miR‑6812‑5p在製備治療白血病的藥物中的應用的製作方法

2023-10-10 20:46:04

本發明涉及生物技術領域，具體的，涉及一種microRNA在製備治療白血病的藥物中的應用。

背景技術：

microRNA(miR)，是一種大小約21-23個鹼基的單鏈小分子RNA，通過和靶基因mRNA鹼基配對引導沉默複合體(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，通常在轉錄後水平調控蛋白表達(最近發現microRNA也能在轉錄水平調控基因表達)。隨著對microRNA研究的不斷深入，越來越多的證據表明microRNA分子在腫瘤發生發展的各個環節中發揮著原癌基因或抑癌基因的作用。

白血病是一類造血幹細胞惡性克隆性疾病。克隆性白血病細胞因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，並浸潤其他組織和器官，同時正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染髮熱以及肝、脾、淋巴結腫大和骨骼疼痛。據報導，我國各地區白血病的發病率在各種腫瘤中佔第六位。臨床上，手術或放療針對局限白血病是有效的，並且針對轉移性白血病治療仍然缺乏有效的藥物。

因此有必要尋找與白血病發生、發展有關的miRNA，從而為臨床上治療轉移性白血病提供一種有效手段。

技術實現要素：

本發明的一個目的是提供一種如下1)-4)中任一所述物質在製備具有促進腫瘤功能的產品中的應用：

1)miR-6812-5p；

2)含有miR-6812-5p的編碼基因的重組載體；

3)含有miR-6812-5p的編碼基因的重組病毒；

4)含有miR-6812-5p的編碼基因的重組病毒載體。所述促進腫瘤功能為促進腫瘤細胞的遷移、擴散和/或侵襲。所述腫瘤為白血病。

所述產品為藥物；

所述microRNA-145的核苷酸序列為序列表中的序列1。

本發明的第二個目的是提供一種重組細胞。

本發明提供的重組細胞，為將所述miR-6812-5p、所述含有miR-6812-5p的編碼基因的重組載體、所述含有miR-6812-5p的編碼基因的重組病毒或含有miR-6812-5p的編碼基因的重組病毒載體導入出發細胞中得到的重組細胞。

所述出發細胞為腫瘤細胞；所述腫瘤細胞具體為白血病細胞。

所述的重組細胞在篩選和/或製備抑制腫瘤細胞的遷移、擴散和/或侵襲藥物中的應用也是本發明保護的範圍。

本發明的第三個目的是提供一種具有促進腫瘤功能的產品。

本發明提供的產品，其活性成分為所述miR-6812-5p、所述含有miR-6812-5p的編碼基因的重組載體、所述含有miR-6812-5p的編碼基因的重組病毒或含有microRNA-145的編碼基因的重組病毒載體。

所述促進腫瘤為促進腫瘤細胞的遷移、擴散和/或侵襲。

所述腫瘤為白血病；

所述產品為藥物。

抑制miR-6812-5p活性或者表達的物質在製備具有抑制腫瘤功能的產品中的應用也是本發明保護的範圍。

所述抑制腫瘤為抑制腫瘤細胞的遷移、擴散和/或侵襲，所述腫瘤具體為白血病。

本發明的實驗證明，miR-6812-5p過表達後並未能影響Daudi細胞的生長，但可顯著增強高轉移性白血病細胞的侵襲和遷移能力，在白血病轉移過程中可能起重要作用，因此說明，miR-6812-5p與白血病轉移相關。

附圖說明

圖1為螢光顯微鏡下觀察慢病毒載體介導GFP-miR-6812-5p在Daudi細胞中的表達情況和RT-PCR檢測細胞中miR-6812-5p的相對含量；

圖2為利用CCK-8繪製Daudi-miR-6812-5p，Daudi-nc的生長曲線；

圖3為miR-6812-5p對Daudi細胞遷移能力的影響；

圖4為miR-6812-5p對Daudi細胞侵襲能力的影響。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1、穩定高表達miR-6812-5p的轉移性白血病細胞系的獲得

一、白血病細胞系的獲得

大腸癌細胞系Daudi(ATCC)，其培養基為含有10％的胎牛血清(Hyclone)和濃度為0.2％的青鏈黴素(Invitrogen)的1640培養基(Invitrogen，31800-022)。

A、細胞復甦

(1)取出Daudi(ATCC)的凍存管，立即放入37℃-40℃水浴中，快速搖晃直至完全融化。

(2)將細胞懸液轉入10mL冷PBS中，放入15mL離心管中，用水平離心機離心細胞(1000轉/分鐘，8分鐘)後棄上清。

(3)用適量新鮮培養基懸浮細胞，將細胞懸液轉入培養瓶中，置37℃二氧化碳培養箱中培養。

B、細胞培養

將白血病細胞系放入培養基中，於37℃，5％CO2的細胞培養箱中培養，根據細胞生長情況，每天或者隔天更換新鮮培養基，細胞濃度約為培養瓶培養面積80％-90％時進行傳代。

C、細胞凍存

(1)選取處於指數生長期的細胞，凍存前1天給細胞換液1次。

(2)收集細胞培養液，離心(1000轉/分鐘，5分鐘)。

(3)棄上清，用凍存管重懸細胞，調整細胞濃度至5×106/mL。

(4)將細胞懸液移入凍存管，扭緊管蓋，註明細胞名稱和凍存日期，放入凍存盒，置於-80℃冰箱24小時後，移至液氮中保存。

D、細胞傳代

(1)收集細胞培養液，離心(1000轉/分鐘，5分鐘)。

(2)去掉上清，加入新鮮培養基，用一次性吸管將細胞輕輕吹打，製成細胞懸液。

(3)按1∶2移入新的培養平或培養皿，得到傳代後Daudi細胞。

二、細胞轉染

1、轉染

GFP-miR-6812-5p慢病毒表達系統(其中外源基因為miR-6812-5p，Genebank號為NR_106870，即為序列1，購自上海吉凱基因化學技術有限公司，為能表達microRNA-6812的慢病毒顆粒)，根據該公司的操作指南進行細胞轉染：

1)、分別將生長良好的步驟一得到的傳代後Daudi細胞於轉染前一天接種到96孔板中(正常培養，37℃，5％CO2培養箱)，轉染時細胞密度達到30％。

2)、每孔中棄去原培養液，加入100μL培養基及1μL慢病毒試劑(GFP-miR-6812-5p慢病毒表達系統)，溫和混勻。

3)、37℃培養24小時後，換正常培養基終止轉染。

4)、然後37℃培養72小時後，得到Daudi-high細胞系。

採用同樣的方法將NC慢病毒表達系統(購自上海上海吉凱基因化學技術有限公司，其與GFP-miR-6812-5p慢病毒表達系統相比沒有外源基因miR-6812-5p)轉染Daudi細胞，得到Daudi-NC。

2、檢測細胞中miR-6812-5p的表達

1)、螢光顯微鏡觀察

將上述獲得的Daudi-high細胞系置於螢光倒置顯微鏡下，檢測其表達miR-6812-5p情況，結果如圖1A和B所示，從圖中可以看出，Daudi-high細胞系穩定高表達miR-6812-5p(有螢光反應)。螢光顯微鏡下觀察到其轉染效率高於90％。

2)、RT-PCR檢測

利用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取上述獲得的Daudi-high細胞系和Daudi-NC細胞總RNA，以提出的總RNA為模板，miR-6812-5p引物進行RT-PCR，以U6為內參(引物購買自Qiagen，貨號為MS00033740)；以未轉染病毒的Daudi細胞和Daudi(NC)細胞為對照。

結果如圖1C所示：Daudi-high細胞系的miR-6812-5p的相對表達率為2245；Daudi-NC的miR-6812-5p的相對表達率為1；未轉染病毒的Daudi細胞中的miR-6812-5p的相對表達率為1；可以看出，miR-6812-5p在Daudi-high細胞系中穩定過表達。

實施例2、Daudi-high細胞系穩定高表達miR-6812-5p的功能研究

1、細胞生長曲線

(1)取轉染後24小時，生長狀態良好的由實施例1得到的Daudi-high，採用一般傳代方法進行消化，製成細胞懸液。計數，精準地將細胞種在96孔板中，每孔細胞總數要求一致(2000個/孔)，加入培養劑的量也要一致，並設置空白對照(即同樣體積的培養基)，每孔終體積為100μL。置37℃，5％CO2培養箱中孵育24小時。

(2)每孔加入10ul的CCK-8溶液(購自日本同仁化學研究所貨號：CK04)。可根據具體情況增加或減少CCK-8溶液的用量。

(3)正常培養條件(37℃，5％CO2培養箱)下培養4小時(培養時間取決於所使用的細胞類型和細胞濃度)。

(4)水平晃動約10秒後用酶標儀測量450nm波長的OD值，保存好數據。

(5)每天依次法測定，共7天。每培養2天要給未計數的細胞換液。

(6)以培養時間為橫軸，OD值為縱軸，描繪在半對數坐標紙上，連接曲線後即成該細胞的生長曲線。

實驗重複三次，結果取平均值。

結果為圖2所示，可以看出Daudi-high在加入CCK-8溶液後24、48、72、96小時的96孔板中每孔細胞的OD值分別為0.58、0.97、1.47、2.08。空白對照在加入CCK-8溶液24、48、72、96小時的96孔板中每孔細胞的總數分別為0.61、1.02、1.53、2.14；可以看出，miR-6812-5p過表達後並未能影響Daudi細胞的生長。

2、細胞遷移實驗

(1)將Transwell小室(購自Corning公司)用無血清1640培養基(Invitrogen，31053036)平衡至少一個小時或過夜，有助於更好貼附和生長。

(2)實驗前一天，將由實施例1得到的Daudi-high細胞在無血清培養基中飢餓培養。

(3)將Transwell放入24孔板，在Transwell下室中加入600μL含有10％血清的培養基作為趨化因子。

(4)先取轉染後24小時並無血清飢餓過的細胞，消化後進行活細胞計數，調整細胞濃度為4×105/mL，再在每個Transwell小室中加入100μL由實施例1得到的Daudi-high細胞懸液(飢餓培養後，4×104細胞)。每組設三個平行樣本。置於孵箱中培養。

(5)24小時後吸去上室液體，用PBS溼潤棉籤擦去膜上面未穿過聚碳酸酯膜上小孔的細胞，生理鹽水漂洗，稍幹。

(6)0.5mL甲醇結晶紫溶液染色30分鐘，流水衝洗3-5次。

(7)用小刀片將聚碳酸酯膜小心切下，置膜於載玻片上，膜底面朝上，滴樹脂後用蓋玻片封片，顯微鏡下隨機計數5個視野的細胞數，求和，進行統計學檢驗，實驗重複三次，結果取平均值。

以轉染NC的Daudi-NC為陰性對照(NC)。

實驗重複三次，結果取平均值。

結果如圖3所示，miR-6812-5p組為Daudi-high，NC組為Daudi-NC，miR-6812-5p組的細胞數為132，NC組的細胞數為45，miR-6812-5p組大約為NC組的3倍(P<0.01)，這說明miR-6812-5p能夠促進細胞的垂直遷移能力。

3、細胞侵襲試驗

(1)將槍頭、Eppendorf管、Matrigel膠(購自BD公司)、Transwell室、24孔板置於4℃過夜，由實施例1得到的Daudi-high細胞換無血清培養基中飢餓培養過夜。消化細胞，無血清培養基吸打，調整細胞濃度在1×106/mL。

(2)4℃溶解Matrigel基質過夜，用預冷的槍頭將Matrigel膠混勻。

(3)將培養基置於冰上，預冷槍頭取20μL Matrigel膠(1∶3)於Transwell小室的上室，37℃放置30分鐘。

(4)預溫無血清培養基輕柔洗滌已凝固的Matrigel，加100μL細胞懸液(1×105細胞)，每組設三個平行孔。

(5)下室加入600μL含10％胎牛血清的培養基。

(6)置於37℃、5％CO2的培養箱中孵育24小時，棉籤拭去濾膜上表面未穿透的細胞。

(7)對已穿透的細胞進行固定、結晶紫染色、封片，每個樣本均計數5個高倍鏡視野，取其平均值。各組細胞穿透濾膜的數量的多少作為評價其侵襲能力的指標。

以轉染NC的Daudi為陰性對照為對照(NC)。

結果如圖4所示，miR-6812-5p組為Daudi-high，NC組為Daudi-NC，miR-6812-5p組的細胞數為98，NC組的細胞數為31，miR-6812-5p組較對照組(NC組)細胞明顯增多。

這些體外功能預實驗證實miR-6812-5p過表達可顯著增強高轉移性白血病細胞的侵襲和遷移能力，高度提示其在白血病轉移過程中可能起重要作用。