色螢光蛋白)的組合。當採用的螢光蛋白組合由青色螢光蛋白和黃色螢光蛋白組成時，雖然只要形成的融合蛋白能引起FRET，這些蛋白各自可融合到Epac2的N末端或其C末端上，但優選青色螢光蛋白融合到N-末端上，且黃色螢光蛋白融合到C-末端上。本發明中，術語「FRET技術」指將螢光標記的Epac2產生的變化檢測為通過FRET 發出的螢光變化的方法。在本發明中，術語「螢光」還指螢光標記的Epac2通過FRET發出的螢光。儘管只要摻入載體的螢光標記的Epac2能表達，各種表達載體就可用在本發明中而沒有任何具體的限制，但優選用於哺乳動物的表達載體。術語「用於哺乳動物細胞」表示所述載體能夠作為表達載體在哺乳動物細胞內起作用。只要在細胞被本發明表達載體轉化時，螢光標記的Epac2能在所述細胞中表達， 對於本發明所用細胞沒有具體的限制，並且所述細胞可能是包括大腸桿菌(E.coli)的原核細胞或真核細胞如酵母或哺乳動物細胞。當本發明使用哺乳動物細胞時，對於細胞源自的物種沒有具體限制，優選使用源自人、猿、小鼠或大鼠的細胞。此外，對可用的細胞種類沒有具體的限制，且可使用那些細胞如成纖維細胞、腎源細胞、上皮細胞和胰腺β細胞，還可使用任何正常細胞、癌化細胞、細胞系和原代細胞培養物。而且，本發明使用的哺乳動物細胞可以是那些表達Katp通道的細胞例如源自胰腺 β細胞的ΜΙΝ6細胞或是那些不表達Katp通道的細胞例如COS細胞如C0S-1細胞。然而，在要避免SURl和螢光標記的Epac2之間任何相互作用的影響的情況下，優選不表達Katp通道的細胞。術語「不表達Katp通道的細胞」不僅包括那些根本不表達Katp通道的細胞，還包括那些表達Katp通道但僅表達量很小以至於不能對用FRET技術獲取的測量值產生影響的細胞。本發明的篩選胰島素分泌增強劑的方法可通過以下方式進行觀察表達螢光標記 Epac2的細胞與試劑接觸之後、或之前和之後FRET技術產生的螢光變化。如果所述螢光標記的Epac2由Epac2和與之融合的青色螢光蛋白和黃色螢光蛋白組成，則可用作FRET技術的激發光波長為435-445nm，優選440nm。且在這種情況下發出的螢光的波長為475-485nm 和 530-540nm，特別是 480nm 和 535nm。進一步，在本發明的篩選胰島素分泌增強劑的方法中，可使用表達螢光標記的 Epac2的細胞勻漿以及完全或部分純化自該勻漿的螢光標記的Epac2。對於可被本發明篩選的胰島素分泌增強劑沒有具體的限制，只要它們能直接或間接通過Epac2增加胰島素分泌，且它們包括治療1型和2型糖尿病的試劑。所述術語「直接通過Epac2」作用指試劑通過直接結合Epac2起作用，且術語「間接通過Epac2」作用指胰島素分泌增強劑通過它對Epac2相關分子的作用引起信號傳輸(如通過所述信號傳輸通路的 Epac2上遊蛋白如Rab3起作用，或通過結合Epac2的分子起作用)，儘管所述試劑本身並不直接結合Epac2。因此本發明可用於篩選通過Epac2起作用的胰島素分泌增強劑。反過來，這意味著本發明可用於從包括已知的抗糖尿病藥物的胰島素篩選增強劑中篩選不通過Epac2起作用的試劑。進一步，本發明可用於篩選用於缺乏Katp通路的糖尿病患者的治療劑或評估它們的藥理學效果。本文所述術語「缺乏Katp通路的糖尿病患者」指那些遺傳性缺乏Katp通路的糖尿病患者且包括具有該遺傳特性的新生兒糖尿病患者。本文待篩選或評估藥理學效果的治療劑包括例如SU劑。本發明揭示了一些SU劑通過Epac2表現其藥理學活性，而其他的則不通過Epac2。那些預期在治療缺乏Katp通路的糖尿病患者中起作用的SU劑，是那些通過Epac2表現其藥理學活性的SU劑，此類試劑可用本發明篩選和評估它們的效果。
實施例參照實施例對本發明進行進一步詳細的描述。然而，這並不意味著本發明受所述實施例限制。具體地，雖然下述實施例是在小鼠Epac2上，但如上所述小鼠Epac2和人Epac2 都由1011胺基酸組成且它們之間的同源性不低於98%的事實強有力地證明它們在結構和功能上基本等同。因此，下述實施例在小鼠Epac2上獲得的所有結果在基本等同的人Epac2 上也必然有效。同時，所有動物實驗依照神戶大學醫學院倫理委員會(Ethics Committee, School of Medicine, Kobe University)的指南進行。試劑格列本脲購自ALEXIS公司(美國聖地牙哥市)。甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、乙醯苯磺醯環己脲、格列甲嗪、那格列奈和12-0-十四烷醯基-佛波醇-13-乙酸鹽(TPA)購自西格瑪(SIGMA)公司(美國聖路易斯市)。格列齊特購自LKT實驗室(美國聖保羅市)。氚標記的格列本脲購自帕金埃爾默(PerknElmer)公司(美國沃森姆市)。動物缺乏Epac2 的小鼠用文獻 Shibasaki T.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104， 19333-9(2007)中所述技術製備。在所有動物實驗中用野生型小鼠(C57BL/6)作為對照組。缺乏Epac2的胰腺β細胞。缺乏Epac2 的胰腺 β 細胞按照文獻 Shibasaki Τ.等 Proc. Natl. Acad. ki. USA 104,19333-9(2007)中公開的技術獲得，所述細胞分離自Epac2缺乏的小鼠和IT6小鼠交配後繁殖的小鼠，其中SV40大T抗體在人胰島素基因啟動子控制下表達。製備IT6小鼠的方法如文獻 Miyazaki J，等 Endocrinology，127，126-132 (1990)所述。進一步，MIN6 細胞通過日本專利申請公開號2002-125661中所述技術製備。小鼠Epac2表達載體所用的野生型小鼠Epac2表達載體(pFLAG-EpaC2 圖1)和突變型小鼠表達載體 (pFLAG-Epac2 G114E G422D:圖 2)如文獻Ozaki N.等 U000)Nat. Cell. Biol. 2,805-811所述(非專利文獻13)。在野生型小鼠Epac2cDNA(SEQ ID NO 1)中，除了終止密碼子(tag) 外的前14個鹼基和後12個鹼基是PCR中使用的引物序列。用於構建pFLAG-Epac2 和 pFLAG_Epac2 G114E G422D 的 pFLAT-CMV-2 的載體圖示於圖3a，且其全長DNA的核苷酸序列示於SEQ ID NO :5，其多克隆位點的核苷酸序列分別示於圖 3b 和 SEQ ID NO :6。在表達載體pFLAG-Epac2 和 pFLAG-Epac2 G114E G422D 中，Epac2 基因插入到pFLAT-CMV-2載體的EcoRI位點。進一步，上述所用的小鼠突變型Epac2的cDNA序列示為SEQ ID NO :7，且其胺基酸序列示為SEQ ID NO :8ο構建青色和黃色螢光標記的小鼠Epac2表達載體-步驟1 使用上述小鼠Epac2表達載體pFLAG_Epac2作為模板，用引物BglII_Epac2 (5 『 -agatctatggtcgctgcgca-3『 ,SEQ ID NO :9)禾口弓丨物 Epac2_EcoRI(5' -gaattctggccttcga gg-3『 =SEQ ID NO 10)進行PCR反應以擴增小鼠Epac2的cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個循環(95°C 30秒，55°C :30秒，68°C 2分鐘)，30個循環(94°C :30秒， 500C 30秒，68°C 3分鐘)和之後的最終反應(68°C 5分鐘)組成。如此擴增的小鼠野生型Epac2cDNA (上述SEQ ID NO 1)用BglII和EcoRI酶切，之後插入到已用Bgl11和EcoRI 酶切的青色螢光蛋白(ECFP)表達載體pECFP-Cl (圖4，克隆泰克公司(Clontech))中，其多克隆位點的DNA序列示於SEQ ID NO 11。所獲的這個載體命名為pECFP-小鼠Epac2表達載體。分別地，青色螢光蛋白(ECFP)的cDNA序列示於SEQ ID NO 12，其胺基酸序列示於 SEQ ID NO :13ο構建青色和黃色螢光標記的小鼠Epac2表達載體-步驟2 使用黃色螢光蛋白表達載體pEYFP-Nl (圖5，克隆泰克公司)作為模板(該載體多克隆位點的 DNA 序列示於 SEQ ID NO :14)，用引物 GFP-fw(5' -atggtgagcaagggcg-3 『 SEQ ID NO 15)和引物 GFP_rv(5' -cttgtacagctcgtccat-3『 :SEQ IDNO :16)進行 PCR 以擴增黃色螢光蛋白EYFP的cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個循環(95°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 1 分鐘)，30 個循環(94°C :30 秒，52°C :30 秒，68°C 1 分鐘)和之後的最終反應(68°C :5分鐘)組成。使用通過PCR獲得的EYFP的cDNA作為模板，用引物 EcoRI-EYFP(5『 -gaattcatggtgagcaagg-3『 :17)禾口弓|物 EYFP-EcoRI(5' -gaattccttgta cagctcgt-3' =SEQ ID NO :18)進行 PCR 以擴增加上一個 EcoRI 位點的 EYFP cDNA。黃色螢光蛋白(EYFP)的cDNA序列示於SEQ ID NO 19，其胺基酸序列示於SEQ ID NO :20。在所述cDNA中，除了終止密碼子「tag」外的前端13個鹼基和最後14個鹼基是引物序列。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個循環(95°C :30秒，55°C :30秒，72°C :1分鐘)，30 個循環(94°C 30秒，52°C 30秒，68°C 1分鐘)和之後的最終反應(68°C 5分鐘)組成。 所述擴增的加入EcoRI位點的EYFP cDNA用EcoRI酶切並插入到已用EcoRI酶切的前述 PECFP-小鼠Epac2表達載體中。所獲的載體用作螢光標記的小鼠Epac2表達載體。構建突變型螢光標記的小鼠Epac2表達載體-步驟1 使用前述突變型小鼠Epac2表達載體(pFLAG-EpaC2 G114E G422D)作為模板， 用引物 Bgl II-Epac2 (前述的 5 『 -agatctatggtcgctgcgca-3 『，SEQ ID NO 9)和引物 Epac2-EcoRI(前述的 5' -gaattctggccttcgagg-3 『 :SEQ ID NO 10)進行 PCR 反應以擴增突變型小鼠Epac2cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個循環(95°C :30秒， 550C 30 #, 680C 2 分鐘),30 個循環(94°C 30 秒，50°C :30 秒，68°C 3 分鐘)和之後的最終反應(68°C 5分鐘)組成。所述擴增的突變型小鼠Epac2cDNA用BglII和EcoRI酶切， 之後插入到PECFP-Cl載體中(克隆泰克公司)。所獲的這個載體命名為突變型pECFP-小鼠Epac2表達載體。構建突變型螢光標記的小鼠Epac2表達載體-步驟2 使用所述pEYFP-Nl載體(克隆泰克公司)作為模板，用引物 GFP-fw(前述的 5 『 -atggtgagcaagggcg-3 『 =SEQ ID NO 15)和引物 GFP-rv (5 『 -cttgtacagctcgtccat-3 『 :SEQ ID NO 16)進行 PCR 以擴增所述黃色螢光蛋白EYFP cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個循環(95°C :30秒，55°C :30秒， 72°C:1分鐘)，30個循環(94°〇:30秒，521:30秒，681:1分鐘)和之後的最終反應(68°C 5分鐘)組成。然後使用通過PCR獲得的EYFP cDNA作為模板，用引物EcoRI-EYFP(前述的 5 『 -gaattcatggtgagcaagg-3 『 :SEQ ID NO 17)禾Π 弓丨物 EYFP-EcoRI (前述的 5' -gaattccttgtacagctcgt-3『 :SEQ ID NO 18)進行 PCR 以擴增加入 EcoRI 位點的 EYFP cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個循環(95°C :30秒，55°C :30秒，72°C 1 分鐘)，30個循環(94°C 30秒，52°C :30秒，68°C 1分鐘)和之後的最終反應(68°C 5分鐘)組成。所述擴增的加入EcoRI位點的EYFP cDNA用EcoRI酶切並插入到已用EcoRI酶切的所述突變型PECFP-小鼠Epac2表達載體中。所獲的這個載體命名為螢光標記的突變CN 102395677 A
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型小鼠Epac2表達載體。圖6是螢光標記的小鼠Epac2和螢光標記的突變型小鼠的Epac2的二級結構示意圖。細胞培養和轉化在5% CO2下將MIN6和C0S-1細胞培養物導入包含10%熱滅活胎牛血清的杜爾伯科改良伊勾培養基(Dulbecco' s modified Eagle' s medium, DMEM)中。用 FuGENE6 轉染試劑(羅氏分子生物化學公司，瑞士巴塞爾)進行所述細胞的轉化。通過FRET技術對螢光標記的小鼠Epac2的觀察和動態分析測量前兩天，用螢光標記的小鼠Epac2表達載體轉化所述細胞並培養。測量前一天，將所述細胞轉移到直徑25mm的玻璃培養皿上繼續培養。轉化後約48小時，用 HEPES-KRB 緩衝液替代培養基(HEPES 緩衝液包含 133. 4mM NaCU 4. 7mM KCl、1. 2mM KH2PO4, 1. 2mM MgSO4,2. 5mM CaCl2,5. OmM NaHCO3,2. 8mM 葡萄糖禾口 0. 2% BSA(pH 7. 4))。通過裝有 UPlanSApo物鏡(100倍油鏡/1. 40NA)的共聚焦顯微鏡(FV1000，奧林巴斯公司(Olympus Corporation))觀察所述細胞，將所述物鏡焦點設置在細胞上，並用波長440nm的激發光照射，使用440nm LD雷射器(FV5-LDPSU，奧林巴斯公司)，功率0. 5%。如此激發的螢光標記小鼠Epac2所發出的螢光通過兩個螢光濾片480DF30 (用於480nm光)和535DF25 (用於 535nm光)觀察，作為每5秒的螢光雙重圖像用於所述發出螢光的動態分析。每次測量中在首次計算535nm與480nm的螢光強度的比率R後(535nm強度/480nm強度的比率)，所述動態分析的結果用所述比率除以初始值Rtl導出的值表示，即R/Ro。所有觀察在室溫下進行。硫醯脲類結合實驗用小鼠Epac2表達載體轉化COS 1細胞。轉化兩天後，用緩衝液QOmM HEPES，包含 119mM NaCl,4. 7mM KCl，2· 5mM CaCl2,1. 2mM KH2PO4,1. 2mM MgSO4,5. OmM NaHCO3, (pH 7. 4)) 清洗所述細胞兩次並將其以2. 5-5. 2xl05細胞/400 μ 1的濃度懸浮於同一緩衝液中。所述細胞再分成每管400μ 1，在加入氚標記的格列本脲後室溫靜置1小時。同時加入未標記的格列本脲或甲苯磺丁脲等，與氚標記的格列本脲競爭。破裂C0S-1細胞，且在細胞內結合到蛋白上的氚標記的格列本脲通過真空過濾被吸收到沃特曼GF/C膜上(沃特曼(Whatman) 公司，英國梅德斯通市)。用冰冷卻的相同緩衝液清洗所述膜四次，然後在液體閃爍計數器上測量放射活性。GTP-RAPl 牽出實驗按照文獻Shibasaki T.等 Proc. Natl. Acad. ki. USA 104，19333-9 Q007)所述的方法進行GTP-RAPl牽出實驗。即，預先在HEPES-KRB緩衝液中靜置30分鐘的MIN6細胞在包含感興趣的試劑和2. SmM葡萄糖的HEPES-KRB緩衝液中繼續培養15分鐘。然後破裂上述細胞，在所獲細胞裂解物中加入結合有GST-RalGDS-RID的穀胱甘肽樹脂(西格瑪公司)。 4°C孵育90分鐘後，離心分離所述樹脂，用HEPES-KRB緩衝液清洗數次，並進行SDS-PAGE凝膠電泳。所述SDS-PAGE凝膠電泳後，進行Western印跡以將蛋白轉移到PVDF膜上，並且用抗Rapl抗體(聖克魯茲生物技術公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)，美國)檢測轉移到所述膜上的Rapl。胰島素分泌實驗小鼠胰腺β細胞分離自野生型小鼠(C57BL/6)或Epac2缺陷小鼠並培養兩天。所述小鼠胰腺β細胞在含2. 8mM葡萄糖的HEPES-KRB緩衝液中靜置30分鐘。然後以每孔包含5個相似大小的胰島的方式將所述細胞分配到92孔板上，並在包含感興趣的試劑和 2. SmM葡萄糖的100 μ 1 HEPES-KRB緩衝液中培養15分鐘。用胰島素實驗試劑盒(醫學生物學實驗室有限公司(Medical Biological Laboratories Co. Ltd.))測量釋放入上述培養基中的和細胞中的胰島素量。分泌的胰島素量用細胞中的胰島素量標準化。口服葡萄糖耐受測試禁食16小時的小鼠單獨口服給予1. 5g/kg體重的葡萄糖或1. 5g/kg體重的葡萄糖加上100mg/kg體重的甲苯磺丁脲。在預定時間提取外周血樣本，並用ELISA試劑盒(莫林納加(Morinaga)公司製造)和安特森III (Antsense III)糖分析儀(拜爾醫藥有限公司Bayer Yakuhin, Ltd.)分別測量血清胰島素濃度和血糖濃度。用FRET技術觀察螢光標記的小鼠Epac2的三維結構變化當轉化有螢光標記小鼠Epac2表達載體的所述C0S-1細胞(表達螢光標記小鼠 Epac2的C0S-1細胞)在包含有ImM或IOmM 8-溴-cAMP (cAMP類似物)的緩衝液中用FRET 技術進行6分鐘測量時，觀察到R/禮值有濃度依賴性的降低(圖7a)。認為R/禮值的所述降低是FRET改變的結果，所述改變是螢光標記小鼠Epac2與8-溴-cAMP的結合導致其三維結構的改變引起的。另一方面，當用同樣的方法測量轉化有螢光標記突變型小鼠Epac2 表達載體(其cAMP結合位點被破壞)的所述C0S-1細胞時，沒有觀察到R/%值的降低(圖 7b)。認為這是由於8-溴-cAMP不能結合到所述突變型螢光標記的小鼠Epac2上，沒有造成所述突變型螢光標記的小鼠Epac2的三維結構發生變化，這就沒有導致FRET的變化。此外，在沒有加入8-溴-cAMP作培養時，上述兩種情況下都沒有觀察到R/%的變化(圖7a、 7b)。這些結果證明由8-溴-cAMP與之結合造成的螢光標記的小鼠Epac2的高級結構的變化可通過所述FRET技術在細胞中觀察到。因此，cAMP和Epac2的結合是通過Epac2的信號傳導的步驟之一，用表達螢光標記的小鼠Epac2的細胞可隨著時間觀察到所述結合步
馬聚οSU劑和螢光標記的小鼠Epac2的結合當有SU劑(甲苯磺丁脲或格列甲嗪)存在下，用FRET技術測量轉化有螢光標記小鼠Epac2表達載體的MIN6細胞時，觀察到R/&值有濃度依賴性的降低。因為已知所述SU 劑通過與SURl (Katp通道的組分)結合表現其功能，所以不排除這裡觀察到的所述R/R。值的降低可能是SURl的間接效應。因此，在有一種不同的SU劑存在下，用FRET技術測量表達螢光標記小鼠Epac2而不表達SURl的C0S-1細胞，並且該測量顯示有甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙醯苯磺醯環己脲和格列甲嗪存在下觀察到R/&降低(圖9a_e)。該結果說明這些SU劑不是通過 SURl作用而是直接作用在Epac2上以改變其高級結構。這是令人意外的，因為從未預期 Epac2是SU劑的靶標。另一方面，有格列齊特和那格列奈存在下沒有觀察到R/禮值的變化，儘管它們也是SU劑。這說明這些試劑不是直接作用在Epac2上造成其高級結構變化的 (圖9f-g)。因為Epac2是在胰島素分泌中起作用的信號傳輸器，所以上述結果說明SU劑可因其作用機制而有不同組，一種通過Epac2起作用和另一種不是。之後，為了驗證SU劑是否直接與Epac2結合，用氚標記的格列本脲進行硫醯脲類結合測試。所述轉化有小鼠Epac2表達載體的C0S-1細胞在濃度為1_40ηΜ的氚標記的格列本脲存在下培養，之後破裂所述細胞以測量結合到C0S-1的胞內因子上的氚標記格列本脲的放射活性。與濃度為100 μ M的非放射性標記的格列本脲共存培養時，氚標記的格列本脲的非特異性結合量即為所測的放射活性。結果顯示，氚標記的格列本脲的特異性結合量以濃度依賴性方式增加(圖IOa)。另一方面，在正常C0S-1細胞中觀察到非特異性結合(數據未顯示)。這些結果表明格列本脲與Epac2特異結合。接下來，轉化有小鼠Epac2表達載體的C0S-1細胞在未標記的格列本脲(GLB)、甲苯磺丁脲(TLB)或8-溴-cAMP(8-Br-cAMP)和IOnM氚標記的格列本脲共存下培養以使它們競爭結合Epac2。結果顯示，非標記的格列本脲的IC5tl為25nM，甲苯磺丁脲的IC5tl為240 μ Μ, 且8-溴-cAMP幾乎沒有觀察到競爭性(圖IOb)。這些結果說明格列本脲對Epac2的親和力比甲苯磺丁脲高。此外，它們還說明Epac2分子上的格列本脲結合位點與cAMP結合位點沒有重疊。這些結果表明用FRET技術，利用螢光標記的Epac2作為傳感器有可能觀察到試劑 (包括SU劑)是否結合Epac2。Epac2 參與 SU 劑激活 Rap 1 Epac2有GEF活性且通過將Rapl與GTP結合使其轉換為GTP結合的Rapl而激活 Rapl0所述反應組成β細胞中胰島素分泌的信號傳輸的一部分。因此，用源於β細胞的 ΜΙΝ6細胞檢測Rapl是否被SU劑激活。使用GTP-RAPl牽出實驗，通過測定GTP結合的Rapl 來檢測Rapl的激活。使用稱為Rapl激活劑化合物的8-溴-cAMP和TPA作為陽性對照。結果顯示，發現甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙醯苯磺醯環己脲和格列甲嗪在MIN6細胞中以濃度依賴性的方式提高GTP結合的Rapl含量，即激活了 Rapl (圖lla_e)。 然而，雖然格列本脲直到濃度為IOOnM都提高GTP結合的Rapl含量，但它在更高的濃度沒有提高作用(圖lib)。另一方面，沒有發現格列齊特在MIN6細胞中對GTP結合的Rapl的含量有影響，即未激活Rapl (圖11)。全部激活Rapl的甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙醯苯磺醯環己脲和格列甲嗪是用FRET技術觀察到R/R0值降低的SU劑，而沒有激活Rapl的格列齊特是沒有觀察到 R/R0值降低的SU劑。這些結果表明SU劑對Rapl的激活通過SU劑結合Epac2進行。然後，用Epac2缺乏的胰腺β細胞檢測Rapl是否被SU劑激活。使用GTP-RAPl 牽出實驗，通過測定GTP結合的Rapl的含量來檢測Rapl的激活。用已知可激活Rapl的 8-溴-cAMP和TPA作為陽性對照。結果顯示，在MIN6細胞中發現激活Rapl的甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙醯苯磺醯環己脲和格列甲嗪在上述Epac2缺乏的胰腺β細胞中沒有激活Rapl (圖12a)。然而，當在用小鼠Epac2表達載體轉化Epac2缺乏的胰腺β細胞後進行相似的實驗，發現所有上述試劑激活Rapl (圖12b)。這些結果說明所述SU劑是通過Epac2激活Rapl的。另一方面，即使在小鼠Epac2表達載體轉化的Epac2缺乏的胰腺β細胞中，用FRET技術檢測到對R/Ro值沒有影響的那格列奈也沒有激活Rapl (數據未顯示)。這些結果表明使用螢光標記的Epac2作為傳感器，採用FRET技術觀察到結合 Epac2的上述試劑通過Epac2激活Rapl。即，所述結果表明使用螢光標記的Epac2作為傳感器的FRET技術可用於篩選通過Epac2激活Rap 1的試劑。
SU劑通過Epac2對胰島素分泌的影響利用胰島，在胰島素分泌試驗中測量SU劑通過Epac2對胰島素分泌的影響。首先， 用葡萄糖刺激獲自野生型小鼠和Epac2缺乏小鼠的胰島，並測量胰島素分泌量。結果顯示， 二者之間的胰島素分泌沒有發現顯著不同(圖13a)。用KCl進行刺激後的結果一樣(圖 13a)。然後，用FRET技術中檢測能降低R/禮值的甲苯磺丁脲(IOOnM)或格列本脲(IOnM) 刺激獲自野生型小鼠和Epac2缺乏小鼠的胰島，並用同樣的方法測量胰島素分泌量。結果顯示，這些試劑刺激後，Epac2缺乏小鼠的胰島與野生型小鼠的胰島相比表現出明顯較低的胰島素分泌(圖13b，c)。另一方面，用FRET技術中未檢測到R/&值變化的格列齊特的兩組之間沒有發現明顯不同(圖13d)。這些結果表明通過Epac2的通路對於採用FRET技術測定到R/Ro值降低的那些SU劑表現其全部藥理學效果是必須的。為了檢測通過Epac2的SU劑的體內效果，依照口服葡萄糖耐受測試，在口服給予葡萄糖後測量甲苯磺丁脲對血清胰島素和血糖濃度的影響。首先，對野生型小鼠和Epac2 缺乏小鼠單獨給予葡萄糖，並測量其血清胰島素和血糖濃度，其結果顯示兩組間沒有顯著差異(圖14a)。接下來，葡萄糖和甲苯磺丁脲一起給予，並用同樣的方法進行測量。結果顯示與野生型小鼠相比，Epac2缺乏小鼠的血清胰島素濃度較低(圖14b)。同時，與所述血清胰島素濃度相對應，Epac2缺乏小鼠的血糖濃度高於野生型小鼠(圖14b)。上述結果表明通過Epac2的SU劑也在體內表現出效果，且激活EpaC2/Rapl信號傳輸通路對於某些SU劑(包括甲苯磺丁脲)完全表現其效果是必須的。進一步發現，因為通過Epac2激活Rapl的試劑可採用以螢光標記的Epac2作為傳感器的FRET技術進行篩選， 所以可用相同的方法篩選通過Epac2增強胰島素分泌的試劑。例如，因為可用作治療缺乏 Katp通路的糖尿病患者的藥劑的SU劑局限於激活Epac2/Rapl信號傳輸通路的那些試劑，所以可用本方法篩選此類試劑。相反，也可篩選不能激活Epac2/Rapl信號傳輸通路的試劑。工業實用性本發明可用作篩選應用於糖尿病患者的胰島素分泌增強劑的材料，也可用作所述篩選的方法。
0140]序列表自由文字0141]SEQIDNO1 =小鼠野生型Epac20142]SEQIDNO3 =人野生型Epac20143]SEQIDNO5 = pFLAT-CMV-2 全長 DNA0144]SEQIDNO6 =多克隆位點，pFLAT-CMV-20145]SEQIDNO7 =小鼠突變型 Epac2(Epac2 G114E G422D)0146]SEQIDNO9 =引物 BglII-Epac20147]SEQIDNO10 =引物 Epac2-EcoRI0148]SEQIDNO:11 =多克隆位點，PECFP-Cl0149]SEQIDNO12 = ECFP0150]SEQIDNO13 =合成的構建體0151]SEQIDNO14 =多克隆位點，pEYFP-Nl0152]SEQIDNO15 =引物 GFP-fw0153]SEQIDNO16 =引物 GFP-rv
SEQIDNO:17=引物 EcoRI-EYFP
SEQIDNO:18=引物 EYFP-EcoRI
SEQIDNO:19=EYFP
SEQIDNO:20=合成的構建體
權利要求
1.一種編碼螢光標記的Epac2的DNA，包含編碼發出波長彼此不同的螢光的兩種不同螢光蛋白的兩種不同DNA和編碼Epac2的DNA，這些DNA同框融合。
2.如權利要求1所述的DNA，其特徵在於，所述兩種不同螢光蛋白是青色螢光蛋白和黃色螢光蛋白。
3.如權利要求2所述的DNA，其特徵在於，編碼所述青色螢光蛋白的DNA和編碼所述黃色螢光蛋白的DNA分別與編碼Epac2的DNA的5'-和3'-末端融合。
4.如權利要求2或3所述的DNA，其特徵在於，所述青色螢光蛋白是ECFP且所述黃色螢光蛋白是EYFP。
5.一種表達載體，其特徵在於，所述載體包含如權利要求1-4所述的摻入DNA。
6.如權利要求5所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體用於哺乳動物細胞。
7.一種細胞，其特徵在於，所述細胞是攜帶有如權利要求5或6所述的表達載體的轉化體。
8.如權利要求7所述的細胞，其特徵在於，所述細胞是哺乳細胞。
9.如權利要求8所述的細胞，其特徵在於，所述細胞不表達SURl基因。
10.如權利要求9所述的細胞，其特徵在於，所述細胞是COS細胞。
11.一種螢光標記的Epac2，其是融合蛋白，包含Epac2和與之融合的兩種不同的螢光蛋白，其中，所述兩種不同的螢光蛋白發出彼此波長不同的螢光。
12.一種螢光標記的Epac2，其是融合蛋白，包含兩種不同的的螢光蛋白和Epac2，其中，所述融合蛋白在如權利要求7-10中任一所述的細胞內表達。
13.—種篩選胰島素分泌增強劑的方法，所述方法包括以下步驟提供胰島素分泌增強劑的候選化合物，使各候選化合物與如權利要求7-10之一所述的細胞接觸，在所述候選化合物與所述細胞接觸前後用所述兩種不同螢光蛋白中的短波長螢光蛋白的激發光照射所述細胞以測量所述細胞中包含在螢光標記的Epac2內的所述兩種不同螢光蛋白各自發出的螢光強度，檢測所述候選化合物與所述細胞接觸前後的所述兩種不同螢光之間強度比率的變化，和篩選引起變化的候選化合物作為胰島素分泌增強劑。
14.一種篩選胰島素分泌增強劑的方法，所述方法包括以下步驟提供胰島素分泌增強劑的候選化合物，使各候選化合物與如權利要求11或12所述的螢光標記Epac2接觸，在所述候選化合物與所述Epac2接觸前後用所述兩種不同螢光蛋白中的短波長螢光蛋白的激發光照射所述Epac2以測量包含在所述螢光標記Epac2內的所述兩種不同螢光蛋白各自發出的螢光強度，檢測與所述候選化合物接觸前後的所述兩種不同螢光之間強度比率的變化，和篩選引起變化的候選化合物作為胰島素分泌增強劑。
全文摘要
揭示了一種篩選胰島素分泌加強劑的新方法以及進行該篩選的工具該工具包括編碼螢光標記的Epac2的DNA，包含編碼發出波長彼此不同的螢光的兩種不同螢光蛋白的兩種不同DNA和編碼Epac2的DNA，這些DNA同框融合，和轉化該DNA的細胞。還揭示了篩選胰島素分泌增強劑的方法，該方法包括將一種候選化合物與轉化有所述DNA的細胞接觸，並檢測該化合物是否結合Epac2。
文檔編號C07K14/47GK102395677SQ20108001707
公開日2012年3月28日 申請日期2010年4月15日 優先權日2009年4月17日
發明者加藤惠, 張長亮, 柴崎忠雄, 清野進 申請人:國立大學法人神戶大學, 日本化學研究株式會社