一種檢測試紙及其製備方法與流程

2023-10-10 06:38:49 2

本發明涉及農藥殘留檢測技術領域，特別涉及一種用於檢測農產品中啶蟲脒的殘留的檢測試紙及其製備方法。

背景技術：

在現有技術中，用於農藥殘留檢測的試紙主要是針對氨基甲酸酯類和有機磷類農藥，檢測原理是利用有機磷或氨基甲酸酯類農藥對乙醯膽鹼酯酶的抑制作用。此類試紙的使用範圍有限，僅適用於有機磷或氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測。

啶蟲脒屬於氯代菸鹼類殺蟲劑,主要用於防治瓜果蔬菜上的蚜蟲、小菜蛾等，它能夠與菸鹼乙醯膽鹼受體作用，引起昆蟲異常興奮，全身痙攣麻痺而死。雖然啶蟲脒在害蟲防治上起到了重要作用，但同時對土壤和水資源造成了汙染，此外食物上的農藥殘留還會對人類健康造成危害，因此檢測啶蟲脒殘留對環境的可持續發展和人類的健康是非常必要的。農藥殘留檢測常用的方法有色譜、色譜-質譜聯用技術，但是這些技術檢測成本高、需要專業的操作人員，不利於實現現場快速操作。

啶蟲脒為小分子農藥，本身不具備免疫原性，需要將其與大分子結合才能成為免疫原，生成抗體。抗體製備過程複雜，質量不穩定，且不易於儲存，相對於其他農藥更難檢測，目前現有技術中並沒有關於檢測農產品中啶蟲脒殘留的檢測試紙公開。

技術實現要素：

本發明旨在克服現有技術的缺陷，提供一種用於檢測農產品中啶蟲脒的殘留的檢測試紙。

為實現上述目的，本發明採用以下技術方案：

一方面，本發明提供一種檢測試紙，用於檢測農產品中啶蟲脒的殘留，其中，所述檢測試紙包括底板，設置於底板上的樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述金標結合墊的一端與所述樣品墊的一端部分重疊，所述金標結合墊的另一端與所述硝酸纖維素膜的一端部分重疊；所述硝酸纖維素膜的另一端與所述吸水墊的一端部分重疊；所述硝酸纖維素膜上設有檢測線和質控線。

優選的，所述部分重疊的長度範圍為1～3mm。

優選的，所述硝酸纖維素膜上吸附有結合物，所述結合物為生物素修飾的互補單鏈DNA與鏈黴親和素的結合物。

優選的，所述金標結合墊上吸附有啶蟲脒核苷酸適體修飾的膠金體。

優選的，所述啶蟲脒核苷酸適體的寡核苷酸鏈為5』GCAGC GGTTC TTGAT CGCTG ACACC ATATT ATGAA GAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AA-C6-SH3』。

優選的，啶蟲脒核苷酸適體分子與膠體金粒子的數目比為2:1～9:1。

優選的，啶蟲脒核苷酸適體修飾的膠金體復溶於緩衝液中吸附於所述金標結合墊上。

優選的，所述緩衝液包括蔗糖和吐溫20；所述蔗糖的濃度為5～30％，所述吐溫20的濃度為0.1-1％。

優選的，所述樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼於所述底板上。

另一方面，本發明還提供一種檢測試紙的製備方法，所述製備方法包括分別製備樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，再將所述樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次設置於底板上，使得所述金標結合墊的一端與所述樣品墊的一端部分重疊，所述金標結合墊的另一端與所述硝酸纖維素膜的一端部分重疊；所述硝酸纖維素膜的另一端與所述吸水墊的一端部分重疊；所述硝酸纖維素膜上設有檢測線和質控線，所述硝酸纖維素膜的製備方法包括將生物素修飾的互補單鏈DNA與鏈黴親和素混合，吸附於硝酸纖維素膜上的檢測線和質控線區域；所述金標結合墊的製備方法包括將啶蟲脒核苷酸適體與膠體金按比例混合，得到啶蟲脒核酸適體修飾的膠金體，將啶蟲脒核酸適體修飾的膠金體復溶於緩衝液中，吸附於金標結合墊上。

本發明的有益效果在於：提供一種用於檢測農產品中啶蟲脒的殘留的檢測試紙及其製備方法，利用可以特異性識別啶蟲脒分子的核酸適體作為識別元素，同時創造性的發現了核酸適體分子與膠體金粒子數目最優比，使得檢測濃度可以達到0.2mg/mL。檢測速度快，檢測過程中需要時間少於10分鐘，降低了試紙的生產成本，提高了試紙的穩定性，操作簡單，不需要專業人員操作，普通人員按照說明進行操作即可，可以用於檢測部門的現場檢測以及普通市民對農產品的檢測，易於推廣使用。

附圖說明

圖1示意性示出根據本發明一個實施例的檢測試紙的結構示意圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及具體實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，而不構成對本發明的限制。

首先參考圖1所示，本發明一個實施例所提供的檢測試紙，用於檢測農產品中啶蟲脒的殘留。檢測試紙由樣品墊1、金標結合墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4以及底板(圖中未示出)構成。

其中，硝酸纖維素膜3上有檢測線31和質控線32。將硝酸纖維素膜3貼到底板上，將金標結合墊2也貼到底板上，並與硝酸纖維素膜重疊約1-3mm，優選2mm。將吸水墊4貼於硝酸纖維素膜3的另一側，並與硝酸纖維素膜3重疊約1-3mm，優選2mm。再將樣品墊1貼於金標結合墊2的一側，與金標結合墊2有1-3mm左右的重疊，優選2mm。

具體的，硝酸纖維素膜3上吸附有生物素修飾的互補單鏈DNA與鏈黴親和素的結合物。金標結合墊上2吸附有啶蟲脒核苷酸適體修飾的膠金體。啶蟲脒核苷酸適體的寡核苷酸鏈為5』GCAGC GGTTC TTGAT CGCTG ACACC ATATT ATGAA GAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AA-C6-SH3』。啶蟲脒核苷酸適體的寡核苷酸鏈可以變化。啶蟲脒核苷酸適體修飾的膠金體復溶於緩衝液中吸附於金標結合墊上，其中緩衝液的成分為5～30％的蔗糖和0.1-1％的吐溫20水溶液，能夠使得結合墊上的膠體金釋放完全。

優選的實施例中，啶蟲脒核苷酸適體分子與膠體金粒子的數目比為2:1～9:1。更為優選的，啶蟲脒核苷酸適體分子與膠體金粒子的數目比為3:1。採用該比例的啶蟲脒核苷酸適體修飾膠體金，既能防止膠體金髮生團聚，又能減少核酸適體的用量，從而降低生產成本，還能使最後獲得的檢測試紙能夠具有最高的檢測靈敏度。

本發明一個實施例所提供的檢測試紙的製備方法包括，分別製備樣品墊1、金標結合墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4，再將樣品墊1、金標結合墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4依次設置於底板上，使得金標結合墊2的一端與樣品墊1的一端部分重疊，金標結合墊2的另一端與硝酸纖維素膜3的一端部分重疊，硝酸纖維素膜3的另一端與吸水墊4的一端部分重疊，兩兩重疊部分約為1-3mm左右。其中，樣品墊1、金標結合墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4的分別製備並沒有先後順序，分別獲得樣品墊1、金標結合墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4後，依次通過粘貼或其他方式部分重疊的設置於底板上即可。

硝酸纖維素膜3上設有檢測線31和質控線31，硝酸纖維素膜3的製備方法包括將生物素修飾的互補單鏈DNA與鏈黴親和素混合，吸附於硝酸纖維素膜3上的檢測線31和質控線32區域；金標結合墊2的製備方法包括將啶蟲脒核苷酸適體與膠體金按比例混合，得到啶蟲脒核酸適體修飾的膠金體，將啶蟲脒核酸適體修飾的膠金體復溶於緩衝液中，吸附於金標結合墊2上，緩衝液的成分為5～30％的蔗糖和0.1-1％的吐溫20水溶液。

具體的，本發明一個實施例所提供的檢測試紙的製備過程包括如下步驟：

1.膠體金的製備

用蒸餾水配置0.01％氯金酸溶液100mL，加熱至沸騰；在劇烈攪拌下，迅速加入2mL 1％的檸檬酸三鈉水溶液，可以觀察到淡黃色溶液變成灰色，繼而轉成深紫色，最後溶液成透明的酒紅色；在沸騰的情況下繼續攪拌20分鐘，冷卻至室溫，用蒸餾水補充至原體積，4℃保存。製備好的膠體金透明、無懸浮物。

2.啶蟲脒核酸適體修飾膠體金

製備好的膠體金在12000r/min下離心25分鐘，棄去上清液，將沉澱懸浮於蒸餾水中；按照核酸適體分子數與膠體金粒子數之比3:1將巰基修飾的核酸適體與膠體金混合，該核酸適體可以特異性識別啶蟲脒分子，與啶蟲脒分子結合，其寡核苷酸鏈為5』GCAGC GGTTC TTGAT CGCTG ACACC ATATT ATGAA GAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AA-C6-SH3』。室溫下反應24小時，再逐滴加入1M的NaCl溶液使最終濃度達到50mM,在室溫下放置12小時後，在12000r/min下離心25分鐘，復溶於緩衝液中並吸附於結合墊上，過夜晾乾，得到金標結合墊2。

3.試紙的製備

將生物素修飾的互補單鏈DNA與5uL鏈黴親和素混合，4℃下放置2小時後用超濾離心管離心分離。將結合物分別吸附於硝酸纖維素膜3的檢測線31和質控線32區域，晾乾後將硝酸纖維素膜3黏於底板上，與吸水1墊、金標結合墊2和樣品墊4組裝到底板上形成4mm×3cm試紙。

將巰基核酸適體與膠體金的結合物滴加至硝酸纖維素膜3的另一端，觀察硝酸纖維素膜上檢測線31和質控線32的顏色變化情況。

本發明實施例提供的檢測試紙在使用時，取待測的蔬菜水果樣品，擦去表面泥土，稱取樣品，將樣品的表皮部分剪碎，放入瓶中，加入緩衝液，震搖數十次後，靜置3分鐘，取上清液滴加於樣品墊1上，樣品在層析作用下向硝酸纖維素膜3一端移動，經過金標結合墊2時，吸附於金標結合墊2上的膠體金會發生復溶，隨著樣品一起向硝酸纖維素膜3移動，在這過程中，如果樣品中含有啶蟲脒，啶蟲脒會與膠體金上連接的核酸適體發生特異性結合。當通過硝酸纖維素膜3上的檢測線31時，未結合啶蟲脒的膠體金被互補序列截獲在檢測線31，使檢測線31由無色逐漸變成紅色；繼續向前移動，膠體金將被截獲在質控線32上。即若檢測線31和質控線32均顯示紅色，說明檢測結果呈陰性，檢測樣品中沒有啶蟲脒殘留，或者啶蟲脒殘留含量在0.2mg/mL以下；若只有質控線變為紅色，說明檢測結果呈陽性，檢測樣品中有啶蟲脒殘留，或者啶蟲脒殘留含量在0.2mg/mL以上。

本發明的檢測試紙檢測濃度可以達到0.2mg/mL(檢測蔬菜水果樣品時最低檢測濃度可以達到2ppm，國家標準制定的不同農作物上啶蟲脒的最大殘留量為0.1-2ppm)，檢測速度快，檢測過程中需要時間少於10分鐘，降低了試紙的生產成本，提高了試紙的穩定性，操作簡單，不需要專業人員操作，普通人員按照說明進行操作即可，可以用於檢測部門的現場檢測以及普通市民對農產品的檢測，易於推廣使用。

以上所述本發明的具體實施方式，並不構成對本發明保護範圍的限定。任何根據本發明的技術構思所作出的各種其他相應的改變與變形，均應包含在本發明權利要求的保護範圍內。