一種利用紫外光譜儀檢測PCB77的方法與流程
2023-10-09 21:37:54
本發明屬於化工領域，涉及檢測水樣中pcb77的方法，具體來說是一種利用紫外光譜儀檢測pcb77的方法。
背景技術：
多氯聯苯是一類具有209種同系物的持久性有機汙染物。20世紀以來，由於人類的不正當使用，多氯聯苯的汙染越來越嚴重，威脅著人類的健康。
近年來，很多研究結果發現多氯聯苯具有三致作用(致癌性、致突變性、致死)，並且在自然界中很難降解。多氯聯苯能夠在生物體殘留蓄積，最終可以通過食物鏈在人體內富集，即便少量的多氯聯苯，也會對生物體產生危害。pcb77(3，3′，4，4′-四氯聯苯)是一種典型的多氯聯苯同系物，具有較強的毒性。目前，針對多氯聯苯的檢測多為傳統色譜學檢測法，比如液質連用、氣質聯用等，雖然具有較高的精確度和準確度，但是這些方法操作時間較長、必須使用大型儀器，而且耗材昂貴。免疫檢測法對多氯聯苯的檢測具有較強的特異性和較低的檢測限，但是，抗體的製備較為複雜，並且不易保存，有些情況下，檢測結果會出現假陽性，從而導致實驗的失敗。因此，我們需要開發一種簡單、快速的檢測體系實現對pcb77的實時檢測。
核酸適配體是一類具有特定生物功能的核酸分子序列，一般是一段dna或者rna，通過技術selex(指數富集配體的系統進化技術)篩選而來，它能特異性識別和結合靶物質。近年來核酸適配體已被廣泛應用於檢測領域，並實現了對蛋白質、金屬離子以及小分子等進行定量檢測。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種利用紫外光譜儀檢測pcb77的方法，所述的這種利用紫外光譜儀檢測pcb77的方法要解決現有技術中採用色譜學方法和免疫學方法檢測多氯聯苯的過程操作複雜、周期較長和假陽性的技術問題。
本發明提供了一種利用紫外光譜儀檢測pcb77的方法，包括以下步驟：
1)一個製備功能核酸適配體母液的步驟，所述的功能核酸適配體的核苷酸序列為：5'-ggcggggctacgaagtagtgattttttccgatggcccgtg-3'，所述的功能核酸適配體母液的濃度為2μmol/l；
2)一個建立已知pcb77濃度的檢測體系的步驟，取12支離心管，分別加入25μl2μmol/l的核酸適配體，加入濃度為10ppm不同體積的pcb77溶液，充分混勻後將離心管置於25℃條件下孵育20～30分鐘，在反應液中加入200μl納米金溶液，充分混勻後再將離心管置於25℃條件下孵育20～30分鐘，在上述混合液中加入50μl、2mol/l的氯化鈉溶液，最後用丙磺酸緩衝液定容，使得檢測體系溶液總體積達到1000μl，留作以下測定用；
3)另取1支離心管將pcb77溶液用超純水替代，按照上述步驟(1)的方法處理後作為空白對照體系溶液；
4)分別取1000μl步驟(1)和步驟(2)製備的標準溶液和空白對照液，置於石英螢光比色皿中，用紫外光譜儀進行掃描測定信號，掃描波長範圍為450nm到700nm，並且得到520nm和650nm處的波長吸光度，pcb77和空白對照液的吸光度分別為a＝a650/a520和a0＝a650/a520，計算增強的吸光度δa＝a-a0；
5)以不同濃度pcb77(c)與對應增強吸光度δa作圖，繪製標準曲線；
6)製備樣品檢測體系：取10μl待測樣品，按照步驟1)的方法製備檢測體系離心管，按步驟4)方法測定吸光度比值並計算δa；
7)根據計算所得的δa值，查標準曲線，可以求得樣品中pcb77含量。
進一步的，所述的納米金溶液通過以下方法製備：在100ml煮沸的質量百分比濃度為0.01％的氯金酸溶液中，加入3.5ml質量百分比濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液，攪拌20～40分鐘，移除加熱裝置後繼續攪拌混合物5～15分鐘，最後，使溶液達到室溫並且使用0.2μm超濾膜過濾，然後儲存在恆溫為4℃的棕色玻璃瓶中備用。
進一步的，上述步驟2)中，檢測體系中核酸適配體的最終濃度為50nmol/l，檢測體系中氯化鈉的最終濃度為100mmol/l。
進一步的，所述的丙磺酸緩衝液的濃度為10mm，ph＝10。
進一步的，在步驟4)中，利用紫外光譜儀測定520nm和650nm處的波長。
納米金是一種傳到信號的優良材料，分散時呈紅色，聚集時呈藍色，本方法基於適配體和納米金，利用紫外光譜儀建立了一種比色傳感檢測體系，實現了pcb77的定量檢測。
本發明所述實驗方法的原理在於：當反應體系中存在靶物質pcb77時，核酸適配體則跟pcb77特異性結合形成複合物，加入納米金溶液，則納米金處於分散狀態，再加入氯化鈉溶液，納米金則產生聚集，溶液顏色呈藍色；當反應體系中不存在pcb77時，核酸適配體則跟加入的納米金溶液靜電結合，加入的氯化鈉溶液不能使納米金產生聚集，溶液呈紅色。使用紫外光譜儀測定溶液的吸光度，本方法通過反應體系吸光度的變化與pcb77在不同濃度下的線性關係來實現對pcb77的定量檢測。
本發明和已有技術相比，其技術進步是積極和明顯的。本發明提供了一種操作簡單、靈敏度高、成本低且高效的pcb77的檢測方法。本發明的檢測方法操作簡單、成本低、檢測靈敏度高，特異性好，操作簡便快捷且不依賴大型儀器設備，可用於水溶液中pcb77的定量檢測。採用本發明的方法測定水樣中pcb77的濃度範圍為0-1500ppb，線性區間為0-200ppb，線性擬合直線方程y＝1.08×10-4x+1.21×10-3，最低檢測限為10.1ppb。
附圖說明
圖1顯示了本發明的原理示意圖。
圖2顯示了實施例中氯化鈉濃度優化示意圖。
圖3顯示了實施例中適配體濃度優化示意圖。
圖4顯示了靶物質以及幹擾物加入檢測體系後增強的吸光度比值示意圖。
圖5顯示了實施例中不同濃度的pcb77與增強的吸光度比值關係示意圖。
具體實施方式
以下將結合附圖1-5對本發明的技術方案進行詳細說明。
本發明下述所提供的實施例是為了進一步描述並證明本發明的實施例，這些實施例不應當解釋為對本發明保護範圍的限定。
實施例1
氯化鈉濃度優化
在1.5ml離心管中加入200μl納米金溶液，再分別加入(800，790，780，770，760，750，740，730)μl的丙磺酸緩衝液(濃度為10mmol/l、ph為7.0)，混勻，依次加入濃度為0，20，40，60，80，100，120，140mmol/l的氯化鈉溶液，使得體系總體積達到1000μl，然後取1000μl反應液於石英比色皿中，利用紫外光譜儀測定520nm和650nm處的吸光度，計算比值a＝a650/a520(空白組為a0)，計算差值△a＝a-a0繪製曲線，峰值最高對應的氯化鈉濃度為100mmol/l，如圖2所示。
實施例2
核酸適配體濃度優化
將收到的核酸適配體樣品配製成2μmol/l的母液，然後分別設置八組濃度(0，10，20，30，40，50，60，70nmol/l)適配體，每組中加入200μl納米金溶液和(750,745,740,735,730,725,720,715)μl的丙磺酸緩衝液，充分混勻後再將離心管置於25℃條件下孵育20min，加入實施例1中優化好的氯化鈉溶液，混勻，使得檢測體系溶液總體積達到1000μl，利用紫外光譜儀測定520nm和650nm處的吸光度，計算比值a＝a650/a520(空白組為a0)，計算差值△a＝a-a0，繪製曲線，峰值最高處對應的適配體濃度為50nmol/l，如圖3。
上述核酸適配體的核苷酸序列為：5'-ggcggggctacgaagtagtgattttttccgatggcccgtg-3'，購於上海生工。
實施例3
特異性實驗
取5支分別加入25μl，2μmol/l適配體的離心管，設置空白組，其餘四組分別加入100μl，10ppm的pcb77(3，3′，4，4′-四氯聯苯)、pcb28(2，4，4′-三氯聯苯)、pcb52(2，2′，5，5′-四氯聯苯)、pcb118(2，3′，4，4′，5-五氯聯苯)溶液，充分混勻後再將離心管置於25℃條件下孵育20min，在上述混合液中加入200μl納米金溶液和630μl的丙磺酸緩衝液，充分混勻置於25℃條件下孵育20min，在上述混合液中加入50μl、2mol/l氯化鈉溶液，使得檢測體系溶液總體積達到1000μl，分別取上述反應液1000μl於石英比色皿中，利用紫外光譜儀測定520nm和650nm處的吸光度，計算比值a＝a650/a520(空白組為a0)，計算差值△a＝a-a0，繪製柱狀圖，如圖4所示，pcb77具有較好的特異性。
實施例4
靈敏度實驗
本實施例提供一種利用紫外光譜儀檢測pcb77(3，3′，4，4′-四氯聯苯)的方法(如圖5所示)，具體包括如下步驟：
(1)建立已知pcb77濃度的檢測體系的步驟，取12支分別加入25μl，2μmol/l核酸適配體的離心管，加入濃度為10ppm不同體積的pcb77溶液，充分混勻後將離心管置於25℃條件下孵育20分鐘，在反應液中加入200μl納米金溶液和相應體積(475～625μl)的丙磺酸緩衝液，充分混勻後再將離心管置於25℃條件下孵育20分鐘，在上述混合液中加入50μl、2mol/l的氯化鈉溶液，使得檢測體系溶液總體積達到1000μl，留作以下測定用；
(2)另取1支離心管將pcb77溶液用超純水替代，按照上述步驟(1)的方法處理後作為空白對照體系溶液；
(3)分別取1000μl步驟(1)和步驟(2)製備的標準溶液和空白對照液，置於石英螢光比色皿中，用紫外光譜儀進行掃描測定信號，掃描波長範圍為450nm到700nm，並且得到520nm和650nm處的波長吸光度，pcb77和空白對照液的吸光度分別為a＝a650/a520和a0＝a650/a520，計算增強的吸光度δa＝a-a0；
(4)以不同濃度pcb77(c)與對應增強吸光度δa作圖，繪製標準曲線；
(5)製備樣品檢測體系：取10μl待測樣品，加入到步驟(1)方法製備的檢測體系離心管中，充分混勻後再將離心管置於25℃條件下孵育20min後，在混合液中加入50μl、2mol/l的氯化鈉溶液，混勻，使檢測體系總體積達到1000μl，按步驟(3)方法測定吸光度比值並計算δa。
(6)根據計算所得的δa值，查標準曲線，可以求得樣品中pcb77含量。
(7)驗證：用本發明方法測定含pcb77濃度分別為100ppb、500ppb和1000ppb的水樣各一份，得到的平均回收率分別為104.6％，87.0％和111.4％，從而證明了本方法的可靠性。
(8)採用本發明的方法測定水樣中pcb77的濃度範圍為0-1500ppb，線性區間為0-200ppb，線性擬合直線方程為y＝1.08×10-4x+1.21×10-3，最低檢測限為10.1ppb。
序列表
上海市環境科學研究院
一種利用紫外光譜儀檢測pcb77的方法
1
patentinversion3.5
1
40
dna
功能核酸適配體
1
ggcggggctacgaagtagtgattttttccgatggcccgtg40