紅球菌屬的腈水合酶的製作方法

2023-10-17 17:17:34 2

專利名稱：紅球菌屬的腈水合酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及紅球菌多核苷酸簇，其含有能編碼具有腈水合酶活性的多肽的核苷酸序列、能活化該酶的輔助蛋白P15K的核苷酸序列、和鈷轉運蛋白的核苷酸序列，涉及用該簇轉化的微生物，且其中能編碼這些蛋白的核苷酸序列增強地存在，還涉及轉化的微生物在從腈製備醯胺中的應用。
在文獻中已經描述了大量的腈水合酶(Synthetic applicationsof nitrile-converting enzymes；Martinkova，Ludmila；Mylerova，Veronika；Current Organic Chemistry(2003)，7(13)，1279-1295)。自1983年以來，已經使用腈水合酶，以每年數千噸的規模生產丙烯醯胺。已經證實，該生物催化過程能與化學過程相媲美(Enzymicsynthesis of acrylamidea success story not yet over；Kobayashi，Michihiko；Nagasawa，Toru；Yamada，Trends in Biotechnology(1992)，10(11)，402-8)。
除了可以用於轉化丙烯腈的腈水合酶外，還已經描述了例如特別適用於轉化甲基丙烯腈(A nitrile hydratase of Pseudonocardiathermophila and the genes encoding and manufacture of the enzymefor conversion of nitriles to amides(EP 790310))、3-氰基吡啶(Process for producing amides with Rhodococcus nitrilehydratase(WO 2002055670))或2-羥基腈例如2-羥基-4-甲硫基丁腈(A nitrile hydratase of Rhodococcus and its use in themanufacture of amides(WO 2002070717)和Enzymic conversion ofα-hydroxynitriles to the corresponding α-hydroxyamides，acidsor acid salts，(WO 9832872))的腈水合酶。相反地，迄今尚不知道可以用於有效地轉化2-氨基腈的腈水合酶。儘管紅球菌屬Cr4腈水合酶能例如以高度的活性轉化2-羥基腈，它根本不能轉化簡單的2-氨基腈例如氨基乙腈(WO 2002070717)。
氨基腈向對應的醯胺的酶促轉化，打開了一條有吸引力的合成胺基酸的途徑，因為2-氨基醯胺可以被容易地皂化(WO 2001060789)。該方法能在溫和條件下進行，且具有非常高度的選擇性，不會形成副產物例如鹽，如根據化學水解獲得的。
備選地，也可以用鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物將醯胺轉化成對應的酸鹽。當使用氫氧化鈣轉化4-甲硫基-α-羥基丁醯胺(MHA-醯胺)時，該方法是特別優選的，因為MHA的鈣鹽可以直接作為甲硫氨酸或MHA的替代產物形式被用作飼料添加劑。
但是，為了生產日用品產物例如DL-甲硫氨酸，不能得到具有足夠高活性的生物催化劑。為了增加活性，必須建立針對待擴增的基因的表達系統。其自身存在的一種可能性是異源表達，例如，尤其在大腸桿菌、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、畢赤酵母屬、酵母或麴黴屬中，因為這些微生物能表現出快速生長，達到非常高的細胞密度，且可使用的分子生物學工具，其允許非常高的表達水平(Lee SY(1996)Highcell-density culture of Escherichia coli.TIBTECH 1498-105；Riesenberg D，Guthke R(1999)High-cell-density cultivation ofmicroorganisms.Appl Microbiol Biotechnol 51422-430)。
已知要異源地表達腈水合酶，必須共表達至少3個基因。除了2個結構基因外，還必須為依賴於鐵的和依賴於鈷的酶增強相應的輔助蛋白(Nojiri M.等，(1999)Functional expression of Nitrilehydratases in Escherichia coliRequirement of a nitrilehydratase activator and a post-translational modification ofa ligand cysteine.J Biochem 125696-704 and Over-productionof stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida5B in Escherichia coliactivity requires a novel downstreamprotein，Wu，S.；Fallon，R.D.；Payne，M.S.AppliedMicrobiology and Biotechnology(1997)，48(6)，704-708)。
除了這3個基因外，還在玫瑰色紅球菌屬J1的基因簇中的結構基因和輔助蛋白基因旁，發現了另一個基因，其能編碼鈷轉運蛋白(Anovel transporter involved in cobalt uptake，Komeda，Hidenobu等，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America(1997)，94(1)，36-41)。在紅球菌屬和大腸桿菌中的過表達，會導致從培養基中增加攝入Co2+離子。另外證實，當鈷轉運蛋白與3種其它蛋白一起共表達時，可以在培養基中的Co濃度低於單獨表達結構基因和輔助蛋白時的濃度，達到相同的腈水合酶活性。但是，根據Komeda等，該作用僅僅發生在小於42μM濃度的紅球菌屬中。
EP 0 362 829公開了玫瑰色紅球菌屬在有鈷鹽存在下的發酵。
本發明的目的是，獲取具有高活性的腈水合酶，其特別地能將α-氨基腈轉化成醯胺。
本發明涉及下述內容1.從紅球菌屬、特別是混濁紅球菌(Rhodococcus opacus)分離的多核苷酸簇，其含有4個核苷酸序列，其能編碼4種多肽，後者具有在每種情況下與序列SEQ ID NO2至SEQ ID NO5包含的胺基酸序列至少90％一致的胺基酸序列，所述多肽具有腈水合酶輔助蛋白P15K和鈷轉運蛋白的活性，所述腈水合酶由α-亞基和β-亞基組成。
2.多核苷酸，其選自a)多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO1的位置1-708或與其互補的核苷酸序列組成，b)多核苷酸，其在遺傳密碼的簡併性的範圍內，具有與a)的序列相對應的核苷酸序列，c)多核苷酸，其能在嚴格條件下，與互補序列a)或b)雜交，和d)多核苷酸，其具有含有功能上中性的有義突變的a)，b)或c)的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼腈水合酶的β-亞基。
3.多核苷酸，其選自a)多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO1的位置710-1327或與其互補的核苷酸序列組成，b)多核苷酸，其在遺傳密碼的簡併性的範圍內，具有與a)的序列相對應的核苷酸序列，c)多核苷酸，其能在嚴格條件下，與互補序列a)或b)雜交，和d)多核苷酸，其具有含有功能上中性的有義突變的a)，b)或c)的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼腈水合酶的α-亞基。
4.多核苷酸，其選自a)多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO1中的位置1324-1737或與其互補的核苷酸序列組成，b)多核苷酸，其在遺傳密碼的簡併性的範圍內，具有與a)的序列相對應的核苷酸序列，c)多核苷酸，其能在嚴格條件下，與互補序列a)或b)雜交，和d)多核苷酸，其具有含有功能上中性的有義突變的a)，b)或c)的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼輔助蛋白P15K。
5.多核苷酸，其選自a)多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO1中的位置2076-3146或與其互補的核苷酸序列組成，b)多核苷酸，其在遺傳密碼的簡併性的範圍內，具有與a)的序列相對應的核苷酸序列，c)多核苷酸，其能在嚴格條件下，與互補序列a)或b)雜交，和d)多核苷酸，其具有含有功能上中性的有義突變的a)，b)或c)的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有鈷轉運蛋白活性的蛋白。
6)根據2)或3)的多肽，其含有胺基酸序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO3，其中所述多肽具有腈水合酶活性。
7)根據4)的多肽，其含有胺基酸序列SEQ ID NO6，其中所述多肽具有輔助蛋白P15K活性。
8)根據5)的多肽，其含有胺基酸序列SEQ ID NO5，其中所述多肽具有鈷轉運蛋白活性。
9)探針或引物，其含有核苷酸序列SEQ ID NO1的位置1-1327中的至少20個連續核苷酸或它的互補形式。
10)探針或引物，其含有核苷酸序列SEQ ID NO1的位置1324-1737中的至少20個連續核苷酸或它的互補形式。
11)探針或引物，其含有核苷酸序列SEQ ID NO1的位置2076-3146中的至少20個連續核苷酸或它的互補形式。
12)根據2)和3)的分離的多核苷酸，其在嚴格條件下，與具有SEQ ID NO1中的位置1-1327的互補物雜交，其中所述嚴格條件包含在50-68℃的溫度，在5×SSC中洗滌。
13)根據4)的分離的多核苷酸，其在嚴格條件下，與具有SEQ IDNO1中的位置1324-1737的互補物雜交，其中所述嚴格條件包含在50-68℃的溫度，在5×SSC中洗滌。
14)根據5的分離的多核苷酸，其在嚴格條件下，與具有SEQ IDNO1中的位置2076-3146的互補物雜交，其中所述嚴格條件包含在50-68℃的溫度，在5×SSC中洗滌。
15)載體，其含有一個或多個選自1)-5)和12)-14)，或根據2)，3)和4)或根據5)的多核苷酸。
16)載體pUD15，其由核苷酸序列SEQ ID NO.24組成，含有來自SEQ ID NO1的根據2)，3)，和6)的序列，其中所述起始密碼子gtg已經被修改成atg。
17)載體pUD16，其由核苷酸序列SEQ ID NO25組成，含有5)中的序列，其中所述起始密碼子ttg已經被修改成atg。
18)宿主細胞，其通過導入根據1)-5)和12)-14)的多核苷酸，被轉化或轉染；該宿主細胞可以是已知對於表達系統具有足夠穩定性的真核細胞或原核細胞。
19)宿主細胞，其通過導入根據15)-17)的載體被轉化。
20)根據18)或19)的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞是腸桿菌科尤其是埃希氏桿菌屬的細菌。
使用已知的轉化或轉染技術，可以將載體DNA導入真核或原核細胞。
「轉化」，「轉染」，「接合」和「轉導」指根據現有技術已知的用於導入外來DNA的方法。
本發明也涉及多核苷酸，其基本上由多核苷酸序列組成，後者可以通過下述方法得到藉助含有完整基因或其一部分的相應的混濁紅球菌基因庫，與含有根據本發明的來自SEQ ID No1的多核苷酸序列或其片段的探針雜交，而進行篩選，並分離所述多核苷酸序列。
含有根據本發明的序列的多核苷酸適合用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，用於分離編碼根據本發明的蛋白的核酸或多核苷酸或全長基因，或用於分離其序列與根據本發明的基因序列具有高度相似性的核酸或多核苷酸或基因。它們也可以作為探針，應用於所謂的陣列、微陣列或DNA晶片，用於檢測和確定相應的多核苷酸或由其衍化的序列例如RNA或cDNA。
含有根據本發明的序列的多核苷酸也適合用作引物，其可以與聚合酶鏈反應(PCR)一起，用於從編碼根據本發明的蛋白的基因製備DNA。
這些用作探針或引物的寡核苷酸含有至少25或30、優選至少20、非常特別優選至少15個連續核苷酸。具有至少40或50個核苷酸長度的寡核苷酸同樣適用。當合適時，具有至少100，150，200，250或300個核苷酸的寡核苷酸也適用。
「分離」指從它的自然環境取出。
通常，「多核苷酸」指多核糖核苷酸和多脫氧核糖核苷酸，可能是未修飾的RNA或DNA或經修飾的RNA或DNA。
根據本發明的多核苷酸包括如SEQ ID NO.1所述的多核苷酸，或其中包含的片段，以及與SEQ ID NO.1的多核苷酸或其中包含的片段至少90％，93％，95％，97％或99％一致的那些。
「多肽」應當理解為含有2個或多個通過肽鍵相連的胺基酸的肽或蛋白。
根據本發明的多肽包括序列SEQ ID NO2至SEQ ID NO4和SEQ ID NO6所述的多肽，以及與序列SEQ ID NO2至SEQ ID NO4和SEQ ID NO6所述的多肽至少90％、特別優選至少91％，95％，97％或99％一致的多肽。
SEQ ID NO1多核苷酸含有多個單個的編碼不同蛋白的序列。α-亞基和輔助蛋白P15K的序列彼此重疊。
為了得到活性蛋白，必須一同表達編碼腈水合酶的α-亞基和β-亞基的基因。
SEQ ID NO2描繪了表現出腈水合酶活性的蛋白的β-亞基的胺基酸序列，且SEQ ID NO3描繪了α-亞基的胺基酸序列。
SEQ ID NO2源自核苷酸序列SEQ ID NO1的位置1-708，SEQ IDNO3源自位置710-1327。
輔助蛋白P15K的胺基酸序列見SEQ ID NO6，其與核苷酸序列SEQID NO1中的位置1324-1737相對應。
輔助蛋白活化腈水合酶，且在能形成腈水合酶的微生物中，其必須與該酶一起存在。
SEQ ID NO4代表了鈷轉運蛋白的胺基酸序列，其源自核苷酸序列SEQ ID NO1的位置2076-3146。
PatentIN Version 3.1將SEQ ID NO4中的起始密碼子ttg翻譯成亮氨酸，將SEQ ID NO6中的起始密碼子gtg翻譯成纈氨酸。正確的胺基酸是甲硫氨酸。
已經發現，通過共表達鈷轉運蛋白，能使大腸桿菌中的腈水合酶活性增加數倍。當在培養基中使用高濃度的鈷時，也是如此，這些濃度是超過自然發生的濃度的大小量級。意外地，共表達鈷轉運蛋白不會導致生物的任何中毒，但是會導致輕微增加的細胞對培養基中的高鈷濃度的敏感性。
為了分離根據本發明的基因簇，通常首先在大腸桿菌(E.coli)中製備該微生物的基因庫。基因庫的製備，記載在眾所周知的教科書和手冊中。可以提及的實例是Winnacker的教科書Gene und Klone，Eine Einf ührung in die Gentechnologie[Genes和clones，anintroduction to recombinant DNA technology](Verlag Chemie，Weinheim，Germany，1990)或Sambrook等的手冊Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。非常熟悉的已知基因庫是大腸桿菌K-12菌株W3110的基因庫，其由Kohara等(Cell 50，495-508(1987))在λ-載體中製備。Bathe等(Molecular and General Genetics，252255-265，1996)描述了C.glutamicum ATCC13032的基因庫，使用粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987，Proceedings of the National Academy of Sciences USA，842160-2164)，在大腸桿菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，Nucleic Acids Research 161563-1575)中製備它。
還可以使用質粒如pBR322(Bolivar，Life Sciences，25，807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，Gene，19259-268)，在大腸桿菌中製備基因庫。合適的宿主特別是限制缺陷的和重組缺陷的大腸桿菌菌株。這些菌株的實例是菌株DH5αmcr，其已經記載在Grant等(Proceedings of the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)。其然後藉助粘粒克隆的長DNA-片段再亞克隆進常用的適於測序的載體中，隨後如例如Sanger等(Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America，745463-5467，1977)所述進行測序。
然後，使用已知的算法或序列分析程序，例如Staden(NucleicAcids Research 14，217-232(1986))的，von Marck(Nucleic AcidsResearch 16，1829-1836(1988))的，或Butler(Methods ofBiochemical Analysis 39，74-97(1998))的GCG-程序，可以研究得到的DNA-序列。
作為遺傳密碼的簡併性的結果，從SEQ ID No.1包含的序列產生的編碼DNA-序列，同樣會形成本發明的主題的一部分。以相同的方式，能與這些序列或其一部分雜交的DNA-序列，會形成本發明的主題的一部分。而且，蛋白中的保守胺基酸替換，例如用丙氨酸替代甘氨酸，或用穀氨酸替代天門冬氨酸，在本領域已知是有義突變，其不會導致蛋白活性的任何根本變化，即是功能中性的。還已知，蛋白的N-末端和/或C-末端的變化，不會顯著損害蛋白的功能，或者甚至會穩定它。尤其在Ben-Bassat等(Journal of Bacteriology 169751-757(1987))，O』Regan等(Gene 77237-251(1989))，Sahin-Toth等(Protein Sciences 3240-247(1994))，和Hochuli等(Bio/Technology 61321-1325(1988))和已知的遺傳學和分子生物學教科書中，熟練人員可以獲得這方面的信息。
最後，使用來自SEQ ID NO1的引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)製備的DNA-序列，也會形成本發明的主題的一部分。這些寡核苷酸典型地具有至少15個核苷酸的長度。
尤其在Boehringer Mannheim GmbH公司(Mannheim，Germany，1993)出版的手冊「The DIG System Users Guide for FilterHybridization」和Liebl等(International Journal of SystematicBacteriology(1991)41255-260)中，熟練人員可以獲得關於通過雜交鑑別DNA-序列的說明。雜交在嚴格條件下進行，即只形成這樣的雜合體，其中探針和靶序列(即用該探針處理的多核苷酸)是至少90％一致的。已知通過改變緩衝液組成、溫度和鹽濃度影響或決定雜交包括洗滌步驟的嚴格性。優選地，以與洗滌步驟相比相對較低的嚴格性進行雜交反應(Hybaid Hybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如，可以使用5×SSC緩衝液，在約50℃-68℃的溫度，進行雜交反應。在這些條件下，探針也可以與表現出與探針序列小於70％一致性的多核苷酸雜交。這些雜合體不太穩定，可以通過在嚴格條件下洗滌來去除。這可以如下實現例如，通過將鹽濃度降低至2×SSC，當合適時，隨後降至0.5×SSC(The DIG System User’s Guide forFilter Hybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)，將溫度設定在約50℃-68℃。當合適時，可以將鹽濃度降低至0.1×SSC。通過逐步以約1-2℃分步使雜交溫度從50℃增加至68℃，可以分離與採用的探針序列具有例如至少90％-95％一致性的多核苷酸片段。在市場上可以以試劑盒的形式得到進一步雜交說明(例如RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany供應的DIG Easy Hyb，目錄號1603558)。
尤其在Gait的手冊Oligonukleotide synthesisA PracticalApproach(IRL Press，Oxford，UK，1984)和Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)中，熟練人員以獲取使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增DNA-序列的說明。
通常，該方法是，將能高水平表達的基因克隆進具有低拷貝數的載體中，將表達較弱的基因克隆進具有更高拷貝數和/或強啟動子的載體中。可以用這些載體轉化宿主細胞，以便使它們在每種情況下，與起始生物相比，都含有編碼形成腈水合酶或其它蛋白的核苷酸序列的至少一個額外的拷貝。
已經表明，可以有利地以更低的水平表達鈷轉運蛋白-編碼基因，例如使用低拷貝數的載體，即至少比能編碼α-和β-亞基和P15K輔助蛋白的多核苷酸序列少一個拷貝。使用不同強度的啟動子，也可以實現所述基因的有差別的表達。
編碼α-和β-亞基和輔助蛋白的核苷酸，優選地共同位於一個載體上，且具有一個共用啟動子，或具有兩個分開的啟動子。
以該方式製備的轉化的或重組的微生物，同樣形成本發明的主題的一部分。
已經發現，在微生物中編碼腈水合酶、P15K輔助蛋白和鈷轉運蛋白的基因的增強，會導致腈水合酶的增多的生產，或導致腈水合酶的增加的活性。
在這方面，術語「增強」描述了在微生物中由相應DNA編碼的一種或多種酶的細胞內活性的增加，這可以如下實現例如，增加該一個或多個基因的拷貝數，使用強啟動子，或使用編碼具有高活性的對應酶的基因，和視需要組合這些方法。
為了實現過表達，可以突變位於結構基因上遊的啟動子區和調節區或核糖體結合位點。整合在結構基因上遊的表達盒以相同的方式起作用。另外，使用誘導型啟動子，可以增加胺基酸發酵生產過程中的表達。通過用於延長m-RNA的壽命的方式同樣提高表達。
另外，通過預防酶蛋白的降解同樣增強酶活性。基因或基因構建體可以存在於具有不同拷貝數的質粒中或可以整合在染色體中並擴增。備選地，通過改變培養基的組成和培養操作可以實現相關基因的過表達。
通常，採用增強，尤其是過表達，使相應蛋白的活性或濃度，比野生型蛋白或未用根據本發明的核苷酸序列轉化的微生物中的蛋白的活性或濃度，增加至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，和最大高達1000％或2000％。
本發明也涉及載體的提供，該載體通常能在選擇的宿主菌株中自主複製，其彼此相容，且其至少含有權利要求2，3和4保護的核苷酸序列或權利要求4保護的核苷酸序列。
使用已知的轉化技術，可以將載體DNA導入真核或原核細胞。
採用的宿主生物優選地是微生物，例如假單胞菌、畢赤酵母、各種酵母、Saccaromyces、麴黴屬或鏈黴菌科，尤其大腸桿菌，因為它們存在表達系統。紅球菌屬的微生物也是合適的。
本發明也涉及從紅球菌屬、尤其混濁紅球菌或包含該酶的微生物製備腈水合酶的方法，其中a)在導致腈水合酶的形成的條件下，在0.15-4mM(mmol/l)尤其是0.3-4mM Co2+的存在下，發酵轉化的微生物，其包含根據權利要求1-4的核苷酸序列的過表達的基因，b)使該酶在微生物中富集，和c)從細胞分離該酶，或d)收穫微生物，並獲取包含該酶的靜止細胞。
重組生產的腈水合酶以＞50U/mg幹生物量的活性轉化α-氨基腈。
優選地，在0.5-3.5mM尤其是0.7-3mM Co2+的存在下，其優選地作為可溶鹽加入發酵液中，進行發酵。
可以在分批過程(Satzkultivierung)或補料分批過程(Zulaufverfahren)或重複補料分批過程(repetitivesZulaufverfahren)中，連續地或不連續地培養根據本發明使用的微生物。已知的培養方法的總結，記載在Chmiel的教科書(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to bioprocesstechnology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheral equipment](Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中。
使用的培養基必須合適地滿足每種情況下菌株的要求。培養不同微生物的培養基的描述，見美國細菌學學會(Washington D.C.，USA，1981)出版的手冊「Manual of Methods for General Bacteriology」。
可以使用的碳源是糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉和纖維素，油和脂肪例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇例如甘油和乙醇，和有機酸例如乙酸。這些物質可以單獨地或作為混合物使用。
可以使用的氮源是含氮化合物如蛋白腖、酵母提取物、肉膏、麥芽浸膏、玉米漿、豆粉和尿素或無機化合物如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。可以單獨地或作為混合物使用這些氮源。
可以使用的磷源是磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應的含鈉鹽。另外，培養基必須含有生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸亞鐵。最後，除了上述物質外，可以採用基本的生長物質如胺基酸和維生素。上述原料可以以僅僅一次的混合物形式加入培養基，或以合適的方式，在培養過程中補料。
以合適的方式，使用鹼性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物，例如磷酸或硫酸，控制培養物的pH。可以使用消泡劑，例如脂肪酸聚乙二醇酯，控制泡沫形成。可以向培養基中加入合適的選擇性地起作用的物質，例如抗生素，以維持質粒的穩定性。使氧和含氧氣體混合物，例如空氣，注入培養物，以維持氧條件。培養溫度通常是10℃-40℃，優選10℃-30℃。優選地，連續培養，直到已經經過對數生長期。該目的通常在10小時-70小時內實現。
本發明也涉及從腈酶促製備醯胺的方法，其包含下述步驟a)使用具有腈水合酶活性的源自紅球菌屬尤其是混濁紅球菌的酶，轉化含腈基化合物，和b)視需要，分離醯胺。
在一種方法變體中，收穫細胞，洗滌，並轉入pH 5-9、尤其是6.8-7.9的緩衝液中，製成懸浮液。靜止細胞的濃度通常是1-25％、尤其是1.5-15％(溼重/體積)。可以使用物理或化學方法，例如Wilms等，J.Biotechnol.，Vol 86(2001)，19-30所述的甲苯，使細胞滲透化，以便使要轉化的腈化合物可以穿透細胞壁，且形成的醯胺可以離開。
生物催化劑(全細胞催化劑)是非常穩定的，所以可以達到超過100g/l的產物濃度。
也可以使用已知的方法，從細胞分離根據本發明的腈水合酶，視需要純化，並用於轉化腈。
本發明也涉及一種方法，其特徵在於，將下述通式的化合物轉化成對應的醯胺 R″-CN(II)其中X是OH，H，具有1-4個C原子的烷基，芳基，特別是NH2；R是H，任選地被NH2取代的、分支的或不分支的、具有1-12個C原子的飽和的烷基，分支的或不分支的、具有1-12個C原子的鏈烯基，具有3-6個C原子的環烷基，烷硫基-取代的亞烷基，其中烷基對應於C1-C3基團，且亞烷基對應於二價的C3-C8基團，R′是H，或具有1-3個C原子的烷基，R″是單核或雙核的芳香環，其具有6-12個C原子，視需要經1個或2個烷基(C1-C3)或Cl或F取代；具有1-6個C原子的烷基腈。
優選地，轉化下述腈飽和的單腈乙腈、丙腈、丁腈、異丁腈、戊腈、異戊腈和己腈，飽和的二腈
丙二腈、丁二珀腈、戊二腈和己二腈，芳族未取代的和取代的單腈和二腈苯基腈、2，6-二氟苯基腈、鄰苯二腈、間苯二腈和對苯二腈，α-氨基腈α-氨基丙腈，α-氨基甲硫基丁腈，α-氨基丁腈，氨基乙腈，源自天然胺基酸的所有腈，α-氨基-3，3-二甲基丙腈和α-氨基-2，3-二甲基丙腈含有羧基的腈氰基乙酸β-氨基腈3-氨基丙腈不飽和的腈丙烯腈，甲基丙烯腈，烯丙基腈和丁烯腈α-羥基腈α-羥基-正丙腈，α-羥基-正丁腈，α-羥基異丁腈，α-羥基-正己腈，α-羥基-正庚腈，α-羥基-正辛腈，α，γ-二羥基-β，β-二甲基丁腈，丙烯醛氰腈，異丁烯醛氰腈，3-氯乙腈，4-甲硫基-α-羥基丁腈和α-羥基-α-苯基丙醯。
待轉化的腈在反應溶液中的濃度，不限於特定範圍。
為了避免酶活性受到底物的抑制，通常將腈的濃度保持在0.001-10w/w％、尤其是0.1-2w/w％，基於作為幹細胞量(Zellmasse)的生物催化劑的量。可以在反應開始時，加入所有底物，或在反應過程中，連續地或不連續地加入底物。
如果腈化合物在水性反應系統中的溶解度太低，可以加入增溶劑。
但是，作為替代方案，可以在水/有機溶劑兩相系統中進行反應。
當將微生物細胞用作酶活性材料時，採用的細胞的量與底物量的比例優選地是0.001-8w/w％，作為幹細胞量。
使用MA45溼度分析儀(Sartorius)，確定細胞量的乾重。
也可以使用眾所周知的技術，固定化分離的酶，然後採用該形式的酶。
通常，在-5℃至50℃、尤其是0℃至30℃的溫度，反應0.1-100小時。
只要酶活性不受損害，待維持的反應混合物的pH不限於特定值。反應後，可以以已知的方式，從反應溶液中分離已經形成的醯胺，並純化。
本發明也涉及一種方法，其中，從例如生物量的細胞分離醯胺，或含有醯胺的溶液，將醯胺皂化產生對應的酸，或在有加入的鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物存在下，轉化成對應的酸鹽。優選地，用氫氧化鈣皂化MHA-醯胺，並分離對應的鈣鹽。
實施例實施例1克隆混濁紅球菌腈水合酶用限制酶PinAI，PstI和XmaI(Roche)消化混濁紅球菌染色體DNA，並在0.8％瓊脂糖凝膠上分離片段。使用標準方法(例如見Sambrook等Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Habor Laboratory Press，1989)，在帶正電荷的尼龍膜(Hybond-N+，Amersham)上進行DNA印跡。根據生產商的(Roche)說明書，用DIG-標記的探針，進行雜交。使用退化引物1F和1R，使用基因組DNA作為模板，通過PCR製備探針。引物源自β-亞基的同源區，通過比對各種Nhasen的序列確定這些區域。從資料庫得到它們的序列。為了分離檢測到的約2.2kb大小的PinAI-片段，通過製備凝膠電泳純化了2至2.5kb的PinAI切割的DNA-片段，並與XmaI切割的載體pUC18(Promega)連接，將連接混合物轉化進大腸桿菌JM109(Promega)。通過菌落雜交，使用相同的探針鑑別陽性轉化體。以該方式得到的克隆含有2206核苷酸插入物，其包含腈水合酶的β-亞基的基因，和α-亞基的基因的大部分。
對於缺少的序列，使用上述的方法，其採用引物2F和2R，製備新探針，其能在克隆的PinAI-片段的3′-末端雜交。克隆進pUC18中的PinAI-片段用作模板。在與該探針雜交之前，首先根據生產商的(Roche)說明書，從上述膜去除顏色信號和第一個探針。使用第二個探針在該膜上檢測約2kb大小的PstI-帶。如上所述，將對應的DNA-片段克隆進已經用PstI切口的載體pUC18，並將產物轉化進大腸桿菌JM109；然後，通過菌落雜交鑑別陽性克隆。PstI-片段是1883核苷酸大小，且含有腈水合酶的α-亞基的基因的(3′-)部分，輔助蛋白P15K的基因和鈷轉運蛋白的基因的(5′-)部分。
為了克隆鈷轉運蛋白基因缺失的序列的DNA-片段，使用引物3F和3R，和用作模板的克隆進pUC18中的PstI-片段，製備新探針，其能在克隆的PstI-片段的3′-末端雜交。該探針用於檢測相同膜上的約1.7kb大小的XmaI-帶，之前再次從該膜上去除顏色信號和第二個探針。將對應的DNA-片段克隆進已經用XmaI切口的pUC18載體，並將產物轉化進大腸桿菌JM109；通過菌落雜交鑑別陽性克隆。為此使用經引物4F和3R擴增的探針。所述XmaI-片段是1747核苷酸大小，且含有鈷轉運蛋白的基因的(3′-)部分。
SEQ ID NO1描述了基因簇的連續序列，其含有編碼腈水合酶的α-β-亞基、輔助蛋白P15K和鈷轉運蛋白的多核苷酸。
實施例2表達載體的構建將結構基因克隆進用於大腸桿菌的已知表達載體中，且其中插入的基因是在鼠李糖啟動子的控制下。另外，插入了第二個鼠李糖啟動子。為此，使用引物5F和5R擴增β-亞基的基因，其插入限制酶NdeI，BamHI和HindIII的剪切位點。使用引物6F和6R擴增第二個鼠李糖啟動子，其插入限制酶BamHI，NcoI和HindIII的剪切位點。使用引物7F和7R擴增α-亞基的基因，其插入限制酶NcoI，KpnI和HindIII的剪切位點。使用引物8F和8R擴增P15K蛋白的基因，其插入限制酶KpnI和HindIII的剪切位點，並將起始密碼子從GTG改變成ATG。將以該方式構建的表達載體命名為pUD15。


圖1給出了限制圖譜，SEQ ID NO24給出了該序列。
將鈷轉運蛋白的基因克隆進另一個大腸桿菌表達載體，其中所插入的基因也在鼠李糖啟動子的控制下。為此，使用引物9F和9R擴增鈷轉運蛋白基因，其插入限制酶NdeI和HindIII的剪切位點，並將起始密碼子從TTG改變成ATG。將以該方式構建的表達載體命名為pUD 16。
圖2給出了限制圖譜，SEQ ID NO25給出了該序列。
將表達質粒轉化進大腸桿菌菌株DSM 14459，其保藏在DeutschenSammlung von Mikroorganismen和Zellkulturen[German collectionof microorganisms and cell cultures]GmbH(DSMZ)。
引物
位於片段上的基因pUD15β-亞基的基因核苷酸25-732α-亞基的基因核苷酸949-1566P15K基因 核苷酸1592-2005pUD16鈷轉運蛋白的基因 核苷酸25-1095實施例3腈水合酶在大腸桿菌DSM 14559中的異源表達DSM 14559與DE 101 55 928相關。
在37℃搖動下，在含有1mM CoCl2和100μg/ml氨苄西林的LB-培養基(根據Miller的LB肉湯，VWR)中培養pUD15轉化的細胞。以類似的方式培養用pUD15和pUD16轉化的細胞，但是培養基另外含有50μg/ml氯黴素。此後，當它們達到至少OD600為2後，將細胞過量接種進同一的培養基中3次。12-16小時後，將一定量的最後的預培養物接種進主培養物中，使後者具有0.1的OD600。主培養物的培養基與預培養物的培養基相對應，但是它另外含有2g/l L-鼠李糖。22小時後，收穫細胞。
實施例4測定酶活性如實施例3所述培養細胞，通過離心從培養基中分離，並重新懸浮於標準緩衝液(50mM磷酸鉀緩衝液，pH 7.5)。將50μl細胞懸浮液加700μl標準緩衝液，並加入250μl 200mM腈在標準緩衝液中的溶液以啟動反應。在這方面，測量細胞懸浮液中的細胞濃度，以便在20℃、10min後，腈反應了5-30％。在20℃、10min後，通過加入20μl半濃縮的磷酸終止反應，並通過離心分離細胞。
將一單位(U)的活性定義為，能在1分鐘內將1μmol N-甲醯基纈氨酸腈轉化成醯胺的酶的量。比活定義為U/mg幹生物量(U/mg BTM)。
這可以使用MA45型溼度分析儀(Sartorius)測量。
實施例5共表達編碼腈水合酶α-亞基，β-亞基和p15K蛋白的基因。
使用轉化的大腸桿菌菌株DSM 14459，其攜帶質粒pUD15，如實施例3所述進行表達。細胞的比活是23U/mg BTM。
實施例6共表達編碼腈水合酶α-亞基，β-亞基，p15K蛋白和鈷轉運蛋白的基因。
使用轉化的大腸桿菌菌株DSM 14459，其攜帶質粒pUD15和pUD16，如實施例3所述進行表達。細胞的比活是81U/mg BTM。
實施例7底物特異性使用靜止的轉化的大腸桿菌DSM 14459細胞，其攜帶質粒pUD15，類似於實施例3轉化各種腈。將用N-甲醯基纈氨酸腈得到的比活設定為100％。相對於它，給出其它活性。結果如圖3所示。
實施例8在Co2+-鹽存在下，轉化的大腸桿菌DSM 14459的生長如實施例3所述，培養僅攜帶質粒pUD15或攜帶pUD15和pUD16的轉化的大腸桿菌DSM 14459細胞。同時，培養基中的鈷濃度從0.5至2mM變化。24小時後，在600nm測量培養物的光密度。
發現，即使在高鈷濃度，也僅僅能觀察到對細胞生長的輕微影響。
實施例9使用攜帶質粒pUD15的靜止的轉化的大腸桿菌DSM 14459細胞轉化甲硫氨酸腈如實施例3所述，培養攜帶質粒pUD15的大腸桿菌DSM 14459細胞，並離心沉澱。將2.8g(溼重)細胞重新懸浮於47.2ml 50mM磷酸鉀緩衝液，pH 7.5，在20℃，同時劇烈攪拌，以在反應過程中的任何時間的濃度都不超過15g/l的速度，連續加入甲硫氨酸腈。將pH維持恆定在7.5。如實施例4所述，通過HPLC，監視反應。320min後，9.1g腈已經完全轉化成10.4g醯胺。這對應著176g/l的濃度。
附圖簡述圖1質粒pUD15rhaP 鼠李糖啟動子beta 腈水合酶β-亞基的基因alpha 腈水合酶α-亞基的基因P15K 輔助蛋白P15K的基因ori複製起點bla對氨苄西林(β-內醯胺酶)抗性的基因圖2質粒pUD16rhaP 鼠李糖啟動子CoTrans鈷轉運蛋白的基因Ori複製起點Cmr對氯黴素抗性的基因圖3與轉化N-甲醯基纈氨酸腈時的活性相比，轉化各種腈時的相對比活根據布達佩斯特條約的用於專利程序目的的國際公認的微生物保藏國際表格Degussa AGProjekthaus BiotechnologieRodenbacher Chaussee63457 Hanau依據條例7.1由下述國際保藏單位出具的第一次保藏的接收證明
根據布達佩斯特條約的用於專利程序目的的國際公認的微生物保藏國際表格Degussa AGProjekthaus BiotechnologieRodenbacher Chaussee63457 Hanau依據條例10.2由下述國際保藏單位出具的存活證明
序列表110Degussa AG120混濁紅球菌的腈水合酶130040069 BT16025170PatentIn version 3.121012113146212DNA213混濁紅球菌220
221CDS222(1)..(708)223
220
221CDS222(710)..(1327)223
220
221CDS222(2076)..(3146)223
4001atg aac ggc atc ttc gat cta ggc gga acc gac ggc atg ggg ccg gtc 48Met Asn Gly Ile Phe Asp Leu Gly Gly Thr Asp Gly Met Gly Pro Val1 5 10 15gac aac gac aaa ggc acc gag ccg gtg ttc cgc tca gcg tgg gaa aag 96Asp Asn Asp Lys Gly Thr Glu Pro Val Phe Arg Ser Ala Trp Glu Lys20 25 30gcc gcc ttc tcg atg ttc gca caa ggc gcc cga gct ggc ctc tac aac144Ala Ala Phe Ser Met Phe Ala Gln Gly Ala Arg Ala Gly Leu Tyr Asn35 40 45
atc gac gag ttc cgg cac tgc gtc gag cag atg gac ccc gcc gag tat192Ile Asp Glu Phe Arg His Cys Val Glu Gln Met Asp Pro Ala Glu Tyr50 55 60tta cta tcg aac tac tac gag cac tgg acg cat gcc gtc gaa cac ttc240Leu Leu Ser Asn Tyr Tyr Glu His Trp Thr His Ala Val Glu His Phe65 70 75 80gcc cag caa aag aac ctc atc aca gcg gca gag ctc gaa aag cgc acg288Ala Gln Gln Lys Asn Leu Ile Thr Ala Ala Glu Leu Glu Lys Arg Thr85 90 95cat ttc tac cgg gat aac cca gaa gcc ccc ctt ccg gag cgc aag gac336His Phe Tyr Arg Asp Asn Pro Glu Ala Pro Leu Pro Glu Arg Lys Asp100 105 110cca gag ctc ctc gac ttc gtg aac acc gcg atc gcg aac ggt ttc gcg384Pro Glu Leu Leu Asp Phe Val Asn Thr Ala Ile Ala Asn Gly Phe Ala115 120 125gcc tcc cgt gaa acc aat agg tcg gca gca ttc acc atc ggc gac cag432Ala Ser Arg Glu Thr Asn Arg Ser Ala Ala Phe Thr Ile Gly Asp Gln130 135 140gta ctg att gct gcg gac agt cca ttc gga cac acc cga cgg gcc ggc480Val Leu Ile Ala Ala Asp Ser Pro Phe Gly His Thr Arg Arg Ala Gly145 150 155 160tac atc cgc ggt aag acc gga gtc atc acc gcg aca cac ggc gcc tac528Tyr Ile Arg Gly Lys Thr Gly Val Ile Thr Ala Thr His Gly Ala Tyr165 170 175gtc tat ccc gac acc gcc ggt aac ggg ctc ggt gag tgc cca gag cac576Val Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His180 185 190gtc tac acc gtg aag ttc acc gcc acc gaa ctt tgg ggc gaa cag agc624Val Tyr Thr Val Lys Phe Thr Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Gln Ser195 200 205ggt gat cgc cac agc acc gtc tat ttc gat gtc tgg gaa ccg tac ctc672Gly Asp Arg His Ser Thr Val Tyr Phe Asp Val Trp Glu Pro Tyr Leu210 215 220
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1 5 10 15Arg Ala Glu Arg Gln Arg Leu Ser Ala Ile Ile Gly Thr Ile Ala Leu20 25 30Leu His Val Leu Gly Ile Ala Met Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Asn Pro35 40 45Ala Ala Ala Gly Ser Leu Ala Gly Ser Gl y Leu Leu Ala Tyr Val Leu50 55 60Gly Ala Arg His Ala Phe Asp Ala Asp His Ile Ala Ala Ile Asp Asp65 70 75 80Thr Thr Arg Ile Met Leu Leu Arg Gly Arg Arg Pro Val Gly Val Gly85 90 95Phe Phe Phe Ala Met Gly His Ser Thr Val Val Leu Val Leu Ser Leu100 105 110Ile Val Ala Phe Gly Ala Gly Ser Leu Ser Ser Met Glu Ala Ser Arg115 120 125Val Glu Glu Ile Gly Gly Tyr Val Ala Thr Cys Val Ala Val Leu Phe130 135 140Leu Val Leu Val Ala Ala Leu Asn Ser Phe Val Leu Arg Lys Leu Leu145 150 155 160Ala Leu Ser Arg Arg Met Arg Thr Gly Glu Asp Ile Ser Gly Asp Leu165 170 175Glu Arg Gly Leu Gly Glu Arg Gly Leu Leu Ser Trp Leu Leu Ser Gly
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221CDS222(1324)..(1737)223
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1.從混濁紅球菌分離的多核苷酸簇，其含有4個核苷酸序列，其編碼4種多肽，後者具有在每種情況下與序列SEQ ID NO2至SEQ IDNO5包含的胺基酸序列至少90％一致的胺基酸序列，其中所述多肽具有腈水合酶、輔助蛋白P15K和鈷轉運蛋白的活性，所述腈水合酶由α-亞基和β-亞基組成。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其選自a)多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO1的位置1-708或與其互補的核苷酸序列組成，b)多核苷酸，其在遺傳密碼的簡併性的範圍內，具有與a)的序列相對應的核苷酸序列，c)多核苷酸，其能在嚴格條件下，與互補序列a)或b)雜交，和d)多核苷酸，其具有含有功能上中性的有義突變的a)，b)或c)的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼腈水合酶的β-亞基。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，其選自a)多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO1的位置710-1327或與其互補的核苷酸序列組成，b)多核苷酸，其在遺傳密碼的簡併性的範圍內，具有與a)的序列相對應的核苷酸序列，c)多核苷酸，其能在嚴格條件下，與互補序列a)或b)雜交，和d)多核苷酸，其具有含有功能上中性的有義突變的a)，b)或c)的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼腈水合酶的α-亞基。
4.如權利要求1所述的多核苷酸，其選自a)多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO1中的位置1324-1737或與其互補的核苷酸序列組成，b)多核苷酸，其在遺傳密碼的簡併性的範圍內，具有與a)的序列相對應的核苷酸序列，c)多核苷酸，其能在嚴格條件下，與互補序列a)或b)雜交，和d)多核苷酸，其具有含有功能上中性的有義突變的a)，b)或c)的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼輔助蛋白P15K。
5.如權利要求1所述的多核苷酸，其選自a)多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO1中的位置2076-3146或與其互補的核苷酸序列組成，b)多核苷酸，其在遺傳密碼的簡併性的範圍內，具有與a)的序列相對應的核苷酸序列，c)多核苷酸，其能在嚴格條件下，與互補序列a)或b)雜交，和d)多核苷酸，其具有含有功能上中性的有義突變的a)，b)或c)的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼鈷轉運蛋白。
6.如權利要求1所述的多肽，其含有胺基酸序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO3，其中所述多肽具有腈水合酶活性。
7.如權利要求1所述的多肽，其含有胺基酸序列SEQ ID NO4，其中所述多肽具有輔助蛋白P15K活性。
8.如權利要求1所述的多肽，其含有胺基酸序列SEQ ID NO5，其中所述多肽具有鈷轉運蛋白活性。
9.探針或引物，其含有核苷酸序列SEQ ID NO1的位置1-1327中的至少20個連續核苷酸或它的互補形式。
10.探針或引物，其含有核苷酸序列SEQ ID NO1的位置1324-1737中的至少20個連續核苷酸或它的互補形式。
11.探針或引物，其含有核苷酸序列SEQ ID NO1的位置2076-3146中的至少20個連續核苷酸或它的互補形式。
12.如權利要求2所述的分離的多核苷酸，其在嚴格條件下，與具有SEQ ID NO1中的位置1-1327的互補物雜交，其中所述嚴格條件包含在50-68℃的溫度，在5×SSC中洗滌。
13.如權利要求4所述的分離的多核苷酸，其能在嚴格條件下，與具有SEQ ID NO1中的位置1324-1737的互補物雜交，其中所述嚴格條件包含在50-68℃的溫度，在5×SSC中洗滌。
14.如權利要求5所述的分離的多核苷酸，其能在嚴格條件下，與具有SEQ ID NO1中的位置2076-3146的互補物雜交，其中所述嚴格條件包含在50-68℃的溫度，在5×SSC中洗滌。
15.載體，其含有一個或多個選自權利要求1-5和12-14，或權利要求2，3和4和權利要求5所述的多核苷酸。
16.載體pUD15，其由核苷酸序列SEQ ID No.23組成。
17.載體pUD16，其由核苷酸序列SEQ ID NO24組成。
18.宿主細胞，其通過導入權利要求1-5和12-14中的一項或多項的多核苷酸被轉化或轉染。
19.宿主細胞，其通過導入權利要求15-17所述的載體被轉化。
20.宿主細胞，其通過導入載體pUD15和pUD16被轉化。
21.如權利要求18或19所述的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞是腸桿菌科的細菌，特別是埃希氏桿菌屬。
22.從紅球菌屬、尤其混濁紅球菌或包含該酶的微生物製備腈水合酶的方法，其中a)在導致腈水合酶的形成的條件下，在0.15-4mM Co2+存在下，發酵轉化的微生物，其包含具有根據權利要求1-5的核苷酸序列的過表達的基因，b)使該酶在微生物中富集，和c)從細胞分離該酶，或d)收穫微生物，並獲取包含該酶的靜止細胞。
23.權利要求22所述的方法，其特徵在於，使用權利要求18-21所述的宿主細胞。
24.源自混濁紅球菌重組生產的腈水合酶，其能以＞50U/mg幹生物量的比活，轉化α-氨基腈。
25.從腈酶促製備醯胺的方法，其包含下述步驟a)使用具有腈水合酶活性的源自紅球菌屬、尤其是混濁紅球菌的酶，轉化含腈基化合物，所述酶具有與已知的SEQ ID NO2和SEQ IDNO3序列至少90％一致的胺基酸序列，和b)分離醯胺。
26.權利要求25所述的方法，其特徵在於，使用經純化的酶，並視需要使用固定化的酶。
27.權利要求25所述的方法，其特徵在於，使用包含該酶的靜止細胞。
28.權利要求25-27中的一項或多項所述的方法，其特徵在於，將下述通式的化合物轉化成對應的醯胺 和R″-CN(II)其中X是OH，H，具有1-4個C原子的烷基，特別是NH2；R是H，任選地被NH2取代的、分支的或不分支的、具有1-12個C原子的飽和的烷基，分支的或不分支的、具有1-12個C原子的鏈烯基，具有3-6個C原子的環烷基，烷硫基-取代的亞烷基，其中烷基對應於C1-C3基團，且亞烷基對應於二價的C3-C8基團，R′是H，或具有1-3個C原子的烷基，R″是單核或雙核的不飽和環，其具有6-12個C原子，不經取代或經1個或2個烷基(C1-C3)或Cl，Br或F取代；或具有1-6個C原子的單價烷基腈基團。
29.權利要求25-28所述的方法，其特徵在於，從生物量的細胞分離醯胺或含有醯胺的溶液，並將醯胺皂化產生對應的酸。
30.權利要求25-28所述的方法，其特徵在於，從生物量的細胞分離醯胺或含有醯胺的溶液，並用鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物皂化醯胺產生對應的羧酸鹽。
31.權利要求30所述的方法，其特徵在於，用氫氧化鈣皂化MHA-醯胺，並獲取鈣鹽。
全文摘要
本發明涉及紅球菌多核苷酸簇，其含有編碼具有腈水合酶活性的多肽的核苷酸序列、能活化該酶的輔助蛋白P15K的核苷酸序列、和鈷轉運蛋白的核苷酸序列，涉及用該簇轉化的微生物，且其中能編碼這些蛋白的核苷酸序列增強地存在，還涉及轉化的微生物在從腈製備醯胺中的應用。
文檔編號C12N9/78GK1930299SQ200580008206
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月1日 優先權日2004年3月20日
發明者S·奧斯瓦爾多, S·沃瑟克, U·戴廷, C·維克貝克, K·胡斯瑪徹, M·班德, M-R·庫拉, K·歐丹達爾 申請人:底古薩股份公司