新型lhrh拮抗劑,其製備方法和藥物用途的製作方法

2023-10-10 05:03:04

專利名稱：：新型lhrh拮抗劑,其製備方法和藥物用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及溶解性改善的LHRH拮抗劑，製備這些化合物的方法，含有這些化合物的藥物，以及所述藥物用於治療激素-依賴性腫瘤和受激素影響的非惡性病症如良性前列腺增生(BPH)和子宮內膜異位的用途。用於定義肽的命名法與由IUPAC-IUB生物化學命名委員會釋義的命名法(歐洲生物化學雜誌(EuropeanJ.Biochem).1984，138，9-37)一致，其中，與常規表示方法一致，N端的氨基在左，C端的羧基在右。LH-RH拮抗劑如本發明的肽包括天然的和合成的胺基酸，前者包括Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Lys，Arg，Asp，Asn，Glu，Gln，Cys，Met，Phe，Tyr，Pro，Trp和His。每個胺基酸殘基的縮寫基於所述胺基酸的常用名並且Ala＝丙氨酸，Arg＝精氨酸，Gly＝甘氨酸，Leu＝亮氨酸，Lys＝賴氨酸，Pal(3)＝3-(3-吡啶基)丙氨酸，Nal(2)＝3-(2-萘基)丙氨酸，Phe＝苯丙氨酸，Cpa＝4-氯苯丙氨酸，Pro＝脯氨酸，Ser＝絲氨酸，Thr＝蘇氨酸，Trp＝色氨酸，Tyr＝酪氨酸和Sar＝肌氨酸。如果不另指的話，本文記載的全部胺基酸來源於L系列。例如D-Nal(2)是3-(2-萘基)-D-丙氨酸的縮寫以及Ser是L-絲氨酸的縮寫。如果縮寫形式合適的話，賴氨酸側鏈中的ε氨基上發生的取代通過置於Lys後面括號內的一個術語來表示。使用的其它縮寫是Ac乙醯基B4-(4-脒基苯基)氨基-1，4-二氧代丁基Boc叔丁氧羰基Bop苯並三唑-1-氧-三(二甲氨基)-磷鎓六氟磷酸鹽DCC二環己基碳二亞胺DCM二氯甲烷Ddz二甲氧苯基-二甲基亞甲氧基-羰基(二甲氧基-二甲基-Z)DIC二異丙基碳二亞胺DIPEAN，N-二異丙基乙胺DMF二甲基甲醯胺Fmoc芴基甲氧羰基HF氫氟酸HOBt1-羥基苯並三唑HPLC高壓液相色譜Me甲基TFA三氟乙酸Z苄氧羰基。本發明的肽是黃體生成素釋放激素(LH-RH)的類似物，其具有以下結構p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，[LH-RH，促性腺素釋放激素]。二十多年來，研究人員已經尋找到LH-RH十肽的有效選擇性拮抗劑[M.Karten和J.E.Rivier，內分泌綜述(EndocrineReviews)7，44-66(1986)]。這類拮抗劑的最大意義基於它們在內分泌學、婦科學、避孕和癌症方面的用途。已經製備了多種作為LH-RH有效拮抗劑的化合物。迄今為止發現的最有意義的化合物是那些具有修飾LH-RH結構的化合物。第一系列有效拮抗劑通過將芳香胺基酸殘基引入位點1、2、3和6或2、3和6來獲得。書寫所述化合物的常規方式如下所述首先標明置換了LH-RH肽鏈中天然存在的胺基酸的胺基酸，以上角標數字標記發生交換的位點。並且，通地置於後面的符號「LH-RH」表示這些是發生了交換的LH-RH類似物。已知的拮抗劑是[Ac-D-Cpa1，2，D-Trp3，6]LH-RH(D.H.Coy等，Gross，E.和Meienhofer，J.(編輯)，肽(Peptides)；第六次美國肽論壇會議彙編(Proceedingsofthe6thAmericanPeptideSymposium)，775-779，PierceChem.Co.，RockvilleIII.(1979)；[Ac-Pro1，D-Cpa2，D-Nal(2)3，6]LH-RH(美國專利4,419,347)和[Ac-Pro1，D-Cpa2，D-Trp3，6]LH-RH(J.L.Pineda，等，臨床內分泌代謝雜誌(J.Clin.Endocrinol.Metab).56，420，1983)。為了提高拮抗劑的作用效果，鹼性胺基酸，如D-Arg後來被引入位點6。例如，[Ac-D-Cpa1，2，D-Trp3，D-Arg6，D-Ala10]LH-RH(ORG-30276)(D.H.Coy，等，內分泌學(Endocrinology)100，1445，1982)；和[Ac-D-Nal(2)1，D-Phe(4-F)2，D-Trp3，D-Arg6]LH-RH(ORF18260)(J.E.Rivier等，VickeryB.H.Nestor，Jr.J.J.，Hafez，E.S.E(編輯).LHRH及其類似物(LHRHanditsAnalogs)，11-22頁，MTP出版社，Lancaster，UK1984)。其它有效的LH-RH拮抗劑被記載在WO92/19651，WO94/19370，WO92/17025，WO94/14841，WO94/13313，US-A5,300,492，US-A5,140,009，EPO413209Al和DE19544212Al中。後者公開了在位點6上具有經修飾的鳥氨酸或賴氨酸單位並且對應下式的化合物；Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Xxx6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2，其中D-Xxx是一個通式(VI)的胺基酸基團其它已知的H-RH-拮抗劑是安雷利克斯，加尼瑞克和西曲瑞克。安雷利克斯(INNTeverelix)Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2加尼瑞克Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-hArg(Et)26-Leu7-hArg(Et)28-Pro9-D-Ala10-NH2西曲瑞克Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Cit6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2。本發明的目的在於製備對酶穩定性提高以及水溶性顯著提高的新型LH-RH-拮抗劑。所述目的通過下面的通式(I)化合物實現A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9-Xxx10-NH2(I)其中A是一個乙醯基，Xxx1是D-Nal(2)，Xxx2是D-Cpa，Xxx3是D-Pal(3)，Xxx4是Ser，Xxx5是N-Me-Tyr，Xxx6是D-Cit，D-Hci或D-[·-N』-4-(4-脒基苯基)-氨基-1，4-二氧代丁基]-Lys(縮寫D-Lys(B))，Xxx7是Leu或Nle，Xxx8是Arg或Lys(iPr)，Xxx9是Pro而Xxx10是D-Ala或Sar條件是如果Xxx6是D-Lys(B)，則Xxx7是Nle，如果Xxx6是D-Cit，則Xxx7是Nle且Xxx10是D-Ala，或如果Xxx6是D-Hci，則Xxx7是Leu且Xxx10是D-Ala，以及它們與藥用酸形成的鹽，特別是乙酸鹽、撲酸鹽和三氟乙酸鹽。根據本發明的另一方面，下列化合物及其與藥用酸形成的鹽是特別優選的Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sarl0-NH2Ac-D-Nal(2)1-D-Phe(4-Cl)2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2根據本發明的另一方面，本發明的化合物以乙酸鹽、三氟乙酸鹽或撲酸鹽的形式存在。根據本發明的另一方面，本發明的化合物可以被用作藥物或藥物製劑。根據本發明的另一方面，提供了含有至少一種本發明的化合物以及常規載體和賦形劑的藥物製劑。根據本發明的另一方面，提供了一種製備本發明通式I化合物的方法，其中按照常規方法在固相上或溶液中合成來源於具有適當保護基的Xxxm單元的片段，其中m是1至10的整數並且Xxx1被乙醯化，然後通過節段偶聯將所述片段結合到固相上，並且完成偶聯後，通過對Xxx10單元進行醯胺化用常規方法將通式I化合物從所述固相上除下。根據本發明的另一方面，提供了本發明化合物用於生產治療激素-依賴性腫瘤，特別是前列腺癌或乳腺癌以及用於其治療需要LH-RH激素抑制的非惡性適應徵的藥物的用途。根據本發明的另一方面，提供了一種生產藥物製劑的方法，其中權利要求1至10之一所述的至少一種化合物與常規載體和賦形劑混合從而配製成一種藥劑。根據本發明的另一方面，提供了一種通過施用有效劑量的本發明的至少一種化合物來治療激素-依賴性腫瘤，特別是前列腺癌、乳腺癌或子宮肌瘤以及其治療需要LH-RH激素抑制的非惡性適應徵如子宮內膜異位、良性前列腺增生(BPH)以及治療哺乳動物中，特別是人類中雌性或雄性生育障礙的方法。本發明的化合物可被用於治療激素-依賴性腫瘤，特別是前列腺癌、乳腺癌或子宮肌瘤，還可被用於其治療需要LH-RH激素抑制的非惡性適應徵如子宮內膜異位、良性前列腺增生(BPH)。而且，它們可被用於治療男性或女性的生育障礙。例如用於體外受精過程中的受控的卵巢過度刺激。為此，它們通常與常規載體和賦形劑混合併且按照本身已知的方法被製成藥物。通式(I)化合物的合成可以通過經典的片段縮合法或Merrifield的固相合成法來進行，通過利用側鏈中已經乙醯化的D-賴氨酸與通式R1-COOH的羧酸一個接一個地進行合成或者通過D-賴氨酸6側鏈中的醯胺鍵使十肽單元與適當的羧酸發生反應來進行合成。因此，在所述過程中R1-CO-基團的引入可以在三種不同的情況下進行每個單元縮合生成肽之前，肽鏈中引入賴氨酸或鳥氨酸之後，但在下一個單元的縮合之前，或在所有單元縮合之後。通式(I)化合物按照已知方法來合成，例如通過純固相技術，部分固相技術(所謂的片段縮合)或通過經典的溶液偶聯技術(參見M.Bodanszky，″肽合成原理(PrinciplesofPeptideSynthesis)″，SpringerVerlag1984)。例如，所述固相合成方法被記載在教科書″固相肽合成(SolidPhasePeptideSynthesis)″J.M.Stewart和J.D.Young，PierceChem.Company，Rockford，III，1984，和G.Barany和R.B.Merrifield″肽(ThePeptides)″，第1章，1-285頁，1979，AcademicPressInc中。經典溶液合成方法的處理被詳細記載在″有機化學方法，肽的合成(MethodenderOrganischenChemie(HoubenWeyl)，SynthesevonPeptiden)″E.Wünsch(編輯)1974，GeorgThiemeVerlag，Stuttgart，FRG中。按照以下步驟進行分步合成，例如首先將α-氨基被保護的羧基端胺基酸與通常用於此目的不溶性載體進行共價鍵合，除去該胺基酸的α-氨基保護基團，將由此得到的游離氨基基團通過下一個胺基酸的羧基基團鍵合到該下一個被保護的胺基酸，並且以這種方法將所要合成肽的常規胺基酸一步一步地按照正確的序列連接起來，連接了所有的胺基酸後，從所述載體上取下合成好的肽並且除去任何其它可能存在的側鏈功能保護基團。以常規方式從相應的、常規被保護的胺基酸合成來進行分步縮合。每個胺基酸的相互連接是按照用於此目的常規方法來進行的；特別適合的方法是·在有二環己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺(DCC，DIC)存在的條件下的對稱酸酐法·常規的碳二亞胺方法·碳二亞胺/羥基苯並三唑方法(參見肽(ThePeptides)，第2卷，編輯E.Gross和J.Meienhofer)。在片段偶聯方法中，優選使用偶聯過程中不發生外消旋化的氮化物偶聯方法或DCC-1-羥基苯並三唑或DCC-3-羥基-4-氧-3，4-二氫-1，2，3-苯並三嗪-方法。還可利用片段的活化酯。N-端被保護的胺基酸的酯，如N-羥基琥珀醯亞胺酯或2，4，5-三氯苯基酯特別適合於胺基酸的分步縮合。具有大約乙酸酸度的N-羥基化合物如1-羥基苯並三唑能有效催化氨基分解。本身存在的中間氨基保護基團是通過氫化作用而被除去的基團，如苄氧羰基(＝Z基)或可以被弱酸除去的基團。對於α-氨基的合適保護基團是，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基、苄氧羰基或苄硫羰基(carbobenzothio)(如果合適，每個例子具有對-溴-[原文如此]或對-硝基苄基)、三氟乙醯基、鄰苯二醯基、鄰-硝基苯氧乙醯基、三苯甲基、對-甲苯磺醯基、苯甲基、苯環上發生取代的苯甲基(對-溴-或對-硝基苄基)和α-苯乙基。這裡可以參見P.Greenstein和MiltonWinitz，胺基酸化學(ChemistryofAminoAcids)，紐約，1961，JohnWileyandSons，Inc.，第2卷，例如883頁起之各頁，″肽合成原理(PrinciplesofPeptideSynthesis)″，SpringerVerlag1984，″固相肽合成方法(SolidPhasePeptideSynthesis)″J.M.Stewart和J.D.Young，Pierce化學公司，Rockford，III，1984，G.Barany和R.B.Merrifield″肽(ThePeptides)″，第1章，1-285頁，1979，AcademicPressInc.還有「肽(ThePeptides)」，第2卷，編輯E.Gross和J.Maienhofer，AcademicPress，紐約。這些保護基團基本上也適合於所述相應胺基酸的其它功能側基(OH-基，NH2-基)的保護。存在的羥基(絲氨酸，蘇氨酸)優選用苄基及類似基團來保護。非α-位點的其它氨基(例如ω-位點上的氨基、精氨酸的胍基)優選進行正交保護。除被R1-CO基團修飾的賴氨酸[空白]外，每個胺基酸單元均可以通過商業途徑獲得。製備被R1-CO基團修飾的賴氨酸的方法的可能途徑如下所述1.對α-羧酸基團進行適當的保護，例如通過酯化反應。2.對ε-氨基進行適當的保護，例如用Z基團。3.對α-氨基以這樣-種方式進行保護(例如Boc-基團)以使相對於後來去除氨基保護基團的步驟產生選擇性。4.除去ε-氨基上的Z基團。5.將需要的基團R1-CO-引入到ε-氨基上。6.除去α-氨基上的保護基團。7.任選對α-氨基進行可逆衍生，例如利用Z基團。對於通過將賴氨酸的氨基與適當的羧酸或羧酸衍生物發生反應來引入R1-CO-基團，合適的方法基本與上述胺基酸的鍵合相同。然而，特別優選利用碳二亞胺例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺，和1-羥基苯並三唑進行的縮合反應。所述胺基酸的鍵合反應在通常用於此目的的惰性溶劑或懸浮劑(例如二氯甲烷)中進行，如果需要，可加入二甲基甲醯胺以提高溶解度。合適的合成載體是不溶性聚合物，例如珠子形式的聚苯乙烯樹脂，該樹脂在有機溶劑(例如一種聚苯乙烯和1％的二乙烯基苯的共聚物)中可以溶脹。可以按照下面的流程圖在甲基二苯甲基胺樹脂(MBHA樹脂，即具有甲基二苯甲基胺基團的聚苯乙烯樹脂)上合成被保護的十肽醯胺，在從所述載體上經HF裂解下來後，所述樹脂提供了所需的肽C-端醯胺官能基團流程圖利用Boc-保護的胺基酸合成肽的方案在CH2CI2/DMF中有二異丙基碳二亞胺(DIC)和1-羥基苯並三唑(HOBt)存在的條件下經過90分鐘，Nα-Boc-保護的胺基酸通常以三倍的摩爾過量發生偶聯，並且在CH2Cl2中通過50％的三氟乙酸(TFA)作用半小時來去除Boc-保護基團。可採用Christensen的氯醌試驗和Kaiser的茚三酮試驗核實轉化是否完全。通過在CH2Cl2以五倍過量的乙醯基咪唑進行乙醯化來封閉游離的氨基功能基團。在樹脂上合成肽的反應步驟順序按照流程圖進行。為了去除與樹脂結合的肽，將固相合成的各最終產物在真空中利用P2O5進行乾燥並在0℃下用500倍過量的HF/苯甲醚10∶1/v∶v處理60分鐘。在真空中蒸餾HF和苯甲醚以後，在攪拌條件下採用無水乙醚進行衝洗來獲得白色固體形式的肽醯胺，通過採用50％濃度的乙酸水溶液進行衝洗來除去附帶獲得的聚合物載體。通過在真空中小心濃縮所述的乙酸溶液，可以獲得各種高粘度的油狀肽，這些肽在冷卻條件下通過加入無水醚而被轉化成白色固體。通過製備型高壓液相色譜(HPLC)的常規方法進行進一步純化。通過與酸反應，所述肽能夠以本身已知的方式轉化為它們的酸加成鹽。相反，可以通過其酸加成鹽與鹼反應來獲得游離肽。肽撲酸鹽可以通過所述肽的三氟乙酸鹽(TFA鹽)與游離撲酸或撲酸的相應的二鈉鹽反應來製得。為了此目的，在水溶液中用撲酸二鈉鹽在極性非質子介質，優選二甲基乙醯胺中的溶液處理所述的肽TFA鹽，並分離出所形成的淡黃色沉澱物。下列實施例用來說明本發明，但不限制本發明。實施例1(D-68968)Ac-D-Mal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2在裝填密度為0.55mmol/g的聚合物載體(氨甲基-取代的樹脂，Fmoc保護，D-1675型，Bachem)上合成十肽。將賴氨酸偶聯成Fmoc-D-Lys(Boc)-OH並利用20％的哌啶/DMF除去Fmoc保護基團。在同時除去所有側鏈保護基團並從聚合物載體上脫離下來後，利用製備型HPLC純化被分離出的粗肽。凍幹後，得到98.5％濃度的十肽。利用在DMF中的PyBop並加入DIPEA用4-(4-氨基苯基)氨基-1，4-二氧代丁酸在D-賴氨酸的·-氮上進行取代。利用製備型HPLC純化被分離出的粗肽。通過凍幹得到約99％濃度經驗化學式為C82H106ClN19O15的產物(三氟乙酸鹽)，該產物具有正確的FAB-MS1633(M+H)(計算值1631.78096)。實施例2(D-68969)Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2在裝填密度為O.55mmol/g的聚合物載體(氨甲基-取代的樹脂，Fmoc保護，D-1675型，Bachem)上合成十肽。將賴氨酸偶聯成Fmoc-D-Lys(Boc)-OH並利用20％的哌啶/DMF除去Fmoc保護基團。在同時除去所有側鏈保護基團並從聚合物載體上脫離下來後，分離出的約71％(HPLC)含量的粗肽不經純化就進行進一步的反應。利用在DMF中的PyBop並加入DIPEA用4-(4-氨基苯基)氨基-1，4-二氧代丁酸取代D-賴氨酸的側鏈。利用製備型HPLC純化被分離出的粗肽。凍幹後，獲得98.8％濃度經驗化學式為C82H106ClN19O15的產物(三氟乙酸鹽)，該產物具有正確的FAB-MS1633(M+H)(計算值1631.78096)。實施例3(D-68971)Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2在裝填密度為0.55mmol/g的聚合物載體(氨甲基-取代的樹脂，Fmoc保護，D-1675型，Bachem)上合成十肽。將賴氨酸偶聯成Fmoc-D-Lys(Boc)-OH並利用20％的哌啶/DMF除去Fmoc保護基團。在同時除去所有側鏈保護基團和從聚合物載體上脫離下來後，利用製備型HPLC純化被分離出的粗肽(含量約為5996，HPLC)。凍幹後，得到95％濃度的十肽。利用在DMF中的PyBop並加入DIPEA用4-(4-氨基苯基)氨基-1，4-二氧代丁酸取代D-賴氨酸的側鏈。利用製備型HPLC純化被分離出的粗肽。凍幹後，獲得96.6％濃度的產物(三氟乙酸鹽)，該產物的經驗化學式為C85H112ClN17O15，具有正確FAB-MS1648(M+H)(計算值1645.8218)。實施例4(D-68987)Ac-D-Nal(2)1-D-Phe(4-Cl)2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2在9.09g裝填密度為0.55mmol/g的聚合物載體上合成D-Lys-6-未被取代的十肽，將賴氨酸6偶聯成Fmoc-D-Lys(Boc)-OH。從樹脂上脫離後，分離到8.15g的粗肽。利用製備型HPLC純化粗肽。利用在DMF中的PyBop並加入DIPEA用4-(4-氨基苯基)氨基-1，4-二氧代丁酸取代D-賴氨酸的側鏈。利用製備型HPLC純化被分離出的粗肽。凍幹後，獲得94.6％濃度的產物(三氟乙酸鹽)，該產物的經驗化學式為C85H112ClN17O15，具有相應FAB-MS1646.8(M+H；計算值1645.82)。實施例5Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2實施例6Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2實施例7Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2實施例8Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2製備實施例5至8中的肽的通用操作步驟利用Merrifield固相合成法(SPPS)[原文如此]和在溶液中經典片段縮合方法製備十肽。出於經濟原因，優選利用聚合物載體合成肽序列的方法並且原則上可選擇性地按照(1)Boc或(2)Fmoc方案進行合成；相應地，在每種情況下，甲基二苯甲基胺樹脂(用於1)或Fmoc-2，4-二甲氧基-4』-(羧甲基氧)二苯甲基胺樹脂(用於2)可以被用於D-丙氨酸的C-端鍵合。固相合成，Merrifield方法採用5克裝填密度約0.55mmol/g、粒積為200-400目的聚合物載體Fmoc-2，4-二甲氧基-4』-(羧甲基氧)二苯甲基胺樹脂，BachemD1675，在用於固相合成的標準反應條件下根據Fmoc方案合成十肽(流程圖，表I)。按照下列流程圖利用N·-Fmoc-保護的胺基酸，在樹脂上分步合成所述序列表I(*按照T.Christensen，ActaChem.Scand.B33，763-766，1979)按照上述流程圖進行固相合成十肽的方法-典型的(重複性的)反應參數-利用在DMF中的20％哌啶，在RT下處理2×5分鐘來去除Fmoc保護基團(步驟2)。-在有羥基苯並三唑(HOBt)存在的條件下，將各三倍摩爾過量的Fmoc-胺基酸與二異丙基碳二亞胺(DIC)進行偶聯(步驟8)。-從聚合物載體進行C-端去除包括利用三氟乙酸(TFA)去除胺基酸側鏈保護基團。從聚合物載體上除下後，如果採用5克的樹脂，則形成約5-6克的含量為約70-80％所需成分的粗肽混合物；該成分通過後續的製備型HPLC色譜回收。十肽的製備型HPLC純化；色譜法條件製備型HPLC，Shimadzu，Dynamax柱RP18，12μm300？L＝250mm，ID＝41.4mm設有時間程序的梯度系統，40％B·90％B，50分鐘洗脫液A970ml的H2O+30ml的CH3CN+1ml的CF3COOH洗脫液B300ml的H2O+700ml的CH3CN+1ml的CF3COOHUV-檢測，·＝220nm，流速60ml/分鐘將收集到的級分在真空中濃縮並冷凍乾燥。所形成的十肽為無色物質。通過離子交換層析進行雙分解從而成為藥物開發所需的乙酸鹽形式。生物學作用的研究研究本發明式I化合物與受體的結合。研究基本按照Beckers等，歐洲生物化學雜誌(Eur.J.Biochem).231，535-543(1995)中記載的方法進行。將利用上述合成法獲得的西曲瑞克通過利用IodoGen試劑(Pierce)用[125I](Amersham；比活度為80.5Bq/fmol)碘化。通過反相高效液相色譜純化所述的反應混合物，獲得了不含未標記肽的一碘化西曲瑞克。對於每種情況，約80％的[125I]-西曲瑞克和本發明的未標記的化合物適於與特異性受體結合。利用下列方法1和2檢測本發明化合物的體外作用，採用[125I]-西曲瑞克測定在結合鑑定法中的結合親合力(方法1)和以曲普瑞林作為激動劑刺激來測定其功能活性(方法2)。方法1(利用西曲瑞克的例子測定KD)受體結合鑑定法按照Beckers，T.，Marheineke，K.，Reilnder，H.，HilgardP.(1995)″對穩定超表達針對促性腺素釋放激素(GnRH)的人腦垂體受體的哺乳動物細胞系的選擇和表徵(Selectionandcharacterizationofmammaliancelllineswithstableoverexpressionofhumanpituitaryreceptorsforgonadoliberin(GnRH))″歐洲生物化學雜誌(Eur.J.Biochem).231，535-543所述。為了研究受體的結合，利用IodoGen-試劑(Pierce)和[125I](Amersham；80.5Bq/fmol的比活度)來對西曲瑞克進行碘化處理。利用具有交換相的高效液相色譜純化所述的反應混合物，獲得了不含未標記肽的一碘化西曲瑞克。約80％的[125I]-西曲瑞克能夠與特異性受體結合。在已有記載(Beckers等，1995)的生理學條件下利用完整細胞進行受體結合試驗。通過在NaCl/Pi(137mMNaCl，2.7mMKCl，8.1mMNa2HPO4，11.47mMKH2PO4)/1mMEDTA中進行培養來分離表達人LHRH受體的穩定轉染的LTK-細胞的分會合培養物，並通過離心進行收集。將細胞沉澱物重懸於結合緩衝液(不含H2CO3，含有4.5g/l的葡萄糖，10mMHepespH7.5，0.5％(質量/體積)BSA，1g/l桿菌肽，0.1g/lSBTI，0.1％(質量/體積)NaN3的DMEM)中。對於置換試驗，將約225pM的[125I]-西曲瑞克(比活度為5-10×105dpm/pmol)以及各種濃度的未標記的本發明化合物作為競爭劑與0.25×106細胞/100μl進行溫育。將在100μl結合介質中的細胞懸液在400μl分析試管中對200μl84％體積百分比的矽油(Merck550型)/16％體積百分比的石蠟油進行分層。在37℃下緩慢連續振蕩培養1小時後，以9000rpm離心(轉子型號HTA13.8；HeraeusSepatec，Osterode/德國)2分鐘將細胞從培養基中分離出來。切下含有細胞沉澱物的試管尖端。通過計數γ輻射來分析細胞沉澱物和上清。測得的非特異性結合物質的量終濃度為1μM包括未被標記的西曲瑞克並通常≤10％的總結合物。利用EBDA/配體-分析程序(BiosoftV3.0)進行結合數據的分析。西曲瑞克具有170pmol/L(pM)的KD值(獨立進行的實驗次數21)。方法2(功能試驗測定拮抗活性(IC50值))按照Beckers，T.，Reilnder，H.，Hilgard，P.(1997)″基於一種敏感細胞螢光素酶報導基因分析對促性腺激素釋放激素類似物的表徵(Characterizationofgonadotropin-releasinghormoneanalogsbasedonasensitivecellularluciferasereportergeneassay)″，分析生物化學(Analyt.Biochem).251，17-23(Beckers等.1997)中所述，並作如下改進進行試驗分析。在微量滴定板中利用含有添加劑和1％(v∶v)FCSi的DMEM將表達人LHRH受體和一種螢光素酶報導基因的細胞以每孔10000個細胞培養24小時。然後用1nM[D-Trp6]LHRH對所述細胞刺激6小時。刺激之前加入本發明的拮抗化合物，並且為了定量分析細胞的Luc活性而最終將所述細胞溶解。利用Hill模型通過非線性回歸分析方法(C.Grunwald的程序EDX2.0，ArzneimittelwerkDresden)由劑量-效應曲線計算IC50值。利用各個螢光素酶分析系統(PromegaE4030)基本上按照(Promega技術公告(PromegaTechnicalBulletins)#101/161)所述，一式兩份進行Luc-活性的定量分析。由於加入了輔酶A(CoA)，螢光素-CoA發生具有有利動力學參數的氧化反應。將培養基從微量滴定板中去除後，通過加入100μl的溶胞緩衝液(25mMTris-磷酸鹽pH7.8，2mM二硫蘇糖醇，2mM1，2-二氨基環己烷-N，N，N』，N』-四乙酸(CDTA)，10％(v∶v)甘油，1％(v∶v)TritonX-100)來將細胞溶解。室溫下溫育15分鐘後，將10μl的溶胞產物轉移到一個適於發光檢測的白色微量滴定板(Dynatech)中。通過加入50μl的分析緩衝液(20mM麥黃酮(tricine)pH7.8，1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2，2.67mMMgSO4，0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，33.3mM二硫蘇糖醇，270uM輔酶A，470μM螢火蟲(Photinuspyralis)螢光素，530μMrATPNa2)來啟動酶促反應。1分鐘後，使用EGGBertholdMicroLumatLB96P以5分鐘的信號半衰期測定整整1秒鐘的發光。本發明化合物的物理化學和體外數據列於表2中。IC50代表功能活性而pM表示pmol/L。水中溶解度按照注釋2)所述的方法來測定表2注釋1)括號內的數字表示互相獨立的實驗次數2)水中溶解度按照下述方法進行測定根據官方公報中記載的方法在林格液中的溶解度為了按照官方公報中記載的方法測定溶解度，將過量的測試物質與惰性載體物質如沙子混合後裝入一根玻璃柱(容積約10ml)中。預先將一脫脂棉篩和一個玻璃纖維濾器插入到柱底部。將所述物質-沙子混合物在1.0ml要測定在其中溶解度的溶劑中溶脹1小時。然後將10ml的所述溶劑注入所述的玻璃柱中。利用蠕動泵對所述溶液進行再循環。在室溫下(約20℃)進行測定。當連續流出的級分的質量濃度恆定時確定所述溶解度。利用下述HPLC方法測定質量濃度[原文如此]HPLC方法設備HPLC-體系HewlettPackard1100；檢測器HewlettPackardDAD1100系列柱柱材料Nucleosil120-3C18顆粒大小3μm柱大小125×4mm生產商MachereyNagel設備參數注入體積15μl流速1.0ml/min爐溫45℃波長226nm終止時間15分鐘55％流動相A混合970ml的Milli-Q-H20，30ml的乙腈和1ml的三氟乙酸。產生的pH是約1.9。45％流動相B混合300ml的Milli-Q-H20，700ml的乙腈和1ml的三氟乙酸。產生的pH是約1.8。本發明的化合物能以適合於肽活性化合物的不同形式來進行用藥。合適的用藥方法對於本
技術領域：
的技術人員來說是已知的。例如可以通過注射的方式來進行給藥。例如可以通過非腸道的方式來進行給藥。本發明中皮下(s.c.)，肌內(i.m.)，靜脈內(i.v.)，口腔(例如舌下)或直腸用藥是優選的。I.s.和i.m.給藥是特別優選的。本發明的化合物適於製備成不同的用藥劑型，例如製備成凍乾產物、溶液或懸浮液。合適的用藥劑型及其製備方法對於本
技術領域：
的技術人員來說是已知的。合適的賦形劑和填充劑是，例如己糖醇如甘露糖醇，特別是D-甘露糖醇、L-甘露糖醇或D，L-甘露糖醇，山梨醇如D-山梨醇，D-或L-阿卓糖醇，艾杜糖醇，葡萄糖醇和半乳糖醇。按照本身已知的方法，例如通過混合、懸浮或凍幹來進行製備。例A用於製備s.c.注射液的凍乾產物1mg實施例1的化合物(相當於0.26-0.27mg的乙酸鹽)；0-16.9重量份的D-甘露糖醇，優選0.1-7重量份(各基於實施例1)，和注射用水(由所述凍乾產物製備注射液)。製備將1.62g的實施例1的化合物溶解在30％濃度的乙酸(約1.5升的注射用水和91.17g的乙酸)中。用1.5升的水稀釋所述溶液。在無菌條件下，加入82.2g的甘露糖醇，通過無菌濾器分裝到無菌的2ml注射小瓶中並進行凍幹。獲得了1mg實施例1的化合物的凍乾產物。本發明的化合物適合用於，例如治療惡性或非惡性激素-依賴性病症，如治療乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜異位、子宮肌瘤、良性前列腺增生(BPH)以及在治療男性或女性的生育障礙方面，例如用於防止接受受控卵巢刺激、隨後取出卵細胞以及助生殖技術的患者發生過早排卵。所述治療可在哺乳動物，特別是人中進行。權利要求1.通式(I)的化合物及其與藥用酸形成的鹽，A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9-Xxx10-NH2(I)，其中A是一個乙醯基，Xxx1是D-Nal(2)，Xxx2是D-Cpa，Xxx3是D-Pal(3)，Xxx4是Ser，Xxx5是N-Me-Tyr，Xxx6是D-Cit，D-Hci或D-[·-N』-4-(4-脒基苯基)-氨基-1，4-二氧代丁基]Lys(縮寫D-Lys(B))，Xxx7是Leu或Nle，Xxx8是Arg或Lys(iPr)，Xxx9是Pro而Xxx10是D-Ala或Sar，條件是如果Xxx6是D-Lys(B)，則Xxx7是Nle，如果Xxx6是D-Cit，則Xxx7是Nle而Xxx10是D-Ala，或如果Xxx6是D-Hci，則Xxx7是Leu而Xxx10是D-Ala。2.如權利要求1所述的化合物或其與藥用酸形成的鹽，所述化合物具有下式Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2。3.如權利要求1所述的化合物或其與藥用酸形成的鹽，所述化合物具有下式Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2。4.如權利要求1所述的化合物或其與藥用酸形成的鹽，所述化合物具有下式Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2。5.如權利要求1所述的化合物或其與藥用酸形成的鹽，所述化合物具有下式Ac-D-Nal(2)1-D-Phe(4-Cl)2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2。6.如權利要求1所述的化合物或其與藥用酸形成的鹽，所述化合物具有下式Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2。7.如權利要求1所述的化合物或其與藥用酸形成的鹽，所述化合物具有下式Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2。8.如權利要求1所述的化合物或其與藥用酸形成的鹽，所述化合物具有下式Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2。9.如權利要求1所述的化合物或其與藥用酸形成的鹽，所述化合物具有下式Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2。10.如權利要求1至9之一所述的化合物，其中所述鹽是乙酸鹽、三氟乙酸鹽或撲酸鹽。11.如權利要求1至10之一所述的化合物用作藥物的用途。12.藥物製劑，其包含至少一種權利要求1至10之一所述的化合物以及常規載體和賦形劑。13.製備權利要求1的通式(I)化合物以及權利要求2至9之一所述的化合物的方法，其中通過常規方法在固相上或溶液中合成來源於具有適當保護基團的Xxxm單元的片段，其中m是1至10的整數並且Xxx1被乙醯化，然後通過節段偶聯將所述片段結合到固相上並且完成偶聯後，通過對Xxx10單元進行醯胺化用常規方法將通式I化合物從所述固相上除下。14.如權利要求1至10所述的化合物用於生產治療激素-依賴性腫瘤，特別是前列腺癌、乳腺癌或子宮肌瘤，和其治療需要LH-RH激素抑制的非惡性適應徵如子宮內膜異位、良性前列腺增生(BPH)或治療哺乳動物，特別是人類中雌性或雄性生育障礙的藥物的用途。15.用於生產如權利要求12所述的藥物製劑的方法，其中將至少一種權利要求1至10之一所述的化合物與常規載體和賦形劑混合併配製成一種藥物。16.治療激素-依賴性腫瘤，特別是前列腺癌、乳腺癌或子宮肌瘤，和其治療需要LH-RH激素抑制的非惡性疾病如子宮內膜異位、良性前列腺增生(BPH)，以及治療哺乳動物，特別是人類中雌性或雄性生育障礙的方法，其通過施用有效劑量的至少一種權利要求1至10所述的化合物。全文摘要本發明涉及包含N－甲基化的胺基酸組分以及水溶性改善的肽。根據本發明，含有所述肽的藥物可用於治療激素－依賴性腫瘤和受激素影響的非惡性疾病狀態。文檔編號A61P35/00GK1443195SQ01807543公開日2003年9月17日申請日期2001年3月12日優先權日2000年3月14日發明者M·伯恩德,B·庫徹,E·昆徹,P·羅美斯,T·瑞斯曼,T·柏克斯申請人:贊塔裡斯股份公司