一種人lncRNA及其病毒載體在製備抑制真皮成纖維細胞膠原合成藥物中的應用的製作方法
2023-10-10 20:42:59 1
本發明涉及基因工程、細胞學領域，具體地說涉及一種人lncRNA及其病毒載體在製備抑制真皮成纖維細胞膠原合成藥物中的應用。
背景技術：
：增生性疤痕是指皮膚真皮層受損後的癒合期間，膠原局部過量沉積形成突出於皮膚表面的增殖性疤痕組織。皮膚損傷及外科手術後，疤痕的總體發病率為40％～70％，燒傷患者的發病率高達91％。增生性疤痕是燒傷外科和整形外科界面臨的巨大挑戰，因其不僅影響美觀，特殊部位的疤痕還會影響患者的生活質量，給他們帶來生理和心理的雙重壓力。目前，雖然有手術切除、壓力治療、局部皮質激素注射等方法治療疤痕，但是均存在局限性或不良併發症，無法從根本上阻止疤痕產生。目前已知增生性疤痕形成的病理學本質是真皮層中細胞外基質的過量沉積，其主要成分是由真皮成纖維細胞合成的膠原，尤以I、III型膠原為主。技術實現要素：發明目的：本發明的目的是提供一種特異高表達於真皮成纖維細胞膠原合成的分離lncRNA及其的引物對，以及含有前述過表達lncRNA的病毒載體及宿主細胞；本發明還有一個目的是提供前述lncRNA、病毒載體、宿主細胞在製備抑制真皮成纖維細胞膠原合成藥物中的應用。技術方案：為了實現上述發明目的，本發明的一種分離的lncRNA，含有如SEQIDNO.1所示的基因序列。所述lncRNA的轉錄本核苷酸序列位於人的第7號染色體上COL1A2基因5』端上遊位置，與COL1A2為天然反義(NaturalAntisense)的關係。增生性疤痕形成的病理學本質是真皮層中細胞外基質的過量沉積，其主要成分是由真皮成纖維細胞合成的膠原(collagen)，尤以I、III型膠原為主。本發明是基於增生性疤痕的形成機制，採用lncRNA晶片(lncRNAArray)技術篩選獲得特異高表達於真皮成纖維細胞膠原合成的人lncRNA。目前沒有關於該lncRNA相關的報導。所述SEQIDNO.1的序列為：CCUGGACCUAGAAACAAAAAAUGAAAGUGGAGAAAACCAAACAAGAAUCUUUCUUUCUUAAAGUAAACAUCGGACUGACAUCUCCUUUCAAACAUUCAUUGAGGAUCUACUCUGUGAGAAGAAGCAAUACCAUGUUAUCUCAUUCUAGUUCCAGUUCUAGUUGACUUGAUUGUCAAACGACUGCUAAGAAGGUGAAAUAGAGGAGAUGACAUGAAUGAGGGACUACAUUGGAAUGAAGAAGAACCUGGAGGAGGUAAAAAAACUGAAGGCUCCGGAUGUCGGACGAUGGAAAAUAAAAACAACAAGCAAGUGAAACUCCCUGACUUAUCAACCUUACUCAAGAAUUCCUUCU本發明通過構建慢病毒過表達質粒載體，經包裝、感染，來幹擾人真皮成纖維細胞的膠原合成，從而抑制疤痕增生。所述的病毒載體含有前述lncRNA序列。具體地說，先提取人離體增生性疤痕組織的lncRNA，合成cDNA第一鏈，然後設計引物PCR擴增所述lncRNA，在反應體系中與雙酶切擴增序列和載體，建立連接反應；然後轉化、篩選陽性克隆、抽提質粒並測序驗證。接著轉染慢病毒表達質粒、包裝質粒，獲取病毒上清液後，過濾凍存。其中，擴增所述lncRNA的引物對分別如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，經設計分別含有BamHI和EcoRI酶切位點：上遊引物：5′-GCCGGATCCCCTGGACCTAGAAACAAAAAATG-3』；下遊引物：5′-ACCGAATTCAGAAGGAATTCTTGAGTAAGG-3』，上述劃線區域即分別指示了BamHI位點和EcoRI位點。經PCR獲得的產物切膠進一步純化回收，選用Gel/PCRExtractionKit，購於Biomiga公司。所述轉化步驟之後，37℃孵育培養並挑取陽性克隆，選用德國QIAGEN公司的PlasmidMiniKit質粒抽提試劑盒抽提質粒。所述慢病毒包裝是在37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清的DMEM高糖培養基(購於美國Sciencell公司)培養病毒包裝細胞HEK-293T細胞(該細胞保藏於美國ATCC，編號ATCCACS-4500，購於北納創聯生物技術研究院，並接種於6孔板中，待細胞融合度達80％左右時，共轉染慢病毒表達質粒與包裝質粒；轉染試劑、表達/包裝質粒按體積比為2.5∶1，慢病毒表達質粒與包裝質粒按質量比為Pcgvp、Rev、Vsvg比例為1.5∶1.5∶1∶0.5。轉染收取病毒上清液於0.45μM濾器過濾後，分裝-80℃凍存。其中，所述轉染試劑為購於美國Invitrogen公司的LipofectamineTM2000。設計試驗，利用上述慢病毒感染離體人真皮成纖維細胞(即宿主細胞)，感染效率在80％以上時抽提RNA，RT-PCR鑑定所述lncRNA在人真皮成纖維細胞中的過表達。並利用WesternBlot法檢測過表達真皮成纖維細胞的蛋白表達量。WesternBlot實驗表明，本發明所述人lncRNA過表達組的真皮成纖維細胞中膠原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表達量顯著降低，表明真皮成纖維細胞中過表達lncRNA可顯著抑制膠原合成量。因此，所述lncRNA及其過表達的病毒載體可用於製備抑制真皮成纖維細胞合成膠原的藥物，為抑制疤痕增生提供了新的靶點。附圖說明圖1為本發明pGLV-H1-GFP/Puro載體圖譜和lncRNA的插入位點；圖2為本發明lncRNA過表達慢病毒載體酶切的電泳圖譜；圖3為本發明lncRNA的測序鑑定結果；圖4為本發明試驗例1中人lncRNA過表達慢病毒感染人真皮成纖維細胞的RT-PCR鑑定；圖5為本發明試驗例2中Westernblot檢測膠原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表達量以及灰度分析結果；其中，空白：不做任何處理的真皮成纖維細胞，對照：pGLV-H1-GFP/Puro空載轉染對照細胞，lncRNA：pGLV-H1-lncRNA-GFP/Puro過表達的真皮成纖維細胞。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明。如本文所用，術語「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建本發明所需表達的載體，以及利用現有的質粒產品和試劑盒包裝本發明所述的病毒載體。這些方法包括體外重組DNA技術、基因合成技術、病毒重組技術等。所述的表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉黴素、慶大黴素、潮黴素、氨苄青黴素抗性。實施例一、試驗材料pGLV-H1-GFP/Puro質粒購自上海吉瑪公司，包裝質粒Pcgvp、Rev、Vsvg購自美國AlleleBiotech&Pharmaceuticals公司；RNA逆轉錄試劑盒和RNA檢測試劑盒等購自美國ThermoFisher公司，PCR試劑盒TaKaRaLAPolymeraseHot-StartVersionPCR購自日本Takara公司，DMEM高糖培養基購自美國Sciencell公司，限制性內切酶、T4連接酶購自美國NEB公司，全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、WesternBlot檢測試劑盒、ECL檢測試劑盒、Braford蛋白含量檢測試劑盒、預染蛋白分子量以及麗春紅染色液均購自中國南京凱基生物科技發展有限公司，顯色液、定影液購自中國無錫市靈琦服務用品廠。二、IncRNA序列的擴增及慢病毒過表達載體的構建1.1RNA提取1)取約100mg解凍的人增生性疤痕組織至1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol，勻漿機勻漿10秒。室溫放置5分鐘。12,000g，室溫離心10min；2)加入氯仿(每使用1mlTRIzol加0.2ml氯仿)，蓋緊離心管管蓋，振蕩器上振蕩15s，溶液呈乳白狀，室溫靜置3min；3)12,000g，4℃離心15min；4)取出離心管，樣品分為三層：無色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機相；5)小心吸取無色上清水相移至另一離心管，水相體積約為所用Trizol試劑的60％；6)向得到的上清水相加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min；12,000g，4℃離心10min；7)小心去除上清，緩慢沿管壁加入1ml70％的乙醇(用DEPC處理過的水配製)，輕輕混勻；8)12,000g，4℃離心10min；9)小心吸盡上清，室溫乾燥沉澱5min左右，適量而定(不可晾得太幹，否則RNA將會很難溶解)，加入30～50μL的無RNase水溶解RNA沉澱，待完全溶解後於-70℃保存。1.2RNA濃度和純度的測定1)取5μLRNA樣品到595μL1×TEBuffer中，測定樣品在260nm和280nm的吸收值確定；2)RNA的濃度＝OD260×稀釋倍數×0.04μg/μL(比色皿光徑1cm)，OD260/280在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度很高。1.3cDNA第一鏈合成(20μL體系)：1)使用前每個組份輕輕混勻，然後2000rpm離心20s；2)取滅過菌且無核酸酶的0.2mlPCR管，依次加入如下組份：RNA(2μg)nμLOligodT(18)(50μM)2μL無核酸酶的雙蒸水至總體積12.5μL3)65℃保溫5min，然後冰浴5min；4)往上步驟中的0.2mlPCR管依次加入如下組份：5)輕輕混勻後，然後2000rpm離心20s；6)先在42℃保溫1h，然後70℃保溫10min，然後置於冰上5min；7)上述產物可立即進行下一步的PCR反應或-20℃保存。2.1目標lncRNA的擴增目標lncRNA序列如SEQIDNO.1所示，根據引物設計規則，採用Primer5軟體設計擴增包括lncRNA的序列，並在其上遊和下遊分別引入BamHI和EcoRI酶切位點，上遊引物為5′-GCCGGATCCCCTGGACCTAGAAACAAAAAATG-3』，含有BamHI酶切位點；下遊引物為5′-ACCGAATTCAGAAGGAATTCTTGAGTAAGG-3』，含有EcoRI酶切位點。目的基因轉錄本的長度為352bp，其序列如SEQIDNO.2所示。PCR反應體系如表1所示：表1lncRNA擴增的PCR反應體系PCR反應條件為：預變性94℃5min；PCR產物切膠純化回收(Gel/PCRExtractionKit，Biomiga)1)按照5μlPCR產物+1μl上樣緩衝液(6×)比例混勻後，在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，在成像儀顯色下，切取352bp的目的條帶於離心管中。2)加入1倍體積的BufferGC，至於55℃水浴中8-10分鐘，至凝膠完全融化。冷卻至室溫。3)轉移以上混合液至一帶有收集管的吸附柱中，室溫下，13,000×g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。重複此步驟，直至剩餘液體全部通過吸附柱。4)加入650μlDNAWashBuffer至吸附柱中，室溫下，13,000×g離心30秒，倒掉廢液，重複此步驟。5)室溫下，13,000×g開蓋離心2分鐘，去除殘餘的乙醇。6)轉移吸附柱至一新的1.5ml的離心管中，加入30-50μl在60℃預熱的ddH2O，室溫放置數分鐘，13,000×g離心1分鐘。2.2PCR產物及載體pGLV-H1-GFP/Puro雙酶切PCR產物及載體pGLV-H1-GFP/Puro分別按照下述反應體系，37℃反應1小時，得到PCR產物目的片段及載體片段。表2擴增序列和載體雙酶切體系酶切產物，加入2倍體積BufferGC後，瞬時離心。其餘步驟按照上述切膠純化回收步驟進行純化。必要時進行二次酶切。2.3PCR產物及載體pGLV-H1-GFP/Puro連接反應按照載體片段和PCR產物目的片段數目比例為1∶3左右加反應體系(見表2)，通常10μl體系，同時加入1μlT4DNA連接酶及1μlT4DNABuffer，16℃過夜，得到連接產物(pGLV-H1-lncRNA-GFP/Puro)。以不加入目的片段的載體為對照。表3擴增序列和載體的連接反應體系2.4轉化(無菌操作)1)從-80℃冰箱取出TOP10感受態細胞，購於天根生化科技(北京)有限公司，冰上融化，每200μl感受態細菌加入2-4μl連接產物，輕輕扣擊管壁混勻細菌。2)冰上30min，42℃熱休克90sec，然後迅速放置冰上3min。3)加入500μl預熱到37℃的LB培養基，37℃200轉/分鐘培養90分鐘。然後將菌液鋪於含有Ampicillin抗生素(100mg/ml)的LB固體培養板。4)37℃孵育，培養板先正置1h後倒置培養12-16小時後挑取克隆或於4℃保存。2.5陽性克隆擴增和質粒抽提1)取5ml無菌AmpicillinLB液體培養基，加入到無菌的15ml試管中，用無菌移液器槍頭在培養板上隨機挑選陽性克隆，置於上述試管中，37℃200rpm振蕩孵育過夜。2)室溫下，10,000rpm離心1分鐘，收集菌體，並儘可能棄去上清3)加入250μlBufferA1，渦旋震蕩混勻。4)加入250μlBufferB1，混勻後靜置5分鐘至溶液粘稠而澄清5)加入350μlBufferN1，立即反轉多次，至溶液充分混勻，此時出現白色絮狀沉澱。13,000rpm離心10分鐘。6)吸取上清至帶有收集管的DNA吸附柱中，13,000rpm離心1分鐘，棄去收集管中的廢液。7)加入500μlBufferKB，室溫下13,000rpm離心1分鐘，棄去收集管中的廢液。8)加入500μlDNAWashBuffer，13,000rpm離心1分鐘，棄去收集管中的廢液。充分此步驟後，開蓋離心5分鐘。9)向吸附柱中加入50-100μlddH2O。2.6pGLV-H1-lncRNA-GFP/Puro雙酶切驗證、測序及保種按照前述酶切方法(表2)進行雙酶切後，1％瓊脂糖凝膠電泳，切開雙條帶及條帶大小與目的條帶大小相符的(約500多bp)，進行測序驗證。同時取無菌1.5ml離心管並作標記，加入0.15ml無菌甘油溶液，分別吸取0.85ml陽性克隆的菌液，加入相應標記的離心管中，充分混勻，貯存於-80℃保種。構建載體及酶切、測序結果如圖1所示。3慢病毒包裝在37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清的DMEM高糖培養基培養病毒包裝細胞HEK-293T細胞(美國ATCC，購於北納創聯生物技術研究院)。將HEK-293T細胞按105/ml密度均勻接種於6孔板中，待細胞融合度達80％左右時，共轉染慢病毒表達質粒與包裝質粒，轉染試劑(美國Invtrogen公司LipofectamineTM2000)(μl)與表達和包裝質粒總質量(μg)比例為2.5∶1，慢病毒表達質粒與包裝質粒Pcgvp、Rev、Vsvg比例為1.5∶1.5∶1∶0.5(質量比)。轉染12h換液，24h後使用螢光顯微鏡觀察轉染效率，於48h、72h收取細胞培養液上清(即病毒上清)，0.45μM濾器過濾後，分裝-80℃凍存。構建載體及酶切、測序結果如圖1、圖2、圖3所示。三、慢病毒感染人真皮成纖維細胞在37℃、5％CO2孵箱中，培養人真皮成纖維細胞，按105/ml密度接種於6孔板中，待細胞融合度達60％左右時，將收集的病毒上清與凝聚胺(polybrene，終濃度5μg/ml)一同加入人真皮成纖維細胞，24h後換液，48h-72h在螢光顯微鏡通過觀察螢光表達情況判斷感染效率，80％以上細胞可見綠色螢光，表明感染效率達到80％以上(如圖4所示)，72h時使用RNA抽提試劑盒(TRIzol法)提取細胞總RNA。試驗例1RT-PCR鑑定人IncRNA在人真皮成纖維細胞中過表達本試驗例基於前述實施例所獲得的慢病毒載體感染獲得的人真皮成纖維細胞。分別收集lncRNA慢病毒組(lncRNA過表達組)及空載對照組的人真皮成纖維細胞，使用RNA抽提試劑盒(TRIzol法)抽提總RNA，Nanodrop2.0檢測RNA濃度，定量150ng總RNA逆轉錄為cDNA，進一步使用相應引物檢測人lncRNA表達。RealtimePCR反應體系為：2XSybrMix10μl，cDNA1μl，引物1μl，雙蒸水8μl，共20μl，在ABI7500運行，條件為：預變性95℃10min後，95℃15s，60℃1min，重複40個循環。用ΔΔCT法計算人lncRNA的相對表達量。結果如圖4所示。試驗例2Westernblot法檢測蛋白表達含量將人lncRNA過表達的真皮成纖維細胞、空載對照細胞、空白處理細胞培養在10cm培養皿裡。待細胞長滿，進行如下操作：全蛋白的提取將細胞用胰酶消化後，於冷PBS中洗滌2遍，各加入200ul冰預冷裂解緩衝液，混勻後冰浴30min，每隔5min渦旋震蕩10s，充分裂解。離心：4℃，13000×g，10min。將上清分裝，保存於-70℃，避免反覆凍融。蛋白定量1.蛋白標準液的配置：牛血清白蛋白(BSA)50mg，加雙蒸水至50ml，終濃度為1μg/1μl2.標準曲線的測定：BSA(1mg/mL)(μL)0246810雙蒸水(μL)1086420染液(μL)990990990990990990A(595nm)00.0890.1980.2830.3790.4513.繪製標準曲線：A＝0.0459C+0.004R2＝0.9974.取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭G250染液990ml，混勻，測定595nmOD值，然後在標準曲線上求所得濃度。SDS-PAGE電泳取乾淨的Bio-Rad1.5～玻璃板，按說明書在制膠架上裝好；根據目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照下面的表格配製SDS-PAGE的分離膠(即下層膠)；小心用槍頭將分離膠注入玻璃板間隙中，大約在佔三分之二玻璃板高度處停止，爾後在上面加入幾毫升雙蒸水，目的是阻止空氣對凝膠聚合的抑制作用。分離膠聚合完成後，倒掉膠上面覆蓋的雙蒸水，用濾紙儘量吸淨殘存的液體，小心不要碰到分離膠。表4聚丙烯醯胺分離膠配方按照表4配製SDS-PAGE的濃縮膠並注入分離膠的上端，小心插入與玻璃板厚度相適應的樣品梳子，避免產生氣泡：表5配置不同體積SDS-PAGE濃縮膠的組分表成層膠聚合後，小心拔去樣品梳子，然後加入lxTris-Gly的電泳緩衝液。吸取適量樣品上清加入樣品孔中，在樣品旁的孔中加入預染的蛋白Marker，未添加樣品上清的孔中，加入lxSDS上樣緩衝液保持膠面平衡。打開電源，電壓開始設置為60V，當蛋白樣品進入分離膠後，電壓可提高到90V。參照預染Marker的位置，待目的條帶進入凝膠最佳分離區(大約凝膠的2/3)時，停止電泳。預先將轉膜液4℃預冷。在託盤上打開轉移盒，靠近陰極側的內面鋪上已經用轉膜緩衝液浸溼的有孔維墊，其上放三層浸有轉膜緩衝液的Whatman3MM濾紙，注意排淨氣泡。小心撬開玻璃板，將膠放置含有轉膜液的託盤內，將含有目的條帶的分離膠切下，用轉膜液浸泡後置於濾紙上。10)在凝膠上鋪上經甲醇和轉膜液浸溼的NC膜，膠和膜之間不能存有氣泡，膜、濾紙和凝膠的大小，大致相同。在NC膜上再放兩層浸過轉膜液的Whatman濾紙，注意排淨氣泡。放上第二塊海綿墊，使整個轉印夾層依次形成「纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖維墊」層次，關閉轉印夾，放入轉移槽中，槽中灌滿轉膜液。打開電源，穩流200mA，120min。轉膜結束後，取出NC膜並作好標記，用TBST洗膜10minX3次。免疫印跡1)封閉：將NC膜放入平皿中，加入含5％脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5-2h；2)封閉結束後，用TBST洗膜10min×3次；3)將膜放入含一抗(用westem一抗稀釋液稀釋)的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜；4)第二天取出，室溫振蕩30min，吸棄一抗，TBST洗10min×3次；5)用5％脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫搖床振蕩反應1-2h；6)二抗反應結束後，回收二抗。然後用TBsT洗膜5-10min×3次；7)將EcL化學發光試劑盒中的A、B兩種液體按1∶1等體積混合，配置成工作液備用；8)將NC膜從TBST中取出，甩掉多餘的液體，將含有蛋白質的膜正面朝上，放在保鮮膜，滴加適量工作液，用保鮮膜覆蓋，放置顯影夾內，關閉顯影夾；9)使用英國syngene化學發光凝膠成像系統(購於上海仁器儀器儀表有限公司)成像，利用ImageJ軟體對結果進行灰度分析。試驗結果：如圖5所示，通過Westernblot實驗發現，人lncRNA過表達組的真皮成纖維細胞中膠原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表達量顯著降低，分別下降了32％、36％和40％，表明真皮成纖維細胞中過表達lncRNA可顯著抑制膠原合成量。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3