一種優化的、高效率的農桿菌介導的花生轉化方法與流程
2023-10-10 12:23:19 1
本發明所屬的技術領域是農業生物技術領域和植物基因工程領域。
背景技術：
花生是重要的油料和經濟作物，富含油脂和蛋白質。花生種質基礎有限，抗病資源缺乏，其生產一直受病蟲害及極端氣候的危害，導致其產量和品質下降。因此，進行花生遺傳改良，培育新的抗蟲抗病品種具有十分現實的意義。採用傳統的雜交育種、誘變育種均很難有目的性狀創新，而利用基因工程技術育種可以人為地選擇生產上的模式品種進行外源基因的導入，獲得目的性狀基因轉移，從而可目標明確地達到種質改良的目的。目前，植物基因轉化中比較常用的方法是農桿菌介導法。農桿菌介導法可以轉移較大的DNA片段，易產生單位點整合，不易引起分子重排，同時還具有技術簡單和費用較低等優點。
花生屬於雙子葉作物，是農桿菌的天然宿主，但也存在豆科作物共有的外源基因導入難度大的缺點。這使得花生的轉基因育種工作受到一定限制，進展比較緩慢。巴西Lacorte等人於1991年，我國萊陽農學院研究人員於1990年分別報導了農桿菌對花生的侵染力。印度Eapen和George於1994年首次報導通過農桿菌轉化獲得轉基因花生。美國Cheng M等人於1996年和1997年報導通過農桿菌轉化獲得5個獨立的轉化系，共繁殖了52株轉基因植株，但轉化率僅為0.2％～0.3％。同一實驗室的LiZhijian等改進實驗方法，通過優化農桿菌菌液濃度及抗生素使用濃度等因素縮短了獲得枝條所需的時間，轉化效率提高到1.5％。1999年國內方小平等以花生品種鄂花4號齡苗嫩葉作外植體，與A GLI菌株共培養，經卡那黴素篩選獲得轉基因花生，轉化效率為2％左右。2000年，印度Rohini等用LBA404菌株採用相同接種技術獲得轉基因花生，轉化效率提高到3.3％。
近年來，花生的遺傳轉化隨著體細胞植株再生技術的進步取得了一定進展，已經能夠通過農桿菌介導的方式獲得轉基因花生再生株系。但是這些花生轉化系統還是普遍存在著轉化周期長，篩選難度大，轉化效率低及重複性差的問題。因此，無論是從花生的遺傳改良角度，還是從其作為基因功能分析載體作物的角度，建立一種周期短、高效率、易操作、低成本的花生轉化體系都是現實而必要的。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種以花生子葉為轉化外植體的農桿菌介導的周期短、高效率、易操作、低成本的遺傳轉化方法。本發明就遺傳轉化中涉及的農桿菌菌液濃度、侵染時間、共培養時間、超聲波處理時間、菸草提取液濃度、抗生素使用濃度及培養基中新添加的植物激素及自由基清除劑濃度等影響條件進行了優化改進。該方法只需常規菌株和培養基，無需基因槍等昂貴設備。操作簡便易行，實驗周期短，轉化效率高。
本發明的目的通過下述技術方案來實現：
(1)活化、重懸待轉化的重組農桿菌菌液，調整OD600值為0.5～0.8；用酒精、升汞依次處理花生子葉外植體；用無菌水衝洗乾淨後浸泡2.5h；縱切後將子葉胚芽節點處切除得到待轉化外植體；
(2)用加有菸草提取物的農桿菌菌液侵染外植體5～15min，侵染同時進行超聲波處理2～8min，去除多餘的菌液後，將外植體置入共培養基中，26℃條件下暗培養2～4d；
(3)共培養後，將外植體取出用含100～300mg/L Cef和300～500mg/L Carb的無菌水衝洗4～5遍後，用滅菌濾紙吸乾，接到含100～300mg/L Cef和300～500mg/L Carb的抗性芽誘導培養基上，在26℃、16h光照條件下選擇培養14d；當有綠色芽點形成後，去除子葉，在誘導培養基上每兩周繼代一次；
(4)當綠色芽點生長到1～2cm後，接種到分化培養基上促進芽分化及伸長，隨著芽叢的繼續生長，將其切分成小塊，每兩周繼代一次，繼續分化培養；
(5)當誘芽長至3～4cm高並有3～4片小葉時，將誘芽切下，轉接到生根培養基誘導生根，待幼苗根系發育完全，洗淨根上的培養基，移栽到含滅菌沙土的花盆中；每個月用Hoagland營養液澆一次，同時每十天用自來水澆灌一次。
對於上文所述技術方案，步驟(1)所述待轉化的重組農桿菌可以選自任何攜帶特定目的基因的重組農桿菌；具體的，在本發明實施例中選用了兩種攜帶不同目的基因的農桿菌，分別按照本發明所述方法對花生進行轉化，並分別對轉化效果進行了數據分析，從而證明了本發明所述方法，其有效性不受限於重組農桿菌的種類；具體的，本發明實施例中使用的兩種重組農桿菌，其一為帶有表達載體pCAMBIA1301的農桿菌GV3101，其T-DNA區含有GUS基因，由CaMV35S作為啟動子，以潮黴素(HB)作為抗性篩選標記。其製備方法的文獻：農桿菌介導的花生遺傳轉化體系的優化.喬利仙等.核農學報2012，26(9):1244～1248；另一個是帶有表達載體pBI121的農桿菌EHA105，其T-DNA區含有DREB2A基因，由rd29A作為啟動子，以遺傳黴素(G418)作為抗性篩選標記。其製備方法的文獻：北陵鳶尾(Iris typhifolia Kitag.)DREB轉錄因子的克隆及其對菸草的遺傳轉化[J].李雪.東北林業大學.2015(01)67；
對於上文所述技術方案，步驟(1)所述花生種子的品種為阜花12、17、18號；豐花1 號；魯花14、16號。實際上，本發明所述方法，適用於所有類型的花生品種。
優選的情況下，對於上文所述技術方案，步驟(1)所用的酒精、升汞處理方法為，用70％～75％酒精處理花生子葉外植體1～2min，之後用0.1％～0.2％升汞處理子葉外植體10～20min。
優選的情況下，對於上文所述技術方案，步驟(2)所述加有菸草提取物的農桿菌菌液為，每100ml農桿菌菌液中添加菸草提取物1～3ml。
優選的情況下，對於上文所述技術方案，步驟(2)所述超聲波處理的功率為50w，工作頻率為40KHz。
優選的情況下，對於上文所述技術方案，所述共培養基為改良的MS培養基，其中添加1～2mg/L ZT、4～8mg/L 6-BA、0.1～0.5g/L酪蛋白水解物、0.05～0.15g/L肌醇。pH值為5.2。
優選的情況下，對於上文所述技術方案，所述抗性芽誘導培養基為改良的MS培養基，其中添加1～2mg/L ZT、4～8mg/L6-BA、0.1～0.5g/L酪蛋白水解物、2～4g/L L-脯氨酸、0.05～0.15g/L肌醇、0.1～0.3mmol/L維生素C、0.1～0.4mmol/L GSH、0.02～0.1mmol/L維生素E。pH值為5.8。
優選的情況下，對於上文所述技術方案，所述分化培養基為改良的MS培養基，其中添加100～300mg/L Cef、300～500mg/L Carb、1～2mg/L ZT、1～2mg/L NAA、1～3mg/L KT、1～4g/L酪蛋白水解物、0.05～0.15g/L肌醇、20～40g/L山梨醇、0.1～0.3mmol/L維生素C、0.1～0.4mmol/L GSH、0.02～0.1mmol/L維生素E。pH值為5.8。
優選的情況下，對於上文所述技術方案，所述生根培養基為改良的1/2MS培養基，其中添加1～2mg/L NAA、0.05～0.15g/L肌醇。pH值為5.8。
優選的情況下，對於上文所述技術方案，所述滅菌沙土成分重量比是沙：土：蛭石：珍珠巖為10:10:1:1。
本發明相對於現有技術有如下的優點及效果：
(1)本發明優化了花生再生芽的生成途徑，利用細胞全能性及花生子葉節點的高度分化能力減少了變異。同時省去了傳統農桿菌侵染過程前的預培養過程，大大縮短了獲得再生轉化植株的周期。因為不同基因型的花生子葉節點大多具有活躍的分生能力及脫分化作用，因此本發明在花生的遺傳轉化過程中不受基因型的限制。
(2)本發明通過菸草提取物的添加及對花生外植體的超聲波處理安全有效地提高了花生的分化率。傳統方法在侵染過程中多在農桿菌液中添加乙醯丁香酮，但該類物質化學毒性強，成本高，對誘導芽生長易產生褐化的影響。而菸草提取物自身會產生酚類物質，對花生外植體沒有附加傷害。超聲波法是通過空化和微機械損傷作用改變花生外植體細胞膜和細胞壁的通透性，創造微創口，促進細胞內外物質的交換，從而便於外源基因的導入。
(3)本發明通過在花生轉化的共培養基、誘導培養基及分化培養基中添加適當的玉米素ZT來有效地促進花生外植體的細胞分裂，加速抗性芽分化，減少了繼代培養的次數，縮短了轉化周期，同時對葉片有抑制衰老的作用。傳統轉化方式通常在培養基中添加2,4-D來誘導外植體，但人工合成的2,4-D存在一定的化學毒性，而且2,4-D的甲基化作用誘導出的畸形胚的比例較高。而ZT是從玉米中提煉出來的天然細胞分裂素，對花生外植體有打破休眠，促進萌發，延緩葉片衰老及黃化的作用。
(4)本發明通過在花生轉化的誘導培養基及分化培養基中添加適當的自由基清除劑來有效地減輕花生外植體的褐化現象。自由基清除劑可以提高細胞內抗氧化酶的活性，降低細胞的脂類過氧化程度，從而保護細胞免受損傷。通過在培養基中添加維生素C、維生素E，GSH物質可以提高原生質體的分裂頻率，改善原生質體的培養狀況，遏止引起褐化現象的酚類物質的產生和積累。
(5)本發明只需常規的菌株培養，無需基因槍、金粉等昂貴的實驗耗材。本發明操作簡便易行，實驗周期短，轉化率高，在不同基因型花生品種間轉化效果穩定，可以滿足花生規模化轉基因的要求，對於花生轉基因研究及功能基因的分析具有重要的意義。
附圖說明
圖1是花生外植體轉GUS基因的染色鑑定圖，圖中A為葉片GUS染色鑑定；圖中B為愈傷組織GUS染色鑑定(T：轉基因組，CK：對照組)；
圖2是添加ZT促進抗性芽細胞分裂圖，圖中A為添加2,4-D誘導外植體生長情況；圖中B為添加ZT誘導外植體生長情況；
圖3是自由基清除劑抑制外植體衰老及褐化現象圖，圖中A為未添加自由基清除劑植株生長情況；圖中B為添加自由基清除劑植株生長情況；
圖4是花生轉DREB2A基因的PCR鑑定圖，圖中A為轉DREB2A基因的阜花17號植株PCR鑑定圖(M：DL2000；1：陰性對照；2：水對照；3：陽性對照；4～13：轉化花生株系)圖中B為轉DREB2A基因的阜花18號植株PCR鑑定圖(M：DL2000；1：陰性對照；2：水對照；3：陽性對照；4～13：轉化花生株系)。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施方式對本發明的技術方案作進一步的詳細說明。本發明包括但不限於以下實施方式。根據現有技術對本發明所進行的不脫離本發明實質內容的改變，仍屬於本發明的保護範圍。
實施例1農桿菌介導GUS報告基因導入花生
(1)將帶有表達載體pCAMBIA1301(含有潮黴素抗性和GUS基因)的農桿菌GV3101活化並重懸(農桿菌介導的花生遺傳轉化體系的優化 喬利仙 於新玲 隋炯明 範乾程 孫世孟 王晶珊 核農學報2012，26(9):1244～1248)，調整OD600為0.6。選取成熟飽滿、表面無裂痕的花生種子(阜花12號)，用70％酒精處理1.5min，0.1％升汞(W/V)處理10min，用無菌水衝洗10次後在無菌水中浸泡2.5h。置於無菌濾紙上吸去水分，去種皮，將子葉沿縱向分開，用解剖刀沿子葉節點切除胚芽，得到待轉化的外植體。
(2)取菸草小苗嫩葉2g，於無菌離心管中搗碎取汁液，然後加入2ml無菌水，振蕩混勻後靜置5min，獲得菸草提取物。其中每100ml農桿菌菌液中添加菸草提取物1～3ml，再用加有菸草提取物的農桿菌菌液侵染花生外植體10min，侵染同時把裝有外植體的三角瓶置於超聲波清洗器(功率50w，工作頻率40KHz)中央進行超聲波處理。對菸草提取物濃度及超聲波處理時間兩個因素設置不同梯度進行優化篩選，得出菸草提取物的最佳濃度為2ml/100ml，超聲波處理最適時間為6min(如表1所示)。然後用無菌濾紙洗幹多餘的菌液，隨後將外植體置入共培養基中(MS+2mg/L ZT+5mg/L 6-BA+0.3g/L酪蛋白水解物+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)，26℃條件下暗培養3d。
(3)共培養3d後，將花生外植體取出用含Cef為200mg/L、Carb為350mg/L的無菌水衝洗5遍後，用滅菌濾紙吸乾，接到含潮黴素為20mg/L、Cef為200mg/L、Carb為350mg/L的抗性芽誘導培養基上(MS+2mg/L ZT+8mg/L 6-BA+0.3g/L酪蛋白水解物+2.8g/L L-脯氨酸+0.1g/L肌醇+0.15mmol/L維生素C+0.2mmol/L GSH+0.05mmol/L維生素E+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)，在26℃、16h光照條件下選擇培養14d；當有綠色芽點形成後，去除子葉，在誘導培養基上每兩周繼代一次，繼續培養促進芽伸長。
(4)當綠色芽點生長到1～2cm後，接種到潮黴素為20mg/L、Cef為200mg/L、Carb為350mg/L的分化培養基上(MS+1mg/L ZT+1mg/L NAA+2mg/L KT+2g/L酪蛋白水解物+0.1g/L肌醇+30g/L山梨醇+0.15mmol/L維生素C+0.2mmol/L GSH+0.05mmol/L維生素E+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)促進芽分化及伸長，隨著芽叢的繼續生長，將其切分成小塊，每兩周繼代一次，繼續伸長培養。
(5)當抗性誘芽長至3～4cm高並有3～4片小葉時，將誘芽切下，轉接到生根培養基(1/2MS+1mg/L NAA+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)誘導生根，約2周後根開始形成。待幼苗根系發育完全，洗淨根上的培養基，將根系健壯的小植株移栽到含滅菌沙土的花盆中。其中沙土成分為重量比沙：土：蛭石：珍珠巖為10:10:1:1的混合物。每個月用Hoagland 營養液澆一次，同時每十天用自來水澆灌一次。
(6)剪取花生葉片及愈傷組織於X-Gluc溶液(10mM EDTA、100mM磷酸鹽、0.5mM鐵氰酸鉀、0.5mM亞鐵氰酸鉀和0.1％X-Gluc)中進行GUS染色鑑定，於37℃下過夜，在70％乙醇中脫葉綠素。GUS陽性轉基因花生葉片及愈傷組織均出現肉眼可見的藍色斑點，而對照組葉片及愈傷組織均未發生明顯變化(如圖1所示)。阜花12號轉化率為68.6％。與傳統的轉化方式相比，其轉化率得到了顯著提高(如表2所示)。
表1菸草提取物濃度及超聲波處理時間對花生(阜花12號)分化率的影響
表2兩種轉化方式對花生(阜花12號)轉化效果的影響
實施例2農桿菌介導DREB2A基因導入花生
(1)將帶有表達載體pBI121(含有G418抗性和DREB2A基因)的農桿菌EHA105活化並重懸(北陵鳶尾(Iris typhifolia Kitag.)DREB轉錄因子的克隆及其對菸草的遺傳轉化[J].李雪.東北林業大學.2015(01)67)，調整OD600為0.7。選取成熟飽滿、表面無裂痕的花生(阜花17號、阜花18號)種子，用75％酒精處理1min，0.1％升汞(W/V)處理15min，用無菌水衝洗10次後在無菌水中浸泡2.5h。置於無菌濾紙上吸去水分，去種皮，將子葉沿縱向分開，用解剖刀沿子葉節點切除胚芽，得到待轉化的外植體。
(2)取菸草小苗嫩葉2g，於無菌離心管中搗碎取汁液，然後加入2ml無菌水，振蕩混勻後靜置5min，獲得菸草提取物。優化篩選後，用加有3ml/100ml菸草提取物的農桿菌菌液侵染花生外植體8min，侵染同時把裝有外植體的三角瓶置於超聲波清洗器(功率50w，工作頻率40KHz)中央進行超聲波處理8min，然後用無菌濾紙洗幹多餘的菌液，隨後將外植體置入共培養基中(MS+1.5mg/L ZT+6mg/L 6-BA+0.5g/L酪蛋白水解物+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)，同時置入對照培養基中(MS+1.5mg/L 2,4-D+6mg/L 6-BA+0.5g/L酪蛋白水解物+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)，26℃條件下暗培養4d。
(3)共培養4d後，將花生外植體取出用含Cef為250mg/L、Carb為400mg/L的無菌水衝洗5遍後，用滅菌濾紙吸乾，接到含G418為30mg/L、Cef為250mg/L、Carb為400mg/L的抗性芽誘導培養基上(MS+1.5mg/L ZT+8mg/L6-BA+0.4g/L酪蛋白水解物+3.5g/L L-脯氨酸+0.1g/L肌醇+0.2mmol/L維生素C+0.3mmol/L GSH+0.08mmol/L維生素E+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)，同時置入對照培養基上(MS+1.5mg/L2,4-D+8mg/L6-BA+0.4g/L酪蛋白水解物+3.5g/L L-脯氨酸+0.1g/L肌醇+0.2mmol/L維生素C+0.3mmol/L GSH+0.08mmol/L維生素E+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)，在26℃、16h光照條件下選擇培養14d，對比觀察其生長狀況。對照培養基誘導出的畸形胚的比例較高且外植體分化遲滯，而優化的培養基加速了細胞分裂，促進了抗性芽的分化，減少了繼代培養的次數，縮短了轉化周期(如圖2所示)。當有綠色芽點形成後，去除子葉，在誘導培養基上每兩周繼代一次，繼續培養促進芽伸長。
(4)當綠色芽點生長到1～2cm後，接種到G418為30mg/L、Cef為250mg/L、Carb為400mg/L的分化培養基(MS+1.5mg/L ZT+2mg/L NAA+2.5mg/L KT+3g/L酪蛋白水解物+0.1g/L肌醇+30g/L山梨醇+0.2mmol/L維生素C+0.3mmol/L GSH+0.08mmol/L維生素E+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)及對照培養基(MS+1.5mg/L ZT+2mg/L NAA+2.5mg/L KT+3g/L酪蛋白水解物+0.1g/L肌醇+30g/L山梨醇+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)上促進芽分化及伸長，對比觀察其生長狀況。對照培養基分化出的部分抗性外植體出現褐化現象，其葉片呈黃褐色或棕褐色，胚狀體少，長勢緩慢，部分培養基有絲狀物或混濁物產生。而優化的培養基分化出的抗性外植體葉片呈翠綠色，胚狀體增大，生長良好(如圖3所示)。隨著芽叢的繼續生長，將其切分成小塊，每兩周繼代一次，繼續伸長培養。
(5)當抗性誘芽長至3～4cm高並有3～4片小葉時，將誘芽切下，轉接到生根培養基(1/2MS+2mg/L NAA+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L植物凝膠)誘導生根，約2周後根開始形成。待幼苗根系發育完全，洗淨根上的培養基，將根系健壯的小植株移栽到含滅菌沙土的花盆中。其中沙土成分為重量比沙：土：蛭石：珍珠巖為10:10:1:1的混合物。每個月用Hoagland營養液澆一次，同時每十天用自來水澆灌一次。
(6)採用CTAB法提取轉基因花生的基因組DNA，以質粒DNA為陽性對照進行PCR檢測。上遊引物:5'GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3'，下遊引物:5'GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC 3'。PCR反應體系25μl，反應條件:95℃預變性5min；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸7min。反應產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小為205bp的特異性PCR產物(如圖4所示)。阜花17號轉化率為39.4％，阜花18號轉化率為55.8％。與傳統的轉化方式相比，其轉化率得到了顯著提高(如表3所示)。
表3兩種轉化方式對花生轉化效果的影響
上述實例為本發明最佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，本領域的技術人員在未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、優化等均視為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。