基因轉移介導的血管形成療法的製作方法

2023-10-30 15:20:27

專利名稱：基因轉移介導的血管形成療法的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因療法，更確切地說，涉及病毒介導的基因療法和其他形式的基因療法以及可用於導入所需基因的某些腺病毒構建物(constructs)。更具體地說，本發明涉及腺病毒介導的基因轉送，可用於促進心臟中血管形成，還涉及到使用這些媒介體對外周血管疾病和心肌缺血等心臟病進行治療的方法。
背景技術：
據美國心臟協會報導(1995年統計學增刊)，在美國，大約有六千萬成年人患有心血管疾病，其中一千一百萬患有冠狀動脈性心臟病，心血管疾病每年大約造成一百萬美國人死亡，超過所有死亡人數的40％。1995年，一百五十萬美國成年人被診斷為心絞痛，經歷過短時心肌缺血導致的胸痛。在美國，每年大約有三十五萬例初發心絞痛。
當心肌血液供應不足，造成心肌必需的氧和營養物質供應缺乏時，會發生心肌缺血。心肌缺血最常見的原因是動脈粥樣硬化，這會導致供應心肌血液的血管(冠狀動脈)阻塞。現在的治療方法包括藥物療法。冠狀動脈旁路成形術和採用氣囊血管成形術等技術進行經皮血管再造。標準藥物療法基於以下策略增加心肌的供血量或者降低心肌對氧和營養物質的需求。增加心肌的供血量可用鈣離子通道阻斷劑或硝酸甘油等藥物達到，這些藥物被認為通過舒張動脈管壁平滑肌，增加病變動脈的直徑。降低心肌對氧和營養物質需求可通過如下方法達到使用如動脈血管舒張藥降低心臟血液動力負荷，或使用如β-腎上腺素能受體拮抗劑降低心臟在既定血液動力負荷下的收縮反應。缺血性心臟病的手術療法多採用策略性放置的旁路移植物(通常為隱靜脈或哺乳動物體內動脈移植物)使病變動脈部分形成旁路。經皮血管再造系採用導管降低病變冠狀動脈的狹窄度。使用上述策略都是為了減少心肌缺血的次數或使之不再發生，但都存在著一些局限。
已有文獻報導，通過直接注射血管形成蛋白或肽，在心臟中形成新血管，以治療心肌缺血。成纖維細胞生長因子(FGF)家族的一些成員(即酸性成纖維細胞生長因子，aFGF；鹼性成纖維細胞生長因子，bFGF；成纖維細胞生長因子-5，FGF-5和其它因子)已被用於調控生長發育過程中的血管形成。例如，最近的一篇報導主要探討了aFGF蛋白在促進成年動物血管形成中的作用。該報導稱，包被了膠原蛋白的基質中的aFGF蛋白置於成年大鼠的腹膜腔中，形成血管化良好的正常灌流結構(Thompson，etal，PNAS，86；7928-7932，1989)。另據報導，在成年犬冠狀動脈閉合期間，向冠狀動脈中注入bFGF蛋白，會減少心肌機能障礙的發生，減少心肌梗塞，增加危險區域(bed)的血管分布(Yanagisawa-Miwa，et al.，Science，2571401-1403，1992)。在心肌缺血的動物模型中使用bFGF蛋白也有類似結果報導(Harada，et al.，J.Clin.lnvest.，94623-630，1994，Unger etal.，Am.J.Physiol.，266H1588-H1595，1994)。
然而，採用這些蛋白達到血管形成必需有重複的或長期的蛋白供給，這限制了這些刺激血管形成的蛋白在臨床處置中的應用。換而言之，在人體中的成功的治療需要持續和長期地注入一種或多種這些血管形成肽或蛋白，這些肽或蛋白本身價格昂貴，還必需通過置於冠狀動脈內的導管將其導入，這進一步增加了治療的費用和難度。
近來，許多出版物主張使用基因轉移治療或預防疾病，包括心臟病。可參見Mazur等的《冠狀動脈再狹窄和基因療法》(Molecular and CellularPharmacology，21104-111，1994)；French的《基因轉移和心血管功能失調》(Herz，18222-229，1993)；Williams的《缺血性心臟病的基因療法展望》(Amercan Journal of Medical Sciences，306129-136，1993)，Schneicler和French的《腺病毒的出現心血管病的基因療法》(Cirualation，881937-1942，1993)。其它出版物包括Leiden等的國際專利申請號PCT/US 93/11133，名稱為《以腺病毒為介導將基因轉移至心臟和血管平滑肌》，該申請報導了應用以腺病毒為介導的轉移基因方法調控心血管平滑肌細胞的功能。Leiden等宣稱，含有編碼基因產物的DNA序列的重組腺病毒，可被轉移至心臟或血管平滑肌細胞中，這種細胞可持續至基因產物得到表達。根據Leiden等的報導，可通過改變基因轉錄和如多聚核苷酸或多肽等基因轉錄產物的生產來調控肌細胞功能。Leiden等報導這種多聚核苷酸或多肽與心臟或平滑肌細胞發生反應，從而調控細胞功能。Leiden等宣稱，無論細胞在體外、原位還是體內，這種調控均可完成。Leiden等人描述了一種基因轉移方法，包括將已插入一種基因產物的複製缺陷型腺病毒5型(帶有CMV啟動子)，與攜有完整的腺病毒基因組的質粒，如JM17質粒一起，共轉染293細胞，以獲得含有基因產物的腺病毒構建物，在293細胞中增殖所得腺病毒構建物；將載體直接注入細胞，使腺病毒構建物轉移至心肌和血管平滑肌細胞。
使用腺病毒載體成功地向心臟進行基因轉移，存在一些妨礙因素。例如，轉移基因插入迅速分裂的細胞群體實際上會縮短轉移基因表達的時間。這類細胞的實例包括內皮細胞，它們組成所有血管的內層，和成纖維細胞，它們分布於整個心臟。定嚮導入轉移基因，以使只有目的細胞接受和表達轉移基因，轉移基因不會全身分布，也是相當重要的。如果不能做到這樣，轉移基因就會全身表達，隨之而來會引起一些問題。例如，已經證實，以腺病毒為介導在肝臟中進行基因轉移，可引起炎症性浸潤(Yang，etal.，Proc，Natl，Acad.Sci(U.S.A)，914407，1994)。最後，關於以腺病毒為介導轉入FGF-5基因以在體內刺激血管形成，我們已發現注入的病毒物質，能引起嚴重的、通常是危及生命的心律失常。
本發明的說明和權利要求注意並克服了現有技術存在的這些和其它問題。

發明內容
本發明涉及一種基因療法，可用於治療心臟病(優選用於治療心肌缺血)和外周血管疾病。本發明的目的之一是提供一種治療心臟病的方法，該方法包括將含有所說血管形成蛋白或肽的基因的載體構建物定嚮導入至心臟，在連續的期間內使心肌中持續產生顯著治療量的血管形成蛋白或肽。血管形成蛋白或肽優選FGF-5，載體構建物優選複製缺陷型的腺病毒構建物，載體導入採用冠狀動脈內注射，優選導管深插入(通常至少約1cm)一支或兩支冠狀動脈或一支或多支隱靜脈或哺乳動物體內動脈移植物內。
另一方面，本發明提供了一種治療心肌缺血病人的心臟病的方法。該方法包括導入已插入了轉移基因的複製缺陷型腺病毒載體至病人心肌中，以轉染受到影響的心肌細胞。轉移方法採用冠狀動脈內注射，優選載體的單次注射，直接注入一支或兩支冠狀動脈(或移植物)內。所說載體含有轉移基因，該基因編碼血管形成蛋白或肽，如FGF-5、aFGF、bFGF或VEGF(血管內皮生長因子)，載體還能在心臟中表達轉移基因，從而促進心肌受作用區域的血管形成。將不含野生型病毒的載體貯存液注入一支或兩支冠狀動脈(或移植物)腔內深部，優選同時注入左右兩支冠狀動脈(或移植物)，注入量優選光密度測定法測定為107-1013個病毒粒子(更優選109-1011個病毒粒子)，這樣就有可能在受作用的心肌中用編碼血管形成蛋白或肽的基因局部轉染既定數量的細胞，尤其是心肌細胞，從而使基因轉移的治療效果最好，最大限度減少心外部位不必要的血管形成和對病毒蛋白產生炎症反應的可能性。例如，如果使用心室肌細胞特異性啟動子，就能更確定地使表達局限於心肌細胞，以避免在例如視網膜等心外組織中形成血管的潛在有害作用。
另一方面，本發明提供了經過濾的、可注射腺病毒載體製品，包括重組腺病毒載體，優選最終病毒效價(titer)為107-1013個病毒粒子的載體。該載體不含野生型病毒，它包括部分腺病毒序列，該序列缺失了一個或多個腺病毒複製必需基因，如E1A/E1B基因；載體也包括轉移基因，轉移基因編碼血管形成蛋白或肽，如促進血管形成的aFGF、bFGF和VEGF，它通過旁側為部分腺病毒序列的啟動子啟動；該載體還包括藥學上可接受的載體。使用這種可注射的腺病毒載體製品，有可能有效地進行以腺病毒為介導的FGF-5基因轉移，以臨床治療心肌缺血或外周血管疾病，而無任何不良反應。
再者，本發明提供了一種生產病毒貯存液的方法，所述病毒貯存液中含有能夠在活體心肌中表達血管形成蛋白或肽的重組載體。該方法包括如下步驟克隆轉移基因至含有啟動子和多克隆位點的質粒中，轉移基因優選編碼FGF-5、aFGF、bFGF和VEGF等血管形成蛋白或肽的基因，啟動子和多克隆位點旁側為人類腺病毒5基因組的左側末端部分腺病毒序列，該序列中缺失了一個或多個腺病毒複製必需基因，如E1A/E1B基因；另一種質粒含有人類腺病毒5全部基因組和額外的插入片段—該插入片段使質粒過大而無法被包裝；用上述兩種質粒共轉染哺乳動物細胞，該細胞被載體中缺少的複製必需基因轉化過。在被轉染的細胞內發生補救重組，重組發生在已插入了轉移基因的質粒和含有腺病毒全部基因組的質粒之間，從而產生一個重組基因組，該重組基因組含有不具備複製必需基因的轉移基因，所說重組基因組足夠小因而能被包裝；在細胞培養物中鑑別成功的重組子；在被所缺少的複製必需基因轉化過的哺乳動物細胞中增殖所得重組子；純化增殖的重組子以使其中只含重組載體不含野生型病毒，將純化載體通過濾器過濾，優選0.1-0.5微米濾器，更優選0.3微米濾器。
另外，表達血管形成蛋白或肽的重組腺病毒，可通過導管導入一側或雙側股動脈近端部分，從而使基因轉入由股動脈供血的骨骼肌細胞，這將會提供促進血管形成的刺激物，促使腿部骨骼肌中形成血管，從而治療以腿部肌肉供血不足為特徵的外周血管疾病。
還需指出，除心臟和腿部之外，本發明提供的以腺病毒為載體的轉移基因導入和表達也可用於其它器官和組織，以定點方式將基因轉移至目的器官和組織。因而由本發明可期待以腺病病毒為介導將基因定向轉移至任何組織或器官，只要該組織或器官由特定動脈供血。例如，通過對目的動脈腔內的深部注射(如約為1cm)，可導入含有轉移基因的腺病毒，這些動脈可以是一支或多支向腎臟供血的腎動脈或者是肝臟的肝動脈，這樣可以使基因轉移局限於這些器官。這種方法的應用極其廣泛，包括血管形成、器官或組織特異性腫瘤的治療、遺傳性代謝病的治療等。根據靶組織或器官的情況、病人的動脈解剖學和本領域的其它已知因素，注射深度可以改變。選擇注射深度和部位優選使局部而非全身導入重組腺病毒。本領域的技術人員無需過多試驗即可確定該深度。
因此，本發明涉及刺激心肌缺血的病人冠狀動脈並行血管發育的方法，包括通過冠狀動脈內注射直接注入一支或兩支冠狀動脈將複製缺陷型腺病毒載體導入病人心肌中，所說載體含有編碼血管形成蛋白或肽的轉移基因，並能夠在心肌中表達轉移基因，從而促進冠狀動脈並行血管發育。
如上所述的方法，其中載體的導入採用單次注射。
如上所述的方法，其中通過注射導入的腺病毒載體粒子約為107～1013個。
如上所述的方法，其中通過注射導入的腺病毒載體粒子約為109～1012個。
如上所述的方法，其中通過注射導入的腺病毒載體粒子約為1011個。
如上所述治療心臟病的方法，其中所說轉移基因由載體所含的CMV啟動子啟動。
如上所述治療心臟病的方法，其中所說轉移基因由載體所含的心室肌細胞特異性啟動子啟動。
如上所述治療心臟病的方法，其中所說心室肌細胞特異性啟動子含有心室肌漿球蛋白輕鏈-2的序列。
如上所述治療心臟病的方法，其中所說心室肌細胞特異性啟動子含有肌漿球蛋白重鏈啟動子的序列。
如上所述治療心臟病的方法，其中所說血管形成蛋白或肽選自由aFGF、bFGF、FGF-5和VEGF組成的組中。
如上所述方法，其中所說血管形成蛋白為FGF-5。
如上所述的方法，其中所說血管形成蛋白為aFGF。
如上所述的方法，其中所說血管形成蛋白為bFGF。
如上所述的方法，其中所說血管形成肽為VEGF。
如上所述治療心臟病的方法，其中所說冠狀動脈內注射系以導管插入冠狀動脈左支或右支腔內約1cm。
如上所述治療心臟病的方法，其中所說冠狀動脈內注射系以導管插入一支冠狀動脈和一支隱靜脈移植物和/或一支哺乳動物深部動脈移植物腔內約1cm。
本發明還涉及經過濾的可注射腺病毒載體製品，包含重組腺病毒載體，該載體不含野生型病毒，並包含部分腺病毒序列，其中缺失了E1A/E1B基因；和編碼血管形成蛋白或肽的轉移基因，由旁側為部分腺病毒序列的啟動子啟動；和藥學上可接受的載體。
如上所述的製品，其中腺病毒載體通過0.3微米濾器進行過濾。
如上所述的可注射腺病毒載體製品，其中所說血管形成蛋白為FGF-5。
如上所述的可注射腺病毒載體製品，其中所說啟動子選自由CMV啟動子，心室肌細胞特異性啟動子和肌漿球蛋白重鏈啟動子組成的組中。
本發明還涉及含重組載體的病毒貯存液的生產方法，該載體能夠在活體內心臟中表達血管形成蛋白或肽，該方法包括以下步驟將編碼血管形成蛋白或肽的轉移基因克隆至質粒中，該質粒含有旁側為複製缺陷型人類腺病毒基因組左側末端部分腺病毒序列的啟動子和多克隆位點；用該質粒與另一質粒共轉染被腺病毒複製必需基因轉化過的哺乳動物細胞，後一質粒含有人類腺病毒全部基因組和額外的插入片段，該插入片段使質粒過大，無法被包裝，轉染後細胞內發生補救重組，重組發生在已插入了轉移基因的質粒和含有腺病毒全部基因組的質粒之間，所得重組基因組含有轉移基因，缺少一個或多個複製必需基因，該重組基因組較小，可被包裝；在細胞培養物中鑑別成功的重組子；在被缺少的複製必需基因轉化過的哺乳動物細胞中增殖所得重組子；純化增殖的重組子，使其中含重組子載體，不含野生型病毒；和使純化重組子通過0.1-0.5微米的濾器。
如上所述生產病毒貯存液的方法，其中克隆轉移基因的質粒為質粒pAC1或質粒ACCMVPLPA。
如上所述生產病毒貯存液的方法，其中鑑別過程包含如下步驟監視轉染細胞是否出現細胞病變效應；將出現細胞病變效應的細胞培養物的上清液用蛋白酶K處理，隨後用酚/氯仿抽提，乙醇沉澱；使用PCR鑑別成功的重組子，所用引物分別與CMV啟動子和腺病毒序列互補；和進行兩輪噬斑純化。
如上所述生產病毒貯存液的方法，其中所說純化過程包括如下步驟在被複製必需基因轉化過的細胞中增殖所得重組子至效價為1010-1012個病毒粒子；採用雙CsCl梯度超離心純化增殖的重組子；和將純化重組子通過Sepharose柱。
本發明還涉及一種重組載體，包括已插入了轉移基因的複製缺陷型腺病毒質粒，它不含E1A/E1B序列；編碼FGF-5的轉移基因，轉移基因通過與其相連的CMV啟動子啟動。
如上所述的載體，其中所說載體包括與轉移基因相連的多聚腺苷酸化序列。
如上所述的重組載體，其中已插入了轉移基因的複製缺陷型腺病毒質粒為人類腺病毒5型，它位於CMV啟動子和SV40多聚腺苷酸化信號旁側，轉移基因克隆至其中。
如上所述的重組載體，其中含腺病毒全部基因組的質粒含有人類腺病毒5全部基因組和載體pBR322的部分序列，該序列中包括氨苄西林抗性基因。
如上所述的重組載體與含人類腺病毒全部基因組的質粒的聯合。
本發明所述的一種宿主細胞，含有如上所述的聯合載體。
如上所述的宿主細胞，其中所說的細胞為人293細胞。
如上所述獲得重組腺病毒載體的方法，包括用兩種質粒共轉染被腺病毒早期基因1區(E1)轉化過的細胞，一種質粒為已插入了轉移基因的複製缺陷型腺病毒質粒，另一種質粒含腺病毒全部基因組；和在被腺病毒早期基因1區(E1)轉化過的細胞中增殖腺病毒載體，細胞可與共轉染步驟中的細胞相同或不同。
本發明還涉及刺激患有缺陷性外周血管疾病的病人血管發育的方法，包括通過股動脈內注射直接注入一側或雙側股動脈將複製缺陷型腺病毒載體導入病人的外周血管系統，所說載體包括編碼血管形成蛋白或肽的轉移基因，並能夠在外周血管系統中表達轉移基因，從而促進外周血管發育。
如上所述的方法，其中載體的導入採用單次注射。
如上所述的方法，其中通過注射導入的腺病毒載體粒子約為107-1013個。
如上所述的方法，其中通過注射導入的腺病毒載體粒子約為109-1012個。
如上所述的方法，其中通過注射導入的腺病毒載體粒子約為1011個。
如上所述治療心臟病的方法，其中血管形成蛋白或肽選自由aFGF、bFGF、FGF-5和VEGF組成的組中。
本發明還涉及使轉移基因導入和表達局限於單個器官或結構的方法，包括通過在向所說的器官或結構供血的動脈內插入導管約1cm，注入重組腺病毒。
附圖簡述

圖1為通過補救重組構建編碼轉移基因的腺病毒的示意圖。
圖2顯示右心房起博期間(HR＝200bpm)缺血床壁增厚百分比(％WTh)，其計算方法如下在以lacZ(對照基因)和FGF-5基因進行基因轉移前和基因轉移後的14±1天，測量舒張期末壁厚(EDWTh)和收縮期末壁厚(ESWTh)。局部缺血床功能在轉入FGF-5基因(P＝0.0001)之後增加了2.6倍。而對照基因轉入不影響其功能。
圖3顯示峰對照比(與血流量有關)，表示為缺血區(LCx bed)峰視頻密度與室間隔(IVS)峰視頻密度之比。峰視頻密度系來用計算機視頻分析程序由視頻圖像測得，測量在以lacZ(對照基因)和FGF-5基因進行基因轉移前和基因轉移後14±1天於心房起博(200bpm)期間進行。缺血床的血流量，在轉入FGF-5基因(P＝0.0018)之後較正常值增加了兩倍，但轉入對照基因後，仍只有正常值的50％。
圖4為心肌對照超聲波心動圖(未示出)的圖解。白色區域表明反差增強(血流量增加)，暗色區域表明血流量減少。圖4A顯示正常豬中快速(acute)LCx閉合。圖4B顯示轉入lacZ基因14±1天後的情況，圖4C顯示轉入FGF-5基因14±1天後的情況。
圖5顯示毛細血管數與纖維數之比，其定量方法是在轉入FGF-5和lacZ基因後，以顯微鏡對缺血區和非缺血區進行分析。FGF-5基因轉入後(P＜0.038)，血管形成增加。
圖6為治療組動物區域收縮功能的圖解。
圖7為治療組動區域心肌血流量的圖解。
圖8為治療組動物估計血管數的圖解。
發明詳述編碼血管形成蛋白和肽的轉移基因本發明中可以使用多種蛋白質或肽生長因子。它們能增加心臟(或在外周血管疾病時為骨骼肌)缺血區的心肌流量。當血管形成蛋白或肽得以表達時，例如aFGF、bFGF和FGF-5為血管形成蛋白或肽的實例。FGF家族的促血管形成活性，在用蛋白質注入治療時，已得到了科學的認識(Yanagisawa-Miwa，et al.，Science，2571401-1403，1992，Harada，et al.，J.Clin.lnvest.，94623-630，1994，Unger，et al.，Am.J.Physiol.，266H1588-H1595，1994)。VEGF(血管內皮生長因子)可能也能刺激新血管生長，也可使用它的基因。成功地進行基因轉移需有基因產物的合成，也需要基因產物由被轉染的細胞中分泌出來。根據這種觀點，優選編碼FGF-5的基因，而且其中最好包括編碼信號肽的序列，從而保證一旦基因產物得到表達，即能進入心臟(或骨骼肌)間質組織，誘導血管形成。
不依賴於輔助病毒的複製缺陷型人類腺病毒5系統一般而言，目的基因被轉移至活體內心臟(或骨骼肌)，包括心肌細胞(或骨骼肌細胞)中，就可以使基因編碼的蛋白質持續地產生。幾種不同的基因轉移方法都是適用的，優選不依賴於輔助病毒的複製缺陷型人類腺病毒5系統。我們已證實使用該系統只須單次冠狀動脈內注射，即可轉染體內60％以上的心肌細胞(Giordano and Hammond，Clin.Res.，42123A，1994)。在冠狀動脈內注射後轉染冠狀動脈內皮細胞和心肌細胞從而獲得高效轉染時，非複製型重組腺病毒載體特別有用。同樣，在轉染外周血管系統的目的的細胞時，該載體也特別有用。
基於人類腺病毒5的重組腺病毒載體(Virology，163614-617，1988)缺失了腺病毒基因組中的必需早期基因(通常為E1A/E1B)，因而只有在能提供反式作用的缺失基因產物的相容細胞系中生長時，才能夠複製。目的轉移基因可被克隆，並在複製缺陷型的被腺病毒感染的組織/細胞中表達以代替缺失的腺病毒基因組序列。儘管基於腺病毒的基因轉移不能使轉移基因整合進宿主基因組(不到0.1％的以腺病毒為載體的轉染使轉移基因整合進宿主DNA)，因而是不穩定的，但腺病毒載體能以高效價增殖並能轉染非複製細胞。儘管轉移基因不能傳遞到子細胞中，但對不分裂的成人骨骼肌和心肌細胞來說，這種轉移基因方法是可以接受的。逆轉錄病毒載體可提供穩定的基因轉移，通過假型逆轉錄病毒現在可獲得高效價的逆轉錄病毒載體(Burns，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A)，908033-8037，1993)，但現在的逆轉錄病毒載體不能有效地轉導非複製型細胞(成人骨骼肌和心肌細胞)。而且，如果短期基因轉移是有效的，就沒有理由冒著風險使轉移基因整合進宿主DNA中。確實，我們已發現血管形成蛋白的短時表達足以形成相當數量的血管。對心血管病和外周血管疾病的治療來說，短時的基因轉移即已足夠。
人293細胞是被腺病毒E1A/E1B基因轉化過的人胚腎細胞，為典型的有用的相容細胞系。然而，也可使用其它允許複製缺陷型的腺病毒載體在其中增殖的細胞系，包括HeLa細胞。
重組腺病毒載體的構建本發明使用的所有腺病毒載體均可通過補救重組技術構建，該技術由Graham在1988年的Virology 163卷614-617頁中介紹過。簡單地說，目的轉移基因被克隆至穿梭載體中，該載體含啟動子、多克隆位點(pdylinker)和部分旁側腺病毒序列，所述序列中缺失了E1A/E1B基因。穿梭載體的實例如下質粒pAC1(Virology 163614-617，1988)(或其類似物)，編碼人類腺病毒5基因組的左側末端部分(Virology 163614-617，1988)，缺少編碼早期蛋白的E1A/E1B序列，這兩個序列對病毒複製是必需的；質粒ACCMVPLPA(J.Biol.Chem.，26725129-25134，1992)，含有多克隆位點，CMV啟動子和SV40多聚腺苷酸化信號，上述結構旁側為部分腺病毒序列，其中缺失了E1A/E1B基因。使用質粒pAC1或ACCMVPLA可促進克隆過程。另一種質粒含有人類腺病毒5的全部基因組，其長度過大，無法被包裝。將該質粒與上述穿梭載體共同轉染293細胞。可用磷酸鈣沉澱或脂轉染法(lipofection)進行共轉染(Biotechniques.15868-872，1993)。質粒JM17編碼人類腺病毒5全部基因組和載體pBR322的部分序列，包括氨苄西林抗性基因(4.3kb)。儘管JM17編碼病毒粒子成熟必需的全部腺病毒蛋白，但它的長度過大，因而無法被包裝(40kb，而野生型為36kb)。在一小部分共轉染細胞中發生補救重組，重組發生在例如質粒pAC1等含有轉移基因的穿梭載體和另一質粒之間，該質粒含有人類腺病毒5的全部基因組，如pJM17。重組的結果產生一個重組基因組，其中E1A/E1B序列發生了缺失，所述重組基因組含有目的轉移基因，但在重組中它丟失了另外的序列，如pBR322序列，因而重組基因組小到足以能夠被包裝(見圖1)。關於上述方法，我們已有成功的結果報導(Giordano，et al.，Circalation，88I-139，1993，and Giordano and Hammond，Clin，Res.，42123A，1994)。用x-gal處理時，使用CMV啟動的編碼β-半乳糖苷酶的腺病毒HCMVSP1 lacZ，可用來評價基因轉移的效率。
使用腺病毒載體進行基因轉移的初始模式如上所述，這些載體的優點如下能夠進行高效基因轉移(60％以上的靶器官細胞在體內被轉染)，容易獲得高效價病毒貯存液以及能夠使基因轉入心肌細胞等不分裂的細胞。
組織特異性啟動子本發明也考慮過不僅使用細胞導向注入，例如將轉移基因導入冠狀動脈或股動脈，而且考慮過使用組織特異性啟動子。例如，將左心室肌漿球蛋白輕鏈-Z(MLC2V)或肌漿球蛋白重鏈(MHC)的組織特異性轉錄控制序列，與腺病毒構建物內的FGF-5基因等轉移基因融合，轉移基因表達即局限於心室肌細胞。使用本發明的重組腺病毒系統，已經確定了帶有lacZ的MLC2V和MHC啟動子決定的基因表達效力和特異性程度。心臟特異性表達已由lee等報導過(J.Biol.Chem.，267；15875-15885，1992)。MLC2V啟動子由250bp組成。很容易被裝入腺病毒5包裝壓縮物。已知肌漿球蛋白重鏈啟動子為活躍的轉錄啟動子。它是另一種理想的可選擇的心臟特異性啟動子，由不到300bp組成。其他啟動子，如肌鈣蛋白-C啟動子，儘管高效並足夠小，但組織特異性較差。可以相信，通過使用MLC2V或MHC啟動子並在體內導入轉移基因，只有心肌細胞充分表達例如FGF-5等血管形成蛋白(即無心臟內的內皮細胞，平滑肌細胞和成纖維細胞的同時表達)，從而促進血管形成。從基因轉移用於治療臨床缺血的可行性來看，局限於心肌細胞的表達也有優越之處。通過局限於心臟的表達，可以避免在視網膜等心外組織形成血管的潛在有害作用，而且，作為心臟中的細胞，心肌細胞可能使轉移基因表達持續最長的時間，因為這些細胞不會被迅速代換掉，因而不會象在內皮細胞中那樣，基因表達由於細胞有絲分裂和死亡而下降。為上述目的，現在已有了內皮細胞特異性啟動子(Lee et al.，J.Biol.Chem.，26510446-10450，1990)。
本發明中，關於心臟病的治療，現在優選通過冠狀動脈內注射將高效價載體定嚮導入心臟，並轉染各種類型的細胞。
腺病毒載體的增殖和純化成功的重組載體可根據標準方法進行噬斑(plaque)純化。所得病毒載體在293細胞中增殖至效價達到優選範圍1010-1012個病毒粒子/ml，所述細胞可提供E1A和E1B的反式作用。在80％匯合時感染細胞，48小時後收穫細胞，經3次凍融後，離心收集細胞碎片，採用CsCl梯度超離心(優選雙CsCl梯度超離心)純化病毒。在體內注射之前，採用例如G25Sepbadex等Sepharose柱經凝膠過濾使病毒貯存液脫鹽。所得產物經0.3微米濾器過濾，因而減小了冠狀動脈內注射未過濾病毒的有害作用(危及生命的心律失常)，並促進了有效的基因轉移。所得病毒貯存液最終效價為1010-1012個病毒粒子/ml。重組腺病毒需高度純化，不得含有野生型(可能複製的)病毒，不純的構建物會引起宿主動物的強烈免疫反應。根據這種觀點，進行增殖和純化以排除汙染物和野生型病毒可通過諸如以下的方式完成選用合適的引物，用PCR鑑定成功的重組子；進行兩輪噬斑純化，再進行雙CsCl梯度超離心。另外，我們發現，向病人注入腺病毒載體引起的心律失常所帶來的問題，可通過在冠狀動脈內注射前採用大小合適的濾器過濾重組腺病毒而得以避免，這種做法似乎也能明顯促進基因轉移和表達。
重組腺病毒載體的導入病毒貯存液可以是可注射的製品形式，如有必要可含有如鹽水等藥學上可接受的載體。可注射載體製品的最終效價範圍優選107-1013個病毒粒子，這個效價範圍使基因轉移能有效地進行。其它藥物載體、製劑和劑量在以下將要談到。腺病毒轉移基因構建物通過直接冠狀動脈(或移植血管)內注射導入至心肌，注射系以標準經皮導管方法在螢光鏡導引下進行，注射量應足以使轉移基因表達而能夠進行有效治療的程度，注射時應使導管深入冠狀動脈(或移植血管)腔內(至動脈腔內約1cm)，優選兩支冠狀動脈同時注射，因為在個體病人體內並行血管的生長是高度可變的。通過冠狀動脈導管將材料直接注入冠狀動脈腔內，有可能非常有效地定嚮導入基因，並儘量減少注射期間重組載體向主動脈近端的丟失。我們已發現，採用這種方式導入，在肝細胞內沒有基因表達，冠狀動脈內注射後任何時間，均未發現尿中存在有病毒RNA。冠狀動脈導管的任何變化形式或如Stack灌流導管均可用於本發明，而且本領域的普通技術人員已知的其它技術均可用於向動脈管壁轉移基因。
為治療外周血管疾病—該病特徵在於腿部供血不足，通過導管導入表達血管形成肽或蛋白的重組腺病毒，導管插入至一側或雙側股動脈的近端，因而使基因轉移至由股動脈供血的骨骼肌細胞內，這將提供促進血管形成的刺激物，從而使腿部骨骼肌中形成血管。
為治療其他器官或組織特異性疾病，通過導管或類似裝置導入表達例如血管形成蛋白或肽等治療用肽或蛋白的重組腺病毒，導管或裝置應深插入向器官或組織供血的動脈近端，以使基因基本上只轉入靶器官或組織的細胞。
心肌缺血的動物模型成功地進行有關基因療法的研究的重要前提包括(a)用於模擬臨床心肌缺血的動物模型的體質，通過對心肌缺血進行處置，可以提供有關血管形成機制的有用數據；和(b)正確地評價基因轉移的效果。根據這種觀點，現有技術均存在著一些缺憾。我們已使用過心肌缺血的豬模型，該模型模擬了臨床冠狀動脈性疾病。在冠狀動脈左旋(circumfiex)冠狀動脈(LCx)周圍放置ameroid縮窄器(constrictor)，使冠狀動脈逐漸阻塞(放置後7天內)，而只有極小的梗塞形成(左心室為1％，LCx床為4±1％)(Roth，et al.，Circulation，821778，1990；Roth，et al.，Am.J.Physiol.，235H1279，1987；White，et al.，Circ.Res.，711490，1992；Hammond，et al.，Cardiol.，23475，1994；and Hammond，et al.，J.Clin.lnvest.，922644，1993)。由於並行血管的發育，原來由阻塞動脈灌流的區域(即所稱的局部缺血區)，在靜息狀態下，心肌功能和血流量正常，但當心肌氧需求增加時，血流儲備不足以能阻止局部缺血的發生，因而LCx床發生暫時性缺血，類似於臨床上的心絞痛。在ameroid放置後21天內，並行血管發育和流量-功能關係穩定下來，並在四個月內保持不變(Koth，et al.，Circulation，821778，1990；Roth，et al.，Am.J.Physiol.，235H1279，1987；White，et al.，Circ.Res.，711490，1992)。遙測法證實，在一天中的危險時刻，動物的床部位發生暫時性缺血，從而引起功能異常，危險時刻與進食或工作人員幹擾等引起心率迅速增加有關(數據未發表)。因而該模型的一個床部位具有穩定但不充分的並行血管，所以模型會發生暫時性缺血。該模型的另一明顯優點是，它具有一個正常灌流的功能正常區(LAD床)和一個不正常灌流的功能異常區(LCx床)，兩個功能區相鄰，因而在每一動物體內均有一對照床。
心肌造影超聲心動術被用來估計區域心肌灌流量。造影材料包括半乳糖微聚合體，它能增強圖像的回聲效果(白度)，微聚合體在冠狀動脈和心肌壁的分布與血流量成比例(Skyba，et al.，Circulation，901513-1521，1994)。而且造影材料的峰密度與根據微球體測得的心肌血流量密切相關(Skyba，et al.，Circulation，901513-1521，1994)。為證實本發明中使用的超聲心動圖像能準確地標示LCx床，以及心肌造影超聲心動術可用來估計心肌血流量，沿鄰近ameroid的LCx近端放置水壓套咬合器。
本發明中，處死動物時，心臟採用灌流固定(戊二醛，生理壓力下原位固定)以在顯微鏡下確定毛細血管生長量。採用PCR由接受了轉移基因的動物中測定血管形成蛋白DNA和mRNA。而且，如以下所述，基因轉移後兩周，來自所有五隻被lacZ感染的動物的心肌樣品，在進行組織學觀察時均顯示明顯的β-半乳糖苷酶活性。最後，使用血管形成蛋白的多克隆抗體證實，接受了轉移基因的動物心肌和細胞中有血管形成蛋白表達。
治療研究的策略包括轉移基因的導入時機、導入路徑和血管形成基因的選擇。在心肌缺血的ameroid模型中，當並行血管發育已穩定下來但尚不充分時，進行基因轉移。先前採用ameroid模型的研究包括在ameroid閉合期間，並行血管發育和局部缺血發生之前導入血管形成肽。然而，由於以下幾個原因，這一策略未被採用首先，先前研究不適合於臨床治療心肌缺血時的情況，治療行進性心肌缺血時要進行基因轉移。先前研究的情況類似於預計到局部缺血發生時即提供肽，因而相關性較低；其次，根據先前在細胞培養物中的研究可以推測，局部缺血刺激和肽的存在是刺激血管形成的最佳條件，當心肌缺血已經存在時導入轉移基因能最佳地達到上述條件。與這些決定有關的是選擇轉移基因導入的方法，由於該技術應當可用來對患有冠狀動脈疾病的病人進行治療，使得幾種方法難獲支持(持續將肽注入冠狀動脈內，將質粒定向注入心臟，以含肽樹脂包覆心臟以使肽長期緩慢釋放)；最後，豬模型提供了極好的方法來監視基因導入前後區域血流量和功能。使用對照動物能為這些研究提供對照，對照動物獲得了同樣的重組腺病毒構建物，但帶有報導基因。本技術領域的技術人員可以理解，由以下所述豬模型中的結果可預計人類中的結果，豬的天然冠狀動脈循環非常接近於人的冠狀動脈循環，包括缺少天然冠狀動脈並行血管。
治療應用本發明中的複製缺陷型重組腺病毒載體可使體內基因轉移高效進行，而在基因表達區域無細胞病變效應和炎症。根據這些結果，以下實施例中將近一步談到，可以看到只要體內基因轉移水平足夠高，即可造成體內的功能改變。
治療心臟病時，通過冠狀動脈內注射轉入血管形成蛋白基因會促進血管形成。因而一旦觀察到存在短時缺血後，即可著手治療局部缺血。而且基因轉入後，缺血區毛細血管數目、血流量和功能會有提高。這些技術在臨床上會有廣泛用途，特別是初次用於不可手術治療的冠狀動脈疾病和病殘的心絞痛患者。本發明的數據證實，表達成纖維細胞生長因子-5(FGF-5)的重組腺病毒載體的轉入，能大大緩減心肌缺血。
本發明的組合物或產品可以適合於冠狀動脈內給藥的製劑形式方便地提供。合適的給藥方式最好由執業醫師根據每個病人的情況分別確定。合適的藥學上可接受的載體及其製劑在標準製劑專題中論及，如E.W.Martin的《Remington藥學》，也可參見Wang，Y.J.和Hanson，M.A.的《蛋白質和肽的母劑穩定性和穩定劑》(Journals of Parental Sciences andTechnology技術報告第10期，增補本422S(1988)。本發明的載體應在中性pH下配製成溶液，優選pH為約6.5-8.5，更優選pH為約7-8。用賦形劑使溶液達到等滲點，例如賦形劑可用4.5％甘露醇或0.9％氯化鈉，pH緩衝採用本技術領域中熟知的緩衝溶液，如磷酸鈉，一般認為它們是安全的，同果還可使用可接受的防腐劑，如0.1％-0.75％的間甲酚，間甲酚濃度優選為0.15％-0.4％，使用氯化鈉或其他藥學上可接受的試劑使溶液達到等滲點。這些試劑包括葡萄糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇、多元醇(如甘露醇和山梨醇)或其他有機或無機試劑，優選氯化鈉，尤其是使用含鈉離子的緩衝液時。如有必要，可製備上述組合物的溶液，以提高保存壽命和穩定性。以常規方式混合各成分即可製備本發明的治療用組合物。例如，混和選出的成分可製得濃縮混合物，該濃縮物通過加入水和/或控制pH的緩衝液或控制張力的其他溶液調整至最終濃度和粘度。
為了方便內科醫生使用，該組合物可以一定的劑量包裝，其中含有一定量的本發明的載體，以一倍或幾倍量使用時，能使血管形成達到選定水平。正如本領域的技術人員認識到的那樣，治療劑的有效用量受很多因素影響，這些因素包括病人的年齡和體重、病人的身體狀況和欲達到的血管形成水平以及其他一些因素。
本發明的複合物的有效劑量一般為至少約107個病毒粒子，優選約109個病毒粒子，更優選約1011個病毒粒子，但病毒粒子數目最好不要超過1013個。應注意的是，準確的使用劑量應由住院醫師確定，但病毒粒子最好溶於1ml磷酸鹽緩衝液中。
目前，治療心臟病時優選的給藥方式是冠狀動脈內注射。這種方法是採用合適的冠狀動脈導管，向一支或兩支冠狀動脈(或一支或多支隱靜脈或哺乳動物深部動脈移植物)注射。治療外周血管疾病時，優選的給藥方式是採用合適的動脈導管注入一側或兩則股動脈近端。治療其它器官或組織特異性疾病時，優選的給藥方式也是採用合適的動脈導管。
定向基因表達本發明中一個未曾預料到的發現是在其遇到的第一個血管床中，重組腺病毒的吸收非常好。事實上，在實施例4的動物模型中，冠狀動脈注射後心臟中病毒吸收率為98％，即病毒首次通過心肌血管床後，血液中的病毒減少了98％。而且取自注射期間的動物血清稀釋200倍後，才能形成病毒噬斑(Graham，Virology 163614-617，1988)，這表明其中存在抑制病毒增殖的血清因子(或結合蛋白)。上述兩種因素(病毒首次通過時的有效吸收和可能存在血清結合蛋白)可能共同起作用，使基因表達局限於病毒首次遇到的血管床。
為更準確地評價冠狀動脈內基因轉移局限於心臟的程度，在兩隻治療組動物中進行基因轉移兩周後，採用聚合酶鏈式反應(PCR)來驗證心外是否存在著病毒DNA(見以下的實施例4)。結果表明，動物心臟中存在病毒DNA，而視網膜、骨骼肌和肝臟中均不存在病毒DNA。PCR的敏感性保證每5,000,000個細胞中存在一個DNA序列，即可被檢測，因而這些數據表明，基因轉移兩周後心外組織中不存在病毒DNA。這一發現極其重要，因為它與轉移基因定向的概念有關，轉移基因定向就是使基因表達局限於心臟，而其他任何部位均無表達。這使本發明相當安全，使其在對病人的治療中更為有用。因為它利用了腺病毒的一個未曾預料到的生物學特性，即允許定位的基因轉移，這些都是重要的發現，因為就申請人所知，以前沒有人談到過這些，而且因為它們使本領域的技術人員不太了解的這種方法較為安全。這個未曾預料到的發現可以推廣運用於其它血管床，因而使轉移基因能以相對局限性的方式導入由特定動脈供血的特定器官和組織。
具體實施例方式
為便於理解本發明，提供了以下實施例，它們記述了一系列試驗的結果。當然，與本發明有關的試驗不應被理解為特意限制本發明。現在所知的和以後發展出來的本發明的變化形式，只要其為本領域的技術人員能夠預見得到的，均屬於本發明此處和下文所述要求的保護範圍。
實施例1腺病毒構建物採用不依賴於輔助病毒的複製缺陷型人類腺病毒5系統，目的基因為LacZ和FGF-5。人FGF-5的全長cDNA為來自質粒pLTR122E(Zhen，et al，Mol.Cell.Biol.，83487，1988)的1.1kb ECOR1片斷，其中包括981bp基因開放閱讀框，將該cDNA克隆至質粒ACCMVPLPA的多克隆位點，該質粒含有CMV啟動子和SV40多聚腺苷酸化信號和部分旁側腺病毒序列，該序列中缺失了E1A和E1B基因(病毒複製必需基因)。將該質粒與JM17質粒一起共轉染(脂轉染法)293細胞，質粒JM17含有人類腺病毒5的全部基因組和額外的4.3kb插入片斷，這使得pJM17過大而無法被包裝。同源補救重組形成缺少E1A/E1B序列的含有轉移基因的腺病毒載體。儘管這些重組子在哺乳動物細胞中不能複製，但它們能在293細胞中增殖，293細胞已被E1A/E1B轉化過，能提供反式作用的必需基因產物。轉染細胞處於監視之下，看其是否產生通常在轉染後10～14天出現的細胞病變效應。為鑑別成功的重組子，將顯示細胞病變效應的培養皿中的細胞上清液用蛋白酶K(50mg/ml，含0.5％十二烷基硫酸鈉和20mM EDTA)於56℃下處理60分鐘，酚/氯仿抽提，乙醇沉澱。用PCR鑑別成功的重組子以擴增插入片段(預期的1.1kb片段)，所述PCR使用的引物(Biotechniques，15868-872，1993)與CMV啟動子和SV40多聚腺苷酸化序列互補，PCR引物(Biotechniques，15868-872，1993)設計為可伴隨擴增腺病毒序列。成功的重組子隨後進行兩輪噬斑純化。病毒貯存液於293細胞中增殖至效價為1010～1012個病毒粒子，使用前採用雙CsCl梯度離心進行純化。採用全長cDNA構建編碼β-半乳糖苷酶或FGF-5的重組腺病毒。用來生產重組腺病毒的系統要求插入的轉移基因小於5kb才能被包裝，所用的基因由CMV啟動子啟動並帶有SV40多聚腺苷酸化序列，其長度小於4kb，完全能被包裝。重組載體以標準方法進行噬斑純化，所得病毒粒子於293細胞中增殖至效價為1010～1012個病毒粒子，在80％匯合時轉染細胞，36～48小時後收穫細胞，凍融循環後細胞碎片以標準離心沉澱，病毒採用雙CsCl梯度超離心(不連續1.33/1.45CsCl梯度，銫溶於5mM Tris，1mM EDTA(Ph7.8)；90,000×(2hr)，105,000×g(18hr)進一步純化。體內注射前，病毒貯存液以凝膠過濾脫鹽，脫鹽採用例如G25 Sephadex等的Sepharose柱，所得病毒貯存液最終效價為1010～1012個病毒粒子。腺病毒構建物是高度純化的，不含野生型(可能複製的)病毒。
實施例2細胞培養物中的成年鼠心肌細胞採用含有膠原酶的灌注液，根據標準方法進行Langendorf灌注可製備成年鼠心肌細胞。杆狀細胞於層粘連蛋白被覆的平板上培養24小時，用上述實施例1所得編碼β-半乳糖苷酶的腺病毒感染，感染複數(multiplictity)為1∶1，再經36小時，細胞以戊二醛固定，與X-gal一起溫育。與前述結果非常吻合的是70～90％成年鼠心肌細胞被重組腺病毒感染後，表達β-半乳糖苷酶，感染複數為1-2∶1時未觀察到細胞毒性作用。
實施例3活體內豬心肌根據實施例1的方法，將實施例1中所得的編碼β-半乳糖苷酶的腺病毒載體在相容性293細胞中增殖，以CsCl梯度超離心純化，至最終病毒效價為1.5×1010個病毒粒子。對一麻醉的接上呼吸機(ventilated)的40kg的豬進行開胸手術，一隻26號(gauge)蝶形針插入至冠狀動脈左前降支(LAD)中間，以2ml體積量注入載體(1.5×1010個病毒粒子)，縫合胸部讓動物恢復。在注入載體後第四天處死動物，心臟以戊二醛固定，切片後與X-gal一起溫育16.5小時，包埋和切片後組織以伊紅復染。
組織切片(冠狀動脈內注射含lacZ的腺病毒96小時後的LAD床全層組織切片)的顯微鏡觀察表明，冠狀動脈LAD床有明顯的基因轉移，許多組織切片中50～60％以上的細胞因含有β-半乳糖苷酶而陽性著色，遠離LAD循環床的心肌區未見X-gal著色，可作為陰性對照。在心肌細胞和內皮細胞中可觀察到基因的擴散表達，大多數心肌細胞顯示β-半乳糖苷酶活性(染成藍色)。隨後的研究中採用了閉胸冠狀動脈內注射，基因轉移後14天出現類似活性(n＝8)，基因表達區域未見炎症及壞死。
實施例4豬局部缺血模型實驗動物包括18隻家豬(30～40kg)，按照外科無菌操作規程行左側開胸手術(Hammond，et al，J.Clin.Invest.，922644～2652，and Roth，et al.，J.Clin，Invest.，91939-949，1993)，導管置於左心房和主動脈中，以測量區域血流量和監視壓力；導線縫合於左心房上，以進行ECG記錄和心房起搏。最後，將ameroid放置於LCx近端周圍，當穩定的局部缺血形成後，治療組(n＝11)接受含FGF-5(血管形成基因)的腺病毒構建物，腺病毒構建物由CMV啟動子啟動。對照組動物(n＝7)用含報導基因lacZ的腺病毒構建物進行基因轉移，所述腺病毒構建物由CMV啟動子啟動。
Ameroid放置後35±3天開始觀察，此時並行血管發育和起搏引起的機能異常趨於穩定(Roth，et al.，Am.J.Physiol.，253H1279-1288，1987，and Roth，et al.，Circulation，82；1778-1789)。在動物清醒時，將其懸掛於吊索上，以數字格式線的方式記錄LV壓、LA壓和主動脈壓以及心電圖(靜息狀態和200bpm心房起搏期間)，以Hewlett Packard超聲成像系統獲得二維和M-mode圖像，成像部位為胸骨右側乳頭肌中間處，圖像記錄於VHS磁帶上。動物處於基態和右心房起搏(HR＝200bpm)期間記錄圖像，基因轉移前一天進行上述觀察，14±1天後再次觀察，在基因轉移前後兩組的心率-壓力結果和左心房壓接近，表明它們的心肌氧需求和負荷情況接近。超聲心動測量以標準方式進行(Sahn，et al.，Circulation，581072，1978)，舒張期末壁厚(EDWTh)和收縮期末壁厚(ESWTh)根據心臟五次連續跳動測得並取平均值，壁增厚百分比(％WTh)根據下式計算[(EDWTh-ESWTh)/EDWTh]×100，分析數據時不標明動物接受何種基因。為證實超聲心動測量的重複性，連續兩天對動物(n＝5)進行成像，結果顯示高相關性(r2＝0.09；P＝0.005)。
Ameroid放置後35±3天，ameroid阻塞早已形成但尚未進行基因轉移，使用造影材料(Levovist)進行造影超聲心動觀察。造影材料在心房起搏(200bpm)期間注入左心房，基因轉移後14±1天再次觀察，峰對照密度使用計算機視頻分析程序(Color Vue II，Nova Microsonics，Indianapolis，Indiana)由視頻圖像測得，所用程序能準確測量視頻密度。分析造影觀察結果時不標明動物接受何種基因。
完成上述觀察後，將動物麻醉沿中線行開胸手術，分離出短頭動脈，插入插管，結紮其他大血管。通過靜脈給動物注入肝素(10,000IU)和罌慄鹼(60mg)，加入氯化鉀誘導舒張期心動停止，將主動脈用動脈夾夾住，通過短頭動脈插管導入鹽水(120mmHg壓力)，以對冠狀動脈進行灌流。用戊二醛溶液(6.25％，0.1M二甲胂酸鹽緩衝液)灌流至心臟被固定(10～15分鐘)，然後移出心臟，採用注入的有色染料標示床部位，染料注入後依次經過冠狀動脈左前降支(LAD)、左旋支(LCx)及右支，觀察ameroid以證實存在阻塞，來自正常灌流區和局部缺血區的樣品分成三份，心內膜部分和心外膜部分的三份用塑料包埋，採用前述方法(Mathieu-Costello，et al.，Am.J.Physiol.，359H204，1990)進行顯微鏡觀察，以確定毛細血管數量，4個1μm厚的橫切切片來自每個次分樣品(每一區域的心內膜和心外膜)，在400×檔以點計數確定毛細血管數與纖維數之比，每一分樣計數20～25個高倍視野。結果表明，每一區域內心外膜與心內膜部分毛細血管數與纖維數之比接近，所以取每一區域內的40～50個視野的平均數，得到全層毛細血管數與纖維數之比。
為確證提高的區域功能和血流量是由於轉移基因的表達，PCR和RT-PCR被用來檢測轉入FGF-5基因的動物心肌中的FGF-5 DNA和mRNA，使用兩種引物，一種為CMV啟動子的有義引物[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC](SEQID No1)，一種為FGF-5內部序列的反義引物[GAAAATGGGTAGAGATATGCT](SEQ ID No2)，PCR擴增出了預期的500bp片斷。RT-PCR也使用兩種引物，一種為FGF-5起始序列的有義引物[ATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC](SEQ ID No3)，一種為FGF-5內部序列的反義引物[GAAAATGGGTAGAGATATGCT](SEQ ID No2)，結果擴增了預期的400bp片斷。
最後使用FGF-5的多克隆抗體(kitaoka，et al.，Science，353189，1994)，證實在FGF-5基因轉移48小時以及14±1天後，轉入FGF-5基因的動物心肌和細胞有FGF-5蛋白質表達。
實施例1中構建的不依賴於輔助病毒的複製缺陷型人類腺病毒5系統被用來製備含轉移基因的載體，目的基因為lac-Z和FGF-5，注入體內的材料是高度純化的，不含野生型(可複製)腺病毒，因而最大限度地減少了心臟中的腺病毒感染和炎症浸潤。通過冠狀動物導管將材料直接注入冠狀動脈腔內，可以有效地進行基因定向轉移，採用這種方式導入轉移基因時，肝細胞中無轉移基因表達，冠狀動脈內注射後任何時間在尿中均未發現病毒RNA。
向左右兩支冠狀動脈(向LCx床的並行血流似乎來自兩支冠狀動脈)各注入2.0ml構建物(4.0ml含有約1011個腺病毒粒子)。將動物麻醉，通過右頸動脈切開形成動脈通路；放置5F Cordis套。5F多用途(A2)冠狀動脈導管被用來緊密插入冠狀動脈，通過造影注射冠狀動脈左主幹，證實了LCxameroid阻塞的存在，導管頭置於動脈腔內1cm，以使注射時材料向主動脈近端的丟失儘量減少，每隻豬均用上述方法處理。
進行基因轉移後，三個策略被用來保證基因成功地被摻入和表達(1)一些構建物包括報導基因(lacZ)；(2)以相關床心肌作為樣品進行免疫印跡(immunoblotting)，以對FGF-5進行定量；(3)用PCR來檢測FGF-5mRNA和DNA。
圖2的區域收縮功能數據表明接受了lacZ的豬在基因轉移前及基因轉移後14±1天，缺血區由起搏引起的機能異常的程度接近，相反，轉入了FGF-5基因的豬起搏時(P＝0.0001)缺血區壁增厚增加了2.6倍。這些數據表明，根據本發明的FGF-5基因轉移與起搏時缺血區收縮增強有關，正常灌流區(室間隔)的壁增厚在起博期間正常，基因轉移對其無影響(％壁增厚lacZ組轉基因前56±11％；轉基因後51±9％；FGF-5組轉基因前63±7％，轉基因後58±5％；無差別存在，採用雙向差異分析)，幾次測定所得數據具有高度重複性(外側壁增厚r2＝0.90，P＝0.005)，在同一模型中，心房起搏期間用胸腔超聲心動術測得的功能下降百分比，與以微聲計測得的數值非常接近(Hammond，et al.，J.Clin，Invest.，922644，1993)，這表明以超聲心動術評價缺血機能異常非常準確。圖2中方塊表示平均值，T形圖代表1SE，圖4A-4C為心肌造影超聲心動圖的示意圖，圖4A顯示正常豬中快速LCx閉合，當室間隔(IVS)增強時(白色)，LCx床(黑色)未見血流，這證實圖像準確地標示出了LCx床，反差增強的減少伴隨著血流量減少；圖4B顯示轉入lacZ後14天IVS和LCx床間反差增強存在著差異，說明心房起搏(200bpm)期間兩個區域的血流量不同。圖4C中，轉入FGF-5基因後14天IVS和LCx床間反差增強相同，說明心房起搏期間兩個區域的血流量相近。
圖3總結了所有動物的兩個區域視頻密度的計算機分析結果，圖3中數據表示為缺血區(LCx床)峰視頻密度(與心肌血流量相關)與室間隔(IVS，由冠狀動脈左前降支正常供血區域)峰視頻密度之比，兩個區域的血流量相等，則比值為1.0，基因轉移前該比值平均為0.5，表明LCx床中血流量明顯小於室間隔中血流量。圖3顯示轉入lacZ的動物缺血區血流量仍然不足，轉入FGF-5基因的動物兩個區域的反差增強相同，缺血區心肌血流量增加了兩倍(P＝0.0018，雙向差異分析)，方塊代表平均值，T形圖代表1SE。
圖5的條形圖總結了顯微鏡分析的結果，結果顯示，與轉入LacZ的動物相比，轉入FGF-5基因的動物的缺血區和非缺血區毛細血管數與纖維數之比均有提高，方塊代表每一組中5～6隻動物的平均值，T形圖代表1SE，P值為雙向差異分析法分析基因作用的結果，進行分析時不標明哪一組為治療組。
PCR擴增的電泳結果證實，三隻轉入FGF-5基因14天後的豬中LAD和LCx床中存在著JM17-CMV-FGF-5DNA(預期的500bp片斷)。RT-PCR擴增的電泳結果證實轉入FGF-5基因後14天，LAD和LCx床中存在心臟FGF-5mRNA(預期的400bp片斷)，但轉入LacZ後無此結果，並且基因轉移後兩周，來自所有的五隻已轉入LacZ基因的動物心肌樣品在進行組織學觀察時實際上均顯示出β-半乳糖苷酶的活性。
最後使用FGF-5的多克隆抗體對經培養的成纖維細胞進行細胞介質免疫印跡，結果表明轉入FGF-5基因後兩天，即有蛋白質表達和胞外分泌(n＝4隻培養皿)，而轉入LacZ後無表達和分泌。轉入FGF-5基因後14±1天，心肌樣品中也有蛋白質表達，但轉入lacZ後無蛋白質表達(n＝4)。
在更多的家豬中重複以上試驗，治療組(n＝16)接受上述含FGF-5的腺病毒構建物，該構建物由CMV啟動子啟動；對照組(n＝7)接受上述含報導基因LacZ的腺病毒構建物，該構建物同樣由CMV啟動子啟動，5隻治療組的家豬在基因轉移後飼養12周並進行上述觀察，結果示於圖6-8。
圖6為治療組動物區域收縮功能的圖解，使用Hewlett packard超聲成像系統獲得的二維和M-型圖像中，成像部位為右胸骨乳頭肌處，圖像記錄於VHS磁帶上。在動物清醒時，將其懸掛於舒適的吊索上，以儘量減少身體運動，對懸掛的動物進行觀察，在基態和左心房起搏(HR＝200bpm)期間記錄得圖像。基因轉移前一天進行這些觀察，14±1天後再次觀察(圖6a，左邊方塊)。基因轉移12周後對5隻轉入FGF-5的動物再次進行觀察，以確定功能的改善是否持久(右邊方塊，圖6b)。基因轉移前後，兩組的心率-壓力結果和左心房壓接近，表明心肌氧需求和負荷情況接近，超聲心動測量以標準方式進行，舒張期末壁厚(EDWTh)和收縮期末壁厚(ESWTh)根據心臟五次連續的跳動測得，並取平均值，壁增厚百分比(％WTh)根據下式計算[(EDWTh-ESWTh)/EDWTh]×100。為證實超聲心動測量的重複性，治療組動物(n＝5)連續兩天進行成像。幾次測得數據重複性良好(外壁增厚r2＝0.90；P＝0.005)。我們實驗室對這個模型採用胸腔超聲心動術和微聲計測得的功能下降百分比非常接近(Hammond，et al.，J，Clin，Invest.，922644-2652，1993)，證實用超聲心動術評價局部缺血引起的機能異常的準確性。轉入FGF-5基因兩周後缺血區壁的增厚加快了(左側條塊；P＝0.0001，雙向差異分析)，這種作用可持續12周(右側方塊；P＝0.005)，方塊表示平均值，T形圖表示1SE，進行分析時不標明哪一組為治療組。
圖7為治療組動物區域心肌血流量的圖解，造影材料(半乳糖微聚合體)能提高左心房注射後圖像的回聲效果(白度)，微聚合體在冠狀動脈和心肌壁中的分布方式與血流量成比例(Skyba，et al.，Circulation，901513-1521，1994)，反差增強的峰密度與根據微球體測得的心肌血流量密切相關(Skyba，et al.，Circulation，901513-1521，1994)，ameroid放置後32±7天，ameroid阻塞早已形成，但尚未進行基因轉移，心房起搏期間(200bpm)進行造影材料超聲心動觀察。基因轉移14±1天後再次觀察，5隻動物在轉入FGF-5基因12周後再次觀察。峰對照密度使用計算機視頻分析程序(Color Vue II.Nova Microsonics，Indianapolis，Indiana)，由視頻圖像測得，該程序能客觀地測量視頻密度，數據表示為缺血區(LCx床)峰視頻密度與室間隔(IVS，由未閉合的冠狀動脈左前降支正常供血區域)峰視頻密度之比，分析對照觀察結果時不註明動物接受的為何種基因。在我們實驗室的同一模型中，由造影超聲心動術測得的心房起搏期間區域血流量的差異與微球體測得的血流量的差異相近(Hammond，et al.，J.Clin.Invest.，922644-2652，1993)，這證實超聲心動術能評價區域心肌血流量的準確性。
轉入LacZ的動物缺血區仍然供血不足，轉入FGF-5基因的動物兩個區域的反差增強相同，表明缺血區血流量增加(P＝0.0001，雙向差異分析)，這種效果持續12周(P＝0.001)，方塊代表平均值，T形圖表示1SE，在4隻轉入FGF-5基因的動物中未進行造影材料超聲心動測量，分析時不註明哪一組為治療組。
圖8為治療組動物估計血管數的圖解，觀察完畢後將動物麻醉，沿中線行開胸術，分離出短頭動脈，插入插管，結紮其他大血管，靜脈內給藥肝素(10,000IU)和罌慄鹼(60mg)，加入氯化鉀誘導舒張期心動停止，將主動脈用動脈夾夾住，通過短頭動脈插管導入鹽水，對冠狀動脈進行灌流，用戊二醛溶液(6.25％，0.1M二甲胂酸鹽緩衝液)在120mmHg壓力下進行灌流，直至心臟被固定(10-15分鐘)，然後移出心臟，採用注入的有色染料標示床部位，染料注入後依次通過冠狀動脈左前降支、左旋支和右支，觀察ameroid以證實存在阻塞。來自正常灌流區和缺血區的樣品分成三份，心內膜部分和心外膜部分的三份以塑料包埋，採用前述方法(poole，et al.，Am.J.Physiol.，259H204-H201，1990)進行顯微鏡觀察，以確定毛細血管數量。四個1μm厚的橫切切片來自不同次分樣品(每一區域的心內膜和心外膜)，採用點計數確定每一肌纖維周圍的毛細血管數量，每一次分樣品計數20-25個高倍視野(400×)。左側方塊(圖8a)總結了這些數據，結果表明同轉入的LacZ的動物心臟的相同區域相比，轉入FGF-5基因的動物缺血區和非缺血區毛細血管數均有增加，轉入FGF-5基因易於增加較大內徑的血管，這一效果局限於缺血區(右側方塊，圖8b)，T形圖表示1SE，P值為雙向差異分析FGF-5基因作用的結果，進行上述分析時不標明哪一組為治療組。
序列表(1)一般信息(i)申請人加利福尼亞大學董事會(ii)發明名稱基因轉移介導的血管形成療法(iii)序列數3(iv)通訊地址(A)聯繫人Robbins.Berliner Carson(B)街道N.Figueroa街201號5樓(C)城市洛杉磯(D)州CA(E)國家U.S.A.
(F)郵政編碼90012-2628(v)計算機可讀形式(A)介質類型磁碟(B)計算機IBM兼容(C)作業系統DOS(D)軟體Fast SEQ 1.5版(vi)本申請數據(A)申請號(B)提交日(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號08/485,472
(B)提交日1995年6月7日(C)申請號08/396,207(D)提交日1995年2月28日(viii)代理人/代理機構信息(A)姓名Berliner，Robert(B)登記號20,121(C)參考/案卷號5555-362C2(ix)電信信息電話213-977-1001電傳213-977-1003電報(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特徵(A)長度20鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義否(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列表述SEQ ID NO1GCAGAGCTCG TTTAGTGAAC(3)SEQ ID NO2信息
(i)序列特徵(A)長度21鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義是(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列表述SEQ ID NO2GAAAATGGGT AGAGATATGC T(4)SEQ ID NO3信息(i)序列特徵(A)長度21鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義否(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列表述SEQ ID NO3ATGAGCTTGT CCTTCCTCCT C
權利要求
1.複製缺陷型腺病毒在製備藥物中的用途，所述藥物用於刺激患有外周缺陷性血管疾病的患者的血管發育，所述藥物通過直接向一側或雙側股動脈內注射而將載體導入該患者的外周血管系統，所述載體包括編碼血管形成蛋白或肽的轉基因，並能夠在外周血管系統中表達該轉基因。
2.權利要求1的用途，其中給予約107-1013個腺病毒載體顆粒。
3.權利要求2的用途，其中給予約109-1012個腺病毒載體顆粒。
4.權利要求3的用途，其中給予約1011個腺病毒載體顆粒。
5.在先任一權利要求的用途，其中所述血管形成蛋白或肽是成纖維細胞生長因子。
6.權利要求5的用途，其中所述血管形成蛋白或肽選自aFGF、bFGF和FGF-5。
7.權利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述血管形成蛋白或肽是血管內皮細胞生長因子。
8.在先任一權利要求的用途，其中所述血管形成蛋白或肽包含信號肽。
9.經過濾的可注射型腺病毒載體製品，包含重組腺病毒載體，該載體不含野生型病毒，並包含部分腺病毒序列，其中缺失了E1A/E1B基因；和編碼血管形成蛋白或肽的轉基因，由一種旁側為部分腺病毒序列的啟動子啟動；和藥學上可接受的載體。
10.權利要求9的製品，其中腺病毒載體通過0.3微米濾器進行過濾。
11.根據權利要求9的可注射腺病毒載體製品，其中所述血管形成蛋白為FGF-5。
12.根據權利要求9的可注射腺病毒載體製品，其中所述啟動子選自由CMV啟動子，心室肌細胞特異性啟動子和肌球蛋白重鏈啟動子組成的組中。
13.含重組載體的病毒貯存液的生產方法，該載體能夠在活體內心臟中表達血管形成蛋白或肽，該方法包括以下步驟將編碼血管形成蛋白或肽的轉基因克隆至質粒中，該質粒含有旁側為複製缺陷型人類腺病毒基因組左側末端部分腺病毒序列的啟動子和多克隆位點；用該質粒與另一質粒共轉染被腺病毒複製必需基因轉化過的哺乳動物細胞，後一質粒含有人類腺病毒全部基因組和額外的插入片段，該插入片段使質粒過大，無法被包裝，轉染後細胞內發生補救重組，重組發生在已插入了轉基因的質粒和含有腺病毒全部基因組的質粒之間，所得重組基因組含有轉基因，缺少一個或多個複製必需基因，該重組基因組較小，可被包裝；在細胞培養物中鑑別成功的重組子；在被缺少的複製必需基因轉化過的哺乳動物細胞中增殖所得重組子；純化增殖的重組子，使其中含重組子載體，不含野生型病毒；和使純化重組子通過0.1-0.5微米的濾器。
14.根據權利要求13生產病毒貯存液的方法，其中克隆轉基因的質粒為質粒pAC1或質粒ACCMVPLPA。
15.根據權利要求13生產病毒貯存液的方法，其中鑑別過程包含如下步驟監視轉染細胞是否出現細胞病變效應；將出現細胞病變效應的細胞培養物的上清液用蛋白酶K處理，隨後用酚/氯仿抽提，乙醇沉澱；使用PCR鑑別成功的重組子，所用引物分別與CMV啟動子和腺病毒序列互補；和進行兩輪噬斑純化。
16.根據權利要求13生產病毒貯存液的方法，其中所述純化過程包括如下步驟在被複製必需基因轉化過的細胞中增殖所得重組子至效價為1010-1012個病毒粒子；採用雙CsCl梯度超離心純化增殖的重組子；和將純化重組子通過Sepharose柱。
17.一種重組載體，包括已插入了轉基因的複製缺陷型腺病毒質粒，它不含E1A/E1B序列；編碼FGF-5的轉基因，轉基因通過與其相連的CMV啟動子啟動。
18.權利要求17的載體，其中所述載體包括與轉基因相連的多聚腺苷酸化序列。
19.根據權利要求17的重組載體，其中已插入了轉基因的複製缺陷型腺病毒質粒為人類腺病毒5型，它位於CMV啟動子和SV40多聚腺苷酸化信號旁側，轉基因克隆至其中。
20.根據權利要求17的重組載體，其中含腺病毒全部基因組的質粒含有人類腺病毒5全部基因組和載體pBR322的部分序列，該序列中包括氨苄西林抗性基因。
21.根據權利要求17的重組載體與含人類腺病毒全部基因組的質粒的聯合。
22.一種宿主細胞，含有權利要求21的聯合載體。
23.根據權利要求22的宿主細胞，其中所述的細胞為人293細胞。
24.獲得根據權利要求17的重組腺病毒載體的方法，包括用兩種質粒共轉染被腺病毒早期基因1區(E1)轉化過的細胞，一種質粒為已插入了轉基因的複製缺陷型腺病毒質粒，另一種質粒含腺病毒全部基因組；和在被腺病毒早期基因1區(E1)轉化過的細胞中增殖腺病毒載體，細胞可與共轉染步驟中的細胞相同或不同。
全文摘要
已插入轉移基因的複製缺陷型腺病毒載體可被有效地用於活體內基因療法，以治療外周血管疾病和心臟病，包括心肌缺血。載體通過股動脈或冠狀動脈內注射，直接注入一支或兩支股動脈或冠狀動脈(或移植血管)深部，注射量應足以轉染目的區域的細胞。
文檔編號A61K9/08GK1541714SQ20031011496
公開日2004年11月3日 申請日期1996年2月27日 優先權日1995年2月28日
發明者H·K·哈蒙德, H K 哈蒙德, J 喬達諾, 弗蘭克·J·喬達諾, 岡 H 迪爾曼, 沃爾夫岡·H·迪爾曼 申請人:加利福尼亞大學董事會