一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法

2023-10-18 01:29:44

專利名稱：一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種螯合鈣，具體是一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法。
背景技術：
鈣是人體含量最多的礦質元素之一，也是體內最活躍的元素，具有多種重要的生理功能，是維持神經和肌肉正常興奮所必須的成分，也是保證骨骼生長和維持骨質硬度說必須的物質。然後，缺鈣屬於全球性的健康，最新《中國居民營養與健康狀況調查》結果表明，我國約有97 %的人群缺鈣，大部分人屬於一般性缺鈣，少數人則屬於嚴重缺鈣，全國平均每人每日僅為391mg。缺鈣的現象在兒童、婦女和老人中比較普遍，有資料表明，我國某些地區3歲以下兒童佝僂病的患病率平均為40% ;全國有2億婦女患有骨質增生及骨質疏鬆症，孕婦缺鈣人數為監測對象的100% ;我國80歲以上的老年人口約1900萬，以及1.6億的老年人都屬於骨質疏鬆重度發生人群。缺鈣會給人體造成嚴重的危害，兒童長期缺鈣將導致生長發育緩慢，身體矮小，牙齒不全，易患佝僂病，並有晝驚夜啼、煩躁多動和多汗、抽筋等症狀。青年人缺鈣將導致骨質鈣化不良，骨骼軟化，易彎曲，並可導致四肢、脊柱、胸廓和盆腔畸形，在壓力作用下易發生病理性骨折。中老年人和絕經期的婦女缺鈣易發生骨質疏鬆、骨質增生、背下部疼痛，易發生生理性骨折，並有高血壓、肥胖病、大腸癌等疾病發生的可能。孕婦缺鈣不利於胎兒正常生長、骨骼鈣化、 牙齒形成，孕婦妊娠、分娩、產後哺乳期中由於大量消耗鈣，必須及時補充足夠的鈣。目前，國內市場上口服鈣劑品種繁多，但大體上分為有機鈣和無機鈣兩種類型，有機鈣主要有葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、醋酸鈣、檸檬酸鈣、果糖酸鈣、胺基酸鈣、L蘇糖酸鈣、三羥基丁酸鈣等，其優點是溶度高，胃腸刺激小。無機鈣:如磷酸鈣、碳醋鈣、氯化鈣、氫氧化鈣等，優點是含鈣量較高，但水溶性不如有機鈣，且胃腸反應較大，如噁心、嘔吐、腹脹等。很多鈣源都不同程度地存在著副作用，如氯化鈣對胃腸有較大的毒副作用，只能通過注射方能用於應急狀態下的補鈣；醋酸鈣的急性毒性較大，可引起高鈣血症、痙攣、軟組織及血管鈣化、腎結石等病變；氧化鈣的強鹼性，使其具有明顯的急性毒性；碳酸鈣要消耗大量的胃酸而造成對胃腸道的損傷。近幾年來，國內學者關注螯合鈣的研究，祝德義等(2005)對膠原多肽和Ca2+的結合行為進行了研究。結果表明:膠原多肽和Ca2+之間既有羧基與氨基的配位結合，又有羧基的離子鍵結合，還有一定吸附作用。菅景穎(2007)選用豬皮為原料，採用中性蛋白酶、鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解提取膠原多肽，對影響酶作用的PH值、溫度、酶濃度、底物濃度、時間等因素進行單因素和正交試驗，得出水解的最佳工藝條件。並以葡萄糖酸鈣、碳酸鈣為陽性對照研究膠原多肽螯合鈣在防治骨質疏鬆和壯骨方面的效果。結果表明:膠原多肽螯合鈣無論是在對骨質疏鬆的防治中還是在促進骨骼生長、壯骨作用中，其效果均優於葡萄糖酸鈣和碳酸鈣，是一種優良的功能性補鈣製劑。付文雯(2010年)以水解度和可溶性多肽得率為指標，通過對木瓜蛋白酶、A1398中性蛋白酶、胰蛋白酶、鹼性蛋白酶的水解效果進行比較。並選用木瓜蛋白酶和鹼性蛋白酶來對牛骨進行分步酶解。複合酶解最佳工藝為t =
2: 2，E/S = 2: 2，丁 = 55°〇，酶解順序:先鹼性蛋白酶後木瓜蛋白酶。經葡聚糖凝膠6-25分尚，可將酶解液分成四個組分，分子量大概分布在117-81283Da之間，主要以4000Da左右的小肽為主。對以上四個組分分別進行收集，測其與鈣的螯合率，發現分子量小於4000Da的小肽(主要是II，III，IV組分)螯合率明顯高於81283Da的肽段(I組分)。進一步研究發現，低分子短肽與鈣的螯合物具有更好的溶解性、吸收性。中國專利申請號為201010220253.1，發明名稱為一種膠原多肽螯合鈣的製備方法，申請號200910063282.9，發明名稱為一種由低值淡水魚骨製備符合胺基酸螯合鈣的方法，專利申請號201110412878.2，發明名稱為一種豬骨膠原多肽鈣螯合補鈣劑的製備方法，及專利申請號201110412900.3的一種低分子量羊骨膠原多肽鈣螯合物微膠囊的製備方法的發明專利中，分別公開了採用明膠、魚骨、豬骨及羊骨膠原蛋白製備螯合鈣的方法，專利申請號:CN201110295057.5 一種魚骨小分子多肽螯合鈣及製備方法介紹了魚骨蒸煮、搗碎、複合蛋白酶水解、離心分離、3ku的過濾膜超濾，與魚骨粉與複合酸溶液魚骨鈣液螯合，乾燥，得魚骨小分子多肽螯合鈣粉。在現有公開的蛋白肽螯合鈣製備方法中，都包括蛋白肽的製備方法，但存在以下不足:一是沒有考慮到肽分子量大小對螯合鈣性質的影響，如水溶解性，在蛋白肽螯合鈣的製備中，分子量大的肽形成螯合鈣後，其水溶解性降低，並出現沉澱，這樣會影響螯合鈣在體內的吸收，目前，在已有的蛋白肽製備方法中，蛋白肽，尤其是2肽、3肽等短肽的比例低，大分子量的肽比例比較高，影響了產品的水溶解性和螯合鈣的生物利用率；其二，現有的蛋白肽的製備方法中，沒有或很少考慮到蛋白肽的得率，蛋白短肽的製備率較低，這樣會增加生產的原料成本，同樣的蛋白原料在製備蛋白質短肽螯合鈣的生產率也隨之降低，產品成本高，增加了消費者的 負擔。除此之外，在蛋白肽與鈣的螯合過程中，為了提高螯合效率和提高螯合度，即單位重量螯合鈣產品中螯合鈣的量，除了蛋白肽的性質、螯合工藝中的溫度、時間、PH等參數條件外，需要足夠的可溶性鈣才有利於提高產品中螯合鈣的量。因此，在螯合反應中，為了提高螯合鈣在產品中的比例，通常需要加入過量的可溶性鈣，如氯化鈣、氫氧化鈣等。由於氯化鈣、氫氧化鈣對人體胃腸有比較嚴重的副作用，因此，在螯合反應完成後，需要去除溶液中多餘的氯化鈣、氫氧化鈣。現有採用氯化鈣或氫氧化鈣製備螯合鈣的方法中，均是採用無水乙醇進行沉澱，來除去多餘的氯化鈣或氫氧化鈣，乙醇的濃度需要達到90%以上，才能將螯合反應溶液中的短肽螯合鈣沉澱完全，沉澱的蛋白肽螯合鈣需要反覆用乙醇清洗，清洗乾淨的蛋白肽螯合鈣經乾燥得到蛋白肽螯合鈣產品，沉澱和清洗用的乙醇經減壓蒸餾回收乙醇。這樣，在工業化生產中，需要使用大量的酒精，生產成本高，且存在有機溶劑易燃易爆的風險。

發明內容
本發明提供一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，該方法採用二次水解來得到高品質的蛋白質短肽水解液，然後採用過量的可溶性鈣來進行螯合，生產的螯合鈣產品中鈣的含量高，並且採用有效的方法去除螯合過程中多餘的氯化鈣或氫氧化鈣，產品質量好，生產安全性高，大大簡化了工藝，節約了成本。
本發明的技術方案:所述一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於具體步驟如下:(I)將原料蛋白經過清洗、破碎後與水按重量比1: 5 20混合，並將混合物送入膠體磨微細化處理使原料蛋白充分分散均勻形成蛋白質濃度為2% 10%原料液，並對其進行殺菌後加入蛋白水解酶進行第一次水解，第一次水解的條件為 溫度30 60°C，pH2 10，時間1.0 6小時，蛋白水解酶與原料蛋白的質量比為1% 10% ；(2)將步驟(I)中第一次水解後的水解液經過離心、過濾後分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，並將其分別收集起來；然後將收集的水解液液相部分採用截留分子量為1000 6000Da超濾膜進行超濾，將超濾膜非透過的大分子肽液和透過的小分子低聚肽液分別收集起來；(3)將步驟(2)中第一次水解後收集的未水解的固相部分和超濾後收集的非透過的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，並加水控制二次水解原料液中蛋白質濃度在1% 10%之間，然後加入蛋白水解酶進行第二次水解，第二次水解的條件為:溫度30 60°C, pH2-10，時間I 5小時，蛋白水解酶與二次水解原料液中蛋白質的質量比為1% 10% ；(4)將步驟(3)中二次水解後的水解液經過離心、過濾後採用截留分子量(molecular weight cutoff)為1000 6000Da的超濾膜超濾,將超濾膜透過的小分子低聚肽液收集起來並與步驟(2)中第一次水解液超濾後的透過的小分子低聚肽液一起依次經過純化，得到分子量小的蛋白質短肽水解液；(5)在步驟⑷中得到的蛋白質短肽水解液加入氫氧化鈣(CaCl2)或氯化鈣Ca(OH)2 在溫度為 20-70°C、pH 4.0-9.0 的條件下螯合 20_60min ；(6)測量出步驟(5)中螯合反應完畢後的螯合液中剩餘游離鈣離子的濃度，根據螯合液中剩餘游離鈣離子的濃度加入與螯合液中剩餘的游離鈣離子完全反應量的碳酸鈉，在室溫下充分攪拌5-15分鐘，使碳酸鈉與氯化鈣或氫氧化鈣充分反應形成碳酸鈣沉澱，並將完全反應後的螯合液的PH調為中性，然後過濾去除碳酸鈣沉澱；其中:定量加入碳酸鈉的量也可以適當超過與氯化鈣或氫氧化鈣反應所需的量，超出量控制在以能完全與氯化鈣或氫氧化鈣反應為原則，過濾採用板框式過濾法進行過濾；(7)將步驟(6)中完成反應且pH為中性的螯合液依次採用納濾膜脫鹽、殺菌、濃縮、乾燥後得到蛋白質短肽螯合鈣產品。步驟⑴中所用的原料蛋白包括食品級的動物蛋白、植物蛋白或微生物蛋白。其中食品級植物蛋白包括大 蛋白、玉米蛋白、跳 蛋白等，食品級動物蛋白包括水生動物蛋白和陸生動物蛋白，食品級動物蛋白包括陸生動物蛋白和水生動物蛋白，包括蛋清蛋白、雞肉蛋白、豬肉蛋白、牛肉蛋白、牛奶蛋白、昆蟲蛋白以及魚皮膠原蛋白、魚骨膠原蛋白、魚肉蛋白、牡蠣蛋白、海參蛋白、貝類蛋白等，微生物蛋白包括酵母蛋白、藻類蛋白等。在步驟(I)和步驟⑶中所用的蛋白水解酶，包括鹼性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一種或任意兩種的混合物，任意兩種混合的比例為I 3: 3 I。步驟(I )中，經膠體磨分散均勻的原料液體在70 100°C，10秒-15分鐘時間的條件下採用常壓殺菌法殺菌，或在105-121°C，2秒-30秒的條件下超高溫短時殺菌法進行殺菌，然後採用板式冷卻器冷卻到30 60°C後再加入蛋白水解酶進行第一次水解。步驟⑵和步驟⑷中的離心採用臥螺離心或沉降離心，管式離心機分離出水解的蛋白肽液，再經板框式或濾袋式或濾芯式或陶瓷膜方式的過濾法進行過濾，得到透明度良好的蛋白肽溶液。在步驟(5)中，螯合時使用的可溶性鈣原料為氯化鈣時，氯化鈣與蛋白質短肽的質量比為1: 1-1: 3，反應完畢後的螯合液呈酸性，可以加入鹼性物質比如氫氧化鈉調節螯合液的pH，使其呈中性，產生的鹽可以直接通過步驟(7)中的納濾脫鹽的方法脫掉；螯合中使用的可溶性鈣原料為氫氧化鈣時，氫氧化鈣與蛋白質短肽的質量比為1: 1-1: 2，反應完畢後的螯合液呈鹼性，含有少量的氫氧化鈉，加入濃度為用濃度在l_3mol/L的鹽酸調節螯合液的PH，使其呈中性，反應完畢後的鈉鹽可以通過步驟(7)中的納濾脫鹽將其脫掉。在步驟(5)採用EDTA滴定法測定反應完畢的螯合液中游離鈣的含量，根據螯合液中存在的游離鈣含量，在螯合反應液中定量加入碳酸鈉，使氯化鈣或氫氧化鈣與碳酸鈉反應生成碳酸鈣沉澱，並使用鹽酸(HCl)調節其pH為中性。具體測定方法為:取定量的IOOml反應完成的溶液，乙醇沉澱去除蛋白肽螯合鈣，過濾去蛋白肽螯合鈣，剩餘溶液採用EDTA法測游離鈣含量方法測定鈣的含量。在步驟(7)中，納濾脫鹽中採用納濾膜截留分子量在100_300Da，納濾一遍或多遍，直到氯化鈉(NaCl)的含量達到產品要求為止。在步驟(7)中的殺菌採用在70 100°C，10秒-15分鐘時間的條件下常壓殺菌法，或在105-121°C，2秒-30秒的條件下超高溫短時殺菌法，然後採用板式冷卻器冷卻到40 60°C，之後採用真空濃縮，溫度30 70°C，-0.1Mpa -0.05Mpa，使濃縮液中固形物含量在20-40%，濃縮好的蛋白質短肽螯合鈣液，採用噴霧乾燥或冷凍乾燥或真空乾燥，控制產品中的水分在10%以內。 採用碳酸鈉反應去除螯合反應溶液中氯化鈣的化學反應如下:CaCl2+Na2C03—~- CaCO3 丨 +2NaCl採用碳酸鈉反應去除螯合反應溶液中氫氧化鈣的化學反應如下:Ca (OH) 2+Na2C03—~- CaCO3 丨 +2Na0HNaOH+HCl — NaCl+H20上述反應中生成的NaCl通過納濾法去除。本發明的優點:1.本發明採用兩次水解來製備蛋白質短肽酶水解液，大大提高了蛋白質短肽的得率和原料蛋白的利用率，降低生產成本；2.本發明採用兩次水解來製備蛋白質短肽，提高了 2肽、3肽等短肽的得率，普通工藝生成的蛋白肽中，分子量在580Da以下的短肽的比例一般在30% _40%，而採用本工藝生成的蛋白肽中，分子量在580Da以下的短肽的比例可以達到60%-70%，因此，採用本技術生成的蛋白質短肽螯合鈣產品的水溶解性明顯提高；3.本發明採用適當過量的可溶性鈣來進行螯合，可以使蛋白短肽與可溶性鈣充分螯合，生產的螯合鈣產品中的鈣含量高；4.本發明採用碳酸鈉來去除螯合液中多餘的氯化鈣和氫氧化鈣，可以快速、安全的除掉了螯合液中的氯化鈣和氫氧化鈣成分，同時，研究表明，添加的碳酸鈉不會與已經與蛋白質短肽螯合的鈣發生反應，所得到的蛋白質短肽螯合鈣產品質量好，生產安全性高，由於省略乙醇沉澱和酒精回收工序，大大簡化了工藝，節約了有機溶劑的使用成本，也提高了生產安全性。
具體實施例工藝流程為:原料蛋白一加水混合一殺菌、冷卻一第一次蛋白水解酶水解一第一次水解液分離一第一次分離液超濾一收集第一次水解液分離的固相部分和超濾非透過部分，進行第二次蛋白水解酶水解一第二次水解液分離一第二次分離液超濾一第一次和第二次超濾透過液合併一純化(脫鹽、脫色)一加入可溶性鈣離子螯合一定量加入碳酸鈉反應—調pH中性一去碳酸鈣沉澱一納濾脫鹽一殺菌一濃縮一乾燥實施例一一種蛋白質短肽螯合鈣的製備 方法，其特徵在於具體步驟如下:(1)將淡水白鰱魚皮經清洗，破碎，與水按1: 15混合，並將混合物送入膠體磨微細化處理使原料蛋白充分分散均勻，調整蛋白質濃度在5%，磨細並分散均勻的原料液體在85°C的條件下常壓殺菌60秒，並採用板式冷卻器冷卻到50°C，加入原料液中蛋白質質量的3.0%添加鹼性蛋白酶進行水解，酶水解條件為50°C，初始pH9.0，時間4小時。(2)將步驟(I)中第一次水解後的水解液經過採用臥螺離心和板框過濾方式分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，並將其分別收集起來；然後將收集的水解液液相部分採用截留分子量(molecular weight cutoff)為2000Da的超濾膜進行超濾,將超濾膜非透過的大分子肽液和透過的小分子低聚肽液分別收集起來；(3)將步驟(2)中第一次水解後收集的未水解的固相部分和超濾後收集的非透過的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，測定分離成分中的蛋白質含量，再定量加水控制二次水解原料液中蛋白質濃度在5%，然後加入木瓜蛋白酶進行第二次水解，第二次水解的條件為:溫度45°C，pH6.5，時間4小時，木瓜蛋白酶與二次水解原料液中蛋白質的質量比為1.5% ；(4)將步驟(3)中二次水解後的水解液經臥螺離心、板框過濾後，進一步採用截留分子量為2000Da的超濾膜超濾，將超濾膜透過的小分子低聚肽液收集起來並與步驟(2)中第一次水解液超濾後的透過的小分子低聚肽液一起依次經過樹脂脫鹽、活性炭脫色後，得到分子量小的蛋白質短肽水解液；(5)在步驟(4)中得到的蛋白質短肽水解液加入CaCl2,使其在溫度為50°C、pH
6.0的條件下螯合50min，其中CaCl2與蛋白短肽的質量比為1:2;(6)步驟(5)中螯合反應完畢後，採用EDTA法測游離鈣含量，根據溶液中剩餘游離鈣的含量，計算碳酸鈉的添加量，在溶液中加入計算好的與螯合液中剩餘的游離鈣離子完全反應的碳酸鈉，在常溫下反應lOmin，板框過濾去除碳酸鈣沉澱，反應完畢後的螯合液呈弱酸性，可以加入氫氧化鈉將其調整為中性，之後採用截留分子量為200Da的納濾膜納濾3遍脫鹽，使產品中氯化鈉的含量達到產品要求，脫鹽後的螯合液在121°C的條件下高溫殺菌2秒，並冷卻到50°C，然後在溫度為溫度50°C的-0.1Mpa真空條件下，真空濃縮，使固形物含量達到35%，噴霧乾燥，控制產品中的水分在10%以內，即得到蛋白質短肽螯合鈣產品。實施例二
一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於具體步驟如下:(I)將食品級大豆分離蛋白經過清洗、破碎後與水按重量比1: 15混合，並將混合物送入膠體磨微細化處理使原料蛋白充分分散均勻形成蛋白質濃度為6%原料液，將在121°C的條件下高溫殺菌2秒，採用板式冷卻器冷卻到45°C後加入木瓜蛋白酶進行第一次水解，第一次水解的條件為:溫度為50°C，pH6，時間6小時，蛋白水解酶與原料蛋白的質量比為4% ；(2)將步驟(I)中第一次水解後的水解液採用沉降離心機離心和板框過濾方式分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，並將其分別收集起來；然後將收集的水解液液相部分採用截留分子量為4000Da超濾膜進行超濾，將超濾膜非透過的大分子肽液和透過的小分子低聚肽液分別收集起來；(3)將步驟(2)中第一次水解後收集的未水解的固相部分和超濾後收集的非透過的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，測定混合物中的蛋白質含量，再定量加水控制第二次水解原料液中蛋白質濃度在3-5 %，然後在調配好的第二次水解原料液中同時加入鹼性蛋白酶和胃蛋白酶，第二次水解的條件為:溫度45°C，pH9.5，時間5小時，鹼性蛋白酶和胃蛋白酶的質量比為1: 1，且兩種酶混合量與二次水解原料液中蛋白質的質量比為 2.5% ;(4)將步驟(3)中二次水解後的水解液經過離心、過濾後採用截留分子量為4000Da的超濾膜超濾，將超濾膜透過的小分子低聚肽液收集起來並與步驟(2)中第一次水解液超濾後的透過的小分子低聚肽液一起依次經過樹脂脫鹽、活性炭脫色，得到分子量小的蛋白質短妝水解液；(5)在步驟(4)中得到的蛋白質短肽水解液加入氫氧化鈣在溫度為60°C、pH 6.0的條件下螯合60min，氫氧化鈣與蛋白質短肽的質量比為1: 1.5 ;(6)步驟(5)中螯合反應完畢後採用EDTA法測游離鈣含量，根據溶液中剩餘游離鈣的濃度，加入與螯合液中剩餘的游離鈣離子完全反應的碳酸鈉，在常溫下攪拌15min，使用碳酸鈉與氯化鈣或氫氧化鈣充分反應形成碳酸鈣沉澱，採用板框過濾去除碳酸鈣沉澱，並用濃度在l_3mol/L的鹽酸將反應完畢後螯合液的pH調為中性；(7)將步驟(6)中過濾後且pH為中性的螯合液採用截留分子量為250Da的納濾膜納濾5遍脫鹽，使產品中氯化鈉的含量達到產品要求，脫鹽後的蛋白短肽螯合鈣液在115°C條件下高溫殺菌6秒，並冷卻到50°C，後再-0.1Mpa真空條件下濃縮，使固形物含量達到35 %，冷凍乾燥，控制產品中的水分在10 %以內，即得到蛋白質短肽螯合鈣產品。實施例三(I)將食品級蛋清蛋白粉與水按重量比1: 12混合，並將混合物送入膠體磨微細化處理使原料蛋白充分分散均勻形成蛋白質濃度為8%原料液，並在110°C的條件下高溫殺菌5秒之後冷卻到50°C，再加入中性蛋白酶進行第一次水解，第一次水解的條件為:溫度50 V，pH7，時間6小時，中性蛋白酶與原料蛋白的質量比為4% ;(2)將步驟(I)中第一次水解後的水解液經過臥螺離心機-管式離心機離心兩次連續離心，板框過濾分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，並將其分別收集起來；然後將收集的水解液液相部分採用截留分子量 為5000Da超濾膜進行超濾，將超濾膜非透過的大分子肽液和透過的小分子低聚肽液分別收集起來；
(3)將步驟(2)中第一次水解後收集的未水解的固相部分和超濾後收集的非透過的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，測定混合原料物中的蛋白質含量，再定量加水控制二次水解原料液中蛋白質濃度在7.5%左右，同時計入中性蛋白酶、胃蛋白酶進行第二次水解，第二次水解的條件為 溫度45°C，pH7，時間4小時，中性蛋白酶和胃蛋白酶的質量比為1: 1，兩種酶混合後的量與二次水解原料液中蛋白質的質量比為1% 10% ；(4)將步驟(3)中二次水解後的水解液經過採用沉降離心，板框過濾後採用截留分子量為5000Da的超濾膜超濾，將超濾膜透過的小分子低聚肽液收集起來並與步驟(2)中第一次水解液超濾後的透過的小分子低聚肽液一起依次經過納濾脫鹽、活性炭脫色，得到分子量小的蛋白質短肽水解液；(5)在步驟⑷中得到的蛋白質短肽水解液加入氯化鈣在溫度為40°C、pH 5的條件下螯合30min，其中CaCl2與蛋白質短肽的質量比為1: 2.0;(6)步驟(5)中螯合反應完畢後的螯合液採用EDTA法測游離鈣含量，根據溶液中剩餘游離鈣的濃度，加入與螯合液中剩餘的游離鈣離子完全反應的碳酸鈉，在常溫下反應5min，使碳酸鈉與氯化鈣或氫氧化鈣充分反應形成碳酸鈣沉澱，通過板框過濾法去除碳酸鈣沉澱，並用濃度在l-3mol/L的鹽酸將反應液的pH調為中性，之後採用截留分子量為200Da的納濾膜納濾5遍脫鹽，使產品中氯化鈉的含量達到產品要求，脫鹽後的螯合液在110°C的條件下高溫殺菌15秒殺菌，並冷卻到50°C後在-0.1Mpa真空條件下濃縮，使固形物含量達到30%，噴霧乾燥，控制產品中的水分在10%以內，即得到蛋白質短肽螯合鈣產品。採用以上實施例分子量在580Da以下的短肽的比例可以達到60% _70%，明顯提高了蛋白質短肽螯合鈣產品 的水溶 解性。
權利要求
1.一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於具體步驟如下: (1)將原料蛋白經過清洗、破碎後與水按重量比1: 5 20混合，並將混合物送入膠體磨微細化處理使原料蛋白充分分散均勻形成蛋白質濃度為2% 10%原料液，並對其進行殺菌後加入蛋白水解酶進行第一次水解，第一次水解的條件為:溫度30 60°C,pH2 10，時間1.0 6小時，蛋白水解酶與原料蛋白的質量比為1% 10% ； (2)將步驟(I)中第一次水解後的水解液經過離心、過濾後分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，並將其分別收集起來；然後將收集的水解液液相部分採用截留分子量為1000 6000Da超濾膜進行超濾，將超濾膜非透過的大分子肽液和透過的小分子低聚肽液分別收集起來； (3)將步驟(2)中第一次水解後收集的未水解的固相部分和超濾後收集的非透過的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，並加水控制第二次水解原料液中蛋白質濃度在1% 10%之間，然後加入蛋 白水解酶進行第二次水解，第二次水解的條件為:溫度30 60°C, pH2-10，時間I 5小時，蛋白水解酶與二次水解原料液中蛋白質的質量比為1% 10% ； (4)將步驟(3)中第二次水解後的水解液經過離心、過濾後採用截留分子量為1000 6000Da的超濾膜超濾，將超濾膜透過的小分子低聚肽液收集起來並與步驟(2)中第一次水解液超濾後的透過的小分子低聚肽液一起依次經過純化，得到分子量小的蛋白質短肽水解液； (5)在步驟(4)中得到的蛋白質短肽水解液加入氫氧化鈣或氯化鈣在溫度為20-70°C、pH 4.0-9.0的條件下螯合20-60min ； (6)測量出步驟(5)中螯合反應完畢後的螯合液中剩餘游離鈣離子的濃度，根據螯合液中剩餘游離鈣離子的濃度加入與螯合液中剩餘的游離鈣離子完全反應量的碳酸鈉，在室溫下充分攪拌5-15分鐘，使碳酸鈉與氯化鈣或氫氧化鈣充分反應形成碳酸鈣沉澱，並過濾去除碳酸鈣沉澱沉澱，之後調整反應完畢的螯合液的PH呈中性； (7)將步驟(6)中去除碳酸鈣沉澱沉澱且pH為中性的螯合液依次採用納濾膜脫鹽、殺菌、濃縮、乾燥後得到蛋白質短肽螯合鈣產品。
2.根據權利要求1所述的一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中所用的原料蛋白包括食品級的動物蛋白、植物蛋白或微生物蛋白。
3.根據權利要求1所述的一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於:在步驟(I)和步驟(3)中所用的蛋白水解酶，包括鹼性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一種或任意兩種的混合物，任意兩種混合的比例為I 3: 3 I。
4.根據權利要求1所述的一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中，經膠體磨分散均勻的原料液體在70 100°C，10秒-15分鐘時間的條件下採用常壓殺菌法殺菌，或在105-121°C，2秒-30秒的條件下超高溫短時殺菌法進行殺菌，然後採用板式冷卻器冷卻到30 60°C後再加入蛋白水解酶進行第一次水解。
5.根據權利要求1所述的一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於:步驟(2)和步驟(4)中的離心採用臥螺離心或沉降離心，管式離心機分離出水解的蛋白肽液，再經板框式或濾袋式或濾芯式或陶瓷膜方式的過濾法進行過濾，得到透明度良好的蛋白質短肽溶液。
6.根據權利要求1所述的一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於:在步驟(5)中，螯合時使用的可溶性鈣原料為氯化鈣時，氯化鈣與螯合液中蛋白質短肽的質量比為1:1-1: 3;螯合中使用的可溶性鈣原料為氫氧化鈣時，氫氧化鈣與蛋白質短肽的質量比為1: 1-1: 2,完全反應後,並用濃度在l-3mol/L的鹽酸將反應液的pH調為中性。
7.根據權利要求1所述的一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於:在步驟(5)採用EDTA滴定法測定反應完畢的螯合液中游離鈣的含量，根據螯合液中存在的游離鈣含量，在螯合反應液中定量加入碳酸鈉，使氯化韓或氫氧化韓與碳酸鈉反應生成碳酸韓沉澱，並使用鹽酸調節其PH為中性。
8.根據權利要求1所述的一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於:在步驟(7)中，納濾脫鹽中採用納濾膜截留分子量在100-300Da，納濾一遍或多遍，使產品中氯化鈉的含量達到產品要求為止。
9.根據權利要求1所述的一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法，其特徵在於:在步驟(7)中的殺菌採用在70 100°C，10秒-15分鐘時間的條件下常壓殺菌法，或在105-121°C，2秒-30秒的條件下超高溫短時殺菌法，然後採用板式冷卻器冷卻到40 60°C，之後採用真空濃縮，溫度30 70°C，-0.1Mpa -0.05Mpa，使濃縮液中固形物含量在20_40%，濃縮好的蛋白質短肽螯合鈣液，採用噴霧乾燥或冷凍乾燥或真空乾燥，控制產品中的水分在10 %以內。`
全文摘要
本發明提高一種蛋白質短肽螯合鈣的製備方法。所述方法為將原料蛋白與水混合細化處理並殺菌後，加入蛋白水解酶進行第一次水解，將第一次水解後分離的液體部分採用截留分子量為1000～6000Da超濾膜進行超濾，並將超濾膜非透過的大分子肽液和第一次水解分離的固相部分混合後加入蛋白水解酶進行第二次水解，並將兩次水解超濾後的小分子低聚肽液經純化後加入氫氧化鈣或氯化鈣螯合，完畢後定量的碳酸鈉在pH為中性時完全反應，過濾除去沉澱，再依次經過納濾膜脫鹽、殺菌、濃縮、乾燥後得到蛋白質短肽螯合鈣產品。本發明大大提高了蛋白質短肽的得率和原料蛋白的利用率，降低生產成本，所得到的蛋白質短肽螯合鈣產品質量好，生產安全性高。
文檔編號A23L1/304GK103230020SQ20131012865
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月15日 優先權日2013年4月15日
發明者劉良忠, 劉閃, 王夢穎 申請人:武漢工業學院