一株離子注入誘變選育的高效微生物絮凝劑產生菌的製作方法

2023-10-17 15:51:49 3

專利名稱：一株離子注入誘變選育的高效微生物絮凝劑產生菌的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種新興的交叉學科-離子注入育種技術篩選得到絮凝效果提高顯著的高效絮凝菌。絮凝技術是提高水處理效率的一種既經濟又簡便的處置處理方法，絮凝效果的好壞往往決定後續流程的運行狀況、最終出水水質和費用，在絮凝處理過程中，絮凝劑的種類、性質、品種直接影響到處理效果，因此絮凝劑是絮凝法處理水的核心。
背景技術：
隨著工業和科學技術的發展，無機和有機合成高分子絮凝劑越來越廣泛地被應用於各種水源水和廢水的處理過程中。但是，在其使用的過程中，人們逐漸認識到傳統絮凝劑的不安全性和造成環境二次汙染染的問題。過量的無機離子不僅影響產品的風味、口感，腐蝕生產輸送設備，也不利於人體健康。比如鋁系絮凝劑的頻繁使用，導致飲用水中含有過量的鋁離子，或者毒害水生生物和微生物，通過食物鏈進入人體，攝入過量的鋁離子人群中，老年性痴呆的患者比例較高。有機合成高分子絮凝劑如丙烯醯胺多聚體，雖然其本身沒有任何毒性，但其難降解性卻易造成二次汙染，而且聚合單體丙烯醯胺的殘留也是一個令人十分擔憂的問題，它不僅具有強烈的神經毒性，而且是強致癌物，現在許多國家和領域已禁止或限量使用此類絮凝劑。因此，開發一種安全無毒、絮凝活性高、無二次汙染的新型絮凝劑對人類的健康和環境保護都具有很重要的現實意義。
微生物絮凝劑是利用生物技術，從微生物體內或分泌物中分離提取的一種安全、高效且能自然降解的特殊高分子代謝產物(次生代謝產物)。生物絮凝劑與傳統的無機和有機合成高分子絮凝劑相比具有許多獨特的性質和優點，如高效、無毒、無二次汙染、價格較低，採用微生物絮凝劑處理廢水時，其處理費用較目前的化學絮凝處理費用低，大約節約1/3的費用。
20世紀50年代，人們發現了能產生絮凝作用的細菌培養液，1986年，Ryuichiro Kurane等人，採用從旱田土壤中分離出的紅球菌屬微生物Rhodococcus erythropolis的S-1菌株，用特定培養及培養條件，製成絮凝劑NOC-1。並且把它用於畜牧產廢水處理、膨脹汙泥處理、磚廠生產廢水處理和廢水的脫色處理，都取得了很好的處理效果，被認為是目前發現的最好的微生物絮凝劑，也是目前研究最為深入的生物絮凝劑。此後，國內外掀起了微生物絮凝劑研究的高潮，但大部分研究都集中在利用傳統的分離純化方法篩選微生物絮凝劑產生菌及絮凝特性的研究、化學本質的分析和產絮凝劑機制的研究。
但是，製備高絮凝活性的微生物絮凝劑離不開菌種的篩選，篩選是最為艱難也是最為重要的步驟。目前篩選高效的微生物絮凝劑的方法有兩種一是通過傳統的分離純化方法，另一種是通過誘變的方法。傳統的分離純化方法工作量大，而且由於從自然界直接分離到的野生型菌株積累產物的能力往往很低，無法滿足工業生產的需要，這就要求對它們進行菌種改造。根據大量的研究報導，微生物絮凝劑的產生是由絮凝基因控制的，而誘變能夠從本質上改變絮凝基因，使遺傳物質核酸中的核苷酸順序發生了穩定的可遺傳的變化，從而產生絮凝率大幅度提高的可穩定遺傳的突變株。
目前，國內外對微生物絮凝劑產生菌進行誘變育種的研究很少，並且僅僅局限於傳統的物理化學誘變，但是，由於這些誘變源的反覆使用，導致其誘變新突變的能力減弱，老的誘變源誘變產量的提高已到極限，若再想使工業微生物積累大量新的突變，必須尋找新的物理誘變源。離子束生物技術是一種菌種選育新方法，它集化學誘變和物理誘變於一身，突變率高、操作簡單，顯現了巨大的優勢，並已被生產實踐證明是一種行之有效的微生物菌種選育的方法，也是一種不可替代的育種方法。目前，採用離子注入微生物誘變育種的研究工作主要集中於醫學、藥學、食品行業的微生物誘變育種及基因工程，該技術在環境微生物的誘變育種工作中開展的不多。

發明內容
本發明利用離子注入的方法誘變微生物絮凝劑，篩選出具有高產趨勢，遺傳性能穩定的高效微生物絮凝劑突變菌株C3-X。使一些其他方法很難取得誘變效果的環境微生物發生有經濟意義的突變，為環境微生物誘變育種開闢一條新的途徑。
本發明優點與現有的微生物絮凝劑育種技術相比，本發明有以下優點1.離子注入生物體有眾多新特點，注入離子的質、能、電聯合作用的生物學效應比核輻射產生的生物學效應具有更豐富的內容和更寬廣的誘變圖譜，可能在較低的劑量下，產生很高的突變率，尤其是在存活下來的菌種中發生變異的機率是很高的；2.大幅度提高了絮凝率；3.拓寬了離子注入的應用領域。
具體實施辦法出發菌株C3為傳統方法篩選，確定其為細菌，其絮凝率為84.2％。本發明實施過程所採用的模擬廢水為高嶺土懸濁液(200目過篩、濃度4g/L)，在其中投加一定量的絮凝劑和助凝劑(1％的CaCl2溶液)，進行絮凝試驗，水力條件為200rpm快攪1min，80rpm慢攪2min，靜沉5min，取距液面50％深度處液體，測定其吸光度OD550，同時以蒸餾水代替發酵液作對照。
絮凝率的計算公式如下絮凝率E＝(A-B)/A×100％式中A-對照上清液550nm處的吸光度B-絮凝後清液550nm處的吸光度離子注入方法採用幹胞法。於新鮮斜面取一環菌接入種子培養基(100mL/250mL三角瓶)，30℃，150r/min培養10h，取菌液1.5mL與離心管中。離心收集菌體(4000r/min，5min)，用無菌生理鹽水洗滌菌體三次，加0.4mL生理鹽水，製成菌體濃度約為107個/mL的單細胞菌懸液，取0.03mL均勻塗布於無菌平皿中央Φ10mm左右範圍，以無菌風吹乾，即製得菌膜。取鏡檢無細胞重疊者進行離子注入。注入劑量為1012-1014ion/cm2H+，輻照在大氣中進行。篩選出的突變株菌落形態見表1，存活率-劑量曲線見

圖1。
表1初篩結果

離子注入篩選到一株突變株C3-X，照片見圖2。將其連續轉接六代，絮凝率均穩定保持在98％左右，絮凝率比野生菌株C3提高了13.8％，證明通過離子照射後的菌株發生了突變而不是刺激作用，同時也表明用離子注入的方法進行微生物絮凝劑產生菌的誘變篩選是可行的，具有實際意義及工業價值。
權利要求
1.一種本實驗室篩選保藏的絮凝劑產生菌C3及突變株C3-X。
2.權力要求書1中的C3-X菌用於製備微生物絮凝劑。
3.權力要求書1中的用C3菌製備微生物絮凝劑的方法，其特徵是挑取純菌落塗布至細菌平板培養基使菌落長到滿視野，用打孔器打孔，接入裝有150ml發酵培養基的錐形瓶中培養，在恆溫振蕩器中30℃，150rpm條件下培養66h，即得到絮凝劑樣品。發酵培養基成分為葡萄糖30g，尿素0.3g，酵母膏0.6g，NaCl0.6g，K2HPO46g，KH2PO43g，pH＝7。
4.權力要求書1中所利用的離子注入選育高效的微生物絮凝劑產生突變株C3-X的方法。
全文摘要
目前所使用的絮凝劑存在著各種局限性，限制了其廣泛的開發應用，生物絮凝劑作為一類新型絮凝劑，其廣譜的絮凝活性、可生物降解性及應用安全性，顯示了它在水處理、食品加工和發酵工業等方面的應用前景。因此，篩選高效新型絮凝劑產生菌對其應用做出很大的貢獻。重離子和傳統的物理誘變源相比具有許多獨特的特性，利用它可能使一些其他方法很難取得誘變效果的工業微生物發生有經濟意義的突變，為工業微生物誘變育種開闢一條新的途徑。同理，此種方法也可以應用於環境微生物工程中，提高微生物絮凝劑的生產能力，目前將重離子誘變微生物應用於環境工程中的研究微乎其微，可以說我們的發明可以為此領域的研究提供一些重要的基礎。
文檔編號C02F1/52GK101050434SQ20061001161
公開日2007年10月10日 申請日期2006年4月7日 優先權日2006年4月7日
發明者楊玉楠, 任娜, 胡訓傑, 陳亞松, 韓冬, 湯歷漫 申請人:北京航空航天大學