一種利用基因工程手段製備人幹擾素ω的方法
2023-10-10 20:41:24 4
專利名稱：一種利用基因工程手段製備人幹擾素ω的方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，涉及一種利用基因工程手段製備人幹擾素ω的方法。
背景技術：
人幹擾素ω發現於1985年，是同α幹擾素功能相近但抗原性不同的一類幹擾素分子(Hauptmann R，Swetly P.A novel class of human type Iinterferons[J].Nucleic Acids Res，1985，13(13)4739-4749.)。利用標準抗病毒試驗，已經測定出人幹擾素ω的比活性為2.7～4×108U/mg。通過仙臺病毒誘導，已經成功地利用人外周血白細胞產生並純化出了人幹擾素ω(Adolf G R，Maurer-Fogy I，Kalsner I et al.Purification and characterization of natural humaninterferon omega 1.Two alternative cleavage sites for the signal peptidase[J].JBiol Chem，1990，265(16)9290-9295.)。另外，利用不同的外源蛋白表達系統，分別在大腸桿菌、昆蟲細胞和CHO細胞中表達了重組的人幹擾素ω。這些使得對該蛋白的深入研究成為可能。在幾種人腫瘤的小鼠模型中，包括卵巢癌、黑色素瘤和皮膚癌等，證實了人幹擾素ω具有體內的抗腫瘤功能(Horton H M，Hemandez P，Parker S E，et al.Antitumor effects of interferon-omegain vivotherapy of human tumor xenografts in nude mice[J].Cancer Res，1999，59(16)4064-4068.)。利用人的肝癌細胞系，Hagelstein J等(Hagelstein J，Kist A，Stremmel W，et al.Antiviral potential of interferon-omega on hepatitis B virusreplication in human hepatoma cells[J].Arzneimittelforschung，1998，48(3)343-347.)比較了各種幹擾素對B肝病毒複製的抑制作用，結果發現，人幹擾素ω具有同α幹擾素、γ幹擾素以及腫瘤壞死因子α相似的抑制病毒複製作用。在體外對HIV病毒的抑制實驗中，發現人幹擾素ω有比α幹擾素更強的抑制病毒蛋白合成的作用。由於人幹擾素ω具有較強的抗病毒複製，抗細胞增殖和免疫調節等作用，該細胞因子有望用於治療多種腫瘤、病毒性疾病以及對α幹擾素耐藥的患者。
畢赤酵母表達系統(Pichia pastoris)是近幾年建立的一種真核表達系統(Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)45-66.)，是用於表達外源蛋白的最成功的表達系統之一。由於它既具有原核表達系統，如常用的大腸桿菌表達系統，繁殖迅速，費用低廉及操作方便的特點，又具有真核表達系統能對表達的蛋白質進行正確加工、摺疊及適度糖基化的優點。同時，重組蛋白易於純化。因此正越來越廣泛地用於蛋白質的大量表達。目前已有200多種蛋白在該表達系統中得以表達(Cregg JM，Cereghino JL，Shi JY，et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J].Mol Biotechnol，2000，16(1)23-52.)。
畢赤酵母表達系統包括胞內表達和分泌表達兩種方式，其中分泌表達由於其表達量高，糖基化完全，二硫鍵和高級結構形成正確，尤其是後續分離純化簡單方便而備受青睞。
畢赤酵母是一種甲醇營養型酵母菌，其生長迅速，培養條件簡單，可以高密度連續培養；其遺傳操作與釀酒酵母相似，技術已相當成熟；表達載體中普遍使用的醇氧化酶基因的啟動子(pAOX1)為誘導型啟動子，受葡萄糖抑制，甲醇誘導後才開始轉錄、翻譯，非常適合於外源基因的表達。
pPIC9K是Invitrogen公司推出的多拷貝分泌型表達載體。大小為9.3kb。該載體含有大腸桿菌複製起點Col E1和氨苄青黴素及卡那黴素兩個抗性基因，其中卡那黴素抗性基因還可以使畢赤酵母對G418產生抗性，可用於多拷貝插入的篩選。pPIC9K利用α因子的分泌信號將目的基因分泌至胞外。由於畢赤酵母本身僅分泌約佔總量5％的蛋白至胞外，因此對分泌表達的蛋白進行分離純化極為方便。
目前，尚沒有利用Pichia pastoris酵母表達系統製備人幹擾素ω的報導。
發明內容
本發明首次利用Pichia pastoris酵母表達系統製備了人幹擾素ω。
製備方法包括以下步驟構建分泌型酵母表達載體pMEX9K。利用分泌型表達載體pPIC9K表達的外源蛋白存在著不正確的N端，這些多出的胺基酸殘基會影響和改變所表達的蛋白的結構和功能(Goda S，Takano K，Yamagata Y.et al.Effect of extraN-terminal residues on the stability and folding of human lysozyme expressed inPichia pastoris[J].Protein Eng，2000，13(4)299-307.)。為了糾正這個缺陷，發明人對分泌型表達載體pPIC9K進行了改構，構建成了新的表達載體pMEX9K。分泌型酵母表達載體pMEX9K的構建方法參見文章(齊連權，陳薇，於長明等。兩個新型多拷貝畢赤酵母表達載體的構建[J].軍事醫學科學院院刊，2002，26(4)264-266.)。
構建重組載體pMEX9Kω。構建方法見附圖1。用PCR的方法擴增人幹擾素ω基因，分別酶切載體pMEX9K和PCR產物並回收酶切產物，連接並轉化大腸桿菌。對轉化子的酶切鑑定和序列測定表明，重組載體構建成功。
重組載體pMEX9Kω經線性化後電轉化受體菌GS115，進行表達。
目的蛋白的分離純化。將發酵上清過預平衡的大顆粒陽離子交換層析柱，用氯化鈉洗脫目的蛋白峰，目的蛋白峰可直接上樣於疏水層析柱，洗脫後上樣於小顆粒的陽離子交換柱，再經過進一步的凝膠層析，目的蛋白得到了很好的分離。
目的蛋白的活性測定。按照文獻(中國生物製品標準化委員會編.中國生物製品規程[M].北京化學工業出版社，2000，373-375.)進行。
發明人還探索了高表達菌株的誘導表達條件及純化工藝。發現在酵母培養上清液中，目的蛋白的含量在誘導後48～60h達到最高，佔培養上清液中總蛋白的20％～30％。在經過四步層析純化後，目的蛋白的純度達到95％以上，回收率在30％以上。
本發明提供的人幹擾素ω的製備方法具有產量高，表達及純化簡單易行，費用低廉，便於擴大生產等特點，具有廣闊的市場前景。
圖1為人幹擾素ω表達載體的構建過程示意圖。其中Kan+為卡那黴素抗性基因；IFNW為人幹擾素ω基因SS為α-因子信號肽圖2為畢赤酵母轉化子表達產物的SDS-PAGE分析圖譜。
a.b.c.誘導後轉化子的表達上清d.誘導前轉化子的表達上清e.目的蛋白m.蛋白分子量標準圖3為人幹擾素ω的分離純化後的SDS-PAGE分析a.純化後的目的蛋白；b.經PNGase F糖苷酶消化後；c.PNGase F糖苷酶；m.蛋白分子量標準具體實施方式
實施例一人幹擾素ω重組表達載體的構建1材料和方法1.1質粒，菌種，病毒和細胞株大腸桿菌DH5α，畢赤酵母Pichia pastoris購自華美公司。
1.2酶，載體，引物和主要試劑限制性內切酶、T4DNA連接酶、質粒抽提和回收試劑盒和pGEMT載體均購自Promega公司。引物由上海生工公司合成。FICOLL，TRIZOL，瓊脂糖購自華美公司。YNB為Difico公司產品。低分子量標準蛋白為AmershamPharmacia公司產品。糖苷酶PNGase F購自New England Biolabs公司。MEM培養基和新生牛血清購自Hyclone公司。其他所有化學試劑均為進口或國產分析純試劑。
1.3培養基1.3.1大腸桿菌培養基LB培養基1％蛋白腖，1％氯化鈉，0.5％酵母提取粉；LBAK培養基LB培養基中分別加入氨苄青黴素和卡那黴素至終濃度為100μg/mL。
1.3.2酵母培養基YPD培養基1％酵母提取粉，1％蛋白腖，2％葡萄糖。BMGY培養基1％酵母提取粉，1％蛋白腖，1.34％YNB，1％甘油，100mmol/LpH6.0的磷酸鹽緩衝液，4×10-5％生物素。BMMY培養基1％酵母提取粉，1％蛋白腖，1.34％YNB，1％甲醇，100mmol/L pH6.0的磷酸鹽緩衝液，4×10-5％生物素。
1.3.3細胞培養基採用MEM培養基，添加3％～10％的新生牛血清。
1.4方法1.4.1有關質粒DNA的提取、酶切、回收、連接和轉化等均按參考文獻(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manual[M].New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，16-56)操作。
1.4.2採用FICOLL試劑，從人血中分離白細胞，用TRIZOL提取總RNA，採用RT-PCR方法擴增人幹擾素ω基因，連接pGEMT載體，構建pGEMTω質粒。
1.4.3用PCR的方法從攜帶人幹擾素ω基因的質粒pGEMTω上擴增出該基因，人幹擾素ω基因的DNA序列為序列表中序列1的核苷酸序列。序列表中序列3和序列4分別為擴增人幹擾素ω的5』端和3』端引物。同時添加相應的酶切位點上遊加入Xho I切點，下遊加入Eco R I切點，序列3中5』第一個CTG密碼子為編碼人幹擾素ω的第一個密碼子。分別用Xho I和Eco R I酶切載體pMEX9K和PCR產物並回收酶切產物，連接並轉化大腸桿菌。對轉化子的酶切鑑定和序列測定表明，重組載體構建成功。重組載體的構建過程如附圖1。
1.4.4重組質粒pMEX9Kω DNA的酶切鑑定重組質粒pMEX9Kω DNA用Xho I和Eco R I酶切鑑定，然後經Sal I酶切，分離純化。
實施例二 重組人幹擾素ω的高效表達一、材料同上實施例二、方法將上面實施例中經過酶切的重組質粒pMEX9Kω回收，用電轉化法轉化畢赤酵母GS115。
重組克隆的篩選轉化後的GS115經MD平板篩選得到his+重組克隆，將每個克隆同時點種於MD、MM平板，30℃培養2～3d，確定每一個菌株的Mut表型。
重組人幹擾素ω的誘導表達將篩選出的重組克隆接種於5ml BMGY中，30℃300r/min培養至OD600為2.0～6.0；室溫6,000r/min離心4min。收集的菌體用BMMY懸浮並稀釋至OD600為1.0後，30℃300r/min誘導。每12h補加甲醇至0.5％。誘導48h後收集培養上清，SDS-PAGE檢測蛋白表達並測定其生物活性。
三、結果將經過電轉化法轉化的畢赤酵母GS115進行篩選，篩選到三個表達量較高的轉化子，分別進行發酵培養和誘導，離心並收集上清。活性測定結果表明，三個陽性克隆上清活性分別為3.2×106，1.6×106和3.0×106U/mL；利用SDS-PAGE檢測蛋白表達，並和低分子量蛋白標準相比較，結果如圖2。圖中在22,000處的蛋白條帶為目的蛋白，該蛋白分子量大於理論分子量，推測可能為糖基化所致(在目的蛋白的胺基酸序列中，有一個潛在的糖基化位點Asn80-Met81-Thr82)。利用糖苷酶PNGase F對目的蛋白的消化證實了該推測的正確(圖3)。經過PNGase F消化後的目的蛋白經MALDI-TOF測定其相對分子質量與理論值基本一致(MALDI-TOF測定目的蛋白在PNGase F消化前後的分子量分別是22,166.10和20,340.71)。
實施例三 重組人幹擾素ω的分離純化一、材料同實施例一。
二、方法將誘導後48h的菌液，10,000r/min離心10min後，取上清用0.45μm濾膜過濾，上樣於乙酸鈉預平衡的大顆粒陽離子層析柱，用0.5M氯化鈉洗脫目的蛋白峰；目的蛋白峰上樣於疏水層析柱，洗脫峰上樣於小顆粒離子交換柱，500mol/L氯化鈉洗脫目的蛋白峰；目的蛋白峰上樣於Superdex 75凝膠過濾柱，並用20mmol/L PBS，150mol/L氯化鈉，pH7.2洗脫目的蛋白峰。
三、結果目的蛋白得到了很好的分離，經薄層掃描發現，目的蛋白純度大於95％，如圖3。
實施例四 重組人幹擾素ω的鑑定一、材料見實施例一。
二、方法結果人幹擾素ω的N端胺基酸序列分析。利用PE公司的491蛋白序列分析儀，採用自動Edman降解法，發明人測定了目的蛋白的氨基端的15個胺基酸殘基，其順序為LGCDLPQNHGLLSRN。說明目的蛋白具有同天然蛋白一致的氨基端胺基酸序列。
人幹擾素ω的活性測定 按照文獻(中國生物製品標準化委員會編.中國生物製品規程[M].北京化學工業出版社，2000，373-375.)進行。活性測定結果表明，經過三步層析純化後，目的蛋白的回收率在35％以上，最終目的蛋白的比活性達到了2.2×108U/mL，同文獻(Horton H M，Hernandez P.Parker S E，et al.Antitumor effects of interferon-omegain vivo therapy of human tumorxenografts in nude mice[J].Cancer Res，1999，59(16)4064-4068.)報導結果相似。
人幹擾素ω的理化鑑定。對純化後的重組蛋白用基質輔助雷射解吸飛行時間(MALDI-TOF)質譜技術確定其相對分子質量，進行了N端胺基酸序列測定和糖苷酶PNGase F消化。結果見實施例二。
序列表110軍事醫學科學院微生物流行病研究所120一種利用基因工程手段製備人幹擾素ω的方法130
1604170PatentIn version 3.12101211525212DNA213
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權利要求
1.一種利用基因工程手段製備人幹擾素ω的方法，包括以下步驟(1)構建酵母表達載體；(2)構建人幹擾素ω的重組酵母表達載體；(3)重組人幹擾素ω的表達；(4)重組人幹擾素ω的分離純化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的人幹擾素ω具有序列表中序列2的胺基酸序列或其基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的酵母表達載體為能使表達的目的蛋白質具有正確胺基酸序列的酵母表達載體。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述的酵母表達載體為pMEX9K。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述的人幹擾素ω重組酵母表達載體為利用權利要求4所述載體構建的載體。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述的人幹擾素ω重組酵母表達載體為pMEX9Kω。
全文摘要
本發明公開了一種利用基因工程手段製備人幹擾素ω的方法。本發明通過畢赤酵母表達系統，利用經過改造的分泌型表達載體pMEX9K，對人幹擾素ω進行了高效表達。本發明公開的方法具有產量高，簡便易行，費用低廉等優點，有良好的市場前景。
文檔編號C12N15/19GK1539971SQ03123299
公開日2004年10月27日 申請日期2003年4月25日 優先權日2003年4月25日
發明者陳薇, 齊連權, 於長明, 付玲, 來大志, 陳 薇 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物